جلد 22، شماره 1 - ( بهار 1404 )
جلد 22 شماره 1 صفحات 29-19 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Zandi M, Sharifi Z, Ajorloo M. Design and In-Silico Evaluation of Specific Primers for the HBZ Gene of HTLV-1 to Establish a Semi-Nested PCR Method. bloodj 2025; 22 (1) :19-29
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1567-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1567-fa.html
زندی مهدی، شریفی زهره، آجورلو مهدی. طراحی و ارزیابی اینسیلیکو آغازگرهای اختصاصی ژن HBZ ویروس HTLV-1 جهت راه اندازی روش Semi-Nested PCR. فصلنامه پژوهشی خون. 1404; 22 (1) :19-29
استاد مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 1144 kb]
(347 دریافت)
| چکیده (HTML) (811 مشاهده)
مقدمه
ویروس لنفوتروپیک سلول T انسانی نوع 1(HTLV-1) به خانواده رتروویروسها تعلق دارد و نخستین بار در دهه ۱۹۸۰ توسط پوئز کشف شد (1). این ویروس با ادغام ژنوم خود در DNA میزبان، موجب عفونت‌های مزمن می‌گردد و ارتباط مستقیمی با بیماری‌های خطرناکی مانند لوسمی/لنفوم سلول T بالغین (ATL)، میلوپاتی مرتبط با (HAM/TSP) HTLV-1 و التهاب لایه میانی چشم دارد (2). تخمین زده می‌شود 25 ﻣﯿﻠﯿﻮن ﻧﻔﺮ در ﺳﺮاﺳﺮ ﺟﻬﺎن ﺑﻪ HTLV آﻟﻮده ﻫﺴﺘﻨﺪ. میزان شیوع آن به‌طور ویژه در مناطق بومی مانند جنوب ژاپن، بخش‌هایی از آفریقا، آمریکای مرکزی، آمریکای جنوبی و خاورمیانه بالاست (2). شهرهای مشهد، نیشابور و سبزوار در شمال شرقی ایران از جمله مناطق اندمیک ویروس به شمار می‌آیند (3). انتقال ویروس از طریق راه‌های مختلفی مانند تماس جنسی، استفاده از سرنگ مشترک، انتقال خون و از مادر به نوزاد (معمولاً از طریق شیردهی) انجام می‌شود (4). تشخیص زود هنگام و دقیق عفونت HTLV-1 برای مدیریت مؤثر بیماران و پیشگیری از گسترش آن اهمیت حیاتی دارد (5). با این حال، روش‌های تشخیصی کنونی مانند الایزا و وسترن بلات، دارای محدودیت‌هایی از نظر حساسیت و اختصاصیت هستند. همچنین این روش‌ها در دوره کمون ویروس و در مراحل اولیه ابتلا، زمانی که تیتر آنتی‌بادی ضد آنتی‌ژن‌های ویروسی قابل اندازه‌گیری نیست، کارآمد نمی‌باشند (5). مطالعه‌های گذشته نشان داده‌اند در بسیاری از موارد، با وجود مثبت بودن نتایج الایزا، نتایج آزمایش وسترن بلات که به عنوان آزمایش تأییدی استفاده می‌شود، نامشخص گزارش شده است. این موارد نشان‌دهنده نیاز به توسعه روش‌های دقیق‌تر و حساس‌تر است (6). روش‌های مولکولی به دلیل توانایی تشخیص مستقیم مواد ژنتیکی ویروس در ژنوم میزبان، جایگاه ویژه‌ای در تشخیص عفونت‌های ویروسی پیدا کرده‌اند. PCR ، یک روش مولکولی بسیار حساس و دقیق است که با استفاده از چرخه‌های دمایی، امکان تکثیر نواحی خاصی از DNA را فراهم می‌آورد (6). آغازگرها در این فرآیند نقش کلیدی داشتـه و بـه عنوان نقطه شروع بـرای سـاخت DNA عمـل
می‌کنند. آغازگرها به طور خاص از سمت ‘3 انتهای DNA نوکلئوتیدها را اضافه می‌کنند، این ویژگی بیوشیمیایی باعث می‌شود فرآیند تکثیر به صورت دقیق و قابل کنترل انجام شود. جهت طراحی آغازگرها، انتخاب نواحی محافظت شده در ژنوم و تنظیم دقیق توالی‌ها به منظور افزایش اختصاصیت و حساسیت، از اهمیت بالایی برخوردار می‌باشند. روش Nested PCR به عنوان یکی از روش‌های پیشرفته با دو مجموعه آغازگر خارجی و داخلی، توانسته است دقت و حساسیت بیشتری را در مقایسه با روش‌های معمولی PCR ارائه دهد (7). در مطالعه‌های مختلف، آغازگرها غالباً برای ژن Tax ویروس طراحی شده‌اند، اما در برخی موارد به ویژه در موارد ابتلای جدید، با وجود مثبت بودن نتایج سرولوژیک، ژن Tax با استفاده از PCR شناسایی نشده است که می‌تواند به علت رخداد جهش‌های متعدد در این ژن باشد (8). این امر نشان می‌دهد که بررسی چندین ناحیه از ژنوم ویروس برای افزایش دقت و اطمینان از تشخیص ضروری است.
در این مطالعه، طراحی و بهینه‌سازی آغازگرها با بهره‌گیری از نرم‌افزارهای پیشرفته بیوانفورماتیکی انجام شده است که امکان شناسایی و هدف‌گیری دقیق نواحی ژنی را فراهم کرده است. پروتئین HBZ از یک ناحیه بسیار محافظت شده رشته منفی پروویروس HTLV-1 کد می‌شود، که افزایش بیان آن با افزایش بار پروویروسی همراه می‌باشد. انتخاب ژن HBZ به دلیل نقش مهم آن در پاتوژنز و بیان آن درتمامی موارد ابتلا به لوسمی/لنفوم سلول T بالغین (ATL) و سایر بیماری‌های مرتبط با HTLV-1 انجام شده است. علاوه بر این، بیان ژن HBZ در حامل‌های آلوده بهHTLV-1 نیز قابل تشخیص است. با توجه به اهمیت ژن HBZ ، در این مطالعه با استفاده از روش‌های In Silico آغازگرهای اختصاصی برای ناحیه محافظت شده ژن HBZ ویروس HTLV-1 طراحی گردید. جهت ارزیابی روش semi-nested PCR ، از نرم‌افزار SnapGene برای شبیه‌سازی عملکرد آغازگرها در شرایط آزمایشگاهی استفاده شد و در نهایت تشخیص ویروس HTLV-1 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده بـرای ناحیــه محافظـت شـده ژن HBZ ویروس HTLV-1
در آزمایشگاه انجام گردید.
مواد و روش‌ها
1- طراحی اینسیلیکو آغازگر:
نرم‌افزارهای مختلفی جهت طراحی آغازگرهای مورد استفاده در انواع واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) وجود دارد. این نرم‌افزارها کاربردهای بسیاری از جمله تجزیه و تحلیل کامل DNA و پروتئین، پیش‌بینی ساختار ثانویه پروتئین، طراحی آغازگر، مدل‌سازی مولکولی، توسعه استراتژی‌های شبیه‌سازی و تجزیه و تحلیل آنزیم‌های محدود کننده اندونوکلئاز دارند.
شناسایی توالی هدف:
جهت طراحی آغازگرهای اختصاصی، توالی‌های ژن HBZ از پایگاه داده NCBI GenBank استخراج شد.NCBI (National Center for Biotechnology Information) یکی از بزرگ‌ترین منابع اطلاعات بیولوژیکی است که دسترسی به توالی‌های ژنتیکی، داده‌های بیولوژیکی و ابزارهای تحلیل آن‌ها را فراهم می‌کند. این پایگاه داده شامل بانک گسترده‌ای می‌باشد که توالی‌های ژنی انواع ارگانیسم‌ها را ذخیره و به اشتراک می‌گذارد. علاوه بر این، این پایگاه داده به طور منظم اطلاعات خود را هر ۲۴ ساعت با دیگر پایگاه‌های داده معتبر از جمله EMBL (European Molecular Biology Laboratory) و DDBJ (DNA Data Bank of Japan) به اشتراک می‌گذارد تا داده‌ها و منابع به‌روز و جامع‌تر باشند. در این مطالعه، ۴۳ فایل توالی کامل ژن HBZ استخراج گردید که شامل توالی‌های مربوط به تمامی گونه‌های ویروس HTLV-1 از سراسر جهان، به ویژه گونه‌های ایرانی، برزیلی و آفریقایی بودند.
هم‌ردیفی توالی‌ها:
هم ردیفی توالی‌ها به منظور شناسایی نواحی محافظت شده و متغیر در ژنوم ویروسHTLV-1 انجام شد. این فرآیند به شناسایی سویه‌های مختلف ویروس و طراحی آغازگرهای دقیق‌تر برای آزمایش تشخیصی semi-nested PCR کمک می‌کند. در این مطالعه، با استفاده از نسخه 0/6 نرم‌افزار MEGA و به کمک الگوریتم ClustalW، توالی‌های کدکننده پروتئین HBZ از ۴۳ فایل مختلف با منشأهای جغرافیایی مختلف هم ردیف شدند، تا نواحی محافظت شده در این توالی‌ها شناسایی شوند. این نرم‌افزار به کمک الگوریتم‌های مختلف هم‌ردیف‌سازی مانند ClustalW و Clustal Omega ، امکان هم‌ردیف‌سازی دقیق توالی‌های DNA را فراهم می‌آورد. ClustalW یک الگوریتم مشهور برای هم‌ردیف‌سازی چند تایی توالی‌ها است که از روشی مبتنی بر مقایسه جفتی استفاده می‌کند. این الگوریتم به طور خودکار توالی‌های DNA ، RNA و پروتئین را با یکدیگر مقایسه و هم‌ردیف می‌کند تا تفاوت‌های بین آن‌ها مشخص شوند. در ClustalW ، ابتدا جفت‌های توالی با استفاده از ماتریس‌های مشابهت مقایسه می‌شوند، سپس نتیجه این مقایسه‌ها به صورت ماتریس‌های فاصله برای تمام توالی‌ها نمایش داده می‌شود. در نهایت، بر اساس این ماتریس‌ها، بهترین ترتیب هم‌ردیفی انتخاب شده که کمترین فاصله را بین توالی‌ها ایجاد کند، با استفاده از هم ردیفی43 توالی استخراج شده، نواحی محافظت شده و مشترک بین تمامی سویه‌ها مشخص گردید که هدف اصلی طراحی آغازگر قرار گرفت.
طراحی آغازگرها:
پس از مشخص کردن توالی‌های مشترک حاصل از هم‌ردیفی مرحله قبل ، طراحی آغازگر برای PCR semi-nested انجام شد. در روش Nested PCR دو مجموعه آغازگر استفاده می‌شود. یک جفت آغازگر خارجی که در واکنش اول مورد استفاده قرار می‌گیرد و محصول این مرحله، جهت افزایش اختصاصیت، توسط یک جفت آغازگر داخلی که قسمت‌های درونی‌تر ژن هدف را تکثیر می‌کنند در مرحله دوم PCR می‌شوند. در روش semi-nested PCR یک آغازگر در بین هر دو مرحله به طور مشترک مورد استفاده قرار می‌گیرد. برای این مطالعه یک آغازگر پیشرو خارجی، یک آغازگر پیشرو داخلی و یک آغازگر پیرو که به طور مشترک در هر دو مرحله مورد استفاده قرار می‌گیرد، طراحی گردید. تمامی آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner نسخه 5.0.33 طراحی شدند. این نرم‌افزار قابلیت‌های متنوعی برای طراحی، تجزیه و تحلیل و ویرایش توالی‌های DNA دارد. از جمله ویژگی‌های برجسته آن می‌توان به طراحی آغازگر با توجه به معیارهای مختلف مانند طول، درصد GC و دمای ذوب (Tm) اشاره کرد. نرم‌افزار Gene Runner با پیش‌بینی ساختار ثانویه (مانند ساختارهای حلقه‌ای) تأثیر زیادی در طراحی آغازگر دارد. اگر ساختارهای ثانویه به درستی پیش‌بینی شوند، می‌توان از تشکیل دایمرهای آغازگر یا تعاملات جانبی که ممکن است کارآیی یا دقت واکنش PCR را کاهش دهند، جلوگیری کرد. این قابلیت پیش‌بینی ساختاری به ویژه در طراحی آغازگرها برای نواحی پیچیده ژنی اهمیت زیادی دارد. جدول زیر آغازگرهای طراحی شده برای ژن HBZ جهت راه‌اندازی آزمایش semi-nested PCR را نشان می‌دهد (جدول 1).
ارزیابی آغازگرها:
آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار OligoAnalyzer تحلیل شدند. این نرم‌افزار به بررسی پارامترهای مهمی مانند دمای ذوب (Tm)، تشکیل ساختارهای سنجاق سری (Hairpin)، و ایجاد دایمر (Self-dimerization) پرداخت. عدم تطابق در توالی آغازگر (Mismatch) و هدف یکی از عوامل مهم کاهش کارآیی واکنش PCR است، به ویژه در ناحیه’3 آغازگر که برای اتصال و عملکرد صحیح پلیمراز ضروری است. در این مطالعه، آغازگرهای طراحی شده به منظور ارزیابی عدم تطابق با استفاده از ابزار OligoAnalyzer بررسی شدند. این ابزار امکان شناسایی هرگونه اتصال غیر اختصاصی، ساختارهای ثانویه، و ناسازگاری‌های احتمالی را فراهم کرد. همچنین در این مطالعه، به منظور بررسی اختصاصیت آغازگرهای طراحی شده، از ابزار تحت وب NCBI- blastn استفاده گردید (جدول 2).
توالی‌های آغازگرهای طراحی شده وارد این ابزار شدند و در برابر بانک داده‌های ژنومی موجود در NCBI بررسی شدند. هدف از این تجزیه و تحلیل، اطمینان از هم‌ردیفی آغازگرها با ژن هدف (HBZ) و شناسایی نواحی غیر اختصاصی احتمالی بود.
در نهایت، از نرم‌افزار SnapGene نسخه 7.2.1 برای شبیه‌سازی عملکرد آغازگرها در شرایط آزمایشگاهی استفاده شد. قابلیت شبیه‌سازی ژل الکتروفورز این نرم‌افزار، برای بررسی طول قطعات تکثیر شده با آغازگر به کار رفت. این ویژگی امکان پیش‌بینی دقیق محصول PCR و مقایسه آن با نتایج واقعی آزمایشگاهی را فراهم کرد.
2- بررسی در آزمایشگاه:
ساخت و ذخیره‌سازی آغازگرها:
برای اطمینان از صحت آغازگرها، اطلاعات مربوط به توالی آن‌ها پیش از ساخت دوباره مورد بررسی قرار گرفت و در نهایت، آغازگرهای طراحی شده، ساخته شدند (شرکت ندای فن، تهران، ایران). پـس از ساخت، آغازگرها
با غلظت مشخصی (100 میکرومولار) در دمای 20- درجه سانتی‌گراد ذخیره شدند تا از تخریب و کاهش کارآیی آن‌ها در فرآیندهای بعدی جلوگیری شود.
استخراج DNA از نمونه‌ها:
در این مطالعه، از 5 نمونه خون اهداکننده HTLV-1 منفی، 5 نمونه خون اهداکننده HTLV-1 مثبت که غربالگری اولیه برای شناسایی ویروسHTLV-1 با استفاده از آزمایش ELISA انجام شده بود و نتایج این آزمایش توسط روش وسترن بلات با کیت دیاگنوستیکا MP تأیید گردیده بود و 4 نمونه مربوط به افراد مبتلا به سایر ویروس‌های انسانیHIV) ، HCV ، HBV و(HSV، استفاده شد. DNA ژنومی از بافی‌کوت نمونه خون افراد در لوله‌های حاوی EDTA با استفاده از کیت DNJia plus Blood and Cell kit (LOT: 506923112710040) تولید شرکت روژه تکنولوژی استخراج شد. غلظت DNA استخراج شده با دستگاه اسپکتروفتومتر نانو دراپ اندازه‌گیری گردید.
انجام واکنش PCR :
واکنش PCR با استفاده از مستر میکس آماده از شرکت آمپلیکون (دانمارک) و به وسیلـــه آغازگرهای طراحی و سنتز شده انجام شد. مقدار DNA الگو در هر واکنش به صورت دقیق تنظیم گردید. برای بهینه‌سازی دمای اتصال آغازگرها و جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی، از تنظیمات ترموسایکلر با گرادیان شیب غلظتی و روشTouchdown PCR استفاده شد. این روش به صورت مرحله‌ای دما را کاهش داد. در ابتدا دمای بالا را برای افزایش اختصاصیت آغازگرها به کار گرفته و در نهایت دما بهینه تثبیت گردید. مراحل دمایی برای هر دو مرحله از واکنش semi-nested PCR مشابه بود و شامل واسرشت اولیه، چرخه‌های تکراری واسرشت، اتصال و گسترش و در نهایت گسترش نهایی بود. برای دستیابی به نتایج دقیق و قابل‌اعتماد، تنظیمات دمایی و غلظت‌ها بر اساس آزمایشهای متعدد اولیه، تعیین و بهینه‌سازی گردید (جداول 3 و 4).
تحلیل محصول PCR:
محصولات PCR جهت بررسی صحت و کیفیت، تحت تحلیل ژل الکتروفورز با ژل آگارز 1.5% قرار گرفتند. برای جداسازی قطعات، از ولتاژ 100 ولت به مدت 45 دقیقه استفاده شد.در مرحله اولsemi- nested PCR، که طول قطعه مورد نظر 493 جفت باز بود، محصولات با استفاده از نشانگر 100 bp الکتروفورز شدند. در مرحله دوم، به دلیل کوتاه‌تر بودن قطعه (106 جفت باز)، نشانگر 50 bp برای ارزیابی به‌کار رفت.جهت آشکارسازی، از رنگ Green Viewer استفاده شد که در مرحله آماده‌سازی ژل به آن افزوده شده بود. بررسی نهایی نتایج با دستگاه ژل داک و نرم‌افزار مربوطه انجام شد .
یافته‌ها
1- نتایج بیوانفورماتیکی:
برای بررسی شباهت‌ها و تفاوت‌های توالی‌ها، از ابزار هم ردیفی چندتایی MEGA6 استفاده شد. نتایج هم‌ردیفی نشان داد که ناحیه مورد نظر برای طراحی آغازگرها در ژن HBZ پس از هم ردیفی بیشترین شباهت را در میان 43 توالی مختلف داشت. این ناحیه به دلیل حفظ ویژگی‌های بیولوژیکی در گونه‌های مختلف ویروس، به‌عنوان توالی هدف انتخاب شد (شکل 1). پس از انتخاب ناحیه هدف، طراحی آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner (ver.5.0.33) انجام شد و ویژگی‌های آن‌ها شامل دمای ذوب (Tm)، طول آغازگر، غلظت GC و ساختار ثانویه بررسی گردید. به منظور ارزیابی بیشتر آغازگرهای طراحی شده، آغازگرها با استفاده از ابزار blastn در پایگاه داده NCBI بررسی شدند. نتایج BLAST نشان داد که این آغازگرها هم‌پوشانی قابل‌توجهی با توالی‌های ژنومی سایر ویروس‌ها یا انسان‌ها ندارند. به ویژه در مقایسه با ویروس‌های هم‌خانواده یا مشابه، تطابقی با توالی‌های غیر هدف پیدا نشد.
این نتیجه نشان‌دهنده دقت بالا و خاصیت انتخابی آغازگرها برای شناسایی دقیق ویروس HTLV-1 بود. جهت پیش‌بینی عملکرد PCR ، از نرم‌افزار SnapGene استفاده شد. در این مرحله، نقشه PCR برای هر دو مرحله
semi-nested PCR طراحی گردید. برای مرحله اول که طول قطعه هدف 493 نوکلئوتید بود، پیش‌بینی نرم افزار نشان داد که محصول PCR در شرایط آزمایشگاهی به درستی تکثیر خواهد شد. همچنین مرحله دوم، که هدف 106 نوکلئوتید بود، به دقت شبیه‌سازی شد (شکل 3).
2- نتایج آزمایشگاهی:
نتایج آزمایشگاهی تأیید کرد که باندهای مورد نظر در ژل الکتروفورز برای نمونه‌های مثبت در هر دو مرحله PCR قابل شناسایی‌اند. در مرحله اول، باند مربوط به قطعه ۴۹۳ جفت بازی و در مرحله دوم، باند مربوط به قطعه ۱۰۶ جفت بازی به وضوح شناسایی شدند (شکل 4). نمونه مثبت به طور صحیح در هر دو مرحله PCR مثبت تشخیص داده شدند و این امر صحت و دقت بالای روش طراحی شده را تأیید کرد. همچنین، در آزمایش بر روی نمونه‌های منفی که شامل نمونه‌های اهداکنندگان سالم که از نظر ویروس HTLV-1 منفی بودند همچنین نمونه‌های افراد مبتلا به سایر ویروس‌های انسانیHIV) ، HCV ، HBV و(HSV نتایج تمامی موارد منفی گزارش شد، که نشان‌دهنده ویژگی بالای آزمایش و عدم تقاطع با ویروس‌های دیگر بود.
بحث
این مطالعه پتانسیل استفاده از ژن HBZ را به عنوان یک هدف کارآمد جهت تشخیص ویروس HTLV-1 نشان داد و می‌تواند در طراحی آزمایشهای PCR کمی و کیفی به کار رود. همچنین، این مطالعه استفاده از روش semi-nested PCR راه‌اندازی شده را به عنوان یک ابزار تشخیصی حساس و اختصاصی جهت بررسی پروویروس HTLV-1 پیشنهاد می‌کند. در هر دو مرحله آزمایش PCR ، محصول تولیدی در اندازه‌های پیش‌بینی شده (493 و 106 جفت باز) در تمام نمونه‌های مثبت مشاهده شدند، در حالی که در تمامی نمونه‌های منفی و نمونه‌های حاوی سایر ویروس‌های شایع انسانی هیچ واکنش مثبتی دیده نشد.
در بسیاری از مطالعه‌ها، طراحی آغازگرها به عنوان ابزاری مهم برای تشخیص دقیق عفونت‌های مختلف مورد توجه قرار گرفته است. از آغازگرها در شناسایی ویروس‌ها و باکتری‌ها از طریق روش‌های مبتنی بر PCR استفاده می‌شوند. در مطالعه‌ای که توسط بیگوم و همکاران منتشر شده است، به طراحی آغازگرهای ویژه برای شناسایی انواع
مختلف ویروس دلتا SARS-CoV-2 پرداخته‌اند. در این مطالعه با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی توالی‌های محافظت‌شده ژنوم ویروس را شناسایی کرده و به طراحی آغازگرهای مناسب برای تشخیص سریع‌تر این ویروس پرداخته اند. همچنین از داده‌های بیوانفورماتیکی برای بهینه‌سازی انتخاب آغازگرها استفاده کردند تا دقت و حساسیت آزمون PCR بهبود یابد (9).
این مطالعه از نظر استفاده از روش‌های بیوانفورماتیکی و طراحی آغازگرهای هدفمند، مشابه مطالعه کنونی بود و در هر دو مطالعه، هدف ارتقاء دقت تشخیص از طریق طراحی آغازگر برای نواحی محافظت شده ژنوم ویروس بود. اما تفاوت اصلی هدف این دو مطالعه در این است که بیگوم و همکاران، بیشتر بر روی انتخاب آغازگرهایی برای شناسایی و تمیز دادن انواع مختلف ویروس دلتا SARS-COV-2 تمرکز کرده‌اند، در حالی که در مطالعه ما، هدف طراحی آغازگر برای ناحیه ژنومی HBZ ویروس HTLV-1 بود، که در طول زمان کم تر در معرض جهش قرار می‌گیرند و شناسایی دقیق آن می‌تواند چالش‌های مرتبط بـا
تشخیص قطعی ویروس HTLV-1 را برطرف کند.
در مطالعه‌ای که توسط ساندرا گالگو و همکاران انجام شد، از ژن‌های tax/rex برای شناسایی پرویروس‌های HTLV-1 و HTLV-2 در سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی استفاده شد. این مطالعه نشـان داد کـه آزمایش PCR Nested دقت و حساسیت بالاتری در شناسایی این ویروس‌ها نسبت به روش‌های دیگر PCR دارد. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که استفاده از آزمایش Nested PCR می‌تواند به ویژه برای تشخیص HTLV در مناطق غیر اندمیک با بار ویروسی پایین و در بیماران با علائم خفیف یا مراحل اولیه عفونت بسیار مفید باشد. همچنین، این روش در مقایسه با PCR تک مرحله‌ای توانایی تشخیص دقیق‌تر پروویروس را در نمونه‌هایی با غلظت کم DNA و حتی نمونه‌هایی با جواب‌های وسترن بلات نامشخص فراهم می‌کند (10).
در مطالعه‌ای که توسط کاترینو دو اروجو و همکاران انجام شد، در 69 ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺧﻮن ژنﻫﺎی LTR ،env و TAX ویﺮوس HTLV با آزمایش PCR ارزیابی گردید. ﻧﺘﯿﺠﻪ ایﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﻧﺸﺎن داد در ﺑﺮﺧﯽ از ﻣﻮارد در نمونه‌هایی که جواب وﺳﺘﺮن ﺑﻼت ﻧﺎﻣﺸﺨﺺ دارند، ژن TAX ﻗﺎﺑﻞ ﺷﻨﺎﺳﺎیﯽ ﻧﺒﻮده و ﻣﯽﺗﻮاند علت ایﺠﺎد ﺟﻮاب ﻣﻨﻔﯽ ﮐﺎذب و یﺎ ﻧﺎﻣﺸﺨﺺ باشد، در ﺣﺎﻟﯽ ﮐﻪ ﺳﺎیﺮ ژنﻫﺎی ویﺮوﺳﯽ ﺑﻪ ﻃﻮر ﺣﻔﺎﻇﺖ ﺷﺪه وﺟﻮد دارند و در ﻧﺘﯿﺠﻪ ﺑﺮای ﺗﺸﺨﯿﺺ ویﺮوس HTLV ﻧﯿﺎز اﺳﺖ ﮐﻪ ﺑﯿﺶ از یﮏ ﺑﺨﺶ از ناحیه ژنی ویﺮوس را ﺟﺴﺘﺠﻮ ﮐﺮد (8).
بیشتر روش‌های مولکولی تشخیصی HTLV-1 بر اساس شناسایی ژن‌هایی هم‌چون TAX و LTR طراحی شده‌اند که به دلیل نقش اساسی این ژن‌ها در تکثیر و پاتوژنز ویروس، در شناسایی ویروس بسیار مفید هستند. با این حال، استفاده از این ژن‌ها در تشخیص HTLV-1 محدودیت‌هایی دارد که می‌تواند بر دقت و حساسیت نتایج تأثیر بگذارد. انتخاب ژن‌های LTR و env به عنوان مناطقی جهت طراحی آغازگر ممکن است اختصاصیت لازم را نداشته باشد و استفاده از این نواحی با احتمال ایجاد واکنش متقاطع با سایر رتروویروسها همانند HIV-1 همراه می‌باشد که می‌تواند دقت نتایج را کاهش دهد. همچنین در مواردی با بارویروسی پایین ممکن است عملکرد ضعیفی داشته باشد. در حال حاضر آزمایشهای تشخیصی PCR کمی و کیفی اکثراً بر پایه تشخیص و تکثیر ژن TAX ویروس HTLV-1 ، طراحی شده‌اند. اگر چه این ژن مختص ویروس HTLV بوده و انتظار می‌رود که ژنوم ویروس با اختصاصیت بالا تکثیر شود، مطالعه‌های قبلی نشان داده‌اند که در مواردی ژن TAX توسط روش‌های مولکولی قابل شناسایی نیست که می‌تواند منجر به تولید نتایج منفی کاذب یا نامشخص گردد (11، 8).
با توجه به این مشکلات، استفاده از ژن‌های دیگری که در برابر جهش‌های توالی مقاوم‌تر هستند و کمتر تحت تأثیر تغییرات قرار می‌گیرند، می‌تواند در افزایش دقت و حساسیت روش‌های تشخیصی مؤثر باشد. یکی از این ژن‌ها، HBZ می‌باشد. پروتئین HBZ از روی رشته منفی پروویروس کد می‌شود و به طور ثابت در طول عفونت ویروسی بیان می‌گردد. این خصوصیات باعث شده‌اند که ژن HBZ به عنوان یک هدف مناسب برای طراحی آغازگرها در تشخیص HTLV-1مورد توجه قرار گیرد. در این مطالعه، به منظور بهبود دقت تشخیص و رفع مشکلات مربوط به جهش‌ها و میس‌مچ‌های موجود در آغازگرهای طراحی شده برای ژن‌های TAX و LTR ، از ژن HBZ به عنوان هدف اصلی برای طراحی آغازگرهای اختصاصی استفاده شد. پیشنهاد می‌شود در مطالعه‌های آینده، بررسی آغازگرهای طراحی شده، در مقیاس‌های بالینی و در جمعیت‌های بزرگ‌تر انجام شود. همچنین، بررسی پرووایرال لود و بیان ژن HBZ در نمونه‌های افراد مبتلا می‌تواند در درک بهتر دلایل ایجاد جواب‌های نامشخص آزمایش وسترن بلات مفید باشد.
نتیجه‌گیری
استفاده از ژنHBZ برای تشخیص عفونت ویروس HTLV ، به دلیل نقش آن در پاتوژنز ویروس و خصوصیات منحصر به فرد آن، به عنوان نقطه تمایز این مطالعه با تحقیقات پیشین که سایر بخش‌های ژنوم ویروس را بررسی کرده‌اند، است. نتایج به دست آمده در هر دو مرحله بررسی اینسیلیکو و بررسی در محیط آزمایشگاه نشان می‌دهد که آغازگرهای طراحی شده برای ژن HBZ قادر به شناسایی ژن هدف بوده و در تمایز نمونه‌های مثبت از منفی کارآمد است. همچنین آزمون semi-nested PCR طراحی شده در این مطالعه می‌تواند به عنوان یک روش مؤثر برای شناسایی عفونت ویروس HTLV مورد استفاده قرار بگیرد.
حمایت مالی
این پروژه توسط مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین مالی شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه به تأیید کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون رسیده است (کد اخلاق: IR.TMI.REC.1402.017).
عدم تعارض منافع
هیچ‌گونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود نداشته
است.
نقش نویسندگان
مهدی زندی: نگارش اولیه مقاله و تجزیه و تحلیل اطلاعات
دکتر زهره شریفی: طراحی مطالعه، نظارت بر اجرای طرح و نگارش نهایی مقاله
دکتر مهدی آجورلو: نظارت بر اجرای طرح پژوهشی و نگارش مقاله
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد زیست فناوری مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی انتقال خون ایران است. بدیـن وسیلـه از ایـن مـؤسسه به خاطر حمایت‌های مالی آن تشکر می‌شود.
متن کامل: (238 مشاهده)
طراحی و ارزیابی اینسیلیکو آغازگرهای اختصاصی ژن HBZ ویروس HTLV-1
جهت راه اندازی روش Semi-Nested PCR
مهدی زندی1، زهره شریفی2 ، مهدی آجورلو3
1- کارشناس ارشد زیست فناوری ـ مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- PhD ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- PhD ویروس‌شناسی ـ استادیار مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
جهت راه اندازی روش Semi-Nested PCR
1- کارشناس ارشد زیست فناوری ـ مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- PhD ویروس‌شناسی ـ استاد مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- PhD ویروس‌شناسی ـ استادیار مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
http://dx.doi.org/10.61186/bloodj.22.1.19 Citation: Zandi M, Sharifi Z, Ajorloo M. Design and In-Silico Evaluation of Specific Primers for the HBZ Gene of HTLV-1 to Establish a Semi-Nested PCR Method. J Iran Blood Transfus. 2025: 22 (1) : 19-29. نویسنده مسئول: دکتر زهره شریفی. استاد مرکز تحقیقات فرآورده‌های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران صندوق پستی: 1157-14665 E-mail:
کد اخلاق: IR.TMI.REC.1402.017 |
 چکیدهسابقه و هدف  ویروس لنفوتروپیک سلول T انسانی نوع 1 (HTLV-1)، تنها رتروویروس سرطان‌زای انسانی است که با بیماری‌های لوسمی/لنفوم سلول T بالغین و فلج اسپاستیک گرمسیری مرتبط می‌باشد. روش‌های سرولوژیکی رایج برای تشخیص این ویروس، الایزا و وسترن بلات می باشد. ژن HBZ ، که توسط رشته منفی پروویروس HTLV-1 کد می‌شود، برخلاف سایر ژن‌های ویروسی، دچار جهش‌های مداوم نمی‌شود. در این مطالعه، ژن HBZ ویروس HTLV-1 برای طراحی آغازگرهای اختصاصی و توسعه آزمایش Semi-nested PCR مورد استفاده قرار گرفت.مواد و روش‌ها در یک مطالعه مقطعی، توالی ژن HBZ از ایزوله‌های گوناگون ویروس ازپایگاه داده NCBI استخراج شد و با نرم‌افزار MEGA6 هم‌ردیف گردید. طراحی آغازگر از ناحیه محافظت شده مشترک بین تمامی سویه‌ها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner انجام شد. جهت ارزیابی آغازگرها، پارامترهایی از قبیل درصد GC ، دمای ذوب ، ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر از نرم‌افزارهای OligoAnalyzer و SnapGene استفاده شد. برای بررسی محل دقیق اتصال آغازگرها، جهت شببه‌سازی واکنش PCR و الکتروفورز، از نرم‌افزارSnapGene استفاده شد. آغازگرها با استفاده از ابزار BLASTN در NCBI بررسی و سنتز شدند. در مرحله آزمایشگاهی، DNA ژنومی استخراج شده از نمونه‌های خون افراد HTLV-1 مثبت و سالم جهت واکنش Semi-Nested PCR و ارزیابی محصولات PCR ، الکتروفورز شد. یافته‌ها ابتدا توالی‌های کدکننده پروتئین HBZ از ۴۳ ایزوله ویروسی با منشا جغرافیایی مختلف با همدیگر هم‌ردیف شدند، سپس آغازگرها از نواحی محافظت‌شده با بیشترین شباهت طراحی شدند. آغازگرها فاقد ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر بودند .درصد GC بین 60%-45% و دمای ذوب بین 67-64 درجه سانتی‌گراد بود. نتایج BLAST نشان داد که آغازگرهای طراحی شده، 100% قادر به شناسایی ژن هدف (HBZ) بوده و هم‌پوشانی با توالی‌های ژنومی سایر ویروس‌ها یا انسان‌ها مشاهده نشد. پس از استخراج DNA ژنومی و انجام PCR ، طول قطعه مورد نظر در مرحله اول، 493 و در مرحله دوم، 106 جفت باز بود و با نتایج پیش‌بینی شده بیوانفورماتیکی مطابقت داشت. نتیجه گیری طراحی آغازگرهای ژن HBZ با استفاده از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی و توسعه آزمایش Semi-Nested PCR با موفقیت انجام شد. نتایج آزمایشگاهی، پیش‌بینی‌های بیوانفورماتیکی را تایید کرده و کارآیی این روش را برای تشخیص دقیق و سریع ویروس نشان داد. کلمات کلیدی: HTLV-1 ، Nested PCR ، لوسمی |
مقدمه
ویروس لنفوتروپیک سلول T انسانی نوع 1(HTLV-1) به خانواده رتروویروسها تعلق دارد و نخستین بار در دهه ۱۹۸۰ توسط پوئز کشف شد (1). این ویروس با ادغام ژنوم خود در DNA میزبان، موجب عفونت‌های مزمن می‌گردد و ارتباط مستقیمی با بیماری‌های خطرناکی مانند لوسمی/لنفوم سلول T بالغین (ATL)، میلوپاتی مرتبط با (HAM/TSP) HTLV-1 و التهاب لایه میانی چشم دارد (2). تخمین زده می‌شود 25 ﻣﯿﻠﯿﻮن ﻧﻔﺮ در ﺳﺮاﺳﺮ ﺟﻬﺎن ﺑﻪ HTLV آﻟﻮده ﻫﺴﺘﻨﺪ. میزان شیوع آن به‌طور ویژه در مناطق بومی مانند جنوب ژاپن، بخش‌هایی از آفریقا، آمریکای مرکزی، آمریکای جنوبی و خاورمیانه بالاست (2). شهرهای مشهد، نیشابور و سبزوار در شمال شرقی ایران از جمله مناطق اندمیک ویروس به شمار می‌آیند (3). انتقال ویروس از طریق راه‌های مختلفی مانند تماس جنسی، استفاده از سرنگ مشترک، انتقال خون و از مادر به نوزاد (معمولاً از طریق شیردهی) انجام می‌شود (4). تشخیص زود هنگام و دقیق عفونت HTLV-1 برای مدیریت مؤثر بیماران و پیشگیری از گسترش آن اهمیت حیاتی دارد (5). با این حال، روش‌های تشخیصی کنونی مانند الایزا و وسترن بلات، دارای محدودیت‌هایی از نظر حساسیت و اختصاصیت هستند. همچنین این روش‌ها در دوره کمون ویروس و در مراحل اولیه ابتلا، زمانی که تیتر آنتی‌بادی ضد آنتی‌ژن‌های ویروسی قابل اندازه‌گیری نیست، کارآمد نمی‌باشند (5). مطالعه‌های گذشته نشان داده‌اند در بسیاری از موارد، با وجود مثبت بودن نتایج الایزا، نتایج آزمایش وسترن بلات که به عنوان آزمایش تأییدی استفاده می‌شود، نامشخص گزارش شده است. این موارد نشان‌دهنده نیاز به توسعه روش‌های دقیق‌تر و حساس‌تر است (6). روش‌های مولکولی به دلیل توانایی تشخیص مستقیم مواد ژنتیکی ویروس در ژنوم میزبان، جایگاه ویژه‌ای در تشخیص عفونت‌های ویروسی پیدا کرده‌اند. PCR ، یک روش مولکولی بسیار حساس و دقیق است که با استفاده از چرخه‌های دمایی، امکان تکثیر نواحی خاصی از DNA را فراهم می‌آورد (6). آغازگرها در این فرآیند نقش کلیدی داشتـه و بـه عنوان نقطه شروع بـرای سـاخت DNA عمـل
می‌کنند. آغازگرها به طور خاص از سمت ‘3 انتهای DNA نوکلئوتیدها را اضافه می‌کنند، این ویژگی بیوشیمیایی باعث می‌شود فرآیند تکثیر به صورت دقیق و قابل کنترل انجام شود. جهت طراحی آغازگرها، انتخاب نواحی محافظت شده در ژنوم و تنظیم دقیق توالی‌ها به منظور افزایش اختصاصیت و حساسیت، از اهمیت بالایی برخوردار می‌باشند. روش Nested PCR به عنوان یکی از روش‌های پیشرفته با دو مجموعه آغازگر خارجی و داخلی، توانسته است دقت و حساسیت بیشتری را در مقایسه با روش‌های معمولی PCR ارائه دهد (7). در مطالعه‌های مختلف، آغازگرها غالباً برای ژن Tax ویروس طراحی شده‌اند، اما در برخی موارد به ویژه در موارد ابتلای جدید، با وجود مثبت بودن نتایج سرولوژیک، ژن Tax با استفاده از PCR شناسایی نشده است که می‌تواند به علت رخداد جهش‌های متعدد در این ژن باشد (8). این امر نشان می‌دهد که بررسی چندین ناحیه از ژنوم ویروس برای افزایش دقت و اطمینان از تشخیص ضروری است.
در این مطالعه، طراحی و بهینه‌سازی آغازگرها با بهره‌گیری از نرم‌افزارهای پیشرفته بیوانفورماتیکی انجام شده است که امکان شناسایی و هدف‌گیری دقیق نواحی ژنی را فراهم کرده است. پروتئین HBZ از یک ناحیه بسیار محافظت شده رشته منفی پروویروس HTLV-1 کد می‌شود، که افزایش بیان آن با افزایش بار پروویروسی همراه می‌باشد. انتخاب ژن HBZ به دلیل نقش مهم آن در پاتوژنز و بیان آن درتمامی موارد ابتلا به لوسمی/لنفوم سلول T بالغین (ATL) و سایر بیماری‌های مرتبط با HTLV-1 انجام شده است. علاوه بر این، بیان ژن HBZ در حامل‌های آلوده بهHTLV-1 نیز قابل تشخیص است. با توجه به اهمیت ژن HBZ ، در این مطالعه با استفاده از روش‌های In Silico آغازگرهای اختصاصی برای ناحیه محافظت شده ژن HBZ ویروس HTLV-1 طراحی گردید. جهت ارزیابی روش semi-nested PCR ، از نرم‌افزار SnapGene برای شبیه‌سازی عملکرد آغازگرها در شرایط آزمایشگاهی استفاده شد و در نهایت تشخیص ویروس HTLV-1 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده بـرای ناحیــه محافظـت شـده ژن HBZ ویروس HTLV-1
در آزمایشگاه انجام گردید.
مواد و روش‌ها
1- طراحی اینسیلیکو آغازگر:
نرم‌افزارهای مختلفی جهت طراحی آغازگرهای مورد استفاده در انواع واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) وجود دارد. این نرم‌افزارها کاربردهای بسیاری از جمله تجزیه و تحلیل کامل DNA و پروتئین، پیش‌بینی ساختار ثانویه پروتئین، طراحی آغازگر، مدل‌سازی مولکولی، توسعه استراتژی‌های شبیه‌سازی و تجزیه و تحلیل آنزیم‌های محدود کننده اندونوکلئاز دارند.
شناسایی توالی هدف:
جهت طراحی آغازگرهای اختصاصی، توالی‌های ژن HBZ از پایگاه داده NCBI GenBank استخراج شد.NCBI (National Center for Biotechnology Information) یکی از بزرگ‌ترین منابع اطلاعات بیولوژیکی است که دسترسی به توالی‌های ژنتیکی، داده‌های بیولوژیکی و ابزارهای تحلیل آن‌ها را فراهم می‌کند. این پایگاه داده شامل بانک گسترده‌ای می‌باشد که توالی‌های ژنی انواع ارگانیسم‌ها را ذخیره و به اشتراک می‌گذارد. علاوه بر این، این پایگاه داده به طور منظم اطلاعات خود را هر ۲۴ ساعت با دیگر پایگاه‌های داده معتبر از جمله EMBL (European Molecular Biology Laboratory) و DDBJ (DNA Data Bank of Japan) به اشتراک می‌گذارد تا داده‌ها و منابع به‌روز و جامع‌تر باشند. در این مطالعه، ۴۳ فایل توالی کامل ژن HBZ استخراج گردید که شامل توالی‌های مربوط به تمامی گونه‌های ویروس HTLV-1 از سراسر جهان، به ویژه گونه‌های ایرانی، برزیلی و آفریقایی بودند.
هم‌ردیفی توالی‌ها:
هم ردیفی توالی‌ها به منظور شناسایی نواحی محافظت شده و متغیر در ژنوم ویروسHTLV-1 انجام شد. این فرآیند به شناسایی سویه‌های مختلف ویروس و طراحی آغازگرهای دقیق‌تر برای آزمایش تشخیصی semi-nested PCR کمک می‌کند. در این مطالعه، با استفاده از نسخه 0/6 نرم‌افزار MEGA و به کمک الگوریتم ClustalW، توالی‌های کدکننده پروتئین HBZ از ۴۳ فایل مختلف با منشأهای جغرافیایی مختلف هم ردیف شدند، تا نواحی محافظت شده در این توالی‌ها شناسایی شوند. این نرم‌افزار به کمک الگوریتم‌های مختلف هم‌ردیف‌سازی مانند ClustalW و Clustal Omega ، امکان هم‌ردیف‌سازی دقیق توالی‌های DNA را فراهم می‌آورد. ClustalW یک الگوریتم مشهور برای هم‌ردیف‌سازی چند تایی توالی‌ها است که از روشی مبتنی بر مقایسه جفتی استفاده می‌کند. این الگوریتم به طور خودکار توالی‌های DNA ، RNA و پروتئین را با یکدیگر مقایسه و هم‌ردیف می‌کند تا تفاوت‌های بین آن‌ها مشخص شوند. در ClustalW ، ابتدا جفت‌های توالی با استفاده از ماتریس‌های مشابهت مقایسه می‌شوند، سپس نتیجه این مقایسه‌ها به صورت ماتریس‌های فاصله برای تمام توالی‌ها نمایش داده می‌شود. در نهایت، بر اساس این ماتریس‌ها، بهترین ترتیب هم‌ردیفی انتخاب شده که کمترین فاصله را بین توالی‌ها ایجاد کند، با استفاده از هم ردیفی43 توالی استخراج شده، نواحی محافظت شده و مشترک بین تمامی سویه‌ها مشخص گردید که هدف اصلی طراحی آغازگر قرار گرفت.
طراحی آغازگرها:
پس از مشخص کردن توالی‌های مشترک حاصل از هم‌ردیفی مرحله قبل ، طراحی آغازگر برای PCR semi-nested انجام شد. در روش Nested PCR دو مجموعه آغازگر استفاده می‌شود. یک جفت آغازگر خارجی که در واکنش اول مورد استفاده قرار می‌گیرد و محصول این مرحله، جهت افزایش اختصاصیت، توسط یک جفت آغازگر داخلی که قسمت‌های درونی‌تر ژن هدف را تکثیر می‌کنند در مرحله دوم PCR می‌شوند. در روش semi-nested PCR یک آغازگر در بین هر دو مرحله به طور مشترک مورد استفاده قرار می‌گیرد. برای این مطالعه یک آغازگر پیشرو خارجی، یک آغازگر پیشرو داخلی و یک آغازگر پیرو که به طور مشترک در هر دو مرحله مورد استفاده قرار می‌گیرد، طراحی گردید. تمامی آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner نسخه 5.0.33 طراحی شدند. این نرم‌افزار قابلیت‌های متنوعی برای طراحی، تجزیه و تحلیل و ویرایش توالی‌های DNA دارد. از جمله ویژگی‌های برجسته آن می‌توان به طراحی آغازگر با توجه به معیارهای مختلف مانند طول، درصد GC و دمای ذوب (Tm) اشاره کرد. نرم‌افزار Gene Runner با پیش‌بینی ساختار ثانویه (مانند ساختارهای حلقه‌ای) تأثیر زیادی در طراحی آغازگر دارد. اگر ساختارهای ثانویه به درستی پیش‌بینی شوند، می‌توان از تشکیل دایمرهای آغازگر یا تعاملات جانبی که ممکن است کارآیی یا دقت واکنش PCR را کاهش دهند، جلوگیری کرد. این قابلیت پیش‌بینی ساختاری به ویژه در طراحی آغازگرها برای نواحی پیچیده ژنی اهمیت زیادی دارد. جدول زیر آغازگرهای طراحی شده برای ژن HBZ جهت راه‌اندازی آزمایش semi-nested PCR را نشان می‌دهد (جدول 1).
ارزیابی آغازگرها:
آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار OligoAnalyzer تحلیل شدند. این نرم‌افزار به بررسی پارامترهای مهمی مانند دمای ذوب (Tm)، تشکیل ساختارهای سنجاق سری (Hairpin)، و ایجاد دایمر (Self-dimerization) پرداخت. عدم تطابق در توالی آغازگر (Mismatch) و هدف یکی از عوامل مهم کاهش کارآیی واکنش PCR است، به ویژه در ناحیه’3 آغازگر که برای اتصال و عملکرد صحیح پلیمراز ضروری است. در این مطالعه، آغازگرهای طراحی شده به منظور ارزیابی عدم تطابق با استفاده از ابزار OligoAnalyzer بررسی شدند. این ابزار امکان شناسایی هرگونه اتصال غیر اختصاصی، ساختارهای ثانویه، و ناسازگاری‌های احتمالی را فراهم کرد. همچنین در این مطالعه، به منظور بررسی اختصاصیت آغازگرهای طراحی شده، از ابزار تحت وب NCBI- blastn استفاده گردید (جدول 2).
توالی‌های آغازگرهای طراحی شده وارد این ابزار شدند و در برابر بانک داده‌های ژنومی موجود در NCBI بررسی شدند. هدف از این تجزیه و تحلیل، اطمینان از هم‌ردیفی آغازگرها با ژن هدف (HBZ) و شناسایی نواحی غیر اختصاصی احتمالی بود.
در نهایت، از نرم‌افزار SnapGene نسخه 7.2.1 برای شبیه‌سازی عملکرد آغازگرها در شرایط آزمایشگاهی استفاده شد. قابلیت شبیه‌سازی ژل الکتروفورز این نرم‌افزار، برای بررسی طول قطعات تکثیر شده با آغازگر به کار رفت. این ویژگی امکان پیش‌بینی دقیق محصول PCR و مقایسه آن با نتایج واقعی آزمایشگاهی را فراهم کرد.
2- بررسی در آزمایشگاه:
ساخت و ذخیره‌سازی آغازگرها:
برای اطمینان از صحت آغازگرها، اطلاعات مربوط به توالی آن‌ها پیش از ساخت دوباره مورد بررسی قرار گرفت و در نهایت، آغازگرهای طراحی شده، ساخته شدند (شرکت ندای فن، تهران، ایران). پـس از ساخت، آغازگرها
با غلظت مشخصی (100 میکرومولار) در دمای 20- درجه سانتی‌گراد ذخیره شدند تا از تخریب و کاهش کارآیی آن‌ها در فرآیندهای بعدی جلوگیری شود.
استخراج DNA از نمونه‌ها:
در این مطالعه، از 5 نمونه خون اهداکننده HTLV-1 منفی، 5 نمونه خون اهداکننده HTLV-1 مثبت که غربالگری اولیه برای شناسایی ویروسHTLV-1 با استفاده از آزمایش ELISA انجام شده بود و نتایج این آزمایش توسط روش وسترن بلات با کیت دیاگنوستیکا MP تأیید گردیده بود و 4 نمونه مربوط به افراد مبتلا به سایر ویروس‌های انسانیHIV) ، HCV ، HBV و(HSV، استفاده شد. DNA ژنومی از بافی‌کوت نمونه خون افراد در لوله‌های حاوی EDTA با استفاده از کیت DNJia plus Blood and Cell kit (LOT: 506923112710040) تولید شرکت روژه تکنولوژی استخراج شد. غلظت DNA استخراج شده با دستگاه اسپکتروفتومتر نانو دراپ اندازه‌گیری گردید.
انجام واکنش PCR :
واکنش PCR با استفاده از مستر میکس آماده از شرکت آمپلیکون (دانمارک) و به وسیلـــه آغازگرهای طراحی و سنتز شده انجام شد. مقدار DNA الگو در هر واکنش به صورت دقیق تنظیم گردید. برای بهینه‌سازی دمای اتصال آغازگرها و جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی، از تنظیمات ترموسایکلر با گرادیان شیب غلظتی و روشTouchdown PCR استفاده شد. این روش به صورت مرحله‌ای دما را کاهش داد. در ابتدا دمای بالا را برای افزایش اختصاصیت آغازگرها به کار گرفته و در نهایت دما بهینه تثبیت گردید. مراحل دمایی برای هر دو مرحله از واکنش semi-nested PCR مشابه بود و شامل واسرشت اولیه، چرخه‌های تکراری واسرشت، اتصال و گسترش و در نهایت گسترش نهایی بود. برای دستیابی به نتایج دقیق و قابل‌اعتماد، تنظیمات دمایی و غلظت‌ها بر اساس آزمایشهای متعدد اولیه، تعیین و بهینه‌سازی گردید (جداول 3 و 4).
تحلیل محصول PCR:
محصولات PCR جهت بررسی صحت و کیفیت، تحت تحلیل ژل الکتروفورز با ژل آگارز 1.5% قرار گرفتند. برای جداسازی قطعات، از ولتاژ 100 ولت به مدت 45 دقیقه استفاده شد.در مرحله اولsemi- nested PCR، که طول قطعه مورد نظر 493 جفت باز بود، محصولات با استفاده از نشانگر 100 bp الکتروفورز شدند. در مرحله دوم، به دلیل کوتاه‌تر بودن قطعه (106 جفت باز)، نشانگر 50 bp برای ارزیابی به‌کار رفت.جهت آشکارسازی، از رنگ Green Viewer استفاده شد که در مرحله آماده‌سازی ژل به آن افزوده شده بود. بررسی نهایی نتایج با دستگاه ژل داک و نرم‌افزار مربوطه انجام شد .
یافته‌ها
1- نتایج بیوانفورماتیکی:
برای بررسی شباهت‌ها و تفاوت‌های توالی‌ها، از ابزار هم ردیفی چندتایی MEGA6 استفاده شد. نتایج هم‌ردیفی نشان داد که ناحیه مورد نظر برای طراحی آغازگرها در ژن HBZ پس از هم ردیفی بیشترین شباهت را در میان 43 توالی مختلف داشت. این ناحیه به دلیل حفظ ویژگی‌های بیولوژیکی در گونه‌های مختلف ویروس، به‌عنوان توالی هدف انتخاب شد (شکل 1). پس از انتخاب ناحیه هدف، طراحی آغازگرها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner (ver.5.0.33) انجام شد و ویژگی‌های آن‌ها شامل دمای ذوب (Tm)، طول آغازگر، غلظت GC و ساختار ثانویه بررسی گردید. به منظور ارزیابی بیشتر آغازگرهای طراحی شده، آغازگرها با استفاده از ابزار blastn در پایگاه داده NCBI بررسی شدند. نتایج BLAST نشان داد که این آغازگرها هم‌پوشانی قابل‌توجهی با توالی‌های ژنومی سایر ویروس‌ها یا انسان‌ها ندارند. به ویژه در مقایسه با ویروس‌های هم‌خانواده یا مشابه، تطابقی با توالی‌های غیر هدف پیدا نشد.
این نتیجه نشان‌دهنده دقت بالا و خاصیت انتخابی آغازگرها برای شناسایی دقیق ویروس HTLV-1 بود. جهت پیش‌بینی عملکرد PCR ، از نرم‌افزار SnapGene استفاده شد. در این مرحله، نقشه PCR برای هر دو مرحله
semi-nested PCR طراحی گردید. برای مرحله اول که طول قطعه هدف 493 نوکلئوتید بود، پیش‌بینی نرم افزار نشان داد که محصول PCR در شرایط آزمایشگاهی به درستی تکثیر خواهد شد. همچنین مرحله دوم، که هدف 106 نوکلئوتید بود، به دقت شبیه‌سازی شد (شکل 3).
2- نتایج آزمایشگاهی:
نتایج آزمایشگاهی تأیید کرد که باندهای مورد نظر در ژل الکتروفورز برای نمونه‌های مثبت در هر دو مرحله PCR قابل شناسایی‌اند. در مرحله اول، باند مربوط به قطعه ۴۹۳ جفت بازی و در مرحله دوم، باند مربوط به قطعه ۱۰۶ جفت بازی به وضوح شناسایی شدند (شکل 4). نمونه مثبت به طور صحیح در هر دو مرحله PCR مثبت تشخیص داده شدند و این امر صحت و دقت بالای روش طراحی شده را تأیید کرد. همچنین، در آزمایش بر روی نمونه‌های منفی که شامل نمونه‌های اهداکنندگان سالم که از نظر ویروس HTLV-1 منفی بودند همچنین نمونه‌های افراد مبتلا به سایر ویروس‌های انسانیHIV) ، HCV ، HBV و(HSV نتایج تمامی موارد منفی گزارش شد، که نشان‌دهنده ویژگی بالای آزمایش و عدم تقاطع با ویروس‌های دیگر بود.
بحث
در بسیاری از مطالعه‌ها، طراحی آغازگرها به عنوان ابزاری مهم برای تشخیص دقیق عفونت‌های مختلف مورد توجه قرار گرفته است. از آغازگرها در شناسایی ویروس‌ها و باکتری‌ها از طریق روش‌های مبتنی بر PCR استفاده می‌شوند. در مطالعه‌ای که توسط بیگوم و همکاران منتشر شده است، به طراحی آغازگرهای ویژه برای شناسایی انواع
مختلف ویروس دلتا SARS-CoV-2 پرداخته‌اند. در این مطالعه با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی توالی‌های محافظت‌شده ژنوم ویروس را شناسایی کرده و به طراحی آغازگرهای مناسب برای تشخیص سریع‌تر این ویروس پرداخته اند. همچنین از داده‌های بیوانفورماتیکی برای بهینه‌سازی انتخاب آغازگرها استفاده کردند تا دقت و حساسیت آزمون PCR بهبود یابد (9).
این مطالعه از نظر استفاده از روش‌های بیوانفورماتیکی و طراحی آغازگرهای هدفمند، مشابه مطالعه کنونی بود و در هر دو مطالعه، هدف ارتقاء دقت تشخیص از طریق طراحی آغازگر برای نواحی محافظت شده ژنوم ویروس بود. اما تفاوت اصلی هدف این دو مطالعه در این است که بیگوم و همکاران، بیشتر بر روی انتخاب آغازگرهایی برای شناسایی و تمیز دادن انواع مختلف ویروس دلتا SARS-COV-2 تمرکز کرده‌اند، در حالی که در مطالعه ما، هدف طراحی آغازگر برای ناحیه ژنومی HBZ ویروس HTLV-1 بود، که در طول زمان کم تر در معرض جهش قرار می‌گیرند و شناسایی دقیق آن می‌تواند چالش‌های مرتبط بـا
تشخیص قطعی ویروس HTLV-1 را برطرف کند.
در مطالعه‌ای که توسط ساندرا گالگو و همکاران انجام شد، از ژن‌های tax/rex برای شناسایی پرویروس‌های HTLV-1 و HTLV-2 در سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی استفاده شد. این مطالعه نشـان داد کـه آزمایش PCR Nested دقت و حساسیت بالاتری در شناسایی این ویروس‌ها نسبت به روش‌های دیگر PCR دارد. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که استفاده از آزمایش Nested PCR می‌تواند به ویژه برای تشخیص HTLV در مناطق غیر اندمیک با بار ویروسی پایین و در بیماران با علائم خفیف یا مراحل اولیه عفونت بسیار مفید باشد. همچنین، این روش در مقایسه با PCR تک مرحله‌ای توانایی تشخیص دقیق‌تر پروویروس را در نمونه‌هایی با غلظت کم DNA و حتی نمونه‌هایی با جواب‌های وسترن بلات نامشخص فراهم می‌کند (10).
در مطالعه‌ای که توسط کاترینو دو اروجو و همکاران انجام شد، در 69 ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺧﻮن ژنﻫﺎی LTR ،env و TAX ویﺮوس HTLV با آزمایش PCR ارزیابی گردید. ﻧﺘﯿﺠﻪ ایﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﻧﺸﺎن داد در ﺑﺮﺧﯽ از ﻣﻮارد در نمونه‌هایی که جواب وﺳﺘﺮن ﺑﻼت ﻧﺎﻣﺸﺨﺺ دارند، ژن TAX ﻗﺎﺑﻞ ﺷﻨﺎﺳﺎیﯽ ﻧﺒﻮده و ﻣﯽﺗﻮاند علت ایﺠﺎد ﺟﻮاب ﻣﻨﻔﯽ ﮐﺎذب و یﺎ ﻧﺎﻣﺸﺨﺺ باشد، در ﺣﺎﻟﯽ ﮐﻪ ﺳﺎیﺮ ژنﻫﺎی ویﺮوﺳﯽ ﺑﻪ ﻃﻮر ﺣﻔﺎﻇﺖ ﺷﺪه وﺟﻮد دارند و در ﻧﺘﯿﺠﻪ ﺑﺮای ﺗﺸﺨﯿﺺ ویﺮوس HTLV ﻧﯿﺎز اﺳﺖ ﮐﻪ ﺑﯿﺶ از یﮏ ﺑﺨﺶ از ناحیه ژنی ویﺮوس را ﺟﺴﺘﺠﻮ ﮐﺮد (8).
بیشتر روش‌های مولکولی تشخیصی HTLV-1 بر اساس شناسایی ژن‌هایی هم‌چون TAX و LTR طراحی شده‌اند که به دلیل نقش اساسی این ژن‌ها در تکثیر و پاتوژنز ویروس، در شناسایی ویروس بسیار مفید هستند. با این حال، استفاده از این ژن‌ها در تشخیص HTLV-1 محدودیت‌هایی دارد که می‌تواند بر دقت و حساسیت نتایج تأثیر بگذارد. انتخاب ژن‌های LTR و env به عنوان مناطقی جهت طراحی آغازگر ممکن است اختصاصیت لازم را نداشته باشد و استفاده از این نواحی با احتمال ایجاد واکنش متقاطع با سایر رتروویروسها همانند HIV-1 همراه می‌باشد که می‌تواند دقت نتایج را کاهش دهد. همچنین در مواردی با بارویروسی پایین ممکن است عملکرد ضعیفی داشته باشد. در حال حاضر آزمایشهای تشخیصی PCR کمی و کیفی اکثراً بر پایه تشخیص و تکثیر ژن TAX ویروس HTLV-1 ، طراحی شده‌اند. اگر چه این ژن مختص ویروس HTLV بوده و انتظار می‌رود که ژنوم ویروس با اختصاصیت بالا تکثیر شود، مطالعه‌های قبلی نشان داده‌اند که در مواردی ژن TAX توسط روش‌های مولکولی قابل شناسایی نیست که می‌تواند منجر به تولید نتایج منفی کاذب یا نامشخص گردد (11، 8).
با توجه به این مشکلات، استفاده از ژن‌های دیگری که در برابر جهش‌های توالی مقاوم‌تر هستند و کمتر تحت تأثیر تغییرات قرار می‌گیرند، می‌تواند در افزایش دقت و حساسیت روش‌های تشخیصی مؤثر باشد. یکی از این ژن‌ها، HBZ می‌باشد. پروتئین HBZ از روی رشته منفی پروویروس کد می‌شود و به طور ثابت در طول عفونت ویروسی بیان می‌گردد. این خصوصیات باعث شده‌اند که ژن HBZ به عنوان یک هدف مناسب برای طراحی آغازگرها در تشخیص HTLV-1مورد توجه قرار گیرد. در این مطالعه، به منظور بهبود دقت تشخیص و رفع مشکلات مربوط به جهش‌ها و میس‌مچ‌های موجود در آغازگرهای طراحی شده برای ژن‌های TAX و LTR ، از ژن HBZ به عنوان هدف اصلی برای طراحی آغازگرهای اختصاصی استفاده شد. پیشنهاد می‌شود در مطالعه‌های آینده، بررسی آغازگرهای طراحی شده، در مقیاس‌های بالینی و در جمعیت‌های بزرگ‌تر انجام شود. همچنین، بررسی پرووایرال لود و بیان ژن HBZ در نمونه‌های افراد مبتلا می‌تواند در درک بهتر دلایل ایجاد جواب‌های نامشخص آزمایش وسترن بلات مفید باشد.
نتیجه‌گیری
استفاده از ژنHBZ برای تشخیص عفونت ویروس HTLV ، به دلیل نقش آن در پاتوژنز ویروس و خصوصیات منحصر به فرد آن، به عنوان نقطه تمایز این مطالعه با تحقیقات پیشین که سایر بخش‌های ژنوم ویروس را بررسی کرده‌اند، است. نتایج به دست آمده در هر دو مرحله بررسی اینسیلیکو و بررسی در محیط آزمایشگاه نشان می‌دهد که آغازگرهای طراحی شده برای ژن HBZ قادر به شناسایی ژن هدف بوده و در تمایز نمونه‌های مثبت از منفی کارآمد است. همچنین آزمون semi-nested PCR طراحی شده در این مطالعه می‌تواند به عنوان یک روش مؤثر برای شناسایی عفونت ویروس HTLV مورد استفاده قرار بگیرد.
حمایت مالی
این پروژه توسط مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون تأمین مالی شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه به تأیید کمیته اخلاق مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون رسیده است (کد اخلاق: IR.TMI.REC.1402.017).
عدم تعارض منافع
هیچ‌گونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود نداشته
است.
نقش نویسندگان
مهدی زندی: نگارش اولیه مقاله و تجزیه و تحلیل اطلاعات
دکتر زهره شریفی: طراحی مطالعه، نظارت بر اجرای طرح و نگارش نهایی مقاله
دکتر مهدی آجورلو: نظارت بر اجرای طرح پژوهشی و نگارش مقاله
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد زیست فناوری مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی انتقال خون ایران است. بدیـن وسیلـه از ایـن مـؤسسه به خاطر حمایت‌های مالی آن تشکر می‌شود.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
ويروس شناسي
فهرست منابع
1. Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S 1980;77(12):7415-9. [DOI:10.1073/pnas.77.12.7415] [PMID] []
2. Baratella M, Forlani G, Raval GU, Tedeschi A, Gout O, Gessain A, et al. Cytoplasmic Localization of HTLV-1 HBZ Protein: A Biomarker of HTLV-1-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP). PLoS egl Trop Dis 2017;11(1):e0005285. [DOI:10.1371/journal.pntd.0005285] [PMID] []
3. Hedayati-Moghaddam MR. A Systematic Review for Estimation of HTLV-I Infection in the Blood Donors of Iran. Iran J Basic Med Sci. 2013;16(3):196-201.
4. Proietti FA, Carneiro-Proietti AB, Catalan-Soares BC, Murphy EL. Global epidemiology of HTLV-I infection and associated diseases. Oncogene. 2005;24(39):6058-68. [DOI:10.1038/sj.onc.1208968] [PMID]
5. Kia V, Forouzandeh Moghadam M, Paryan M, Raz A, Mirab cation of HBV and HTLV-I viruses by Melting curve Samiee S. Simultaneous detection and identifi analysis ofmultiplex Real-time PCR. Molecular and Biochemical Diagnosis Journal 2014;1(1):51-8.
6. Cánepa C, Salido J, Ruggieri M, Fraile S, Pataccini G,Berini C, et al. Low Proviral Load is Associated with Indeterminate Western Blot Patterns in Human T-Cell Lymphotropic Virus Type 1 Infected Individuals: Could Punctual Mutations be Related? Viruses 2015;7(11):5643-58. [DOI:10.3390/v7112897] [PMID] []
7. Green MR, Sambrook J. Nested Polymerase Chain Reaction (PCR). Cold Spring Harb Protoc. 2019 Feb 1;2019(2). [DOI:10.1101/pdb.prot095182] [PMID]
8. Caterino-de-Araujo A, Campos KR. Defective particles of human T-lymphotropic virus and negative results in molecular assays. Infect Genet Evol 2021;96:105141. [DOI:10.1016/j.meegid.2021.105141] [PMID]
9. Begum KT, Wnaiza J, Absar N, Az S. In Silico Primer Design for Accurate Detection of SARS-CoV-2 Delta Variants. JBCG 2022;5:104. [DOI:10.17303/jbcg.2022.5.104]
10. Gallego S, Mangano A, Gastaldello R, Sen L, Medeot S. Usefulness of a Nested-polymerase chain reaction for molecular diagnosis of human T-cell lymphotropic virus type I/II. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004 Jun;99(4):377-80. [DOI:10.1590/S0074-02762004000400006] [PMID]
11. Blanco S, Frutos MC, Balangero MC, Gallego SV. Human T-Lymphotropic virus type 1 infection in absence of tax gene: A challenge for molecular diagnosis. Infect Genet Evol 2021;90:104765. [DOI:10.1016/j.meegid.2021.104765] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
