Journal of Iranian Blood Transfusion

fa غیرفعال‌سازی ۱-HSV با متیلن بلو و نور مرئی: همبستگی کاهش TCID50 با بیان RNA گلیکوپروتئین D با روش RT-qPCR Inactivation of HSV-1 Using Methylene Blue and Visible Light: Correlation of TCID50 Reduction with Glycoprotein D RNA Expression by RT-qPCR ويروس شناسي Virology پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده سابقه و هدف  علی‌رغم پیشرفت‌های قابل توجه در سلامت خون، خطر انتقال عوامل عفونی هم‌چنان یک چالش برای مراکز انتقال خون است. برای افزایش سلامت خون، روش‌هایی برای حذف یا غیرفعال کردن ویروس‌ها توسعه یافته است. این مطالعه بر غیرفعال‌سازی  ویروس هرپس سیمپلکس نوع ۱ ( HSV-1)با استفاده از متیلن‌بلو و نور مرئی در پلاسما تمرکز دارد و اثربخشی غیر فعال‌سازی را با روش‌های qRT-PCR و TCID50 مقایسه می‌کند. مواد و روش‌ها در یک مطالعه تجربی سلول‌ Vero در محیط DMEM با 1% پنی‌سیلین-استرپتومایسین و 10% سرم جنین گوساله در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با 5% CO2 کشت داده شدند. تیتر ویروس با آلوده‌سازی این سلول‌ها تعیین شد. متعاقب آن، ذخیره ویروس در حجم 0/1 پلاسما به آن اضافه شد. ویروس به پنج واحد پلاسمای جداگانه که از اهداکنندگان خون مختلف به دست آمده بود، اضافه شد. پنج نمونه پلاسمای حاوی ویروس با متیلن بلو ۱ میکرومولار تیمار شدند و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در طول موج ۶۲۷ نانومتر تحت پرتودهی قرار گرفتند.  تیتراسیون ویروس در پلیت‌های ۹۶ چاهکی انجام شد و تیتر ویروس قبل و بعد از پرتودهی از طریق رقت‌های سریالی 10 برابری با روش  TCID50اندازه‌گیری شد. گروه کنترل شامل پلاسمای بدون ویروس، پلاسمای حاوی ویروس پرتودهی شده بدون متیلن‌بلو و پلاسمای حاوی متیلن‌بلو بدون پرتودهی بود. پس از استخراج RNA ازرقت‌ها و ساخت cDNA ، بیان گلیکوپروتئین D با qRT-PCR اندازه‌گیری شد. تمامی آزمایش‌ها 3 مرتبه تکرار گردید. در نهایت محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار 26 SPSS انجام شد و ضریب همبستگی پیرسون بین دو آزمایش محاسبه گردید.  یافته‌ها قبل از غیر فعال‌سازی، تیتر ویروس با مشاهده اثرات سیتوپاتیک در سلول‌های Vero به صورت TCID50/mL  107 تعیین شد. پس از غیرفعال‌سازی با متیلن بلو و پرتودهی، تیتر به TCID50/mL 102 کاهش یافت که نشان‌دهنده کاهش ۵ لگاریتمی است. میانگین چرخه آستانه (Ct) ژن گلیکوپروتئین D در کشت‌های سلولی حاوی HSV-1 غیرفعال نشده (TCID50/mL 107(، 22/6 (22/6 Ct=) بود، در حالی که میانگین Ct ژن گلیکوپروتئین D در نمونه‌های پلاسما پس از غیرفعال شدن توسط متیلن بلو و نور مرئی (TCID50/mL 102)، 28 (28 Ct=)، بود . این نشان دهنده کاهش 15 برابری در بیان گلیکوپروتئین D است (0.001 =p). نتیجه گیری             بین مقادیر لگاریتمی TCID50 و مقادیر Ct به دست آمده از روش qRT-PCR همبستگی مشاهده شد. روش‌های مولکولی مبتنی بر بیان گلیکوپروتئین (gD mRNA) D ممکن است به عنوان یک رویکرد مفید برای تشخیص عفونت فعال HSV به کار گرفته شوند.</div> A B S T R A C T Background and Objectives Despite Significant advances in blood safety, the risk of infectious agent transmission remains a challenge for blood transfusion centers. To enhance blood safety, methods for removing or inactivating viruses have been developed. This study focuses on the inactivation of the herpes simplex virus type 1 (HSV-1) using methylene blue and visible light in plasma and compares the efficacy of the qRT-PCR and TCID50 methods. Materials and Methods In a experimental study, vero cells were cultured in DMEM with 1% penicillin-streptomycin and 10% fetal calf serum at 37°C with 5% CO2. The virus thiter was determinded by infectivy these cells. Subsequently, the virus stock was added to  plasma at 0.1 volume. The virus was added to five individual plasma units obtained from different blood donors. Five plasma samples containing virus were treated with 1 μM methylene blue and then irradiated for 10 min at 627 nm. Virus titration was performed in 96-well plates, and virus titer was measured before and after irradiation through 10-fold serial dilutions using the TCID50 method. The control group included plasma without virus, plasma containing virus irradiated without methylene blue, and plasma containing methylene blue without irradiation. After RNA extraction from the dilutions and cDNA construction, glycoprotein D expression was quantified by qRT-PCR. All experiments were repeated three times. Statistical analyses were performed using SPSS-26 and the Pearson correlation coefficient between the two tests was calculated. Results Before inactivation, the virus titer was determined by observing cytopathic effects in Vero cells as 107TCID50/mL. After inactivation with methylene blue and irradiation, the titer decreased to 102 TCID50/mL, representing a 5-log reduction. The mean threshold cycle (Ct) of the glycoprotein D gene in cell cultures containing non-inactivated HSV-1 (107TCID50/mL) was 22.6 (Ct = 22.6) whereas the mean Ct of the glycoprotein D gene in plasma samples after inactivation by methylene blue and visible light (102 TCID50/mL) was 28 (Ct = 28). This indicates a 15-fold decrease in glycoprotein D expression (p= 0.001). Conclusions  A correlation was observed between the logarithmic values of TCID50 and Ct values obtained by qRT-PCR assay. Molecular methods based on glycoprotein D (gD mRNA) expression may be served as a usefull approach for detecting of active HSV infection. Key words: Virus  Inactivation, Herpes Simplex Virus Infection, methylene blue, visible light, RT-PCR   غیرفعال‌سازی ویروس , ویروس هرپس سیمپلکس, متیلن بلو, نور مرئی, RT-PCR Virus Inactivation, Herpes Simplex Virus Infection, methylene blue, visible light, RT-PCR 12 21 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-53-11&slc_lang=fa&sid=1 Leila Mousavi Dehaqani لیلا موسوی دهاقانی 9100319475328460027422 9100319475328460027422 No مرکز تحقیقات فرآورده‌های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Zohreh Sharifi زهره شریفی z.sharifi@tmi.ac.ir 9100319475328460027423 9100319475328460027423 Yes استاد مرکز تحقیقات فرآورده‌های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون