جلد 23، شماره 1 - ( بهار 1405 )
جلد 23 شماره 1 صفحات 21-12 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: TMI.IR 1395
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mousavi Dehaqani L, Sharifi Z. Inactivation of HSV-1 Using Methylene Blue and Visible Light: Correlation of TCID50 Reduction with Glycoprotein D RNA Expression by RT-qPCR. bloodj 2026; 23 (1) :12-21
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1609-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1609-fa.html
موسوی دهاقانی لیلا، شریفی زهره. غیرفعالسازی ۱-HSV با متیلن بلو و نور مرئی: همبستگی کاهش TCID50 با بیان RNA گلیکوپروتئین D با روش RT-qPCR. فصلنامه پژوهشی خون. 1405; 23 (1) :12-21
استاد مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 770 kb]
(104 دریافت)
| چکیده (HTML) (397 مشاهده)
مقدمه
با توجه به پیشرفتهای قابل توجه در سلامت خون و وجود روشهای مختلف موجود، هنوز شناسایی عوامل عفونی به صفر نرسیده است و احتمال انتقال ویروسها از طریق خون و فرآوردههای آن، یکی از چالشهای مهم و اصلی در مراکز انتقال خون میباشد (3-1). برای افزایش سلامت خون، روشهای حذف یا غیر فعالسازی ویروسها مورد توجه قرار گرفته است (4). برای بررسی مؤثر بودن روش غیر فعالسازی، از تکثیر ویروس در کشت سلول استفاده میشود و نتایج آزمایش بر اساس تغییرات در مورفولوژی سلول استوار است و ممکن است اثر تخریب طبیعی سلول با اثر سایتوپاتیک ویروس از هم قابل تشخیص نباشد. در نتیجه استفاده از روشهایی که تکثیر ویروس را در کشت سلول نشان دهد میتواند بسیار کمککننده باشد تا تکثیر ویروس از تخریب طبیعی تشخیص داده شود.
ویروس هرپس سیمپلکس نوع یک و دو (HSV-2 ، HSV-1) به عنوان ویروس هرپس انسانی نوع یک و دو (human herpesvirus 1 & 2, HHV-1, HHV-2) نیز شناخته میشوند (5). تمام ویروسهای هرپس دارای ویژگیهای مشترک ژنوم DNA دو رشتهای بزرگ خطی با کپسید بیست وجهی و پوشش خارجی لیپید دولایه میباشند. پوشش ویروس توسط تگو منت به کپسید متصل است و ذره کامل ویریون را تشکیل میدهد (7، 6). ورود هرپس به داخل سلول میزبان توسط چندین گلیگوپروتئین سطح پوشش ویروس به گیرندههای سطح سلول انجام میشود (8). بعد از اتصال ویروس به سطح سلول از طریق فیوژن غشا و تلفیق شدن پوشش ویروسی با غشای سلول، محتویات ویروسی به سلول وارد میشود. ویروس هرپس ابتدا با دو گلیکوپروتئین gC و gD به هپاران سولفات سطح سلول متصل میشود. سپس گلیکوپروتئین gD حداقل به سه گیرنده اختصاصی شناخته شده متصل میگردد (9). گلیکوپروتئین D (gD) برای ورود به سلول و عفونت HSV ضروری است و ژن آن به دلیل نواحی حفاظت شده و اختصاصی بودن برای تشخیص HSV به کار میرود، mRNA gD یک هدف مناسب برای تشخیص عفونت فعال HSV است.
از آن جایی که پاتوژنهای ویروسی برای تکثیر و گسترش خود به مکانیسمهای سلول میزبان متکی هستند و از آنها بهره میبرند، بنابراین مطالعه تعاملات بین ویروس و سلول میزبان و تعیین عفونتزایی ویروس، به عنوان مثال، با سنجشهای دوز عفونی50% کشت بافت (TCID50)، انجام میشود. تعیین تیترهای کمی ویروس ابزاری مهم برای تعیین عفونتزایی و تکثیر ویروس هستند و هر دو پارامترهای حیاتی برای ارزیابی و بررسی تأثیر روشهای غیر فعالسازی ویروسها میباشند. سنجشهای دوز عفونی 50% کشت بافت (TCID50) آزمایشهای تیتراسیون ویروس هستند که میتوانند با بررسی اثرات سیتوپاتیک ویروس بر روی کشت سلولی میزبان تلقیح شده، برای تعیین کمیت تیترهای ویروس استفاده شوند. در سنجشهای TCID50، رقتهای مختلف ویروس به جمعیتهای سلولی میزبان با تعداد سلول یکسان اضافه شده و تا زمانی که اثر سیتوپاتیک مشاهده شود، انکوبه میشوند. مقدار TCID50 نشاندهنده مقدار رقت ویروس مورد نیاز برای القای اثرات سیتوپاتیک در 50% از چاهکهای حاوی کشت سلولی تلقیح شده پس از یک دوره زمانی مشخص است. سنجشهای TCID50 با شمارش چشمی تعداد چاهکهای آسیب دیده یا سنجشهای زنده مانی سلول با استفاده از میکروسکوپ معکوس به عنوان نتیجه نهایی ارزیابی میشود (10).
برای بررسی تغییرات ناشی از عوامل طبیعی یا غیره در فرآیندهای بیولوژیک سلول، از روشهای مختلفی میتوان استفاده نمود. یکی از این راهها، بررسی تغییرات ایجاد شده در میزان رونوشتهای سلولی (transcript) است که نشانه تغییرات پروتئینهای سلول میباشد. در حال حاضر با استفاده همزمان از واکنش ترانس کریپتاز معکوس (RT-PCR) شناسایی یک رونوشت RNA از ژنهای اولیه حاوی تعداد کپی پایین امکان پذیر است (11).
در این پژوهش برای بررسی مؤثر بودن روش غیر فعالسازی 1-HSV به عنوان ویروس مدل ویروسهای DNA دو رشتهای پوششدار با روش متیلنبلو و نور مرئی از کشت سلول استفاده شد و تیتر عفونی ویروس با روش دوز عفونی 50% کشت بافت (TCID50) وReal Time PCR قبل و بعد از غیر فعالسازی بررسی و همبستگی دو روش مقایسه شد تا روشی حساس و با دقت بالا که از نظر زمان و هزینه به صرفه باشد ارائه شود.
مواد و روشها
کشت سلول:
لاین سلولی VERO با منشا کلیه میمون سبز آفریقایی
که در تانک ازت آزمایشگاه ویروسشناسی موجود بود، مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا کرایو ویال پس از خروج از تانک ازت در 196- درجه سانتیگراد به سرعت در بن ماری 37 درجه سانتیگراد ذوب شد. پس از شستشو و حذف DMSO ، سلولها با لام نئوبار و محلول تریپانبلو شمارش گردید و درصد سلول زنده محاسبه شد. سپس سلولها در محیـط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ، آنتیبیوتیک پنیسیلین - استرپتومایسین تا غلظت نهایی 1% و سرم جنین گوساله 10% (Gibco) به فلاسک کشت cm3 25 منتقل شد و در انکوباتور حاوی رطوبت 95% در دمای 37 درجه سانتیگراد و CO2 5% قرار داده شد.
تیتراسیون ویروس:
ابتدا سلولهای Vero در پلیتهای 96 خانهای کشت داده شد. پس از کامل شدن 70% لایه سلولی ، استوک ویروس HSV-1 از فریزر منفی 70 درجه سانتیگراد ذوب شد و در هشت رقت از (8-10-1-10) تهیه گردید. برای رقتهای تهیه شده چهار چاهک کشت سلول، کشت سلول بدون ویروس به عنوان کنترل سلول و در چهار چاهک کشت سلول، از استوک ویروس بدون ایجاد رقت به عنوان کنترل ویروس ریخته شد. محیط کشت از چاهکهای پلیت خارج شد و سطح سلولها به منظور حذف سرم سه بار با μL 300 DMEM شسته شد. از هر رقت ویروس μL 100 در 4 چاهک ریخته شد. به مدت 1 ساعت ویروس در مجاورت سلول در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در طول این مدت، هر 10 دقیقه یک بار پلیت چرخانده شد تا ویروس در تماس با سلولها قرار گیرد. پس از یک ساعت، μL 300 محیط کشت با 2% سرم به چاهکهای پلیت اضافه شد. پلیت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. اثر سیتوپاتوژنیک Cytopathogenic Effects(CPE) به مدت 7 روز بررسی شد و تیتر TCID50 بر اساس روش Reed-Muench محاسبه شد.
پلاسمای تازه منجمد Fresh Frozen Plasma (FFP):
پنج نمونه پلاسمای تازه منجمد شده با گروه خونی O مثبت از سازمان انتقال خون، پایگاه وصال تهیه گردید. فرآوردهها تا زمان استفاده در فریزر 30- درجه سانتیگراد نگهداری شد. هنگام آزمایش فرآورده در 37 درجه سانتیگـراد ذوب گـردید و در حجمهـای کوچکتر (cc 10)
تقسیم شد.
متیلن بلو:
متیلن بلو از شرکتproduct number 1592700010) Merk) تهیه گردید. با توجه به جرم مولی متیلنبلو، cc 1 (g/moL 319/85) از محلول متیلن بلو با غلظت µM 500 تهیه و در ظرفی تاریک در 4 درجه سانتیگراد ذخیره گردید.
غیر فعالسازی ویروس HSV-1 با روش متیلنبلو و پرتودهی با نور مرئی:
به منظور استفاده از روش متیلنبلو و پرتودهی، از دستگاه پرتودهی با نور مرئی استفاده شد (12). غیر فعالسازی ویروس با نور دو طرفه طی دستورالعمل زیر انجام گرفت. ابتدا نمونه پلاسما از فریزر 30- درجه سانتیگراد خارج و در بن ماری با دمای 37 درجه سانتیگراد ذوب گردید.
کیسه حاوی50 میلیلیتر فرآورده پلاسمایی تا زمان استفاده در فریزر 30- درجه سانتیگراد نگهداری شد. هنگام آزمایش فرآورده در دمای 37 درجه سانتیگراد ذوب و در حجمهای کوچکتر (cc 10) تقسیم گردید. در زیر هود لامینار کلاس 2 با استفاده از رابط استریل و دستگاه اتصال (آلمان، CompoDock Fresenius) 50 میلیلیتر پلاسما از کیسه اصلی به 5 کیسه به حجم 10 میلیلیتری تقسیم و بدون باز کردن به کیسهها منتقل شد و با استفاده از ترازو توزین شد. کیسهها توسط یک دستگاه سیلر حرارتی (Fresenius، آلمان) از هم جدا شدند. سپس به کمک سرنگ استریل از طریق کورد به ازای هر 9 میلیلیتر پلاسما، 1 میلیلیتر از استوک ویروس و متیلن بلو با غلظت µM 1 به پلاسمای موجود در کیسه اضافه و با سیلر حرارتی سیل گردید به نحوی که ضخامت پلاسما در کیسه حدود یک میلیمتر شد.
سپس کیسه در محل تعبیه شده در دستگاه برای پرتودهی گذاشته شد. پرتودهی در زمان 10 دقیقه به صورت دو طرفه در nm 627 تحت تابش و shaking قرار گرفتند. به منظور تعیین کاهش تیتر ویروس از پلاسما پس از پرتودهی نمونهبرداری شد. پس از ضد عفونی کردن کیسه پس از تابش، زیر هود کلاس 2 بـا استفـاده از قیچی استریل کورد بریده شد و محتویات آن به آرامی به یک فالکون 15 میلیلیتـری منتقـل شـد.
پس از غیر فعالسازی ویروس HSV-1 با روش متیلنبلو و نورمرئی، تیتراسیون مجدد ویروس قبل و بعد از غیر فعالسازی انجام شد. تیتر ویروسها پس از غیر فعالسازی /mL 50 TCID 102 ، محاسبـه شـد. کاهــــش لگاریتمی تیتر ویروس HSV-1؛ 5 لوگ گزارش شد.
برای بررسی تیتر عفونتزایی ویروس با روش Real Time PCR ، در روز سوم بعد از آلودگی به ویروس HSV-1 بدون رقت و با رقتهای 10 برابری قبل و بعد از غیر فعالسازی با روش متیلنبلو و نورمرئی، استخراج RNA و ساخت cDNA ، با کمک آغازگرهای اختصاصی ژنهای GAPDH و گلیکوپروتئین D (GPD) برای ویروسHSV Real Time RT-PCR انجام شد. براساسCt های به دست آمده از رقتهای مختلف، نمودار منحنی استاندارد برای هر دو ژن مورد بررسی قرار گرفت و بر اساس تجزیه و تحلیل رگرسیون نتایج برای slope و R2 برای هر دو ژن به ترتیب 15/3- و 2/3- و 99% و 5/99% گزارش شد (شکل 2). برای بررسی اختصاصی بودن آزمایش در واکنش PCR از analysis curve melt استفاده شد(شکل 3).
برای هر رقت ویروسی سه تکرار انجام شد و با استفاده از نرمافزار Rest بیان ژن گلیکوپروتئین Dدر مقابل ژن رفرانس محاسبه شد. میانگین چرخه آستانه ژن گلیکوپروتئین D در کشت سلول حاوی ویروس HSV-1 بدون غیر فعالسازی (/mL 50 TCID 107)، برابر 6/22 (6/22 =Ct) و میانگین چرخه آستانه ژن گلیکوپروتئین D در نمونه پلاسما پس از غیر فعالسازی با روش متیلنبلو و نور مرئی (/mL50 TCID 102)، برابر 28 (28=Ct) بود، که کاهش معنادار بیان ژن گلیکوپروتئین D (/mL50 TCID 102) مشاهده شد (001/0 p=). بر اساسCt های حاصله و نرمافزار Rest، بیان گلیکوپروتئین D در گروه کنترل (قبل از غیر فعالسازی) نسبت به گروه درمان (بعد از غیر فعالسازی)، 15 برابر کاهش یافته بود (001/0 = p ).
به دلیل استفاده از رنگ سایبرگرین در واکنش Real Time PCR و به علت اتصال غیر اختصاصی این رنگ به تمامی DNA های دورشتهای، برای اطمینان از اختصاصی بودن واکنش ازmelt curve analysis استفاده شد(شکل 3). واکنش Real Time-PCR ، تا /mL50 TCID 5 لوگ کاهش بیان گلیکوپروتئین D (GPD) را در محیط کشت سلولهای Vero پس از غیر فعالسازی ویروســی (/mL50 TCID 2-10) نشان داد.
همبستگی بین qRT-PCR و TCID50/mL :
ارتباط بین مقادیر Ct به دست آمده از هر رقت ویروسی با تیتر /mL50 TCID (در مقیاس) Log 10 بررسی شدند. مقادیر Ct مرتبط به qRT-PCR به دست آمده از غیر فعالسازی ویروس با تیتر /mL50 TCID محاسبه شده پس از غیر فعالسازی طبق روش Reed-Muench ، با یکدیگر همبستگی داشتند (98/0 r= ، 001/0 p<).
بحث
برای کاهش بیشتر عفونتهای منتقله از طریق خون (TTIs)، ویروسزدایی یک راهبرد است. برای بررسی مؤثر بودن روش غیر فعالسازی ویروسی، از اثر CPE روی سلولهای کشت شده استفاده میشوند. در روش سنتی برای تعیین کمیت تیتر عفونی، تیتراسیون نقطه پایانی و محاسبه دوز 50 درصد آلودهکننده کشت بافت در هر میلیلیتر (/mL50 TCID) استفاده میشود که به عنوان "بار ذرات عفونی ویروسی در واحد حجم که قادر به ایجاد اثر سیتوپاتیک در نیمی از کشتهای سلولی آلوده هستند" تعریف میشود (18-16). این فرآیند نیاز به دانش وسیع در زمینه تکثیر و نگهداری کشت سلولی دارد، پر زحمت است و به طور متوسط سه تا چهار روز طول میکشد تا تکمیل شود. علاوه بر این، عفونت سلولی باید در یک آزمایشگاه با سطح ایمنی زیستی مناسب انجام شود. با توجه به دلایل فوق، در شرایط خاص، تیتراسیون نقطه پایانی ممکن است به دلیل فقدان یکی از حداقل الزامات فوقالذکر، عملی نباشد. همچنین تنوع سیستم بیولوژیکی میتواند به راحتی بر نتایج تأثیر بگذارد و استانداردسازی این نوع کمیت نیز دشوار است. در واقع، تنوع بیولوژیکی به دلیل دشواری در کشت تعداد یکسانی از سلولها، افزودن مقدار یکسانی از ویروس و توقف همزمان عفونت، زیاد است. استراتژیهای تشخیص و تکثیر اسید نوکلئیک، یعنی RT-PCR ممکن است به تعیین کمی بار ویروسی یا نیمه کمی در نمونه مورد نظر به همان اندازه حساس منجر شود. روشهای نیمه کمی و کمی از نظر دقت نتیجهای که در پایان تجزیه و تحلیل به دست میآورند، متفاوت هستند. در روشهای نیمه کمی (qRT-PCR)، شدت فلورسانس ساطع شده پس از هر چرخه تکثیر ثبت میشود تا مقدار نسبی هدف تعیین شود و مقادیر آستانه چرخه (Ct) که به این ترتیب به دست میآیند، با مقدار بار ویروسی نسبت معکوس دارند، اما نمیتوان آنها را مستقیماً به معادلهای تعداد کپی ژنوم تبدیل کرد. تعیین کمی نسبی کپیهای هدف با استفاده از qRT-PCR مستلزم تولید یک منحنی استاندارد است.
از آن جایی که شناسایی CPE ناشی از ویروسها در کشت سلول طولانی مدت (7-5 روز) است و گاهی با تخریب سلول اشتباه میشود، بنابراین استفاده از روشهای دیگر مانند Real Time RT-PCR در مقایسه با تکثیر ویروس هرپس بر روی سلولهای VERO و مشاهدهCPE با میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه سلولهای VERO با میزان پرشدگی 90% (Confluency) در مجاورت رقتهای مختلف ویروس هرپس با 8 رقت لگاریتمی در نمونه پلاسما حاوی ویروس قبل و بعد از غیر فعالسازی با روش متیلنبلو و نور مرئی قرار گرفت و تیتر ویروس با روش مشاهده CPE و Real Time RT-PCR مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت.
در این مطالعه تیتر ویروس /mL50TCID 107 محاسبه شد. پس از غیر فعالسازی ویروس HSV-1 با روش متیلنبلو و نورمرئی، تیتراسیون مجدد ویروس قبل و بعد از غیر فعالسازی انجام شد. تیتر ویروسها پس از غیر فعالسازی /mL50TCID 102 محاسبه شد. کاهش لگاریتمی تیتر ویروس HSV-1؛ 5 لوگ گزارش شد. در واکنش RealTime-PCR بر روی رقتهای مختلف ویروس قبل و بعد از غیر فعالسازی در کشت سلول از /mL50TCID 102 کاهش معنادار در مقادیر Ct و بیان گلیکوپروتئین D (GPD) در محیط کشت سلولهای Vero پس از غیر فعالسازی ویروسی یعنی /mL50 TCID 5 لوگ را نشان دادکه با نتایج روش 50 TCID مطابقت داشت. تاثیر غیر فعالسازی ویروس HSV-1 با روش متیلنبلو و نور مرئی با مطالعه الیکایی و همکاران مطابقت داشت و بیشترین کاهش لگاریتمی برای HSV به مقدار 28/6 ، لوگ با زمان پرتودهی ۴۵ دقیقه بود (12).
همچنین در این مطالعه بین مقادیر Ct مرتبط به qRT-PCR به دست آمده از غیر فعالسازی ویروس با تیتر /mL50 TCID محاسبه شده پس از غیر فعالسازی ویروس با یکدیگر همبستگی داشتند که با مطالعهای که بین دو روش qRT-PCR برای تعیین تعداد دقیق کپیهای RNA ویروس کرونا سندرم حاد تنفسی ۲ (SARS-CoV-2) و تیتراسیون ویروس کرونا عفونی روی کشتهای سلولی انجام شده بود، موافقت داشت که نشان داده بودند بین بار نسخههای RNA ( Ct) ویروسی و تیتر عفونی ویروس با دوز آلودهکننده کشت بافت در هر میلیلیتر (/mL50 TCID)، همبستگی وجود داشته است (11). از طرف دیگر ، در مطالعه لوگان و همکاران نشان داده شد بین میزان گرانولوسیتی سلول که با روش فلوسایتومتری تعیین میشود با تیتر لگاریتمی ویروس عفونی ارتباط معناداری وجود دارد و شناسایی بدون فلورسنت غلظت ویروس عفونی از طریق فلوسایتومتری میتواند ابزار سریع و دقیق برای تعیین تیتر ویروس در نظر گرفته شود (19).
در مطالعـه گوستافسـون و همکاران بــرای ارزیابی تیتر
ویروس هرپس انسانی ۶ (HHV-6)، با استفاده از روشهای q-PCR و 50 TCID، به خوبی بیان پروتئینهای ویروسی با روش50 TCID همبستگی داشت و از ویژگی بالایی برای تعیین دوز عفونی برخوردار بود (10).
نتیجهگیری
دادههای ما همبستگی قوی بین تیتر ویروس (/mL50 TCID) با مقادیر Ct (بیان گلیکوپروتئینD) در روش qRT-PCR نشان داد. /mL50 TCID به دلیل تنوع استفاده از سیستم بیولوژیکی میتواند به راحتی بر نتایج تأثیر بگذارد و استانداردسازی این نوع کمیت را دشوار کند. روشهای مولکولی مبتنی بر بیان گلیکوپروتئین D (mRNA gD) میتواند به عنوان یک هدف برای تشخیص عفونت فعال HSV مورد استفاده قرار گیرد.
حمایت مالی
این پروژه توسط مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه
عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین مالی شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه به تایید شورای تجصیلات تکمیلی مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی انتقال خون ایران رسیده است.
عدم تعارض منافع
هیچگونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود ندارد.
نقش نویسندگان
لیلا موسوی دهاقانی: نگارش پایان نامه و انجام آزمایشها زهرا پاز: آموزش روشها و کمک در اجرای آن
دکتر زهره شریفی: طراحی مطـالعـه، نظارت بر اجرای پایان نامه و نگارش مقاله
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل پایاننامه کارشناسی ارشد زیست فناوری مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی انتقال خون ایران است. بدیـنوسیلـه از ایـن مـؤسسه به خاطر حمایتهای مالی آن تشکر میشود.
متن کامل: (85 مشاهده)
غیرفعالسازی ۱-HSV با متیلن بلو و نور مرئی: همبستگی کاهش TCID50
با بیان RNA گلیکوپروتئین D با روش RT-qPCR
لیلا موسوی دهاقانی1، زهرا پاز2، زهره شریفی3
1- کارشناس ارشد زیست فناوری ـ مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- کارشناس میکروبیولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- PhD ویروسشناسی ـ استاد مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
با بیان RNA گلیکوپروتئین D با روش RT-qPCR
1- کارشناس ارشد زیست فناوری ـ مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- کارشناس میکروبیولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- PhD ویروسشناسی ـ استاد مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
http://dx.doi.org/10.61186/bloodj.22.1.19 Citation: Mousavi Dehaqani L, Paz Z, Sharifi Z. Inactivation of HSV-1 Using Methylene Blue and Visible Light: Correlation of TCID50 Reduction with Glycoprotein D RNA Expression by RT-qPCR. J Iran Blood Transfus. 2026: 23 (1): 12-21 نویسنده مسئول: دکتر زهره شریفی. استاد مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران صندوق پستی: 1157-14665 E-mail:
|
 چکیدهسابقه و هدف علیرغم پیشرفتهای قابل توجه در سلامت خون، خطر انتقال عوامل عفونی همچنان یک چالش برای مراکز انتقال خون است. برای افزایش سلامت خون، روشهایی برای حذف یا غیرفعال کردن ویروسها توسعه یافته است. این مطالعه بر غیرفعالسازی ویروس هرپس سیمپلکس نوع ۱ ( HSV-1)با استفاده از متیلنبلو و نور مرئی در پلاسما تمرکز دارد و اثربخشی غیر فعالسازی را با روشهای qRT-PCR و TCID50 مقایسه میکند. مواد و روشها در یک مطالعه تجربی، سلول Vero در محیط DMEM با 1% پنیسیلین-استرپتومایسین و 10% سرم جنین گوساله در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5% CO2 کشت داده شدند. تیتر ویروس با آلودهسازی این سلولها تعیین شد. متعاقب آن، ذخیره ویروس در حجم 1/0 پلاسما به آن اضافه شد. ویروس به پنج واحد پلاسمای جداگانه که از اهداکنندگان خون مختلف به دست آمده بود، اضافه شد. پنج نمونه پلاسمای حاوی ویروس با متیلن بلو ۱ میکرومولار تیمار شدند و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در طول موج ۶۲۷ نانومتر تحت پرتودهی قرار گرفتند. تیتراسیون ویروس در پلیتهای ۹۶ چاهکی انجام شد و تیتر ویروس قبل و بعد از پرتودهی از طریق رقتهای سریالی 10 برابری با روش TCID50اندازهگیری شد. گروه کنترل شامل پلاسمای بدون ویروس، پلاسمای حاوی ویروس پرتودهی شده بدون متیلنبلو و پلاسمای حاوی متیلنبلو بدون پرتودهی بود. پس از استخراج RNA ازرقتها و ساخت cDNA ، بیان گلیکوپروتئین D با qRT-PCR اندازهگیری شد. تمامی آزمایشها 3 مرتبه تکرار گردید. در نهایت محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل دادهها با نرمافزار 26 SPSS انجام شد و ضریب همبستگی پیرسون بین دو آزمایش محاسبه گردید. یافتهها قبل از غیر فعالسازی، تیتر ویروس با مشاهده اثرات سیتوپاتیک در سلولهای Vero به صورت TCID50/mL 107 تعیین شد. پس از غیرفعالسازی با متیلن بلو و پرتودهی، تیتر به TCID50/mL 102 کاهش یافت که نشاندهنده کاهش ۵ لگاریتمی است. میانگین چرخه آستانه (Ct) ژن گلیکوپروتئین D در کشتهای سلولی حاوی HSV-1 غیرفعال نشده (TCID50/mL 107(، 6/22 (6/22 Ct=) بود، در حالی که میانگین Ct ژن گلیکوپروتئین D در نمونههای پلاسما پس از غیرفعال شدن توسط متیلن بلو و نور مرئی (TCID50/mL 102)، 28 (28 Ct=)، بود . این نشان دهنده کاهش 15 برابری در بیان گلیکوپروتئین D است (001/0 p=). نتیجه گیری بین مقادیر لگاریتمیTCID50 و مقادیر Ct به دست آمده از روش qRT-PCR همبستگی مشاهده شد. روشهای مولکولی مبتنی بر بیان گلیکوپروتئین D (gD mRNA) ممکن است به عنوان یک رویکرد مفید برای تشخیص عفونت فعال HSV به کار گرفته شوند. کلمات کلیدی: غیرفعالسازی ویروس ، ویروس هرپس سیمپلکس، متیلن بلو، نور مرئی، RT-PCR |
مقدمه
با توجه به پیشرفتهای قابل توجه در سلامت خون و وجود روشهای مختلف موجود، هنوز شناسایی عوامل عفونی به صفر نرسیده است و احتمال انتقال ویروسها از طریق خون و فرآوردههای آن، یکی از چالشهای مهم و اصلی در مراکز انتقال خون میباشد (3-1). برای افزایش سلامت خون، روشهای حذف یا غیر فعالسازی ویروسها مورد توجه قرار گرفته است (4). برای بررسی مؤثر بودن روش غیر فعالسازی، از تکثیر ویروس در کشت سلول استفاده میشود و نتایج آزمایش بر اساس تغییرات در مورفولوژی سلول استوار است و ممکن است اثر تخریب طبیعی سلول با اثر سایتوپاتیک ویروس از هم قابل تشخیص نباشد. در نتیجه استفاده از روشهایی که تکثیر ویروس را در کشت سلول نشان دهد میتواند بسیار کمککننده باشد تا تکثیر ویروس از تخریب طبیعی تشخیص داده شود.
ویروس هرپس سیمپلکس نوع یک و دو (HSV-2 ، HSV-1) به عنوان ویروس هرپس انسانی نوع یک و دو (human herpesvirus 1 & 2, HHV-1, HHV-2) نیز شناخته میشوند (5). تمام ویروسهای هرپس دارای ویژگیهای مشترک ژنوم DNA دو رشتهای بزرگ خطی با کپسید بیست وجهی و پوشش خارجی لیپید دولایه میباشند. پوشش ویروس توسط تگو منت به کپسید متصل است و ذره کامل ویریون را تشکیل میدهد (7، 6). ورود هرپس به داخل سلول میزبان توسط چندین گلیگوپروتئین سطح پوشش ویروس به گیرندههای سطح سلول انجام میشود (8). بعد از اتصال ویروس به سطح سلول از طریق فیوژن غشا و تلفیق شدن پوشش ویروسی با غشای سلول، محتویات ویروسی به سلول وارد میشود. ویروس هرپس ابتدا با دو گلیکوپروتئین gC و gD به هپاران سولفات سطح سلول متصل میشود. سپس گلیکوپروتئین gD حداقل به سه گیرنده اختصاصی شناخته شده متصل میگردد (9). گلیکوپروتئین D (gD) برای ورود به سلول و عفونت HSV ضروری است و ژن آن به دلیل نواحی حفاظت شده و اختصاصی بودن برای تشخیص HSV به کار میرود، mRNA gD یک هدف مناسب برای تشخیص عفونت فعال HSV است.
از آن جایی که پاتوژنهای ویروسی برای تکثیر و گسترش خود به مکانیسمهای سلول میزبان متکی هستند و از آنها بهره میبرند، بنابراین مطالعه تعاملات بین ویروس و سلول میزبان و تعیین عفونتزایی ویروس، به عنوان مثال، با سنجشهای دوز عفونی50% کشت بافت (TCID50)، انجام میشود. تعیین تیترهای کمی ویروس ابزاری مهم برای تعیین عفونتزایی و تکثیر ویروس هستند و هر دو پارامترهای حیاتی برای ارزیابی و بررسی تأثیر روشهای غیر فعالسازی ویروسها میباشند. سنجشهای دوز عفونی 50% کشت بافت (TCID50) آزمایشهای تیتراسیون ویروس هستند که میتوانند با بررسی اثرات سیتوپاتیک ویروس بر روی کشت سلولی میزبان تلقیح شده، برای تعیین کمیت تیترهای ویروس استفاده شوند. در سنجشهای TCID50، رقتهای مختلف ویروس به جمعیتهای سلولی میزبان با تعداد سلول یکسان اضافه شده و تا زمانی که اثر سیتوپاتیک مشاهده شود، انکوبه میشوند. مقدار TCID50 نشاندهنده مقدار رقت ویروس مورد نیاز برای القای اثرات سیتوپاتیک در 50% از چاهکهای حاوی کشت سلولی تلقیح شده پس از یک دوره زمانی مشخص است. سنجشهای TCID50 با شمارش چشمی تعداد چاهکهای آسیب دیده یا سنجشهای زنده مانی سلول با استفاده از میکروسکوپ معکوس به عنوان نتیجه نهایی ارزیابی میشود (10).
برای بررسی تغییرات ناشی از عوامل طبیعی یا غیره در فرآیندهای بیولوژیک سلول، از روشهای مختلفی میتوان استفاده نمود. یکی از این راهها، بررسی تغییرات ایجاد شده در میزان رونوشتهای سلولی (transcript) است که نشانه تغییرات پروتئینهای سلول میباشد. در حال حاضر با استفاده همزمان از واکنش ترانس کریپتاز معکوس (RT-PCR) شناسایی یک رونوشت RNA از ژنهای اولیه حاوی تعداد کپی پایین امکان پذیر است (11).
در این پژوهش برای بررسی مؤثر بودن روش غیر فعالسازی 1-HSV به عنوان ویروس مدل ویروسهای DNA دو رشتهای پوششدار با روش متیلنبلو و نور مرئی از کشت سلول استفاده شد و تیتر عفونی ویروس با روش دوز عفونی 50% کشت بافت (TCID50) وReal Time PCR قبل و بعد از غیر فعالسازی بررسی و همبستگی دو روش مقایسه شد تا روشی حساس و با دقت بالا که از نظر زمان و هزینه به صرفه باشد ارائه شود.
مواد و روشها
کشت سلول:
لاین سلولی VERO با منشا کلیه میمون سبز آفریقایی
که در تانک ازت آزمایشگاه ویروسشناسی موجود بود، مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا کرایو ویال پس از خروج از تانک ازت در 196- درجه سانتیگراد به سرعت در بن ماری 37 درجه سانتیگراد ذوب شد. پس از شستشو و حذف DMSO ، سلولها با لام نئوبار و محلول تریپانبلو شمارش گردید و درصد سلول زنده محاسبه شد. سپس سلولها در محیـط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ، آنتیبیوتیک پنیسیلین - استرپتومایسین تا غلظت نهایی 1% و سرم جنین گوساله 10% (Gibco) به فلاسک کشت cm3 25 منتقل شد و در انکوباتور حاوی رطوبت 95% در دمای 37 درجه سانتیگراد و CO2 5% قرار داده شد.
تیتراسیون ویروس:
ابتدا سلولهای Vero در پلیتهای 96 خانهای کشت داده شد. پس از کامل شدن 70% لایه سلولی ، استوک ویروس HSV-1 از فریزر منفی 70 درجه سانتیگراد ذوب شد و در هشت رقت از (8-10-1-10) تهیه گردید. برای رقتهای تهیه شده چهار چاهک کشت سلول، کشت سلول بدون ویروس به عنوان کنترل سلول و در چهار چاهک کشت سلول، از استوک ویروس بدون ایجاد رقت به عنوان کنترل ویروس ریخته شد. محیط کشت از چاهکهای پلیت خارج شد و سطح سلولها به منظور حذف سرم سه بار با μL 300 DMEM شسته شد. از هر رقت ویروس μL 100 در 4 چاهک ریخته شد. به مدت 1 ساعت ویروس در مجاورت سلول در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در طول این مدت، هر 10 دقیقه یک بار پلیت چرخانده شد تا ویروس در تماس با سلولها قرار گیرد. پس از یک ساعت، μL 300 محیط کشت با 2% سرم به چاهکهای پلیت اضافه شد. پلیت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. اثر سیتوپاتوژنیک Cytopathogenic Effects(CPE) به مدت 7 روز بررسی شد و تیتر TCID50 بر اساس روش Reed-Muench محاسبه شد.
پلاسمای تازه منجمد Fresh Frozen Plasma (FFP):
پنج نمونه پلاسمای تازه منجمد شده با گروه خونی O مثبت از سازمان انتقال خون، پایگاه وصال تهیه گردید. فرآوردهها تا زمان استفاده در فریزر 30- درجه سانتیگراد نگهداری شد. هنگام آزمایش فرآورده در 37 درجه سانتیگـراد ذوب گـردید و در حجمهـای کوچکتر (cc 10)
تقسیم شد.
متیلن بلو:
متیلن بلو از شرکتproduct number 1592700010) Merk) تهیه گردید. با توجه به جرم مولی متیلنبلو، cc 1 (g/moL 319/85) از محلول متیلن بلو با غلظت µM 500 تهیه و در ظرفی تاریک در 4 درجه سانتیگراد ذخیره گردید.
غیر فعالسازی ویروس HSV-1 با روش متیلنبلو و پرتودهی با نور مرئی:
به منظور استفاده از روش متیلنبلو و پرتودهی، از دستگاه پرتودهی با نور مرئی استفاده شد (12). غیر فعالسازی ویروس با نور دو طرفه طی دستورالعمل زیر انجام گرفت. ابتدا نمونه پلاسما از فریزر 30- درجه سانتیگراد خارج و در بن ماری با دمای 37 درجه سانتیگراد ذوب گردید.
کیسه حاوی50 میلیلیتر فرآورده پلاسمایی تا زمان استفاده در فریزر 30- درجه سانتیگراد نگهداری شد. هنگام آزمایش فرآورده در دمای 37 درجه سانتیگراد ذوب و در حجمهای کوچکتر (cc 10) تقسیم گردید. در زیر هود لامینار کلاس 2 با استفاده از رابط استریل و دستگاه اتصال (آلمان، CompoDock Fresenius) 50 میلیلیتر پلاسما از کیسه اصلی به 5 کیسه به حجم 10 میلیلیتری تقسیم و بدون باز کردن به کیسهها منتقل شد و با استفاده از ترازو توزین شد. کیسهها توسط یک دستگاه سیلر حرارتی (Fresenius، آلمان) از هم جدا شدند. سپس به کمک سرنگ استریل از طریق کورد به ازای هر 9 میلیلیتر پلاسما، 1 میلیلیتر از استوک ویروس و متیلن بلو با غلظت µM 1 به پلاسمای موجود در کیسه اضافه و با سیلر حرارتی سیل گردید به نحوی که ضخامت پلاسما در کیسه حدود یک میلیمتر شد.
سپس کیسه در محل تعبیه شده در دستگاه برای پرتودهی گذاشته شد. پرتودهی در زمان 10 دقیقه به صورت دو طرفه در nm 627 تحت تابش و shaking قرار گرفتند. به منظور تعیین کاهش تیتر ویروس از پلاسما پس از پرتودهی نمونهبرداری شد. پس از ضد عفونی کردن کیسه پس از تابش، زیر هود کلاس 2 بـا استفـاده از قیچی استریل کورد بریده شد و محتویات آن به آرامی به یک فالکون 15 میلیلیتـری منتقـل شـد.
سپس کیسـه خالـی شـده درون کیسه مخصوص اتوکلاو قرار داده شد. از هر نمونه سریال رقت 10 تایی تهیه گردید. از هر رقـت بـر روی پلیـت 96 خانـهای برده شد و CPE سلولها مورد بررسی قرار شد. به منظور بررسی اثر پرتودهی از نمونههای شاهد شامل پلاسمای فاقد ویروس بدون پرتودهی، پلاسما پرتو داده شده حاوی ویروس فاقد متیلن بلو، پلاسما همراه ویروس و متیلن بلو بدون پرتودهی استفاده گردید. تمامی آزمایشها 3 مرتبه تکرار گردید. تیتراسیون ویروس پس از غیر فعالسازی در پلیتهای 96 خانهای انجام شد و کاهش تیتر ویروس با روش Reed-Muench محاسبه گردید (14، 13).
Real Time RT-PCR
استخراج RNA :
استخراج اسید نوکلئیک، با استفاده از کیت استخراج RNA (شرکت Roche) و مطابق با دستور کار شرکت سازنده انجام شد. حدود 5 میلیون سلول در میلیلیتر در پلیتهای 24 چاهکی کشت داده شد و نمونهها قبل و بعد از پرتودهی به چاهکها اضافه شدند. پس ازCPE ، پلیتها در روز سوم فریز شدند. برای استخراج RNA ، محتویات هر چاهک در g 300 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و از سوسپانسیون آن جهت استخراج استفاده شد. جهت بررسی کیفیت RNA تخلیص شده، از دستگاه نانو دراپ استفاده شد. با استفاده از نسبت (OD 280/260)، خلوص RNA بیش از 9/1 مورد استفاده قرار گرفت . همچنین غلظت RNA در جذب نوری260 نانومتر، نیز محاسبه و در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
تهیه cDNA :
برای سنتز cDNA از کیت یکتا تجهیز آزما استفاده شد. ابتدا μL 5 از RNA استخراج شده از سلولهای آلوده به ویروس و کنترل سلول با استفاده از μL 1 از آغازگر راندوم هگزامر و الیگو dT به میکرو تیوپ اضافه و به محلول فوق μL 4 از DEPC Water افزوده شد. مخلوط فوق 5-3 ثانیه سانتریفیوژ و سپس به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد انکوبه شده و سپس ویال به Cool Box منتقل شد. سپس به محلول فوق μL 10 از RT premix افزوده شد. برای سنتز cDNA ، مخلوط فوق به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد؛ 60 دقیقه در دمای 47 درجه سانتیگراد و 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد در ترمال سایکلر قرار داده شد. سپس با کمک آغازگرهای اختصاصی ژنهای GAPDH و گلیکوپروتئین (GPD) D (با شماره دسترسی OZ349004) برای ویروس HSV ؛ بر روی cDNA ، Real Time RT-PCR انجام شد (15).
توالی آغازگری ژنهای مورد استفاده ؛ شامل ژنهای GAPDH و گلیکوپروتئین D (GPD) برای ویروس HSV میباشد:
HSV, Forward (5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGAC),
HSV, Reverse (5'-GGGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA) ,
GAPDH F, 5' CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT 3'
GAPDH R, 5' CCATGGTGTCTGAGCGATGT 3'.
برای انجام آزمایش مطابق دستور عمل کیت (Fast SYBR® Green Master Mix) شرکت رُوش عمل شد. محتوای هر یک از ویالهای Reaction Mix و آنزیم Reaction Mix به مدت 20 ثانیه سانتریفیوژ شد. بر اساس تعداد کلی رقتها؛ تعداد مشخص مورد نیاز کاپیلاری LightCycler در داخل Pre cooled lightCycler Centrifuge Adapters قرار داده شد. چیدمان کاپیلاریها با سه تکرار برای HSV و GAPDH در گروههای شاهد؛ ویروسی؛ و رقتهای از 1-10 تا 8-10 قرار داده شد. در داخل هر کاپیلاری LightCycler از پیش سرد شده µL 4 از Master Mix؛ µL 5 از cDNA؛ µL 5 آغازگر Forward و µL 1 از آغازگر Revers و µL 9 از ddH2o افزوده شد. پس از سانتریفیوژ کاپیلاری، داخل دستگاه lightCycler قرار داده شد. مطابق جدول به دستگاه lightCycler برنامه داده شد (جدول 1).
جهت بررسی کارآیی تکثیر ژنها با استفاده از رقتهای سریالی از cDNA ژنهای مورد مطالعه، رسم منحنی استاندارد انجام شد. برای این منظور، سری رقتهایی از cDNA های نمونه مورد مطالعه تهیه شد. واکنش q PCR انجام شد و بر اساس تجزیه و تحلیل رگرسیون slope و R2 برای هر دو ژن محاسبه گردید. برای تجزیه و تحلیل دادههای Real Time PCR از نرمافزار REST استفاده شد. محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل دادهها با نرمافزار SPSS-26 انجام شد و ضریب همبستگی پیرسون بین دو آزمایش محاسبه گردید.
یافتهها
برای تعیین تیتر ویروس، سلولهای vero با رقتهای 10 برابری از ویروس HSV-1 مجاور شدهاند. اثر CPE ، شامل گرد شدن سلولها در مقابل سلول شاهد بدون مجاورت با ویروس با استفاه از میکروسکوپ اینورت مشاهده گردید و تیتر ویروس /mL 50 TCID 107 محاسبه شد (شکل 1).
Real Time RT-PCR
استخراج RNA :
استخراج اسید نوکلئیک، با استفاده از کیت استخراج RNA (شرکت Roche) و مطابق با دستور کار شرکت سازنده انجام شد. حدود 5 میلیون سلول در میلیلیتر در پلیتهای 24 چاهکی کشت داده شد و نمونهها قبل و بعد از پرتودهی به چاهکها اضافه شدند. پس ازCPE ، پلیتها در روز سوم فریز شدند. برای استخراج RNA ، محتویات هر چاهک در g 300 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و از سوسپانسیون آن جهت استخراج استفاده شد. جهت بررسی کیفیت RNA تخلیص شده، از دستگاه نانو دراپ استفاده شد. با استفاده از نسبت (OD 280/260)، خلوص RNA بیش از 9/1 مورد استفاده قرار گرفت . همچنین غلظت RNA در جذب نوری260 نانومتر، نیز محاسبه و در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
تهیه cDNA :
برای سنتز cDNA از کیت یکتا تجهیز آزما استفاده شد. ابتدا μL 5 از RNA استخراج شده از سلولهای آلوده به ویروس و کنترل سلول با استفاده از μL 1 از آغازگر راندوم هگزامر و الیگو dT به میکرو تیوپ اضافه و به محلول فوق μL 4 از DEPC Water افزوده شد. مخلوط فوق 5-3 ثانیه سانتریفیوژ و سپس به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد انکوبه شده و سپس ویال به Cool Box منتقل شد. سپس به محلول فوق μL 10 از RT premix افزوده شد. برای سنتز cDNA ، مخلوط فوق به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد؛ 60 دقیقه در دمای 47 درجه سانتیگراد و 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد در ترمال سایکلر قرار داده شد. سپس با کمک آغازگرهای اختصاصی ژنهای GAPDH و گلیکوپروتئین (GPD) D (با شماره دسترسی OZ349004) برای ویروس HSV ؛ بر روی cDNA ، Real Time RT-PCR انجام شد (15).
توالی آغازگری ژنهای مورد استفاده ؛ شامل ژنهای GAPDH و گلیکوپروتئین D (GPD) برای ویروس HSV میباشد:
HSV, Forward (5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGAC),
HSV, Reverse (5'-GGGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA) ,
GAPDH F, 5' CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT 3'
GAPDH R, 5' CCATGGTGTCTGAGCGATGT 3'.
برای انجام آزمایش مطابق دستور عمل کیت (Fast SYBR® Green Master Mix) شرکت رُوش عمل شد. محتوای هر یک از ویالهای Reaction Mix و آنزیم Reaction Mix به مدت 20 ثانیه سانتریفیوژ شد. بر اساس تعداد کلی رقتها؛ تعداد مشخص مورد نیاز کاپیلاری LightCycler در داخل Pre cooled lightCycler Centrifuge Adapters قرار داده شد. چیدمان کاپیلاریها با سه تکرار برای HSV و GAPDH در گروههای شاهد؛ ویروسی؛ و رقتهای از 1-10 تا 8-10 قرار داده شد. در داخل هر کاپیلاری LightCycler از پیش سرد شده µL 4 از Master Mix؛ µL 5 از cDNA؛ µL 5 آغازگر Forward و µL 1 از آغازگر Revers و µL 9 از ddH2o افزوده شد. پس از سانتریفیوژ کاپیلاری، داخل دستگاه lightCycler قرار داده شد. مطابق جدول به دستگاه lightCycler برنامه داده شد (جدول 1).
جهت بررسی کارآیی تکثیر ژنها با استفاده از رقتهای سریالی از cDNA ژنهای مورد مطالعه، رسم منحنی استاندارد انجام شد. برای این منظور، سری رقتهایی از cDNA های نمونه مورد مطالعه تهیه شد. واکنش q PCR انجام شد و بر اساس تجزیه و تحلیل رگرسیون slope و R2 برای هر دو ژن محاسبه گردید. برای تجزیه و تحلیل دادههای Real Time PCR از نرمافزار REST استفاده شد. محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل دادهها با نرمافزار SPSS-26 انجام شد و ضریب همبستگی پیرسون بین دو آزمایش محاسبه گردید.
یافتهها
برای تعیین تیتر ویروس، سلولهای vero با رقتهای 10 برابری از ویروس HSV-1 مجاور شدهاند. اثر CPE ، شامل گرد شدن سلولها در مقابل سلول شاهد بدون مجاورت با ویروس با استفاه از میکروسکوپ اینورت مشاهده گردید و تیتر ویروس /mL 50 TCID 107 محاسبه شد (شکل 1).
برای بررسی تیتر عفونتزایی ویروس با روش Real Time PCR ، در روز سوم بعد از آلودگی به ویروس HSV-1 بدون رقت و با رقتهای 10 برابری قبل و بعد از غیر فعالسازی با روش متیلنبلو و نورمرئی، استخراج RNA و ساخت cDNA ، با کمک آغازگرهای اختصاصی ژنهای GAPDH و گلیکوپروتئین D (GPD) برای ویروسHSV Real Time RT-PCR انجام شد. براساسCt های به دست آمده از رقتهای مختلف، نمودار منحنی استاندارد برای هر دو ژن مورد بررسی قرار گرفت و بر اساس تجزیه و تحلیل رگرسیون نتایج برای slope و R2 برای هر دو ژن به ترتیب 15/3- و 2/3- و 99% و 5/99% گزارش شد (شکل 2). برای بررسی اختصاصی بودن آزمایش در واکنش PCR از analysis curve melt استفاده شد(شکل 3).
برای هر رقت ویروسی سه تکرار انجام شد و با استفاده از نرمافزار Rest بیان ژن گلیکوپروتئین Dدر مقابل ژن رفرانس محاسبه شد. میانگین چرخه آستانه ژن گلیکوپروتئین D در کشت سلول حاوی ویروس HSV-1 بدون غیر فعالسازی (/mL 50 TCID 107)، برابر 6/22 (6/22 =Ct) و میانگین چرخه آستانه ژن گلیکوپروتئین D در نمونه پلاسما پس از غیر فعالسازی با روش متیلنبلو و نور مرئی (/mL50 TCID 102)، برابر 28 (28=Ct) بود، که کاهش معنادار بیان ژن گلیکوپروتئین D (/mL50 TCID 102) مشاهده شد (001/0 p=). بر اساسCt های حاصله و نرمافزار Rest، بیان گلیکوپروتئین D در گروه کنترل (قبل از غیر فعالسازی) نسبت به گروه درمان (بعد از غیر فعالسازی)، 15 برابر کاهش یافته بود (001/0 = p ).
به دلیل استفاده از رنگ سایبرگرین در واکنش Real Time PCR و به علت اتصال غیر اختصاصی این رنگ به تمامی DNA های دورشتهای، برای اطمینان از اختصاصی بودن واکنش ازmelt curve analysis استفاده شد(شکل 3). واکنش Real Time-PCR ، تا /mL50 TCID 5 لوگ کاهش بیان گلیکوپروتئین D (GPD) را در محیط کشت سلولهای Vero پس از غیر فعالسازی ویروســی (/mL50 TCID 2-10) نشان داد.
همبستگی بین qRT-PCR و TCID50/mL :
ارتباط بین مقادیر Ct به دست آمده از هر رقت ویروسی با تیتر /mL50 TCID (در مقیاس) Log 10 بررسی شدند. مقادیر Ct مرتبط به qRT-PCR به دست آمده از غیر فعالسازی ویروس با تیتر /mL50 TCID محاسبه شده پس از غیر فعالسازی طبق روش Reed-Muench ، با یکدیگر همبستگی داشتند (98/0 r= ، 001/0 p<).
بحث
برای کاهش بیشتر عفونتهای منتقله از طریق خون (TTIs)، ویروسزدایی یک راهبرد است. برای بررسی مؤثر بودن روش غیر فعالسازی ویروسی، از اثر CPE روی سلولهای کشت شده استفاده میشوند. در روش سنتی برای تعیین کمیت تیتر عفونی، تیتراسیون نقطه پایانی و محاسبه دوز 50 درصد آلودهکننده کشت بافت در هر میلیلیتر (/mL50 TCID) استفاده میشود که به عنوان "بار ذرات عفونی ویروسی در واحد حجم که قادر به ایجاد اثر سیتوپاتیک در نیمی از کشتهای سلولی آلوده هستند" تعریف میشود (18-16). این فرآیند نیاز به دانش وسیع در زمینه تکثیر و نگهداری کشت سلولی دارد، پر زحمت است و به طور متوسط سه تا چهار روز طول میکشد تا تکمیل شود. علاوه بر این، عفونت سلولی باید در یک آزمایشگاه با سطح ایمنی زیستی مناسب انجام شود. با توجه به دلایل فوق، در شرایط خاص، تیتراسیون نقطه پایانی ممکن است به دلیل فقدان یکی از حداقل الزامات فوقالذکر، عملی نباشد. همچنین تنوع سیستم بیولوژیکی میتواند به راحتی بر نتایج تأثیر بگذارد و استانداردسازی این نوع کمیت نیز دشوار است. در واقع، تنوع بیولوژیکی به دلیل دشواری در کشت تعداد یکسانی از سلولها، افزودن مقدار یکسانی از ویروس و توقف همزمان عفونت، زیاد است. استراتژیهای تشخیص و تکثیر اسید نوکلئیک، یعنی RT-PCR ممکن است به تعیین کمی بار ویروسی یا نیمه کمی در نمونه مورد نظر به همان اندازه حساس منجر شود. روشهای نیمه کمی و کمی از نظر دقت نتیجهای که در پایان تجزیه و تحلیل به دست میآورند، متفاوت هستند. در روشهای نیمه کمی (qRT-PCR)، شدت فلورسانس ساطع شده پس از هر چرخه تکثیر ثبت میشود تا مقدار نسبی هدف تعیین شود و مقادیر آستانه چرخه (Ct) که به این ترتیب به دست میآیند، با مقدار بار ویروسی نسبت معکوس دارند، اما نمیتوان آنها را مستقیماً به معادلهای تعداد کپی ژنوم تبدیل کرد. تعیین کمی نسبی کپیهای هدف با استفاده از qRT-PCR مستلزم تولید یک منحنی استاندارد است.
از آن جایی که شناسایی CPE ناشی از ویروسها در کشت سلول طولانی مدت (7-5 روز) است و گاهی با تخریب سلول اشتباه میشود، بنابراین استفاده از روشهای دیگر مانند Real Time RT-PCR در مقایسه با تکثیر ویروس هرپس بر روی سلولهای VERO و مشاهدهCPE با میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه سلولهای VERO با میزان پرشدگی 90% (Confluency) در مجاورت رقتهای مختلف ویروس هرپس با 8 رقت لگاریتمی در نمونه پلاسما حاوی ویروس قبل و بعد از غیر فعالسازی با روش متیلنبلو و نور مرئی قرار گرفت و تیتر ویروس با روش مشاهده CPE و Real Time RT-PCR مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت.
در این مطالعه تیتر ویروس /mL50TCID 107 محاسبه شد. پس از غیر فعالسازی ویروس HSV-1 با روش متیلنبلو و نورمرئی، تیتراسیون مجدد ویروس قبل و بعد از غیر فعالسازی انجام شد. تیتر ویروسها پس از غیر فعالسازی /mL50TCID 102 محاسبه شد. کاهش لگاریتمی تیتر ویروس HSV-1؛ 5 لوگ گزارش شد. در واکنش RealTime-PCR بر روی رقتهای مختلف ویروس قبل و بعد از غیر فعالسازی در کشت سلول از /mL50TCID 102 کاهش معنادار در مقادیر Ct و بیان گلیکوپروتئین D (GPD) در محیط کشت سلولهای Vero پس از غیر فعالسازی ویروسی یعنی /mL50 TCID 5 لوگ را نشان دادکه با نتایج روش 50 TCID مطابقت داشت. تاثیر غیر فعالسازی ویروس HSV-1 با روش متیلنبلو و نور مرئی با مطالعه الیکایی و همکاران مطابقت داشت و بیشترین کاهش لگاریتمی برای HSV به مقدار 28/6 ، لوگ با زمان پرتودهی ۴۵ دقیقه بود (12).
همچنین در این مطالعه بین مقادیر Ct مرتبط به qRT-PCR به دست آمده از غیر فعالسازی ویروس با تیتر /mL50 TCID محاسبه شده پس از غیر فعالسازی ویروس با یکدیگر همبستگی داشتند که با مطالعهای که بین دو روش qRT-PCR برای تعیین تعداد دقیق کپیهای RNA ویروس کرونا سندرم حاد تنفسی ۲ (SARS-CoV-2) و تیتراسیون ویروس کرونا عفونی روی کشتهای سلولی انجام شده بود، موافقت داشت که نشان داده بودند بین بار نسخههای RNA ( Ct) ویروسی و تیتر عفونی ویروس با دوز آلودهکننده کشت بافت در هر میلیلیتر (/mL50 TCID)، همبستگی وجود داشته است (11). از طرف دیگر ، در مطالعه لوگان و همکاران نشان داده شد بین میزان گرانولوسیتی سلول که با روش فلوسایتومتری تعیین میشود با تیتر لگاریتمی ویروس عفونی ارتباط معناداری وجود دارد و شناسایی بدون فلورسنت غلظت ویروس عفونی از طریق فلوسایتومتری میتواند ابزار سریع و دقیق برای تعیین تیتر ویروس در نظر گرفته شود (19).
در مطالعـه گوستافسـون و همکاران بــرای ارزیابی تیتر
ویروس هرپس انسانی ۶ (HHV-6)، با استفاده از روشهای q-PCR و 50 TCID، به خوبی بیان پروتئینهای ویروسی با روش50 TCID همبستگی داشت و از ویژگی بالایی برای تعیین دوز عفونی برخوردار بود (10).
نتیجهگیری
دادههای ما همبستگی قوی بین تیتر ویروس (/mL50 TCID) با مقادیر Ct (بیان گلیکوپروتئینD) در روش qRT-PCR نشان داد. /mL50 TCID به دلیل تنوع استفاده از سیستم بیولوژیکی میتواند به راحتی بر نتایج تأثیر بگذارد و استانداردسازی این نوع کمیت را دشوار کند. روشهای مولکولی مبتنی بر بیان گلیکوپروتئین D (mRNA gD) میتواند به عنوان یک هدف برای تشخیص عفونت فعال HSV مورد استفاده قرار گیرد.
حمایت مالی
این پروژه توسط مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه
عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین مالی شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه به تایید شورای تجصیلات تکمیلی مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی انتقال خون ایران رسیده است.
عدم تعارض منافع
هیچگونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود ندارد.
نقش نویسندگان
لیلا موسوی دهاقانی: نگارش پایان نامه و انجام آزمایشها زهرا پاز: آموزش روشها و کمک در اجرای آن
دکتر زهره شریفی: طراحی مطـالعـه، نظارت بر اجرای پایان نامه و نگارش مقاله
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل پایاننامه کارشناسی ارشد زیست فناوری مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی انتقال خون ایران است. بدیـنوسیلـه از ایـن مـؤسسه به خاطر حمایتهای مالی آن تشکر میشود.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
ويروس شناسي
فهرست منابع
1. Yao C-Y, Fu W-L. Biosensors for hepatitis B virus detection. World J Gastroenterol. 2014; 20(35): 12485-92. [DOI:10.3748/wjg.v20.i35.12485] [PMID] []
2. Wang YF, Pang DW, Zhang ZL, Zheng HZ, Cao JP, Shen JT. Visual gene diagnosis of HBV and HCV based on nanoparticle probe amplification and silver staining enhancement. J Med virol. 2003; 70(2): 205-11. [DOI:10.1002/jmv.10379] [PMID]
3. Quint WG, Heijtink RA, Schirm J, Gerlich WH, Niesters HG. Reliability of methods for hepatitis B virus DNA detection. J Cli Microbiol. 1995; 33(1): 225-8. [DOI:10.1128/jcm.33.1.225-228.1995] [PMID] []
4. Elikaei A, Hosseini SM, Sharifi Z, Latifi H, Nikbakht H, Mirshafiee H, et al. Methylene blue based device for pathogen reduction in human plasma. Iran J Ped Hematol Oncol. 2013; 3(3): 97-102.
5. Ryan KJ, Ray CG. Medical microbiology: An introduction to infectious diseases: McGraw-Hill; Medical Publishing Division.2004.4th edition.
6. Mettenleiter TC, Klupp BG, Granzow H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Curr Opin Microbiol. 2006; 9(4): 423-9. [DOI:10.1016/j.mib.2006.06.013] [PMID]
7. McGeoch DJ, Rixon FJ, Davison AJ. Topics in herpesvirus genomics and evolution. Virus research. 2006; 117(1): 90-104. [DOI:10.1016/j.virusres.2006.01.002] [PMID]
8. Clarke RW. Forces and Structures of the Herpes Simplex Virus (HSV) Entry Mechanism. ACS Infectious Diseases. 2015; 1(9): 403-15. [DOI:10.1021/acsinfecdis.5b00059] [PMID]
9. Akhtar J, Shukla D. Viral entry mechanisms: cellular and viral mediators of herpes simplex virus entry. FEBS J. 2009; 276(24): 7228-36. [DOI:10.1111/j.1742-4658.2009.07402.x] [PMID] []
10. Gustafsson RK Engdahl E, Fogdell-Hahn A. Development and validation of aQ-PCR based TCID50 method for human herpesvirus 6. Virol J. 2012; 9: 311. [DOI:10.1186/1743-422X-9-311] [PMID] []
11. Brandolini M, Taddei F , Marino MM , Grumiro L , Scalcione A , Turba ME, et al. Correlating qRT-PCR, dPCR and Viral Titration for the Identification and Quantification of SARS-CoV-2: A New Approach for Infection Management. Viruses. 2021 ; 13(6):1022. [DOI:10.3390/v13061022] [PMID] []
12. Elikaei A, Sharifi Z, Hosseini SM, Latifi H, Musavi Hosseini MK. Inactivation of model viruses suspended in fresh frozen plasma using novel methylene blue based device. Iran J Microbiol. 2014; 6: 41-5.
13. Reed LJ, Muench H. A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints. Am J Epidemiol. 1938: 27, 493-7. [DOI:10.1093/oxfordjournals.aje.a118408] []
14. Lei C ,Yang J , Hu J, Sun X. On the Calculation of TCID50 for Quantitation of Virus Infectivity. Virol Sin. 2021: 36(1), 141- 4. [DOI:10.1007/s12250-020-00230-5] [PMID] []
15. Zamanian M, Sharifi Z, Noormohammadi Z, Akbarzadeh T, Bineshian F. Antiviral effect of Artemisia aucheri aqueous extract on UL46 and US6 genes of HSV-1. Antivir Ther. 2021; 26(1-2): 43-8. [DOI:10.1177/13596535211039907] [PMID]
16. Stelzer-Braid S, Walker GJ, Aggarwal A, Isaacs SR, Yeang M, Naing Z, et al. Virus isolation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) for diagnostic and research purposes. Pathology .2020; 52: 760-3. [DOI:10.1016/j.pathol.2020.09.012] [PMID] []
17. Lei C, Yang J, Hu J, Sun X. On the Calculation of TCID50 for Quantitation of Virus Infectivity. Virol Sin. 2021; 36: 141-4. [DOI:10.1007/s12250-020-00230-5] [PMID] []
18. Amanat F, White KM, Miorin L, Strohmeier Sh, McMahon M, Meade P, et al. An In Vitro Microneutralization Assay for SARS-CoV-2 Serology and Drug Screening. Curr Protoc Microbiol. 2020; 58(10): e108. [DOI:10.1002/cpmc.108] [PMID] []
19. Logan M, Manalil J, Notte Ch, Kearse C, George S, Zeiser A, et al. A flow cytometric granularity assay for the quantification of infectious virus. Vaccine . 2019; 37(47): 7090- 9. [DOI:10.1016/j.vaccine.2019.02.059] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
