جلد 22، شماره 4 - ( زمستان 1404 )
جلد 22 شماره 4 صفحات 276-265 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.TMI.RCE.1398.014
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Roshanzamir F, Amini-kafiabad S, Mohajer Ansari J, Nikougoftar Zarif M, Arabkhazaeli A, Mohammadipour M. A Comparative Study of Quality Metrics in Leukoreduced Red Blood Cell Units Following Filtration with Two Distinct Inline Filter Blood Bags. bloodj 2025; 22 (4) :265-276
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1605-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1605-fa.html
روشن ضمیر فاطمه، امینی کافیآباد* صدیقه، مهاجر انصاری جواد، نیکوگفتار ظریف مهین، عرب خزائلی علی، محمدیپور مهشید. مقایسه شاخصهای کیفی واحدهای گلبولهای قرمز کم لکوسیت پس از فیلتراسیون با دو نوع فیلتر. فصلنامه پژوهشی خون. 1404; 22 (4) :265-276
فاطمه روشن ضمیر* 
، صدیقه امینی کافیآباد* ، جواد مهاجر انصاری ، مهین نیکوگفتار ظریف ، علی عرب خزائلی ، مهشید محمدیپور
، صدیقه امینی کافیآباد* ، جواد مهاجر انصاری ، مهین نیکوگفتار ظریف ، علی عرب خزائلی ، مهشید محمدیپور
مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی پژوهشکده سلامت هرمزگان و مرکز تحقیقات غدد و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان
واژههای کلیدی: تزریق گلبولهای قرمز، آسیبهای دوران نگهداری، فرآورده گلبول قرمز، فیلتراسیون لکوسیتی، شاخصهای کیفی، میکرووزیکول
متن کامل [PDF 927 kb]
(228 دریافت)
| چکیده (HTML) (906 مشاهده)
بحث
علیرغم دستاوردهای بسیار در زمینه بهبود شرایط نـگهداری فرآوردههای گلبول قرمز و همچنین تـدوین و به کارگیری استانداردهای مختلف، مسأله کیفیت واحدهای RBCs که تحت شرایط مختلف و روشهای متفاوت تهیـه میشوند و همین طور پیامدهـای بالینی ناخواسته در بیمارانی که این فرآوردهها را دریافت میکنند، همچنان یک موضوع چالش برانگیز و مورد بحـث در طب انتقال خون است. مطالعههای مختلف نشان دادهاند که علاوه بر طول عمر و شرایط نگهداری فرآوردهها، روشهای مختلف تهیه و فرآوری نیز میتوانـد بـه عنوان یکی از عوامل مؤثر در کیفیت محصولات مطرح شود (22-19). بر همین اساس با طراحی این مطالعه، تلاش شد که با حذف برخی متغیرهای فردی و مداخلهگر و همسانسازی شرایط فرآوری، تأثیر روشهای مختلف فیلتراسیون لکوسیتی شامل RCF و WBF بر کیفیت فرآوردههای RBCs مورد بررسی قرار گیرد. همان طور که مطالعههای مختلف نشان دادهاند، مصرف گلوکز درون کیسهها بـه مرور زمان باعث کاهش انرژی (ATP) سلولها شده که با مختل کردن پمپ سدیم/ پتاسیم، باعث ورود آب به سلولها و تورم آنها میشود (16). در نتیجـه MCV و هماتوکریـت هم به مرور زمان افزایش مییابد. اریتروسیتها چون فاقد هسته هستند، توانایی مقابله با استرسهای اکسیداتیو و شرایط هیپوکسی را نداشته و دچار تغییرات ساختاری در غشا و اسکلت سلولی میشوند که در نتیجه آن، توزیع نامتقارن فسفولیپیدها در غشا به هم ریخته و فسفاتیدیل سرین (PS) در سطح خـارجی غشا تجمع میکند. همولیز سلولها و تولید میکرووزیکولها از پیامدهای اختلال در انسجـام غشای سلولها است (25-23). با توجه به افزایش میکرووزیکولها در فرآوردهها و تأثیری که بر سیستم انعقاد و افزایش خطر ترومبوز در بیماران دارنـد، بررسی کیفیت فرآوردهها بسیار حائز اهمیت است. اختلال در انسجام غشا باعث افزایش حساسیت سلولها به شرایط هیپوتونیک و کاهش مقاومت اسمزی آنها میشود. در نتیجه به مرور زمان OFT افزایش مییابد که نشاندهنده آسیب غشای اریتروسیتها است. از طرفی به دلیل وزیکولاسیون غشا، میکرووزیکولها دائماً طی دوران نگهداری فرآوردهها افزایش مییابند (26-24). با توجـه بـه این که میکرووزیکولها فعالیت پیش انعقادی دارند، ممکن است در ایجاد عوارض ترومبوتیک ناشی از تزریق خون نقش داشته باشند. تجمــع
PS در سطح خارجی غشای آنها، با ایجاد بستری با بار منفی جهت برهمکنش فاکتورهای انعقادی، بـاعث افزایش 1000 برابری سرعت تشکیل کمپلکسهای فعال برای تولید ترومبین میشود (28-25، 23). کمپلکسهای آنزیمی تناز و پروترومبیناز بـه غشای فسفولیپیدی RMVs متصل شده و باعث افزایش فعالیت فاکتورهایIX ، VIII و XI و در نتیجـه افزایش تولید ترومبین میشوند (29). در کم خونیهای همولیتیک مزمن ماننـد تالاسمی، PNH ، کم خونی داسی شکل و کم خونیهای اتوایمیون، افزایش سطح RMVs بـا حالت بیش انعقادی ارتباط دارنـد. در برخی مطالعهها ارتباط بین غلظت RMVs و افزایش خطر وقوع ترومبوزهای وریدی و شریانی به دنبال تزریق خون، به ویژه در بیماران سرطانی، بسیار مورد توجـه قرار گرفته است (29، 22). هموگلوبین آزاد و هموگلوبین کپسوله شده درون میکرووزیکولها که در طول زمان درون کیسهها افزایش مییابند، پس از تزریق به بدن بیمار، باعث پاکسازی اکسید نیتریک از خون و اختلال در عملکرد سلولهای انـدوتلیال میشود. نتایج آزمایش برادفورد در مطالعه حاضر نشان داد که غلظت میکرووزیکولها در فرآوردههای حاصل از روش WBF بیشتر بوده و این اختلاف در روز 42 بیشترین سطح معناداری را داشته است. آلمیزاک و همکاران در سال 2018 در مطالعهای مشابه، با استفاده از روشهای مختلف نشان دادند که غلظت میکرووزیکولها بـه ویژه در روزهای پایانی ذخیرهسازی، در فرآوردهها با روشهای مختـلف فیلتراسیون تفاوت معنادار دارد (18). همچنین گامونت و همکاران در سال 2020 نشان دادند که جمعیت میکرووزیکولها در فرآوردههای حاصل از روش WBF بیشتر از سایر روشهای فیلتراسیون بوده است (25). از طرفی بیکالهو و همکـاران در مطالعه خود، تفاوت معناداری بین فرآوردههای فیلتر شده با کیسههای مختلف گزارش نکردند (20). آنها در مقایسه با مطالعه آلمیزاک عنوان کردند که میانگین انـدازه میکرووزیکولها در فرآوردههای WBF کمتر از روش RCF بوده و چون این ذرات با فلوسیتومتری قابل شناسایی نیستند، باید با روشهای دیگری ماهیت آنها معلوم شود که آیا مشتق از گلبولهای قرمز هستند یا طبق نظر دیگر محققان مشتق از پلاکتها و لکوسیتها بوده و بنابراین تعداد آنها در فرآوردههای WBF بیشتر است. از تفاوتهای این مطالعه با سایر مطالعههای مشابه، همسانسازی شرایط برای فیلتراسیون فرآوردهها بوده است. در مطالعـه حاضر تلاش شد که تأثیر متغیرهای فردی اهداکنندگان تا حد امکان حذف شود و به طور دقیقتری به تأثیر روشهای فیلتراسیون پرداخته شود.
همولیز یک فاکتور بسیار مهم در ارزیابی کیفیت فرآوردههای RBCs است. به علاوه، همانند سایر مطالعهها، نتایج این مطالعه هم نشان داد که به مرور زمان با افزایش همولیز و میکرووزیکولهـا، میزان لاکتات و LDH نیز درون کیسهها افزایش یافته که باعث افت pH میگردد. نتایج این مطالعه مانند برخی دیگر مطالعـهها نشان داد که اختلاف میانگین شاخصهای غلظت میکرووزیکولها، سطح هموگلوبیـن آزاد، افزایش LDH ، کاهش pH و گلوکز و همچنین نتایـج OFT در نقطه پایان همولیز، بین فرآوردههای RBCs حاصل از روشهای مختلف لکوفیلتراسیون (RCF و WBF) در برخی بـازههای نمونهگیری، از نظر آماری معنادار بود (31، 30، 28). برخی مطالعهها هم مانند بیکالهو و همکاران اختلاف معناداری بین روشهای مختلف گزارش نـکردند (20). البته در هیچ یک از مطالعههای قبلی، بـه منظور حذف تأثیر متغیرهای زمینهای و مداخلهگیر، همسانسازی شرایط نگهداری و فرآوری فرآوردهها رعایت نشده است. سایر شاخصهای اریتروسیتی مانند MCH ، MCHC و RDW اختلاف میانگین معناداری بین فرآوردههای مورد مطالعه در هیچ یـک از بازههای مورد بررسی نداشتند.
نتیجهگیری
با توجه به این که در این مطالعه، بـا همسانسازی شرایط تا حد ممکن متغیرهای فردی حذف شدند، به نظر میرسد فرآوردههای RBC حاصل از روش WBF کیفیت متفاوتی نسبت بـه فرآوردههای حاصل از روش RCF داشته باشند. اریتروسیتها حساسیت بیشتری نسبت به شرایط درون کیسهها و نگهداری در بانک خون دارند. اما مهمترین نکتهای کـه باید به آن دقت کنیم، این است که علیرغم تفاوتهای مشاهده شده در میانگین پارامترهای مختلف بین فرآوردههای مورد بررسی، بیشترین سطح معناداری مربوط به غلظت میکرووزیکولها و سایر شاخصها، مربوط بـه آخرین روز نمونهگیری (روز 42)، یعنی آخرین روز نگهداری فرآوردهها بوده است. همچنین سطح هموگلوبین آزاد درون کیسهها، علیرغم تفاوتهای مشاهده شده، همگی در دامنه استاندارد تعریف شده بود و در هیچ یک از فرآوردهها از میزان تعریف شده استاندارد تجـاوز نکرد.
بنابراین میتوان گفت همه فرآوردهها در طول دوران نگهداری، کیفیت قابـل قبولی جهت تزریق را داشتهاند. با توجه به محدودیت تعداد نمونهها در این مطالعه و همچنین تفاوتهای مشاهده شده در مطالعههای مختلف، پیشنهاد میشود که مطالعه فوق در مقیاس بزرگتر ادامه یـافته و به منظور بررسی دقیقتر تأثیر این فرآیندها در بیماران، مطالعههای بـالینی علاوه بر آزمایشگاهی طراحی شوند.
حمایت مالی
این پژوهش بـا حمایت مالی و معنوی مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون انجام شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مقاله حاصل پایاننامه مقطع دکتری تخصصی (PhD) است کـه با کد اخلاق IR.TMI.RCE.1398.014 در کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون به ثبت رسیده است. اصل رازداری و محرمانگی اطلاعات رعایت شده است.
عدم تعارض منافع
نویسندگان اذعان میدارند که هیچ گونه تضاد منافعی وجود ندارد.
نقش نویسندگان
دکتر فاطمه روشن ضمیر: طراحی مطالعه، انجام مراحل پژوهش، جمعآوری دادهها، تجزیـه و تحلیل دادهها، تهیه گزارش، نگارش مقاله
دکتر صدیقه امینی کافیآباد: طراحی مطالعه، هدایـت و راهنمایی پژوهش
دکتر جواد مهاجر انصاری: تجزیه و تحلیل دادهها، نگارش و ویرایش مقاله
دکتر مهین نیکوگفتار ظریف: مشاور علمی انجام پژوهش
دکتر علی عرب خزائلی: مشاور آماری پژوهش
دکتر مهشید محمدیپور: ویراش مقاله
تشکر و قدردانی
ما صمیمانه از تلاشها و حمایتهای آقای دکتر دیهیم، خانم گلزاده، کارشناسان محترم آزمایشگاههای انعقاد و کنترل کیفی سازمان انتقال خون و همچنین مرکز نوآوری سازمان انتقال خون تشکر و قدردانی میکنیم.
متن کامل: (182 مشاهده)
مقایسه شاخصهای کیفی واحدهای گلبولهای قرمز کم لکوسیت پس از فیلتراسیون
با دو نوع فیلتر
فاطمه روشن ضمیر1 ، صدیقه امینی کافی آباد2 ، جواد مهاجر انصاری3 ، مهین نیکوگفتار ظریف4 ،
علی عرب خزائلی5 ، مهشید محمدی پور6
1- مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی پژوهشکده سلامت هرمزگان و مرکز تحقیقات غدد و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران
2- متخصص آسیبشناسی ـ استاد مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- مرکز تحقیقات غدد و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران
4- دکترای تخصصی خونشناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ دستیار ارشد مرکز هماتولوژی و پزشکی بازساختی ـ مؤسسه کارولینسکا ـ گروه پزشکی ـ بیمارستان دانشگاه کارولینسکا هادینگ ـ استکهلم ـ سوئد
5- PhD آمار و اپیدمیولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
6- PhD ژنتیک مولکولی ـ استادیار مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
با دو نوع فیلتر
1- مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی پژوهشکده سلامت هرمزگان و مرکز تحقیقات غدد و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران
2- متخصص آسیبشناسی ـ استاد مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- مرکز تحقیقات غدد و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران
4- دکترای تخصصی خونشناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ دستیار ارشد مرکز هماتولوژی و پزشکی بازساختی ـ مؤسسه کارولینسکا ـ گروه پزشکی ـ بیمارستان دانشگاه کارولینسکا هادینگ ـ استکهلم ـ سوئد
5- PhD آمار و اپیدمیولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
6- PhD ژنتیک مولکولی ـ استادیار مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
  http://dx.doi.org/10.61186/bloodj.22.1.11 Citation: Roshanzamir F, Amini-kafiabad S, Mohajer Ansari J, Nikougoftar Zarif M, Arabkhazaeli A, Mohammadipour M. A Comparative Study of Quality Metrics in Leukoreduced Red Blood Cell Units Following Filtration with Two Distinct Inline Filter Blood Bags. J Iran Blood Transfus. 2025: 22 (4): 265-276 نویسنده مسئول: دکتر فاطمه روشن ضمیر. استادیار مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی پژوهشکده سلامت هرمزگان و مرکز تحقیقات غدد و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران کد پستی: 79166-13885 E-mail: fatemelab@gmail.com
نویسنده مسئول: دکتر صدیقه امینی کافیآباد. استاد مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران صندوق پستی: 1157-14665 E-mail: s.amini@
کد اخلاق: IR.TMI.RCE.1398.014. |
چکیده سابقه و هدف سالانه 85 تا 90 میلیون فرآورده گلبول قرمز در دنیا تزریق میشود. از این میان، استفاده از فرآوردههای گلبولهای قرمز با کاهش لکوسیت، به ویژه در بیمارانی که نیاز به تزریق خون بـه صورت مزمن دارند بسیار حائز اهمیت است. فیلتراسیون لکوسیتی با دو روش کلی فیلتراسیون خون کامل و فیلتراسیون گلبولهای قرمز انجام میشود. بـا توجه به تأثیر احتمالی روشهای مختلف فرآوری فرآوردههای گلبولهای قرمز، این مطالعه با هدف تأثیر فیلترهای مختلف لکوسیتی (خون کامل در مقابل گلبولهای قرمز) بر شاخصهای کیفی فرآوردهها طراحی شد. در این مطالعه تلاش شده است که با همسانسازی شرایط، تا حدودی متغیرهای زمینهای حذف گردد و تمرکز بر تأثیر روش فیلتراسیون باشد. مواد و روشها در یک مطالعه تجربی، 12 واحد خون کامل به دو قسمت مساوی تقسیم شدند و هر قسمت توسط یکی از کیسههای لکوفیلتراسیون خون کامل (WBF) یا گلبولهای قرمز (RCF) فیلتر شدند. سپس در روزهای 2، 14، 28 و 42، برای آزمایشهای غلظت میکرووزیکولها، شاخصهای اریتروسیتی، هموگلوبین آزاد، شکنندگی اسمزی، pH و غلظت لاکتات دهیدروژناز بررسی شدند. دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS و آزمونهای t دو گروه مستقل و ANOVA با اندازههای تکراری تجزیه و تحلیل شدند. یافتهها در طی زمان افزایش غلظت میکرووزیکولها، LDH، شکنندگی اسمزی، هموگلوبین آزاد، MCV و هماتوکریت و کاهش pH در فرآوردهها معنادار بود (05/0 p<). تفاوت بین گروهها، در برخی بـازههای نمونهگیری، برای آزمایشهای غلظت میکرووزیکولها، مقادیر pH، LDH ، هموگلوبین آزاد و شکنندگی اسمزی از نظر آماری معنادار بود (05/0 p<). نتیجه گیری با توجه به همسانسازی شرایط و حذف نسبی متغیرهای فردی، به نظر میرسد فرآوردههای فیلتر شده با روش WBF کیفیت متفاوتی نسبت به فرآوردههای با روش RCF دارند. اما علیرغم تفاوتهای مشاهده شده، بیشترین سطح معناداری مربوط به شاخصها، در روز آخر نگهداری فرآورده بوده است. بنابراین میتوان گفت که هر دو گروه فرآوردهها، کیفیت قابل قبولی جهت تزریق را داشتهاند. کلمات کلیدی: تزریق گلبولهای قرمز، آسیبهای دوران نگهداری، فرآورده گلبول قرمز، فیلتراسیون لکوسیتی، شاخصهای کیفی، میکرووزیکول |
مقدمه
علیرغم پیشرفتهای چشمگیر در حوزه درمان، تزریق خون و فرآوردههای آن همچنان یکی از درمانهای پر استفاده در جهان است (2، 1). بر اساس گزارشهای سازمان بهداشت جهانی (World Health Organization: WHO)، سالانه حدود 118 میلیون واحد خون کامل اهدا میشود (حدود 10 واحد اهدا در هر 1000 نفر) که بیش از 85% آن به فرآوردههای مختلف تفکیک مـیگردد. تخمین زده میشود کـه سالانه حدود 90-85 میلیون واحد فرآورده گلبول قرمز (Red Blood Cell Concentrates: RBCs) به بیماران مختلف تزریق میشود که رقم قابل تأملی است (4، 3). بنابراین نظارت پیوسته بر تمام مراحـل تهیه، فرآوری، نگهداری و تـزریق، به منظور حفظ کیفیت خون و فرآوردههای آن اهمیت بـه سزایی دارد. در دوران نگهداری فرآوردههای RBCs در دمای °C 2-6، تغییرات مختلفی مانـند افزایش هموگلوبین آزاد، لاکتات، پتاسیم و کاهش pH، گلوکز، 2,3DPG و ATP رخ میدهد کـه در مجموع آسیبهای دوران نگهداری (RBCs storage lesion) نامیده میشونـد (6، 5). تاکنون روشهای مختلفی جهت فرآوری فرآوردههای خون و افزایش کیفیت آنها معرفی شدهاند. یکـی از پرکاربردترین و مؤثرترین روشهـا، فیلتراسیون لکوسیتی بـه منظور حذف لکوسیتها از فرآوردههای RBCs و پلاکتهای ادغام شده است. مطالعههای مختلف نشان دادهانـد کـه حدود 1 درصد بیماران به دنبال دریافت فرآوردههای خون، دچار عارضه میشوند که بیش از 90 درصد این عوارض مرتبط با لکوسیتها است (8، 7). حـذف لکوسیتها، خطرات مرتبط با آنها مانند واکنش تـبزای غیرهمولیتیک، واکنشهای آلرژیک، آلوایمیونیزاسیون مرتبط با آنتیژنهای لکوسیتی و خطر انتقال ویروسهای لکوتروپیک را کاهش میدهد(9). بر اساس استانداردها، فرآورده کم لکوسیت، به فرآورده با تعداد لکوسیت کمتر از WBC/unit 106×5 بر اساس استانداردهای آمریکا و ایران یا کمتر از WBC/unit 106×1 بر اساس استانداردهای اروپا اطلاق میشود. امروزه از روشهـای مختلفی مانند فیلتراسیون خون کامل (Whole Blood Filtration: WBF) و فیلتراسیون RBCs (Red Blood Cell Filtration: RCF)، جهت فیلتراسیون لکوسیتی استفاده میشود (15-10). در سازمان انتقال خون ایران، فیلتراسیون لکوسیتی از سال 1383 شروع شد و امروزه بیش از 60 درصد فرآوردههای RBCs فیلتر میشوند (16). مطالعههای مختلف تـاکنون نشان دادهانـد که علاوه بر شرایط نگهداری فرآوردهها، فـاکتورهای مختلفی مانند اهداکنندگان، شرایط انتقال و روشهای فرآوری، تـأثیر قابل ملاحظهای برکیفیت فرآوردههای RBCs و در نتیجه نتایج تزریق در بیماران دارنـد. بنابراین با توجه به اهمیت استفاده از فرآوردههای گلبول قرمز با کاهش لکوسیت (leukocyte-reduced RBCs: LR-RBCs) و همچنین تـأثیر روشهای مختلف فرآوری بر کیفیت فرآوردهها، این مطالعه طراحی شد تا با حذف تـأثیر برخی متغیرهای مداخله گر مانند ویژگیهای اهداکنندگان و همسان سازی شرایط پیش فرآوری مانند دما و مدت زمان نگهداری خون قبل از فرآوری، به بررسی تأثیر احتمالی روشهای مختلف فیلتراسیون لکوسیتی در سازمان انتقال خون ایران (WBF و RCF)، بر شاخصهای کیفی (اریتروسیتی و تغییرات بیوشیمیایی) فرآوردههای LR-RBCs بپردازد. کیسههای لکوفیلتراسیون مورد استفاده در این مطالعه، متعلق به شرکت فرزنیوس کابی و از دو نوع فیلتراسیون خون کامل و فیلتراسیون RBCs بودنـد که در سازمان انتقال خون ایران استفاده میشدند. کیسههای فیلراسیون خون کامل، فیلترها به منظور حذف لکوسیتها از خون کامل طراحی شدهاند، به نحوی که ابتدا خون کامل از فیلتر عبور کرده، لکوسیتها حذف میشوند و سپس کیسه فیلتر شده سانتریفیوژ شده و گلبولهای قرمز از پلاسما جدا میشوند. در آخر ماده افزودنی SAGM (Saline-Adenine-Glucose-Mannitol) به کیسه حاوی گلبولهای قرمز اضافه میشود. در این روش چون بخش اعظمی از پلاکتها در فیلترها بـه دام میافتند، نمیتوان از پلاکتها استفاده کرد، چون تعداد آنها کاهش مییابد. در کیسههای فیلتراسیون RBCs، فیلترها برای حـذف لکوسیتها از فرآورده RBC طراحی شدهاند. ابتدا کیسهها سانتریفیوژ شده، محلول افزودنی SAGM به کیسه حاوی گلبولهای قرمز اضافـه شده و سپس فیلتر میشود. بنابراین لکوسیتها فقط از فرآورده RBC حذف میشوند. شاخصهای کیفی (اریتروسیتی و هموگلوبین آزاد) مورد مطالعه بخشی از شاخصهایی هستند که به طور روتین در سازمان انتقال خون ایران جهت بررسی و کنترل کیفیت فرآوردهها بررسی میشوند. سایر شاخصها نیز بر اساس مقالات و در دسترس بودن انتخاب شدند.
مواد و روشها
این مطالعه تجربـی (Experimental) بـا کـد اخــــلاق
IR.TMI.RCE.1398.014. در کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی پژوهشی طب انتقال خون تصویب شد.
جمعآوری واحدهای خون، تقسیمبندی و لکوفیلتراسیون:
تعداد 12 واحد خون کامل (mL 45 ± 450)، پس از دریافت رضایت آگاهانه، از اهداکنندگان مستمر مرد سالم (30-50 سال) جمعآوری و وارد مطالعه شدند. منظور از اهداکنندگان مستمر، افرادی هستند که بر اساس تعریف استانداردهای سازمان انتقال خون، حداقل دو بار در سال اهدای خون دارند. به دلیل فراوانی بیشتر در زمان مطالعه، همه فرآوردهها از گروه A+ انتخاب شدند. همه کیسههـا تحت شرایط یکسان و در دمای 24-20 درجه سانتیگراد نگهداری شده و در مدت زمان حداکثر 6 ساعت فرآوری شدند. به منظور حذف برخی متغیرهای مداخلهگر و زمینهای مرتبط با ویژگیهای اهداکنندگان، هر کیسه خون کامـل پس از محاسبه وزن و حجم دقیق، با استفاده از دستگاه جوش استریل (Trumo Bct TSCD II) و در یک سیستم کاملاً بسته و استریل به دو قسمت مساوی تقسیم شدند. سپس از 24 کیسه حاصل از تقسیمبندی، 12 کیسه توسط کیسههای لکوفیلتراسیون به روش WBF و 12 کیسه توسط کیسههای لکوفیلتراسیون به روش RCF، بر اساس دستورالعمل سازنده و استانداردهای سازمان انتقال خون ایران و در شرایط یکسان فیلتر شدند. در نهایت فرآوردههای گلبول قـرمز فیلتر شده در محلول افزودنی SAGM (Saline-Adenine-Glucose-Mannitol) به مدت 42 روز در دمای 6-2 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در بـازههای زمانی 2، 14، 28 و 42 روز، مقدار mL 15 گلبول قرمز از هر کیسه جمعآوری شده و برای آزمایشهای انـدازهگیری غلظت میکرووزیکولها (MVs) به روش برادفورد، شاخصهای اریتروسیتی، هموگلوبین آزاد (Free Hb)، گلوکـز، لاکتات دهیدروژنـاز (LDH)، pH و شکنندگی اسمزی (OFI) گلبولهای قرمز مورد بررسی قرار گرفتنـد. قبل از هر بار نمونهگیری، کیسهها به خوبی مخلوط شده و به صورت چشمی از نظر وجود آلودگی بررسی شدند. نمونهگیری در شرایط کاملاً بسته و با استفاده از دستگاه جوش استریل انجام شد. در هر بازه زمانی، یک کیسه اقماری کوچک با استفاده از دستگاه جوش استریل به کیسه اصلی وصل شده، پس از برداشت مقدار نمونه مورد نیاز، با استفاده از دستگاه سیلر کیسه جدا شده و مورد بررسی قرار میگرفت.
اندازهگیری غلظت MVs :
تعیین غلظت میکرووزیکولهای ایجـاد شده در کیسهها، با استفاده از کیت سنجش پروتئین برادفورد (DNAbiotech, Cat No: DB0017) و دستگاه نانـودراپ (NanoDrop Spectrophotometer ND-1000) انجام شد. مطابق با روش استاندارد کیت، میزان 40 میکرولیتر معرف برادفورد به هر چاهک اضافه کرده، به چاهکهای استاندارد مقدار 160 میکرولیتر معرف استانـدارد و به چاهکهای نمونه، میزان 160 میکرولیتر رسوب MVs اضافه شد (16). جذب نوری نمونهها و استانداردها در طول موج nm595 در مقابل بلانک (نرمال سالین)، خوانش شد و غلظتها با استفاده از مقادیر استاندارد، محاسبه شد.
شاخصهای اریتروسیتی:
شاخصهای گلبولهای قرمز شامل هماتوکریت، میانگین حجـم سلولی (Mean Cell Volume: MCV)، میانگین هموگلوبیـن (Mean Cell Hemoglobin: MCH)، میانگین غلظت هموگلوبین (Mean Cell Hemoglobin Concentration: MCHC) و تفاوت انـدازه سلولها (Red cell Distribution Width: RDW ) توسط دستگاه سل کانتر سیسمکس (Sysmex XT2000i, Diamond Diagnostics, USA) اندازهگیری شدند.
اندازهگیری هموگلوبین آزاد (Free Hb) :
برای اندازه گیری هموگلوبین آزاد کیسهها، از روش رنگسنجی کربنات سدیم استفاده شد (18-16). ابتدا نمونهها 10 دقیقه با دور g × 1000 سانتریفیوژ شده، 100 میکرولیتر از مایع رویی بـه یک میلیلیتر محلول بیکربنات سدیم اضافه شده و به خوبی مخلوط شد. پس از 5 دقیقه جذب نوری محلول حاصل در طول موجهای 415، 450 و 700 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانش شد. سپس مقادیر هموگلوبین آزاد توسط فرمول زیر محاسبه شد:
Free Hb (mg/dL) = (154.7xA415 - 130.7xA450 -123.9xA700)
اندازهگیری LDH و pH :
برای اندازهگیری pH، پس از سانتریفیوژ نمونهها، پــروب
دستگاه pH متر (Inolab, Cond 7110) در مایع رویی نمونهها قرار داده شده و pH هر نمونه خوانش شد. برای اطمینان از عملکرد صحیح دستگاه، از بافرهای با pH 7، 4 و 9 استفاده شد و پس از هر بار استفاده، پروب دستگاه با آب مقطر شستشو داده شد. اندازهگیری شاخص LDH با استفاده از اتوآنالایزر بیوشیمی (Roche’s Cobas Mira Chemistry analyzer, Germany) و کیت پارس آزمون (LOT: 99001) انجام شد. همچنین از نمونه سرم کنترل (درمان فراز کاوه، LOT: 1001) برای اطمینان از عملکرد دستگاه استفاده شد.
آزمون شکنندگی اسمزی گلبولهای قرمز (Osmotic Fragility Test: OFT):
جهت بررسی حساسیت گلبولهای قرمز ذخیره شده به محیطهای هیپوتونیک، از آزمون OFT استفاده شد. برای هر نمونـه ابتدا یـک سریال رقت از لولههای حاوی محلولهای هیپوتونیک NaCl با غلظتهای g/L 9/0تا صفر تهیه شد. به هر لوله 50 میکرولیتر نمونه RBCs اضافه و به خوبی مخلوط شدند. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای اتـاق، لولهها به مدت 5 دقیقه با دور xg 1200سانتریفیوژ شده و جذب نوری هر لوله با استفاده از اسپکتروفتومتر و در طول موج nm 540 خوانش شد. درصد همولیز هر لوله با فرمول زیر محاسبه شد:
از لولههای اول و آخر به ترتیب به عنوان لولههای بلانـک و لوله همولیز 100% استفاده شد. با استفاده از درصد همولیز و غلظت نمکی هر لوله، نمودار نقطهای ترسیم شد و نتیجه آزمایش به صورت غلظت شروع همولیز، پایان همولیز و میانگین شکنندگی سلولی (Mean Corpuscular Fragility: MCF) گزارش گردید. MCF معادل غلظتی از NaCl است که در آن 50% گلبولهای قرمز لیز میشوند.
تجزیه و تحلیل آماری:
بـا توجه به پراکندگی طبیعی دادهها، از آزمونهای t دو گروه مستقل جهت مقایسه میانگینهای بین گروهها در هر یک از روزهای نمونهگیری و ANOVA بـا اندازههای تکراری (One-Way Repeated Measure ANOVA) برای بررسی تغییرات میانگین دادهها برای هر یـک از گروهها در طول زمان ذخیرهسازی استفاده شد. نتایج به صورت SD±Mean بـا فاصله اطمینان 95% گزارش شدند. مقادیر معناداری آماری در سطح 05/0 تعریف شدند. آنالیزها با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 25 انجام شد.
یافتهها
غلظت میکرووزیکولها (μg/mL):
بررسی غلظت MVs به روش برادفورد نشان داد که این ذرات بـه طور تدریجی از روز 2 تا روز 42 به طور معنادار در هر دو نـوع فرآوردههای RCF-RBCs و WBF-RBCs افزایش یافته است. همچنین میانگین غلظت این ذرات به طور معناداری در هر چهار بـازه نمونهگیری، در فرآوردههای WBF-RBCs بیشتر از فرآوردههای RCF-RBCs بود (p-value در زمانهای 2، 14، 28 و 42 روز بـه ترتیب 024/0، 025/0 ، 017/0 و 002/0 بود)(شکل 1).
شاخصهای اریتروسیتی:
نتایج نشان داد که شاخص های هماتوکریت و MCV در طول زمان در هر دو نوع فرآوردهها افزایـش معنادار داشته است. تفاوت میانگینها در هیچ یک از شاخصها، بین دو نوع فرآورده معنادار نبوده است (جدول 1).
هموگلوبین آزاد (Free Hb):
نتایج نشان دادنـد که مقدار هموگلوبین آزاد در هر دو گروه فرآورده در طی زمان بـه طور معنادار افزایش یافت (001/0 p<). هـمچنین میانگین هموگلوبین آزاد در فرآوردههای WBF-RBCs در روزهای 28 (002/0 p=) و 42 (015/0 p=) بـه طور معنادار بیشتر از فرآوردههای RCF-RBCs بود (شکل 2).
LDH و pH :
نتایج نشان دادند که کاهش pH و افزایش LDH در هر دو گروه فرآورده در طول زمان معنادار بود (001/0 p<). همچنین اختلاف معناداری در میانگین pH بین گروههای RCF و WBF در روزهای 14 (015/0 p=) و 42 (002/0 p=) مشاهده شد. اختلاف میانگین LDH (U/L) بین گروههـای RCF و WBF در هر چهار بازه نمونـهگیری معنادار بود به نحوی که افزایش LDH در فرآوردههای حاصل از روش WBF شدیدتر بود (مقدار در زمانهای 2، 14، 28 و 42 روز به ترتیب 001/0 ، 014/0 ، 005/0 و 045/0 بود)(شکل 3).
آزمون شکنندگی اسمزی:
نتایج آزمایش OFT نشان داد که حساسیت و شکنندگی
گلبولهای قرمز در محیط هیپوتونیک، در هر دو گروه فرآوردهها به مرور زمان افزایش معنادار داشته است. تنها تفاوت معنادار آمـاری بین دو گروه فرآورده، مربوط به نقطه پایان همولیز در روزهای 28 و 42 است که نشـان مــیدهد همولیز در فرآوردههای WBF-RBCs سریعتـر کامـل شـده است (p-value معادل 001/0 و 013/0 بــه تـرتیب بــرای
روزهای 28 و 42 بود)، یعنی همولیز در لولـههای با غلظت نمکی بالاتر پایان یافته است. بنابراین اریتروسیتها در این کیسهها، در روزهـای پایانی، مقاومت اسمزی کمتری داشتهاند (شکل 4، جدول 2).
علیرغم پیشرفتهای چشمگیر در حوزه درمان، تزریق خون و فرآوردههای آن همچنان یکی از درمانهای پر استفاده در جهان است (2، 1). بر اساس گزارشهای سازمان بهداشت جهانی (World Health Organization: WHO)، سالانه حدود 118 میلیون واحد خون کامل اهدا میشود (حدود 10 واحد اهدا در هر 1000 نفر) که بیش از 85% آن به فرآوردههای مختلف تفکیک مـیگردد. تخمین زده میشود کـه سالانه حدود 90-85 میلیون واحد فرآورده گلبول قرمز (Red Blood Cell Concentrates: RBCs) به بیماران مختلف تزریق میشود که رقم قابل تأملی است (4، 3). بنابراین نظارت پیوسته بر تمام مراحـل تهیه، فرآوری، نگهداری و تـزریق، به منظور حفظ کیفیت خون و فرآوردههای آن اهمیت بـه سزایی دارد. در دوران نگهداری فرآوردههای RBCs در دمای °C 2-6، تغییرات مختلفی مانـند افزایش هموگلوبین آزاد، لاکتات، پتاسیم و کاهش pH، گلوکز، 2,3DPG و ATP رخ میدهد کـه در مجموع آسیبهای دوران نگهداری (RBCs storage lesion) نامیده میشونـد (6، 5). تاکنون روشهای مختلفی جهت فرآوری فرآوردههای خون و افزایش کیفیت آنها معرفی شدهاند. یکـی از پرکاربردترین و مؤثرترین روشهـا، فیلتراسیون لکوسیتی بـه منظور حذف لکوسیتها از فرآوردههای RBCs و پلاکتهای ادغام شده است. مطالعههای مختلف نشان دادهانـد کـه حدود 1 درصد بیماران به دنبال دریافت فرآوردههای خون، دچار عارضه میشوند که بیش از 90 درصد این عوارض مرتبط با لکوسیتها است (8، 7). حـذف لکوسیتها، خطرات مرتبط با آنها مانند واکنش تـبزای غیرهمولیتیک، واکنشهای آلرژیک، آلوایمیونیزاسیون مرتبط با آنتیژنهای لکوسیتی و خطر انتقال ویروسهای لکوتروپیک را کاهش میدهد(9). بر اساس استانداردها، فرآورده کم لکوسیت، به فرآورده با تعداد لکوسیت کمتر از WBC/unit 106×5 بر اساس استانداردهای آمریکا و ایران یا کمتر از WBC/unit 106×1 بر اساس استانداردهای اروپا اطلاق میشود. امروزه از روشهـای مختلفی مانند فیلتراسیون خون کامل (Whole Blood Filtration: WBF) و فیلتراسیون RBCs (Red Blood Cell Filtration: RCF)، جهت فیلتراسیون لکوسیتی استفاده میشود (15-10). در سازمان انتقال خون ایران، فیلتراسیون لکوسیتی از سال 1383 شروع شد و امروزه بیش از 60 درصد فرآوردههای RBCs فیلتر میشوند (16). مطالعههای مختلف تـاکنون نشان دادهانـد که علاوه بر شرایط نگهداری فرآوردهها، فـاکتورهای مختلفی مانند اهداکنندگان، شرایط انتقال و روشهای فرآوری، تـأثیر قابل ملاحظهای برکیفیت فرآوردههای RBCs و در نتیجه نتایج تزریق در بیماران دارنـد. بنابراین با توجه به اهمیت استفاده از فرآوردههای گلبول قرمز با کاهش لکوسیت (leukocyte-reduced RBCs: LR-RBCs) و همچنین تـأثیر روشهای مختلف فرآوری بر کیفیت فرآوردهها، این مطالعه طراحی شد تا با حذف تـأثیر برخی متغیرهای مداخله گر مانند ویژگیهای اهداکنندگان و همسان سازی شرایط پیش فرآوری مانند دما و مدت زمان نگهداری خون قبل از فرآوری، به بررسی تأثیر احتمالی روشهای مختلف فیلتراسیون لکوسیتی در سازمان انتقال خون ایران (WBF و RCF)، بر شاخصهای کیفی (اریتروسیتی و تغییرات بیوشیمیایی) فرآوردههای LR-RBCs بپردازد. کیسههای لکوفیلتراسیون مورد استفاده در این مطالعه، متعلق به شرکت فرزنیوس کابی و از دو نوع فیلتراسیون خون کامل و فیلتراسیون RBCs بودنـد که در سازمان انتقال خون ایران استفاده میشدند. کیسههای فیلراسیون خون کامل، فیلترها به منظور حذف لکوسیتها از خون کامل طراحی شدهاند، به نحوی که ابتدا خون کامل از فیلتر عبور کرده، لکوسیتها حذف میشوند و سپس کیسه فیلتر شده سانتریفیوژ شده و گلبولهای قرمز از پلاسما جدا میشوند. در آخر ماده افزودنی SAGM (Saline-Adenine-Glucose-Mannitol) به کیسه حاوی گلبولهای قرمز اضافه میشود. در این روش چون بخش اعظمی از پلاکتها در فیلترها بـه دام میافتند، نمیتوان از پلاکتها استفاده کرد، چون تعداد آنها کاهش مییابد. در کیسههای فیلتراسیون RBCs، فیلترها برای حـذف لکوسیتها از فرآورده RBC طراحی شدهاند. ابتدا کیسهها سانتریفیوژ شده، محلول افزودنی SAGM به کیسه حاوی گلبولهای قرمز اضافـه شده و سپس فیلتر میشود. بنابراین لکوسیتها فقط از فرآورده RBC حذف میشوند. شاخصهای کیفی (اریتروسیتی و هموگلوبین آزاد) مورد مطالعه بخشی از شاخصهایی هستند که به طور روتین در سازمان انتقال خون ایران جهت بررسی و کنترل کیفیت فرآوردهها بررسی میشوند. سایر شاخصها نیز بر اساس مقالات و در دسترس بودن انتخاب شدند.
مواد و روشها
این مطالعه تجربـی (Experimental) بـا کـد اخــــلاق
IR.TMI.RCE.1398.014. در کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی پژوهشی طب انتقال خون تصویب شد.
جمعآوری واحدهای خون، تقسیمبندی و لکوفیلتراسیون:
تعداد 12 واحد خون کامل (mL 45 ± 450)، پس از دریافت رضایت آگاهانه، از اهداکنندگان مستمر مرد سالم (30-50 سال) جمعآوری و وارد مطالعه شدند. منظور از اهداکنندگان مستمر، افرادی هستند که بر اساس تعریف استانداردهای سازمان انتقال خون، حداقل دو بار در سال اهدای خون دارند. به دلیل فراوانی بیشتر در زمان مطالعه، همه فرآوردهها از گروه A+ انتخاب شدند. همه کیسههـا تحت شرایط یکسان و در دمای 24-20 درجه سانتیگراد نگهداری شده و در مدت زمان حداکثر 6 ساعت فرآوری شدند. به منظور حذف برخی متغیرهای مداخلهگر و زمینهای مرتبط با ویژگیهای اهداکنندگان، هر کیسه خون کامـل پس از محاسبه وزن و حجم دقیق، با استفاده از دستگاه جوش استریل (Trumo Bct TSCD II) و در یک سیستم کاملاً بسته و استریل به دو قسمت مساوی تقسیم شدند. سپس از 24 کیسه حاصل از تقسیمبندی، 12 کیسه توسط کیسههای لکوفیلتراسیون به روش WBF و 12 کیسه توسط کیسههای لکوفیلتراسیون به روش RCF، بر اساس دستورالعمل سازنده و استانداردهای سازمان انتقال خون ایران و در شرایط یکسان فیلتر شدند. در نهایت فرآوردههای گلبول قـرمز فیلتر شده در محلول افزودنی SAGM (Saline-Adenine-Glucose-Mannitol) به مدت 42 روز در دمای 6-2 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در بـازههای زمانی 2، 14، 28 و 42 روز، مقدار mL 15 گلبول قرمز از هر کیسه جمعآوری شده و برای آزمایشهای انـدازهگیری غلظت میکرووزیکولها (MVs) به روش برادفورد، شاخصهای اریتروسیتی، هموگلوبین آزاد (Free Hb)، گلوکـز، لاکتات دهیدروژنـاز (LDH)، pH و شکنندگی اسمزی (OFI) گلبولهای قرمز مورد بررسی قرار گرفتنـد. قبل از هر بار نمونهگیری، کیسهها به خوبی مخلوط شده و به صورت چشمی از نظر وجود آلودگی بررسی شدند. نمونهگیری در شرایط کاملاً بسته و با استفاده از دستگاه جوش استریل انجام شد. در هر بازه زمانی، یک کیسه اقماری کوچک با استفاده از دستگاه جوش استریل به کیسه اصلی وصل شده، پس از برداشت مقدار نمونه مورد نیاز، با استفاده از دستگاه سیلر کیسه جدا شده و مورد بررسی قرار میگرفت.
اندازهگیری غلظت MVs :
تعیین غلظت میکرووزیکولهای ایجـاد شده در کیسهها، با استفاده از کیت سنجش پروتئین برادفورد (DNAbiotech, Cat No: DB0017) و دستگاه نانـودراپ (NanoDrop Spectrophotometer ND-1000) انجام شد. مطابق با روش استاندارد کیت، میزان 40 میکرولیتر معرف برادفورد به هر چاهک اضافه کرده، به چاهکهای استاندارد مقدار 160 میکرولیتر معرف استانـدارد و به چاهکهای نمونه، میزان 160 میکرولیتر رسوب MVs اضافه شد (16). جذب نوری نمونهها و استانداردها در طول موج nm595 در مقابل بلانک (نرمال سالین)، خوانش شد و غلظتها با استفاده از مقادیر استاندارد، محاسبه شد.
شاخصهای اریتروسیتی:
شاخصهای گلبولهای قرمز شامل هماتوکریت، میانگین حجـم سلولی (Mean Cell Volume: MCV)، میانگین هموگلوبیـن (Mean Cell Hemoglobin: MCH)، میانگین غلظت هموگلوبین (Mean Cell Hemoglobin Concentration: MCHC) و تفاوت انـدازه سلولها (Red cell Distribution Width: RDW ) توسط دستگاه سل کانتر سیسمکس (Sysmex XT2000i, Diamond Diagnostics, USA) اندازهگیری شدند.
اندازهگیری هموگلوبین آزاد (Free Hb) :
برای اندازه گیری هموگلوبین آزاد کیسهها، از روش رنگسنجی کربنات سدیم استفاده شد (18-16). ابتدا نمونهها 10 دقیقه با دور g × 1000 سانتریفیوژ شده، 100 میکرولیتر از مایع رویی بـه یک میلیلیتر محلول بیکربنات سدیم اضافه شده و به خوبی مخلوط شد. پس از 5 دقیقه جذب نوری محلول حاصل در طول موجهای 415، 450 و 700 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانش شد. سپس مقادیر هموگلوبین آزاد توسط فرمول زیر محاسبه شد:
Free Hb (mg/dL) = (154.7xA415 - 130.7xA450 -123.9xA700)
اندازهگیری LDH و pH :
برای اندازهگیری pH، پس از سانتریفیوژ نمونهها، پــروب
دستگاه pH متر (Inolab, Cond 7110) در مایع رویی نمونهها قرار داده شده و pH هر نمونه خوانش شد. برای اطمینان از عملکرد صحیح دستگاه، از بافرهای با pH 7، 4 و 9 استفاده شد و پس از هر بار استفاده، پروب دستگاه با آب مقطر شستشو داده شد. اندازهگیری شاخص LDH با استفاده از اتوآنالایزر بیوشیمی (Roche’s Cobas Mira Chemistry analyzer, Germany) و کیت پارس آزمون (LOT: 99001) انجام شد. همچنین از نمونه سرم کنترل (درمان فراز کاوه، LOT: 1001) برای اطمینان از عملکرد دستگاه استفاده شد.
آزمون شکنندگی اسمزی گلبولهای قرمز (Osmotic Fragility Test: OFT):
جهت بررسی حساسیت گلبولهای قرمز ذخیره شده به محیطهای هیپوتونیک، از آزمون OFT استفاده شد. برای هر نمونـه ابتدا یـک سریال رقت از لولههای حاوی محلولهای هیپوتونیک NaCl با غلظتهای g/L 9/0تا صفر تهیه شد. به هر لوله 50 میکرولیتر نمونه RBCs اضافه و به خوبی مخلوط شدند. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای اتـاق، لولهها به مدت 5 دقیقه با دور xg 1200سانتریفیوژ شده و جذب نوری هر لوله با استفاده از اسپکتروفتومتر و در طول موج nm 540 خوانش شد. درصد همولیز هر لوله با فرمول زیر محاسبه شد:
از لولههای اول و آخر به ترتیب به عنوان لولههای بلانـک و لوله همولیز 100% استفاده شد. با استفاده از درصد همولیز و غلظت نمکی هر لوله، نمودار نقطهای ترسیم شد و نتیجه آزمایش به صورت غلظت شروع همولیز، پایان همولیز و میانگین شکنندگی سلولی (Mean Corpuscular Fragility: MCF) گزارش گردید. MCF معادل غلظتی از NaCl است که در آن 50% گلبولهای قرمز لیز میشوند.
تجزیه و تحلیل آماری:
بـا توجه به پراکندگی طبیعی دادهها، از آزمونهای t دو گروه مستقل جهت مقایسه میانگینهای بین گروهها در هر یک از روزهای نمونهگیری و ANOVA بـا اندازههای تکراری (One-Way Repeated Measure ANOVA) برای بررسی تغییرات میانگین دادهها برای هر یـک از گروهها در طول زمان ذخیرهسازی استفاده شد. نتایج به صورت SD±Mean بـا فاصله اطمینان 95% گزارش شدند. مقادیر معناداری آماری در سطح 05/0 تعریف شدند. آنالیزها با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 25 انجام شد.
یافتهها
غلظت میکرووزیکولها (μg/mL):
بررسی غلظت MVs به روش برادفورد نشان داد که این ذرات بـه طور تدریجی از روز 2 تا روز 42 به طور معنادار در هر دو نـوع فرآوردههای RCF-RBCs و WBF-RBCs افزایش یافته است. همچنین میانگین غلظت این ذرات به طور معناداری در هر چهار بـازه نمونهگیری، در فرآوردههای WBF-RBCs بیشتر از فرآوردههای RCF-RBCs بود (p-value در زمانهای 2، 14، 28 و 42 روز بـه ترتیب 024/0، 025/0 ، 017/0 و 002/0 بود)(شکل 1).
شاخصهای اریتروسیتی:
نتایج نشان داد که شاخص های هماتوکریت و MCV در طول زمان در هر دو نوع فرآوردهها افزایـش معنادار داشته است. تفاوت میانگینها در هیچ یک از شاخصها، بین دو نوع فرآورده معنادار نبوده است (جدول 1).
هموگلوبین آزاد (Free Hb):
نتایج نشان دادنـد که مقدار هموگلوبین آزاد در هر دو گروه فرآورده در طی زمان بـه طور معنادار افزایش یافت (001/0 p<). هـمچنین میانگین هموگلوبین آزاد در فرآوردههای WBF-RBCs در روزهای 28 (002/0 p=) و 42 (015/0 p=) بـه طور معنادار بیشتر از فرآوردههای RCF-RBCs بود (شکل 2).
LDH و pH :
نتایج نشان دادند که کاهش pH و افزایش LDH در هر دو گروه فرآورده در طول زمان معنادار بود (001/0 p<). همچنین اختلاف معناداری در میانگین pH بین گروههای RCF و WBF در روزهای 14 (015/0 p=) و 42 (002/0 p=) مشاهده شد. اختلاف میانگین LDH (U/L) بین گروههـای RCF و WBF در هر چهار بازه نمونـهگیری معنادار بود به نحوی که افزایش LDH در فرآوردههای حاصل از روش WBF شدیدتر بود (مقدار در زمانهای 2، 14، 28 و 42 روز به ترتیب 001/0 ، 014/0 ، 005/0 و 045/0 بود)(شکل 3).
آزمون شکنندگی اسمزی:
نتایج آزمایش OFT نشان داد که حساسیت و شکنندگی
گلبولهای قرمز در محیط هیپوتونیک، در هر دو گروه فرآوردهها به مرور زمان افزایش معنادار داشته است. تنها تفاوت معنادار آمـاری بین دو گروه فرآورده، مربوط به نقطه پایان همولیز در روزهای 28 و 42 است که نشـان مــیدهد همولیز در فرآوردههای WBF-RBCs سریعتـر کامـل شـده است (p-value معادل 001/0 و 013/0 بــه تـرتیب بــرای
روزهای 28 و 42 بود)، یعنی همولیز در لولـههای با غلظت نمکی بالاتر پایان یافته است. بنابراین اریتروسیتها در این کیسهها، در روزهـای پایانی، مقاومت اسمزی کمتری داشتهاند (شکل 4، جدول 2).
علیرغم دستاوردهای بسیار در زمینه بهبود شرایط نـگهداری فرآوردههای گلبول قرمز و همچنین تـدوین و به کارگیری استانداردهای مختلف، مسأله کیفیت واحدهای RBCs که تحت شرایط مختلف و روشهای متفاوت تهیـه میشوند و همین طور پیامدهـای بالینی ناخواسته در بیمارانی که این فرآوردهها را دریافت میکنند، همچنان یک موضوع چالش برانگیز و مورد بحـث در طب انتقال خون است. مطالعههای مختلف نشان دادهاند که علاوه بر طول عمر و شرایط نگهداری فرآوردهها، روشهای مختلف تهیه و فرآوری نیز میتوانـد بـه عنوان یکی از عوامل مؤثر در کیفیت محصولات مطرح شود (22-19). بر همین اساس با طراحی این مطالعه، تلاش شد که با حذف برخی متغیرهای فردی و مداخلهگر و همسانسازی شرایط فرآوری، تأثیر روشهای مختلف فیلتراسیون لکوسیتی شامل RCF و WBF بر کیفیت فرآوردههای RBCs مورد بررسی قرار گیرد. همان طور که مطالعههای مختلف نشان دادهاند، مصرف گلوکز درون کیسهها بـه مرور زمان باعث کاهش انرژی (ATP) سلولها شده که با مختل کردن پمپ سدیم/ پتاسیم، باعث ورود آب به سلولها و تورم آنها میشود (16). در نتیجـه MCV و هماتوکریـت هم به مرور زمان افزایش مییابد. اریتروسیتها چون فاقد هسته هستند، توانایی مقابله با استرسهای اکسیداتیو و شرایط هیپوکسی را نداشته و دچار تغییرات ساختاری در غشا و اسکلت سلولی میشوند که در نتیجه آن، توزیع نامتقارن فسفولیپیدها در غشا به هم ریخته و فسفاتیدیل سرین (PS) در سطح خـارجی غشا تجمع میکند. همولیز سلولها و تولید میکرووزیکولها از پیامدهای اختلال در انسجـام غشای سلولها است (25-23). با توجه به افزایش میکرووزیکولها در فرآوردهها و تأثیری که بر سیستم انعقاد و افزایش خطر ترومبوز در بیماران دارنـد، بررسی کیفیت فرآوردهها بسیار حائز اهمیت است. اختلال در انسجام غشا باعث افزایش حساسیت سلولها به شرایط هیپوتونیک و کاهش مقاومت اسمزی آنها میشود. در نتیجه به مرور زمان OFT افزایش مییابد که نشاندهنده آسیب غشای اریتروسیتها است. از طرفی به دلیل وزیکولاسیون غشا، میکرووزیکولها دائماً طی دوران نگهداری فرآوردهها افزایش مییابند (26-24). با توجـه بـه این که میکرووزیکولها فعالیت پیش انعقادی دارند، ممکن است در ایجاد عوارض ترومبوتیک ناشی از تزریق خون نقش داشته باشند. تجمــع
PS در سطح خارجی غشای آنها، با ایجاد بستری با بار منفی جهت برهمکنش فاکتورهای انعقادی، بـاعث افزایش 1000 برابری سرعت تشکیل کمپلکسهای فعال برای تولید ترومبین میشود (28-25، 23). کمپلکسهای آنزیمی تناز و پروترومبیناز بـه غشای فسفولیپیدی RMVs متصل شده و باعث افزایش فعالیت فاکتورهایIX ، VIII و XI و در نتیجـه افزایش تولید ترومبین میشوند (29). در کم خونیهای همولیتیک مزمن ماننـد تالاسمی، PNH ، کم خونی داسی شکل و کم خونیهای اتوایمیون، افزایش سطح RMVs بـا حالت بیش انعقادی ارتباط دارنـد. در برخی مطالعهها ارتباط بین غلظت RMVs و افزایش خطر وقوع ترومبوزهای وریدی و شریانی به دنبال تزریق خون، به ویژه در بیماران سرطانی، بسیار مورد توجـه قرار گرفته است (29، 22). هموگلوبین آزاد و هموگلوبین کپسوله شده درون میکرووزیکولها که در طول زمان درون کیسهها افزایش مییابند، پس از تزریق به بدن بیمار، باعث پاکسازی اکسید نیتریک از خون و اختلال در عملکرد سلولهای انـدوتلیال میشود. نتایج آزمایش برادفورد در مطالعه حاضر نشان داد که غلظت میکرووزیکولها در فرآوردههای حاصل از روش WBF بیشتر بوده و این اختلاف در روز 42 بیشترین سطح معناداری را داشته است. آلمیزاک و همکاران در سال 2018 در مطالعهای مشابه، با استفاده از روشهای مختلف نشان دادند که غلظت میکرووزیکولها بـه ویژه در روزهای پایانی ذخیرهسازی، در فرآوردهها با روشهای مختـلف فیلتراسیون تفاوت معنادار دارد (18). همچنین گامونت و همکاران در سال 2020 نشان دادند که جمعیت میکرووزیکولها در فرآوردههای حاصل از روش WBF بیشتر از سایر روشهای فیلتراسیون بوده است (25). از طرفی بیکالهو و همکـاران در مطالعه خود، تفاوت معناداری بین فرآوردههای فیلتر شده با کیسههای مختلف گزارش نکردند (20). آنها در مقایسه با مطالعه آلمیزاک عنوان کردند که میانگین انـدازه میکرووزیکولها در فرآوردههای WBF کمتر از روش RCF بوده و چون این ذرات با فلوسیتومتری قابل شناسایی نیستند، باید با روشهای دیگری ماهیت آنها معلوم شود که آیا مشتق از گلبولهای قرمز هستند یا طبق نظر دیگر محققان مشتق از پلاکتها و لکوسیتها بوده و بنابراین تعداد آنها در فرآوردههای WBF بیشتر است. از تفاوتهای این مطالعه با سایر مطالعههای مشابه، همسانسازی شرایط برای فیلتراسیون فرآوردهها بوده است. در مطالعـه حاضر تلاش شد که تأثیر متغیرهای فردی اهداکنندگان تا حد امکان حذف شود و به طور دقیقتری به تأثیر روشهای فیلتراسیون پرداخته شود.
همولیز یک فاکتور بسیار مهم در ارزیابی کیفیت فرآوردههای RBCs است. به علاوه، همانند سایر مطالعهها، نتایج این مطالعه هم نشان داد که به مرور زمان با افزایش همولیز و میکرووزیکولهـا، میزان لاکتات و LDH نیز درون کیسهها افزایش یافته که باعث افت pH میگردد. نتایج این مطالعه مانند برخی دیگر مطالعـهها نشان داد که اختلاف میانگین شاخصهای غلظت میکرووزیکولها، سطح هموگلوبیـن آزاد، افزایش LDH ، کاهش pH و گلوکز و همچنین نتایـج OFT در نقطه پایان همولیز، بین فرآوردههای RBCs حاصل از روشهای مختلف لکوفیلتراسیون (RCF و WBF) در برخی بـازههای نمونهگیری، از نظر آماری معنادار بود (31، 30، 28). برخی مطالعهها هم مانند بیکالهو و همکاران اختلاف معناداری بین روشهای مختلف گزارش نـکردند (20). البته در هیچ یک از مطالعههای قبلی، بـه منظور حذف تأثیر متغیرهای زمینهای و مداخلهگیر، همسانسازی شرایط نگهداری و فرآوری فرآوردهها رعایت نشده است. سایر شاخصهای اریتروسیتی مانند MCH ، MCHC و RDW اختلاف میانگین معناداری بین فرآوردههای مورد مطالعه در هیچ یـک از بازههای مورد بررسی نداشتند.
نتیجهگیری
با توجه به این که در این مطالعه، بـا همسانسازی شرایط تا حد ممکن متغیرهای فردی حذف شدند، به نظر میرسد فرآوردههای RBC حاصل از روش WBF کیفیت متفاوتی نسبت بـه فرآوردههای حاصل از روش RCF داشته باشند. اریتروسیتها حساسیت بیشتری نسبت به شرایط درون کیسهها و نگهداری در بانک خون دارند. اما مهمترین نکتهای کـه باید به آن دقت کنیم، این است که علیرغم تفاوتهای مشاهده شده در میانگین پارامترهای مختلف بین فرآوردههای مورد بررسی، بیشترین سطح معناداری مربوط به غلظت میکرووزیکولها و سایر شاخصها، مربوط بـه آخرین روز نمونهگیری (روز 42)، یعنی آخرین روز نگهداری فرآوردهها بوده است. همچنین سطح هموگلوبین آزاد درون کیسهها، علیرغم تفاوتهای مشاهده شده، همگی در دامنه استاندارد تعریف شده بود و در هیچ یک از فرآوردهها از میزان تعریف شده استاندارد تجـاوز نکرد.
بنابراین میتوان گفت همه فرآوردهها در طول دوران نگهداری، کیفیت قابـل قبولی جهت تزریق را داشتهاند. با توجه به محدودیت تعداد نمونهها در این مطالعه و همچنین تفاوتهای مشاهده شده در مطالعههای مختلف، پیشنهاد میشود که مطالعه فوق در مقیاس بزرگتر ادامه یـافته و به منظور بررسی دقیقتر تأثیر این فرآیندها در بیماران، مطالعههای بـالینی علاوه بر آزمایشگاهی طراحی شوند.
حمایت مالی
این پژوهش بـا حمایت مالی و معنوی مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون انجام شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مقاله حاصل پایاننامه مقطع دکتری تخصصی (PhD) است کـه با کد اخلاق IR.TMI.RCE.1398.014 در کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون به ثبت رسیده است. اصل رازداری و محرمانگی اطلاعات رعایت شده است.
عدم تعارض منافع
نویسندگان اذعان میدارند که هیچ گونه تضاد منافعی وجود ندارد.
نقش نویسندگان
دکتر فاطمه روشن ضمیر: طراحی مطالعه، انجام مراحل پژوهش، جمعآوری دادهها، تجزیـه و تحلیل دادهها، تهیه گزارش، نگارش مقاله
دکتر صدیقه امینی کافیآباد: طراحی مطالعه، هدایـت و راهنمایی پژوهش
دکتر جواد مهاجر انصاری: تجزیه و تحلیل دادهها، نگارش و ویرایش مقاله
دکتر مهین نیکوگفتار ظریف: مشاور علمی انجام پژوهش
دکتر علی عرب خزائلی: مشاور آماری پژوهش
دکتر مهشید محمدیپور: ویراش مقاله
تشکر و قدردانی
ما صمیمانه از تلاشها و حمایتهای آقای دکتر دیهیم، خانم گلزاده، کارشناسان محترم آزمایشگاههای انعقاد و کنترل کیفی سازمان انتقال خون و همچنین مرکز نوآوری سازمان انتقال خون تشکر و قدردانی میکنیم.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
انتقال خون
فهرست منابع
1. Rana M, Arfat Y, Naseem O, Mazari N, Manzoor N, Aziz RS, Rashid M, Mohsin S. Levels of red blood cells derived microparticles in stored erythrocyte concentrate. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2020;14(6):185-91. [DOI:10.5897/AJPP2020.5126]
2. Nikulina M, Nemkov T, D'Alessandro A, Gaccione P, Yoshida T. A deep 96-well plate RBC storage platform for high-throughput screening of novel storage solutions. Front Physiol. 2022;13:1004936. [DOI:10.3389/fphys.2022.1004936] [PMID] []
3. World Health Organization. Global status report on blood safety and availability 2021. World Health Organization; 2022:1-51. [DOI:10.1007/978-3-030-05325-3_125-1]
4. Ma SR, Xia HF, Gong P, Yu ZL. Red blood cell-derived extracellular vesicles: An overview of current research progress, challenges, and opportunities. Biomedicines. 2023;11(10):2798. [DOI:10.3390/biomedicines11102798] [PMID] []
5. Westerman M, Porter JB. Red blood cell-derived microparticles: an overview. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 2016; 59: 134-9. [DOI:10.1016/j.bcmd.2016.04.003] [PMID]
6. Levin G, Sukhareva E, Lavrentieva A. Impact of microparticles derived from erythrocytes on fibrinolysis. Journal of thrombosis and thrombolysis. 2016; 41(3): 452-8. [DOI:10.1007/s11239-015-1299-y] [PMID]
7. Jin Z, Yao S, Li L, Sun S, Zhou Y, Zhou J, Wang Z, Cui Z. Efficient leukocyte removal and enhanced biocompatibility using PVDF membranes prepared by vapor-induced phase separation. Chinese Journal of Chemical Engineering. 2025;89:1-12. [DOI:10.1016/j.cjche.2025.08.017]
8. Silva ND, Nogueira LD, Nukui Y, Almeida-Neto CD. The effect of the leukoreduction filtration moment on the clinical outcome of transfused patients: A retrospective cohort study. Clinics. 2025; 2;80:100633. [DOI:10.1016/j.clinsp.2025.100633] [PMID] []
9. Dejigov Monteiro da Silva N, Nukui Y, Takahashi J, de Almeida Lopes Monteiro da Cruz D, de Souza Nogueira L. Effect of post-storage filters vs. pre-storage filters for leukoreduction of blood components on clinical outcomes: a systematic review and meta-analysis. Systematic reviews. 2024;13(1):196. [DOI:10.1186/s13643-024-02615-z] [PMID] []
10. Yang J, Yang Y, Gao L, Jiang X, Sun J, Wang Z, Xie R. Adverse effects of microparticles on transfusion of stored red blood cell concentrates. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 2024;46:S48-56. [DOI:10.1016/j.htct.2024.01.007] [PMID] []
11. Almizraq RJ, Holovati JL, Acker JP. Characteristics of extracellular vesicles in red blood concentrates change with storage time and blood manufacturing method. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2018; 45(3): 185-193 [DOI:10.1159/000486137] [PMID] []
12. Gao Y, Lv L, Liu S, Ma G, Su Y. Elevated levels of thrombin‐generating microparticles in stored red blood cells. Vox sanguinis. 2013; 105(1): 11-7. [DOI:10.1111/vox.12014] [PMID]
13. Nguyen DB, Ly TBT, Wesseling MC, Hittinger M, Torge A, Devitt A, et al. Characterization of microvesicles released from human red blood cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 2016; 38(3): 1085-99. [DOI:10.1159/000443059] [PMID]
14. Xie R, Jia D, Gao C, Zhou J, Sui H, Wei X, et al. Homocysteine induces procoagulant activity of red blood cells via phosphatidylserine exposure and microparticles generation. Amino Acids. 2014; 46(8): 1997-2004. [DOI:10.1007/s00726-014-1755-6] [PMID]
15. Sadeghi Neysiyani S, Amini-Kafiabad S, Hossieni E, Roshanzamir F. Activated Platelet and Platelet-Derived Microparticle Levels: A Comparative Study between Apheresis Platelet Concentrates and Pooled Platelet-Rich Plasma Platelet Concentrates. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 2026:42(1):222-228. [DOI:10.1007/s12288-025-01977-1] [PMID] []
16. Roshanzamir F, Amini-Kafiabad S, Zarif MN, Arabkhazaeli A, Mohammadipour M. The potential effect of leukocyte filtration methods on erythrocyte-derived microvesicles: One step forward. European Journal of Translational Myology. 2022;32(3):10708. [DOI:10.4081/ejtm.2022.10708] [PMID] []
17. Ghezelbash B, Azarkeivan A, Pourfathollah A, Deyhim M, Hajati E, Goodarzi A. Comparative evaluation of biochemical and hematological parameters of pre-storage leukoreduction during RBC storage. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res. 2018; 12(1): 35.
18. Almizraq RJ, Norris PJ, Inglis H, Menocha S, Wirtz MR, Juffermans N, et al. Blood manufacturing methods affect red blood cell product characteristics and immunomodulatory activity. Blood advances. 2018; 2(18): 2296-306. [DOI:10.1182/bloodadvances.2018021931] [PMID]
19. Almizraq R, Tchir JD, Holovati JL, Acker JP. Storage of red blood cells affects membrane composition, microvesiculation, and in vitro quality. Transfusion. 2013; 53(10): 2258-67. [DOI:10.1111/trf.12080] [PMID]
20. Bicalho B, Pereira A, Acker J. Buffy coat (top/bottom)‐and whole‐blood filtration (top/top)‐produced red cell concentrates differ in size of extracellular vesicles. Vox Sang. 2015; 109(3): 214-20. [DOI:10.1111/vox.12272] [PMID]
21. Hashemi Tayer A, Amirizadeh N, Ahmadinejad M, Nikougoftar M, Deyhim MR, Zolfaghari S. Procoagulant activity of red blood cell-derived microvesicles during red cell storage. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2019;46(4):224-30. [DOI:10.1159/000494367] [PMID] []
22. Rubin O, Crettaz D, Tissot J-D, Lion N. Microparticles in stored red blood cells: submicron clotting bombs? Blood transfusion. 2010; 8(Suppl 3): s31.
23. D'Alessandro A, Liumbruno G, Grazzini G, Zolla L. Red blood cell storage: the story so far. Blood Transfusion. 2010;8(2):82.
24. Almizraq RJ, Seghatchian J, Acker JP. Extracellular vesicles in transfusion-related immunomodulation and the role of blood component manufacturing. Transfusion and Apheresis Science. 2016; 55(3): 281-91. [DOI:10.1016/j.transci.2016.10.018] [PMID]
25. Gamonet C, Desmarets M, Mourey G, Biichle S, Aupet S, Laheurte C, et al. Processing methods and storage duration impact extracellular vesicle counts in red blood cell units. Blood Adv. 2020; 4(21): 5527-39. [DOI:10.1182/bloodadvances.2020001658] [PMID] []
26. Lang F, Gulbins E, Lerche H, Huber SM, Kempe DS, Föller M. Eryptosis, a window to systemic disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 2008; 22(5-6): 373-80. [DOI:10.1159/000185448] [PMID]
27. Saas P, Angelot F, Bardiaux L, Seilles E, Garnache-Ottou F, Perruche S. Phosphatidylserine-expressing cell by-products in transfusion: A pro-inflammatory or an anti-inflammatory effect? Transfusion clinique et biologique. 2012; 17-90: (3) 9. [DOI:10.1016/j.tracli.2012.02.002] [PMID]
28. Hashemi Tayer A, Amirizadeh N, Mghsodlu M, Nikogoftar M, Deyhim MR, Ahmadinejad M. Evaluation of blood storage lesions in leuko- depleted red blood cell units. Iranian Journal of Pediatric Hematology and Oncology. 2017; 7(3): 171-9.
29. Tissot J-D, Rubin O, Canellini G. Analysis and clinical relevance of microparticles from red blood cells. Current opinion in hematology. 2010; 17(6): 571-7. [DOI:10.1097/MOH.0b013e32833ec217] [PMID]
30. Dinkla S, Peppelman M, Der RV, Atsma F, MJ NV, GJ VKM, et al. Phosphatidylserine exposure on stored red blood cells as a parameter for donor-dependent variation in product quality. Blood Transfus. 2014; 12(2): 204.
31. Thangaraju K, Neerukonda S, Katneni U, W BP. Extracellular vesicles from red blood cells and their evolving roles in health, coagulopathy and therapy. Int J Mol Sci. 2021; 22(1): 153. [DOI:10.3390/ijms22010153] [PMID] []
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
