Journal of Iranian Blood Transfusion

fa طراحی و ارزیابی این‌سیلیکو آغازگرهای اختصاصی ژن HBZ ویروس HTLV-1 جهت راه اندازی روش Semi-Nested PCR Design and In-Silico Evaluation of Specific Primers for the HBZ Gene of HTLV-1 to Establish a Semi-Nested PCR Method ويروس شناسي Virology پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده سابقه و هدف  ویروس لنفوتروپیک سلول T انسانی نوع 1 (HTLV-1)، تنها رتروویروس سرطان‌زای انسانی است که با بیماری‌های لوسمی/لنفوم سلول T بالغین و فلج اسپاستیک گرمسیری مرتبط می‌باشد. روش‌های سرولوژیکی رایج برای تشخیص این ویروس، الایزا و وسترن بلات می باشد. ژن HBZ ، که توسط رشته منفی پروویروس HTLV-1 کد می‌شود، برخلاف سایر ژن‌های ویروسی، دچار جهش‌های مداوم نمی‌شود. در این مطالعه، ژن HBZ ویروس HTLV-1 برای طراحی آغازگرهای اختصاصی و توسعه آزمایش Semi-nested PCR مورد استفاده قرار گرفت. مواد و روش‌ها در یک مطالعه مقطعی، توالی ژن HBZ از ایزوله‌های گوناگون ویروس ازپایگاه داده  NCBI استخراج شد و با نرم‌افزار MEGA6 هم‌ردیف گردید. طراحی آغازگر از ناحیه محافظت ‌شده مشترک بین تمامی سویه‌ها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner انجام شد. جهت ارزیابی آغازگرها، پارامترهایی از قبیل درصد GC ، دمای ذوب ، ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر از نرم‌افزارهای OligoAnalyzer و SnapGene استفاده شد. برای بررسی محل دقیق اتصال آغازگرها، جهت شببه‌سازی واکنش PCR و الکتروفورز، از نرم‌افزارSnapGene استفاده شد. آغازگرها با استفاده از ابزار BLASTN در NCBI بررسی و سنتز شدند. در مرحله آزمایشگاهی، DNA ژنومی استخراج‌ شده از نمونه‌های خون افراد HTLV-1 مثبت و سالم  جهت  واکنش Semi-Nested PCR  و ارزیابی محصولات PCR ، الکتروفورز شد. یافته‌ها ابتدا توالی‌های کدکننده پروتئین HBZ از ۴۳ ایزوله ویروسی با منشا جغرافیایی مختلف با همدیگر هم‌ردیف شدند، سپس آغازگرها از نواحی محافظت‌شده با بیشترین شباهت طراحی شدند. آغازگرها فاقد ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر  بودند .درصد GC  بین 60%-45% و دمای ذوب بین 67-64 درجه سانتی‌گراد بود. نتایج BLAST نشان داد که آغازگرهای طراحی شده، 100% قادر به شناسایی ژن هدف (HBZ) بوده و هم‌پوشانی  با توالی‌های ژنومی سایر ویروس‌ها یا انسان‌ها مشاهده نشد. پس از استخراج DNA ژنومی و انجام PCR ، طول قطعه مورد نظر در مرحله اول، 493 و در مرحله دوم، 106 جفت باز بود و با نتایج پیش‌بینی شده بیوانفورماتیکی مطابقت داشت. نتیجه گیری             طراحی آغازگرهای ژن HBZ با استفاده از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی و توسعه آزمایش Semi-Nested PCR با موفقیت انجام شد. نتایج آزمایشگاهی، پیش‌بینی‌های بیوانفورماتیکی را تایید کرده و کارآیی این روش را برای تشخیص دقیق‌ و سریع‌ ویروس نشان داد.  </div> <div style="text-align: justify;">A B S T R A C T Background and Objectives Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the only human oncogenic retrovirus associated with adult T-cell leukemia/lymphoma and tropical spastic paralysis. Common serological methods for detecting this virus are ELISA and Western blot. The HBZ gene, encoded by the negative strand of the HTLV-1 provirus, does not undergo continuous mutations, unlike other viral genes. In this study, the HBZ gene of HTLV-1 was used to design specific primers and develop a semi-nested PCR assay. Materials and Methods In a cross-sectional study, HBZ gene sequences from various virus isolates were extracted from the NCBI database and aligned using MEGA6 software. Using Gene Runner software, the primer design was performed from the conserved region common to all strains. To evaluate the primers, parameters such as GC content, melting temperature, hairpin, and dimer structures were used calculated by OligoAnalyzer software. To examine the exact binding site of the primers, SnapGene software was used to simulate the PCR reaction and electrophoresis. Primers were screened and synthesized using the BLASTN tool in NCBI. In the laboratory stage, genomic DNA was extracted from blood samples of HTLV-1 positive and healthy individuals and electrophoresed for Semi-nested PCR reaction and evaluation of PCR products. Results First, the HBZ protein coding sequences from 43 viral isolates with different geographical origins were aligned, and then primers were designed from the most similar conserved regions. The primers lacked hairpin and dimer structures. The GC percentage was between 45%-60%, and the melting temperature was between 64-67°C. BLAST results showed that the designed primers were 100% capable of identifying the target gene (HBZ), and no overlap with the genomic sequences of other viruses or humans was observed. After genomic DNA extraction and PCR, the length of the desired fragment was 493 bp in the first stage and 106 bp in the second stage, which was consistent with the predicted bioinformatics results. Conclusions  The design of HBZ gene primers utilizing bioinformatics software and the successful development of a Semi-nested PCR assay were achieved. The laboratory results confirmed the bioinformatics predictions and demonstrated the effectiveness of this method for the accurate and rapid detection of the virus.  </div> HTLV-1 , Nested PCR , لوسمی HTLV-1, Nested PCR, Leukemia 19 29 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1629-1&slc_lang=fa&sid=1 Mehdi Zandi مهدی زندی 9100319475328460026419 9100319475328460026419 No مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Zohreh Sharifi زهره شریفی Z.Sharifi@ibto.ir 9100319475328460026420 9100319475328460026420 Yes استاد مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Mehdi Ajorloo مهدی آجورلو 9100319475328460026421 9100319475328460026421 No استادیار مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون