جلد 22، شماره 1 - ( بهار 1404 )
جلد 22 شماره 1 صفحات 29-19 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Zandi M, Sharifi Z, Ajorloo M. Design and In-Silico Evaluation of Specific Primers for the HBZ Gene of HTLV-1 to Establish a Semi-Nested PCR Method. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2025; 22 (1) :19-29
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1567-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1567-fa.html
زندی مهدی، شریفی زهره، آجورلو مهدی. طراحی و ارزیابی این‌سیلیکو آغازگرهای اختصاصی ژن HBZ ویروس HTLV-1 جهت راه اندازی روش Semi-Nested PCR. فصلنامه پژوهشی خون. 1404; 22 (1) :19-29
استاد مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
چکیده: (612 مشاهده)
چکیده
سابقه و هدف
ویروس لنفوتروپیک سلول T انسانی نوع 1 (HTLV-1)، تنها رتروویروس سرطان‌زای انسانی است که با بیماری‌های لوسمی/لنفوم سلول T بالغین و فلج اسپاستیک گرمسیری مرتبط می‌باشد. روش‌های سرولوژیکی رایج برای تشخیص این ویروس، الایزا و وسترن بلات می باشد. ژن HBZ ، که توسط رشته منفی پروویروس HTLV-1 کد می‌شود، برخلاف سایر ژن‌های ویروسی، دچار جهش‌های مداوم نمی‌شود. در این مطالعه، ژن HBZ ویروس HTLV-1 برای طراحی آغازگرهای اختصاصی و توسعه آزمایش Semi-nested PCR مورد استفاده قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه مقطعی، توالی ژن HBZ از ایزوله‌های گوناگون ویروس ازپایگاه داده NCBI استخراج شد و با نرم‌افزار MEGA6 هم‌ردیف گردید. طراحی آغازگر از ناحیه محافظت شده مشترک بین تمامی سویه‌ها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner انجام شد. جهت ارزیابی آغازگرها، پارامترهایی از قبیل درصد GC ، دمای ذوب ، ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر از نرم‌افزارهای OligoAnalyzer و SnapGene استفاده شد. برای بررسی محل دقیق اتصال آغازگرها، جهت شببه‌سازی واکنش PCR و الکتروفورز، از نرم‌افزارSnapGene استفاده شد. آغازگرها با استفاده از ابزار BLASTN در NCBI بررسی و سنتز شدند. در مرحله آزمایشگاهی، DNA ژنومی استخراج شده از نمونه‌های خون افراد HTLV-1 مثبت و سالم جهت واکنش Semi-Nested PCR و ارزیابی محصولات PCR ، الکتروفورز شد.
یافته‌ها
ابتدا توالی‌های کدکننده پروتئین HBZ از ۴۳ ایزوله ویروسی با منشا جغرافیایی مختلف با همدیگر هم‌ردیف شدند، سپس آغازگرها از نواحی محافظت‌شده با بیشترین شباهت طراحی شدند. آغازگرها فاقد ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر بودند .درصد GC بین 60%-45% و دمای ذوب بین 67-64 درجه سانتی‌گراد بود. نتایج BLAST نشان داد که آغازگرهای طراحی شده، 100% قادر به شناسایی ژن هدف (HBZ) بوده و هم‌پوشانی با توالی‌های ژنومی سایر ویروس‌ها یا انسان‌ها مشاهده نشد. پس از استخراج DNA ژنومی و انجام PCR ، طول قطعه مورد نظر در مرحله اول، 493 و در مرحله دوم، 106 جفت باز بود و با نتایج پیش‌بینی شده بیوانفورماتیکی مطابقت داشت.
نتیجه گیری
طراحی آغازگرهای ژن HBZ با استفاده از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی و توسعه آزمایش Semi-Nested PCR با موفقیت انجام شد. نتایج آزمایشگاهی، پیش‌بینی‌های بیوانفورماتیکی را تایید کرده و کارآیی این روش را برای تشخیص دقیق و سریع ویروس نشان داد.
سابقه و هدف
ویروس لنفوتروپیک سلول T انسانی نوع 1 (HTLV-1)، تنها رتروویروس سرطان‌زای انسانی است که با بیماری‌های لوسمی/لنفوم سلول T بالغین و فلج اسپاستیک گرمسیری مرتبط می‌باشد. روش‌های سرولوژیکی رایج برای تشخیص این ویروس، الایزا و وسترن بلات می باشد. ژن HBZ ، که توسط رشته منفی پروویروس HTLV-1 کد می‌شود، برخلاف سایر ژن‌های ویروسی، دچار جهش‌های مداوم نمی‌شود. در این مطالعه، ژن HBZ ویروس HTLV-1 برای طراحی آغازگرهای اختصاصی و توسعه آزمایش Semi-nested PCR مورد استفاده قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه مقطعی، توالی ژن HBZ از ایزوله‌های گوناگون ویروس ازپایگاه داده NCBI استخراج شد و با نرم‌افزار MEGA6 هم‌ردیف گردید. طراحی آغازگر از ناحیه محافظت شده مشترک بین تمامی سویه‌ها با استفاده از نرم‌افزار Gene Runner انجام شد. جهت ارزیابی آغازگرها، پارامترهایی از قبیل درصد GC ، دمای ذوب ، ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر از نرم‌افزارهای OligoAnalyzer و SnapGene استفاده شد. برای بررسی محل دقیق اتصال آغازگرها، جهت شببه‌سازی واکنش PCR و الکتروفورز، از نرم‌افزارSnapGene استفاده شد. آغازگرها با استفاده از ابزار BLASTN در NCBI بررسی و سنتز شدند. در مرحله آزمایشگاهی، DNA ژنومی استخراج شده از نمونه‌های خون افراد HTLV-1 مثبت و سالم جهت واکنش Semi-Nested PCR و ارزیابی محصولات PCR ، الکتروفورز شد.
یافته‌ها
ابتدا توالی‌های کدکننده پروتئین HBZ از ۴۳ ایزوله ویروسی با منشا جغرافیایی مختلف با همدیگر هم‌ردیف شدند، سپس آغازگرها از نواحی محافظت‌شده با بیشترین شباهت طراحی شدند. آغازگرها فاقد ساختارهای سنجاق‌سری و دایمر بودند .درصد GC بین 60%-45% و دمای ذوب بین 67-64 درجه سانتی‌گراد بود. نتایج BLAST نشان داد که آغازگرهای طراحی شده، 100% قادر به شناسایی ژن هدف (HBZ) بوده و هم‌پوشانی با توالی‌های ژنومی سایر ویروس‌ها یا انسان‌ها مشاهده نشد. پس از استخراج DNA ژنومی و انجام PCR ، طول قطعه مورد نظر در مرحله اول، 493 و در مرحله دوم، 106 جفت باز بود و با نتایج پیش‌بینی شده بیوانفورماتیکی مطابقت داشت.
نتیجه گیری
طراحی آغازگرهای ژن HBZ با استفاده از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی و توسعه آزمایش Semi-Nested PCR با موفقیت انجام شد. نتایج آزمایشگاهی، پیش‌بینی‌های بیوانفورماتیکی را تایید کرده و کارآیی این روش را برای تشخیص دقیق و سریع ویروس نشان داد.
فهرست منابع
1. Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S 1980;77(12):7415-9. [DOI:10.1073/pnas.77.12.7415] [PMID] []
2. Baratella M, Forlani G, Raval GU, Tedeschi A, Gout O, Gessain A, et al. Cytoplasmic Localization of HTLV-1 HBZ Protein: A Biomarker of HTLV-1-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP). PLoS egl Trop Dis 2017;11(1):e0005285. [DOI:10.1371/journal.pntd.0005285] [PMID] []
3. Hedayati-Moghaddam MR. A Systematic Review for Estimation of HTLV-I Infection in the Blood Donors of Iran. Iran J Basic Med Sci. 2013;16(3):196-201.
4. Proietti FA, Carneiro-Proietti AB, Catalan-Soares BC, Murphy EL. Global epidemiology of HTLV-I infection and associated diseases. Oncogene. 2005;24(39):6058-68. [DOI:10.1038/sj.onc.1208968] [PMID]
5. Kia V, Forouzandeh Moghadam M, Paryan M, Raz A, Mirab cation of HBV and HTLV-I viruses by Melting curve Samiee S. Simultaneous detection and identifi analysis ofmultiplex Real-time PCR. Molecular and Biochemical Diagnosis Journal 2014;1(1):51-8.
6. Cánepa C, Salido J, Ruggieri M, Fraile S, Pataccini G,Berini C, et al. Low Proviral Load is Associated with Indeterminate Western Blot Patterns in Human T-Cell Lymphotropic Virus Type 1 Infected Individuals: Could Punctual Mutations be Related? Viruses 2015;7(11):5643-58. [DOI:10.3390/v7112897] [PMID] []
7. Green MR, Sambrook J. Nested Polymerase Chain Reaction (PCR). Cold Spring Harb Protoc. 2019 Feb 1;2019(2). [DOI:10.1101/pdb.prot095182] [PMID]
8. Caterino-de-Araujo A, Campos KR. Defective particles of human T-lymphotropic virus and negative results in molecular assays. Infect Genet Evol 2021;96:105141. [DOI:10.1016/j.meegid.2021.105141] [PMID]
9. Begum KT, Wnaiza J, Absar N, Az S. In Silico Primer Design for Accurate Detection of SARS-CoV-2 Delta Variants. JBCG 2022;5:104. [DOI:10.17303/jbcg.2022.5.104]
10. Gallego S, Mangano A, Gastaldello R, Sen L, Medeot S. Usefulness of a Nested-polymerase chain reaction for molecular diagnosis of human T-cell lymphotropic virus type I/II. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004 Jun;99(4):377-80. [DOI:10.1590/S0074-02762004000400006] [PMID]
11. Blanco S, Frutos MC, Balangero MC, Gallego SV. Human T-Lymphotropic virus type 1 infection in absence of tax gene: A challenge for molecular diagnosis. Infect Genet Evol 2021;90:104765. [DOI:10.1016/j.meegid.2021.104765] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
