میلاد رأفت1، محمد شکاری2، الهام نامجو2، فریبا یزدی2، کیانوش ملک‌زاده3
چکیده سابقه و هدف تالاسمی یک نقص ژنتیکی در ساخت زنجیره‌های هموگلوبین است. با شناسایی ناقلین و تشخیص قبل از تولد، می‌توان از بروز بیماریتالاسمی ماژور پیشگیری نمود. مورد زوج جوان ساکن بندرعباس، خانم 23 ساله با MCV:63fL; MCH:19; HbA2:3.9 و آقا 25 سالهبا HbF:36.4؛ HbA2:2.1؛ MCH:32 و MCV:94Flجهت مشاوره پیش از ازدواج به مرکز ژنتیک و تشخیص پیش از تولد بندرعباس مراجعه نمودند. نتیجه‌گیری جهش نادرCD139 (AAT→GAT) ، سبب جایگزینی آسپارتیک اسید به جای آسپاراژین در اسید آمینه 139 و بروز نوعی هموگلوبین بنام Hb Geelong می‌گردد. این مورد اولین گزارش Hb-Geelong در ایرانمیباشدبه نظر می‌رسد که این جهش بر پایداری مولکول هموگلوبین تاثیر گذاشته، ولیکن پاتولوژیک نبوده و تظاهرات فنوتیپی شبیه به تالاسمی مینور b+دارد. کلمات کلیدی:بتا تالاسمی، هموگلوبین، تشخیص پیش از تولد
تاریخ دریافت: 26/9/98 تاریخ پذیرش: 8 /2 /99
1- کارشناس ارشد ژنتیک انسانی ـ دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران 2- کارشناس ارشد ژنتیک ـ آزمایشگاه ژنتیک و تشخیص پیش از تولد دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران 3- مؤلف مسئول: دکترای ژنتیک پزشکی ـ آزمایشگاه ژنتیک و تشخیص پیش از تولد دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی هرمزگان ـ بندرعباس ـ ایران ـ صندوق پستی: 86848-79197
مقدمه تالاسمی، یکی از شایع‌ترین اختلالات خونی و بیماری‌های ژنتیکی است که سرتاسر جهان را درگیر نموده است. بیماری تالاسمی در دو شکل آلفا و بتا بروز می‌کند(2، 1). سازمان بهداشت جهانی، تالاسمی را به عنوان شایع‌ترین اختلال مزمن و ژنتیکی در 60 کشور جهان معرفی کرد به طوری که این بیماری در سال، تقریباً زندگی 10000 نفر را تحت تاثیر قرار می‌دهد(3). کشور ایران نیز از جمله کشورهایی است که بالاترین میزان شیوع را در کرانه‌های دریای خزر و خلیج فارس داراست (6-4). تالاسمی می‌تواند در زنجیره آلفا یا بتاهموگلوبین رخ دهد. شیوع آلفا تالاسمی نادر است اما بتا تالاسمی، شایع‌ترین اختلال تک ژنی اتوزوم مغلوب در سرتاسر جهان است و به علت جهش در ژن بتاگلوبین می‌باشد. بتا تالاسمی در سطح مولکولی بسیار هتروژن است به طوری که تاکنون بیش از200 جهش از آن شناسایی شده است(7).
پراکندگی آلل‌های بتا تالاسمی در جهان تصادفی نیست و هر جمعیت و قومی، آلل‌ها و پراکندگی جهش‌های ویژه خود را دارد که تعداد کمی از جهش‌های شایع با درصد زیاد و تعداد زیادی جهش نادر با درصد کمتری از کل جهش‌های هر جمعیت را شامل می‌شوند(8).
گزارش مورد زوج جوانی جهت انجام مشاوره ژنتیک قبل از ازدواج به آزمایشگاهژنتیکوتشخیص پیشاز تولدبندرعباس مراجعه کردند. گزارش CBC و الکتروفورز هموگلوبین خانم (23 ساله متولد و هم چنین ساکن بندرعباس)، دلالت بر فنوتیپ بتا تالاسمی مینور داشت (MCV:63fL; MCH:19; HbA2:3.9). در CBC و الکتروفورز هموگلوبین، آقای 25 ساله متولد کردستان و ساکن بندرعباس، میزان HbA گزارش شده 9/59% از کل هموگلوبین، میزان HbA2 1/2% وHbF 4/36% گزارش گردید که نشان‌دهنده وجود سطح غیر طبیعی HbF در این فرد بوده است(جدول 1).
جدول 1: اطلاعات هماتولوژیک و الکتروفورز هموگلوبین در خانم و آقا
جدول 2: آغازگرهای استفاده شده در PCR
جدول 3: نتایج آنالیز ژن بتاگلوبین برای هر دو زوج
شکل 1: نتایج تجزیه و تحلیل ژن بتا زوجین
استخراج DNA به روش Salting-out و به دنبال آن انجام آزمایش‌هایی جهت تجزیه و تحلیل ساختاری برای تعیین جهش‌های بتا-تالاسمی با روش توالی‌یابی مستقیم (sequencing) برای هر دو زوج انجام گردید(آغازگرهای 1 تا 3)(جدول 2). به دلیل بالا بودن HbF در آقا و با فرض احتمالی حذف بزرگ در خوشه ژنی که منجر به db0 و gdb0 می‌گردد، روش MLPA-β (کیت MRC ، هلند) برای کل خوشه ژنی بتا گلوبین برای آقا نیز انجام گرفت. جهش IVSI-5(G:C) در ژن زنجیره بتا برای خانم یافت شد. با روش ARMS-PCR ، آغازگرهای 3 تا 7 تایید شد که خانم حامل جهش شناخته شده IVSI-5(G:C) بوده و بنابراین مینور بتاتالاسمی بوده است(جدول 2). نتیجه منفی MLPA-β برای آقا دال بر عدم وجود حذف یا اضافه در خوشه ژنی بتا گلوبین آقا بوده و فرض db0 و gdb0 در آقا رد شد. در سکانس زنجیره ژن بتا آقا، جهش CD139 (AAT→GAT) به طور هتروزیگوت یافت گردید. بر اساس جستجو در وب‌سایت‌ها و پایگاه‌های اطلاعاتی، فقط سه گزارش دیده شد که دلالت بر این داشت که چنین جهشی سبب به وجودآمدن نوعی هموگلوبین کمیاب به نام Hb Geelong می‌گردد(9)(جدول 3 و شکل 1). بنابراین، CBC و الکتروفورز هموگلوبین آقا توسط آزمایشگاه تشخیصی دیگری تکرار شد و گزارش گردید که در حقیقت 7/35% مربوط به یک واریانت ناشناخته هموگلوبین است که بسیار نزدیک به منطقه HbF تولید پیک می‌کند. نمونه خون والدین آقا به همراه آزمایشهای CBC و الکتروفورز هموگلوبین آنان درخواست شد. وضعیت CBC و الکتروفورز هموگلوبین پدر آقا بسیار مشابه ایشان بود. جهش CD139 (AAT→GAT) به طور هتروزیگوت توسط روش توالی‌یابی مستقیم در زنجیره ژن بتا پدر آقا یافت گردید.
بحث در الکتروفورز هموگلوبین نمونه مورد مطالعه، درصد هموگلوبین A از مقدار طبیعی بسیار پایین‌تر بوده(حدود 59%) و هم‌چنین میزان بالایی HbF (حدود 36%) و HbA2 در حد طبیعی(2%) گزارش شده بود و با توجه به MCV=94fL ، گلبول‌های قرمز در رده نورموسیت قرار می‌گرفتند. بررسی‌های ژنتیکی صورت گرفته، وجود نوعی موتاسیون نادر منجر به تولید واریانتی از هموگلوبین بنام Hb Geelong را در این شخص به اثبات رساند. جایگزینی آسپارتیک اسید به جای آسپاراژین در اسید آمینه 139، بر پایداری مولکول Hb تاثیر گذاشته و باعث کاهش خفیفی درمیل ترکیبی به اکسیژن و تغییر اثر بور می‌شود ولیکن خواص الکتروفورز این واریانت، شبیه HbA بوده واین جهش هیچ گونه علایم بالینی از قبیل فقر آهن را سبب نمی شود. در حالت هتروزیگوت، CBC و الکتروفورز هموگلوبین، فنوتیپ بارز b+ از مینور تالاسمی را نشان می‌داد. تعداد بسیار معدودی گزارش درخصوص هموگلوبین Geelong تاکنون در دنیا وجود داشته است. اولین مورد با Hb Geelong ، توسط کومو و همکاران در سال 1991 در یک زن آلمانی، با فنوتیپ تالاسمی که درآن ژن Geelong به عنوان یک ژن تالاسمی از آزمایشهای هماتولوژیک و بیوسنتز گلوبین حاصل شد(9). در یک مورد دیگر هارانو و همکاران در سال 1997 در یک مرد در ژاپن، Hb Geelong را گزارش کردند(10). باقی‌مانده اسید آمینه Asn در زنجیره b139 در ارتباط با حفره مرکزی(central cavity) مولکول Hb در نزدیکی پاکت 2,3 DPG قرار دارد و در تماس با β82Lys است که به 2,3 DPG و b134Val متصل می‌شود. از آن‌جا که کاهش تمایل به اکسیژن در گونه‌های خاص Hb به تعداد بارهای منفی در حفره مرکزی مربوط می‌شود، این امکان وجود دارد که جایگزینی در این جایگاه بتواند بر پایداری مولکول Hb در حالت داکسیژنه تأثیر بگذارد و میل اکسیژن و اثر بور را تغییر دهد. از هموگلوبین‌های غیر طبیعی در زنجیره b در مکان اسیدآمینه 139(b139) می‌توان به [β139(H17)Asn→Lys]Hb-Hinsdale وHb-Sagami [β139(H17)Asn→Thr] اشاره کرد که دارای بار مثبت در حفره مرکزی می‌باشند و در نتیجه با کاهش تمایل به اکسیژن و کاهش همکاری(cooperativity) همراه هستند در حالی که [β139(H17)Asn→Tyr] Hb-Auroraبا یک جایگزینی خنثی باعث افزایش تمایل Hb به اکسیژن می‌شود(13-11). جایگزینی آسپاراتیک اسید با بار منفی به جای اسید آمینه آسپاراژین با بار خنثی در اسید آمینه139 درHb Geelong ، هم بر پایداری مولکول Hb درحالت غیر اشباع شدهتأثیرمیگذارد وهم باعث کاهش خفیف وابستگی به اکسیژن و تغییر اثر بور می‌شود. بنابراین به نظر می‌رسد که عوامل دیگری نیز باید به تعادل مولکول‌های غیراشباع شده و اکسیداسیون Hb مرتبط باشند(10). خواص الکتروفورز HbA و Hb Geelong در استات سلولز در هر دو حالت اسیدی و قلیایی مشابه است.به همین دلیل پیک این Hb-Geelong در الکتروفورز مشاهده نمی‌گردد.از سوی دیگر به طور کلی ساخت زنجیره b از آلل ایجادکننده واریانت، کاهش یافته و با توجه به تخریب پس از رونویسی واریانت هموگلوبین، سطح Hb Geelong در خون فرد هتروزیگوت بسیار کاهش می‌یابد(9). اختلالات در شاخص‌های خونی CBC و الکتروفورز هموگلوبین به واسطه Hb Geelong خفیف بوده و به نظر می‌رسد این واریانت هموگلوبین باعث هیچ کم خونی یا عوارض بالینی نمی‌شود. احتمال بروزβ0-thal/Hb-Geelong به صورت compound heterozygote در جنین این زوج جوان در هر حاملگی به احتمال 25% می‌بود که بروز یک صفت اینترمدیا محتمل بود. در خوش‌بینانه‌ترین حالت و با فرض همراه بودن آلفا تالاسمی به جهت متعادل شدن نسبت زنجیره آلفا به بتا، شاید احتمال بروز فنوتیپ مینور بتا تالاسمی نیز انتظار برود. فنوتیپ Hb Geelong به طور جامع توصیف نشده است. هم‌چنین در برخی از مقالات گزارش شده است که Hb Geelong یک نوع خفیف ناپایدار هموگلوبین است که به نظر می‌رسد فنوتیپ شدید مینور تالاسمیβ+ را در حالت هتروزیگوت نشان می‌دهد(9). در حقیقت این مورد اولین گزارش HbGeelong در ایران می‌باشد. با توجه به جستجو در منابع اینترنتی، این اولین مورد گزارش شده در بین جمعیت ایران بوده است. دیگر معدود گزارش‌ها موجود از سرتاسر جهان، حاکی از آن است که این نوع جهش نادر دارای هیچ‌گونه علایم بالینی از قبیل فقر آهن نبوده و تا قبل از مراجعه بیمار به آزمایشگاه ژنتیک و انجام آزمایشهای مربوط به حذف در خوشه ژنی بتا، این جهش ناشناخته باقی مانده بود. نتیجه‌گیری با توجه به شیوع بیماری تالاسمی در کشور، برنامه کشوری پیشگیری از بروز موارد جدید تالاسمی از طریق غربالگری در والدین است. در این برنامه، زوجین با اندکس‌های خونی غیر متعارف که مشکوک به تالاسمی مینور باشند، مورد مشاوره ژنتیک قرار می‌گیرند که متعاقباً با شناسایی جهش‌ها و افراد ناقل، مشاوره ژنتیک و انجام تشخیص پیش از تولد، راه عملی جلوگیری از بروز تالاسمی ماژور می‌باشد(17-14). در این راستا گرفتن نمونه CVS در هفته 10 تا 12 بارداری دارای اهمیت می‌باشد. با توجه به مورد بررسی شده فوق و نیز معدود گزارش‌هایی که از این هموگلوبین در سرتاسر جهان وجود دارد، به نظر می‌رسد که هموگلوبین Geelong یک هموگلوبین پاتولوژیک نباشد ولی تغییراتی شبیه به مینور تالاسمی β+ را در CBC و الکتروفورزیس موجب می‌گردد. از سوی دیگر تعیین نوع هموگلوبین و خصوصیت آن برای
مواردی که Hb-Unknown گزارش می‌گردد، به جهت تصمیم‌گیری نهایی بالاخص در تشخیص پیش از تولد الزامی به نظر می‌رسد. البته بایستی در نظر گرفت بعضی از انواع هموگلوبین‌ها و یا جهش‌ها توسط روش‌ها و امکانات آزمایشگاهی قابل افتراق نبوده و در اندکس‌های خونی نیز آن چنان تاثیر نمی‌گذارند ولی ممکن است در ترکیب با جهش‌های دیگر، کم خونی‌هایی از ملایم تا اینترمدیا را موجب گردد. گزارش‌هایی مبنی بر Hb-unknown و عدم تعیین نوع آن و هم‌چنین عدم تعین میزان تاثیر آن بر اندکس‌های خونی بالاخص در زمان تشخیص پیش از تولد الزامی و حیاتی است. بررسی زنجیره بتا برای شخصی با واریانت نادری از هموگلوبین‌ها - بالأخص اگر زوج ایشان مینور هم باشد - و تعیین نوع هموگلوبین و میزان پاتولوژیک آن در برنامه غربالگری توصیه اکید می‌گردد و نمی‌توان به الکتروفورز Hb و CBC اکتفا نمود.
Rafat M, Shekari M, Namjoo E, Yazdi F, Malekzadeh K. A Case Report of Hb-Geelong in Hormozgan Province. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2020; 17 (2) :140-146 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1321-fa.html
رافت میلاد، شکاری محمد، نامجو الهام، یزدی فریبا، ملک زاده کیانوش. گزارش یک مورد بیمار Hb-Geelong دراستان هرمزگان. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (2) :140-146
