جلد 13، شماره 1 - ( بهار 1395 )
جلد 13 شماره 1 صفحات 10-1 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Asghari kia L, Bashash D, Ghaffari S, Hamid poor M, Ghavamzadeh A. Induction of cell death and apoptosis in NB4 promyelocytic leukemic cells using Oligonucleotide as a telomerase antagonist . Sci J Iran Blood Transfus Organ 2016; 13 (1) :1-10
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-949-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-949-fa.html
اصغری‌کیا لیلا، بشاش داود، غفاری سید حمیدا...، حمیدپور محسن، قوام‌زاده اردشیر. القای آپوپتوز در سلولهای لوسمیک پرومیلوسیتی(NB4) توسط الیگونوکلئوتید ضد آنزیم تلومراز. فصلنامه پژوهشی خون. 1395; 13 (1) :1-10
کارگر شمالی ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 14111
متن کامل [PDF 479 kb]
(2590 دریافت)
| چکیده (HTML) (6919 مشاهده)
مقدمه
لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، زیر گروهی از لوسمیهای میلوئیدی حاد (Acute Myeloid Leukemia) است که با جابه‌جایی کروموزومی t (15:17) در 90%-85% موارد همراه بوده و منجر به تشکیل انکوپروتئین PML-RARα میشود (2، 1). تاکنون پنج ترانسلوکیشن کروموزومی درارتباط با این بیماری شناسایی شدهاند که همگی با درگیری ژن گیرنده رتینوئیک اسید (متابولیت فعال ویتامین A) یا همان RARα همراه هستند(3). این بیماری یکی از شدیدترین انواع بیماری AML همراه با خونریزی بوده و در کمتر از چندین هفته میتواند سبب مرگ بیماران شود(3). در بیماران تازه تشخیصداده شده، شیمیدرمانی خط اول دفاعی در این بیماران را تشکیل میدهد. با این رژیم درمانی فقط 45%-35% بیماران به بهبودی کامل حدود 25-11 ماه رسیده و خونریزیهای شدید در بعضی موارد مرگ بیماران را نیز به دنبال دارد. در سال 1985 معرفی ATRA سبب تحولی عظیم در درمان بیماریAPL شد. ATRA که ایزومری از ویتامین A میباشد، با القای تمایز و پیشبرد مراحل بلوغ باعث افزایش بهبودی کامل به حدود 85% میشود. با این حال درمان با ATRA در بعضی از بیماران حالت مقاومت دارویی را ایجاد میکند که سبب عود بیماری، بالا رفتن تعداد گلبولهای سفید و ایجاد سندرم کشنده رتینوئیک اسید (RAS) میشود(4).
مشخص شده است که مهم‌ترین تفاوت بین سلولهای سرطانی و طبیعی، توانایی تکثیر و رشد غیرقابل کنترل، تهاجم به بافتها و انتشار متاستاتیک این سلولها میباشد. فعالیت تلومراز و حفظ طول تلومرها، کلید اصلی توانایی سلولهای سرطانی برای نامیرا شدن میباشد(5). تلومرها توالیهای تکراریTTAGGG میباشند و به عنوان کلاهکی
در انتهای DNA ، از کروموزوم سلولهای یوکاریوتی محافظت میکنند. مشخص شده است که از دست رفتن تلومر به بیثباتی ژنتیکی، پیری و آپوپتوز منجر شده و وجود آنزیم تلومراز مانع از کوتاهی و فرسایش تلومرها شده و مسئول نامیرایی سلولهای تومورال و قابلیت تکثیر نامحدود این سلولها است(6). این آنزیم در بسیاری از سلولهـای سـوماتیـک بیـان نمـیشود، امـا در سلـولهای
سریع‌التکثیر مانند استم سلها (HSC)، سلولهای جنسی مردان و سلولهای سرطانی بیان میشود(5). این آنزیم از دو زیر واحـد کاتالیتیک تحت عنوان hTERT و یـک جـزء RNA به نام hTERC تشکیل شده است(6). با توجه به افزایش فعالیت آنزیم تلومراز در بیش از ۸۵% بدخیمی‌های انسان، این آنزیم به عنوان هدف درمانی بسیار امیدوار کننده جهت درمان سرطانها معرفی شده و اخیراً مهارکنندگان تلومراز به عنوان راهکارهای درمانی جدید مورد توجه شایانی قرار گرفتهاند(7).
از مهم‌ترین داروهای مهارکننده تلومراز میتوان به ترکیبات الیگونوکلئوتیدی مهارکننده hTERC اشارهکرد. ترکیبات الیگونوکلئوتیدی هم چون GRN163L با هدف قراردادن 11 نوکلئوتید واحد RNA تلومراز و با مهار رقابتی، از تشکیل کمپلکس hTERC با واحد کاتالیتیک TERT جلوگیری به عمل میآورد؛ روندی که با کوتاه شدن طول تلومر، الحاق کروموزومی، شکستهای کروموزومی و توقف تقسیم میتوزی همراه میشود(9، 8). تحقیقات مختلف نشان میدهند که GRN163L ، داروی مناسبی در مهار تلومراز و جلوگیری از تکثیر سلولهای سرطانی در بدخیمیهایی هم چونCLL ، سرطان پروستات، سرطان مری، مالتیپل میلوما و بسیاری دیگر از بدخیمیها میباشد(10، 9).
علی‌رغم این که درمان بیماران APL با سه استراتژی ATRA ،ATO و داروهای شیمیدرمانی موجب تحولی عظیم در درمان بیماران شده است، با این حال مواردی از بیماری مشاهده میشود که در برابر این درمانها مقاومت میکنند(12، 11). مطالعههای قبلی نشان دادهاند که نزدیک به 90 % از بیماران APL، به طور قابل توجهی دارای تلومرهای کوتاه(متوسط TRF: kb 5/3) میباشند که این امر بـازگوکننده افزایش فعالیـت پـرولیفراتیو سلولها در این بیماری است(13). هم چنین بیان شدهاست که طول تلومری کوتاه و افزایش فعالیت تلومراز در بیماران APL ، با پیشرفت و عود بیماری مرتبط بوده و نشاندهنده زیر مجموعهای از بیماران با بیماری تهاجمیتر و علائم بالینی شدیدتر است(14، 13). از طرفی دیگر تحقیقات مختلف نشان میدهند که سلولهایی با تلومر کوتاهتر و فعالیت تلومراز بالاتر، بیشتر از درمان ضد تلومراز بهرهمند خواهند شد(15)؛ لذا چشمانداز اضافهکردن درمانهای مبتنی بر مهار تلومراز میتواند در بیماران APL امیدوارکننده باشد و به نظر میرسد این بیماران، کاندید مناسبی برای درمان با مهارکنندگان تلومراز باشند(16). به این منظور و برای بررسی کارآیی استفاده از استراتژی درمان آنتیتلومراز در بیماری APL ، نوعی الیگونوکلئوتید در این مطالعه طراحی و نتایج حاصل از تیمار سلولهای NB4 با غلظتهای متفاوت این الیگونوکلئوتید مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
کشت سلولی:
در این مطالعه تجربی، سلولهایNB4 (رده سلولی انسانی (APL به صورت سوسپانسیون در محیط کشت 1640 RPMI حاوی mM2 از L- گلوتامین، FBS %10، پنیسیلین به میزان U/mL100 و استرپتومایسین به میزان µg/mL 100 در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و فشار ۵% از CO2 کشت داده شدند. سلولهای NB4از بانک سلولی انستیتو پاستور تهیه شد و برای بررسی حضور (15:17)t ، روش استاندارد کاریوتایپینگ انجام شد. همچنین این رده سلولی برای حضورmRNA ژن ترکیبی PML/RARα نیز مورد مطالعه قرار گرفت.
طراحی الیگونوکلئوتید:
در این مطالعه با توجه به تحقیق و مطالعه فراوان بر روی ساختار الیگونوکلئوتیدهای تجاری و اعمال تغییرات بر روی ساختار شیمیایی آنها، الیگونوکلئوتید جدیدی برای مهار آنزیم تلومراز طراحی شد. بدین ترتیب که الیگونوکلئوتید از 13 واحد نوکلئوتیدی 3' 5'-TAGGGTTAGACAA- اصلاح شده با ساختار N3'→P5' تیوفسفرآمید(phosphothioate linkage) تشکیل شده که مکمل منطقه RNA تلومراز میباشد. شایان ذکر است اصلاح جایگاههای تیو فسفرآمید، ارتباط داخل نوکلئوزیدی با RNA را برای ثبات ترمودینامیکی بالا و نیمه عمر طولانی الیگونوکلئوتید فراهم میکند؛ همچنین اصلاحات تیوفسفرآمید سبب مقاومت الیگونوکلئوتید در شرایط اسیدی و در برابر نوکلئازها میشود. در ضمن لازم به ذکر است که با تغییر در سکانس نوکلئوتیدی، الیگونوکلئوتید دیگری به عنوان الیگونوکلئوتید کنترل طراحی شد.
تیمار دارویی سلولها با الیگونوکلئوتید به روش ترانسفکشن :
برای تیمار دارویی سلولها با الیگونوکلئوتید طراحی شده از روش ترانسفکشن با لیپوفکتامین 2000 تهیه شده از شرکت اینویتروژن استفاده شد. در این روش سلولهای NB4 به تعداد 7000 سلول با استفاده از محیط RPMI حاوی FBS بدون آنتی بیوتیک در هر چاهک پلیت 96 خانه ریخته شدند. طبق دستورالعمل ارایه شده توسط شرکت اینویتروژن، عمل ترانسفکشن با الیگونوکلئوتید در غلظتهای مختلف 5، 10، 20، 30، 40 و 50 پیکومولار و غلظت ثابت µL 25/0 لیپوفکتامین بر روی سلولهای NB4 انجام گرفت؛ سلولها در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد حاوی 5% CO2 انکوبه شده و پس از گذشت 6 ساعت محیط کشت سلولها که حاوی الیگونوکلئوتید بود با محیط RPMI حاوی FBS بدون آنتی‌بیوتیک جایگزین شده و سلولها به مدت 48 ساعت دیگر انکوبه شدند.
کسب غلظت بهینه الیگونوکلئوتید و بررسی درصد زندهمانی سلولها:
در این مطالعه به منظور بهدست آوردن غلظت بهینه الیگونوکلئوتید طراحی شده مهارکننده تلومراز و همچنین بررسی تاثیر سایتوتوکسیک الیگونوکلئوتید بر میزان زندهمانی سلولها، از روش MTT استفاده شد. برای این کار از پلیت 96 چاهکی و با مقادیرمتفاوت 5 ،10 ،20، 30، 40 و 50 پیکومولار الیگونوکلئوتید و 25/0 میکرولیتر لیپوفکتامین 2000 استفاده شد. پلیتها در انکوباتور قرار داده شدند و 6 ساعت بعد از ترانسفکشن، محیط سلولها با محیط RPMI دارای FBS 10% تعویض شد و 48 ساعت بعد از ترانسفکشن، آزمون MTT انجام شد. به هر چاهک 100 میکرولیتر محلول MTT اضافه شده و پلیت به مدت 5 دقیقه شیک و به مدت 3 ساعت دیگر انکوبه شد. سپس پلیت به مدت 10 دقیقه با دور g350 سانتریفوژ گردید. سپس مایع رویی را دور ریخته و به رسوب سلولی ته هر چاهک 100 میکرولیتر محلول DMSO اضافه گردید. پس از مخلوط نمودن به مدت 5 دقیقه، پلیت را به مدت 5 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد انکوبه نمودیم. سپس جهت خواندن جذب نوری چاهکها، پلیت را در دستگاه الایزا ریدر قرار داده و در طول موج 570 نانومتر جذب نوری قرائت شد. به منظور افزایش بهره وری و بررسی مقایسهای، تمامی آزمایشها برای هر دوز به صورت تریپلیکیت انجام شد. میزان زندهمانی ایجاد شده با توجه به میانگین مقادیر OD از پلیت MTT که توسط دستگاه الایزا ریدر به دست‌آمده است طبق فرمول زیر محاسبه شد:
تعداد سلولهای زنده
100 * ـــــــــــــــــــــــــــ = درصد زندهمانی سلولها
مجموع سلولهای زنده و مرده
استخراج RNA :
برای استخراج RNA ابتدا سلولها با لیپوفکتامین 2000 و الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز ترانسفکت شده و بعد از 6 ساعت از ترانسفکشن، با محیط RPMI60 حاوی FBS 10% تعویض محیط صورت گرفت و به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از تیمار، سلولها جمعآوری شده و RNA سلولها با استفاده از کیتHigh Pure RNA Isolation شرکت روش استخراج شد و مقدار RNA با روش تعیین جذب نوری (OD) و میزان جذب در طول موج nm260 توسط دستگاه نانودراپ ND-1000 (نانودراپ تکنولوژیس - ویل مینگتون) اندازهگیری شد. هم چنین برای بررسی کیفیتRNA استخراج شده، 2 میکرولیتر از RNA استخراج شده را بر روی ژل آگاروز 5/1% با ولتاژ 140ولت در تانک الکتروفورز به مدت 15 دقیقه الکتروفورز کردیم.
ساخت cDNA :
برای ساخت cDNA در این تحقیق از کیت PrimeScript™ RT reagent (تاکارا بیو) استفاده شد. برای هر نمونه استخراج شده RNA ، یک لوله نیم میلی‌لیتری انتخاب شد. برای ساخت cDNA با توجه به تعداد نمونهها میزان مورد نیاز Master Mix تهیه گردید. حجم مورد نظر برای ساخت cDNA ، 20 میکرولیتر بوده و محتویات Master Mix برای هر واکنش شامل µL4 بافر X 5 PrimeScript™ ، µL1 از PrimeScript™ RT Enzyme ، µL 1 از آغازگر Oligo dT (µM 50)، µL 1 از mers 6 Random (µL 100) و µg 1 ازRNA مورد نظر میباشد که در نهایت با آب DEPC حجم مورد نظر به 20 میکرولیتر رسانده میشود. سپس لولهها 15 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد جهت انجام رونویسی معکوس و 5 ثانیه در 85 درجه سانتیگراد جهت غیرفعال شدن آنزیم نسخهبردار معکوس توسط تیمار حرارتی در دستگاه PCR قرار گرفتند. cDNA ساخته شده در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
ارزیابی بیان ژن با Real-Time PCR :
آزمون Real-Time PCR با استفاده از دستگاه Applied Biosystems StepOnePlus™ و در حجم 20 میکرولیتر انجام شد. به ازای هر واکنش، μL 10 از SYBR® Premix Ex Taq ™ ( 2X ) ، μL 2 از محصول cDNA ، μL5/0 از هر یک از آغازگرها( pMol10) و μL7 آب عاری از نوکلئاز اضافه شد(جدول1). شرایط دمایی مورد استفاده شامل یک مرحله آمادهسازی اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و سپس 40 چرخه برای دناتوراسیون(۵ ثانیه در ۹۵ درجه سانتیگراد) و مرحله آنیلینگ/اکستنشن توأم (20 ثانیه در ۶۰ درجه سانتیگراد) بود. برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت. از جمله مزایای Real-Time PCR ، ترسیم منحنی ذوب است که این عمل پس از اتمام فرآیند PCR انجام میشود و در واقع نوعی بررسی کیفی محسوب می‌گردد. دمایی که در آن DNA دو رشته‌ای دناتوره یا از هم باز میشود، نقطه ذوب خوانده میشود. از آن جایی که SYBR Green نمی‌تواند بین محصولات مختلف تفاوتی قائل باشد، میتوان با استفاده از منحنی ذوب(Melting Curve) تنوع محصولات را در فرآیند PCR مشخص کرد. در این آزمون از ژن HPRT به عنوان ژن مرجع استفاده شد. از آن جایی که سایبرگرین نمی‌تواند بین محصولات مختلـف تفـاوتی قائل باشد، با استفاده از منحنی
جدول 1: توالی آغازگرهای به کار رفته در مطالعه جهت آزمون Real-Time PCR
نمودار 1 : تعیین دوز بهینه الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز سلولهای NB4 در تعداد 7000 سلول در پلیت 96 خانهای به روش ترانسفکشن تحت تاثیر مقادیر مختلف 5 ،10 ،20 ، 30 ،40 و50 پیکومولار الیگونوکلئوتید و 25/0 میکرولیتر لیپوفکتامین 2000 قرارگرفته و پس از مدت زمان 48 ساعت انکوباسیون، درصد زندهمانی آنها محاسبه شد. نتایج نشان داد که با بالارفتن غلظت الیگونوکلئوتید مرگ سلولی در این سلولها بیشتر شده و بیشترین مرگ سلولی در غلظت pMol/µL 40 مشاهده شد. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دست آمده(001/0 p< *** ؛ 01/0 p< ** ؛ 05/0 p< *) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل میباشد.
شکل 1 : منحنی ذوب(راست) و منحنی تکثیر (چپ) ژنهای مورد بررسی: همان طور که در شکل دیده میشود، پس از مشتق‌‌گیری منحنی درجه دومی به دست میآید که وجود پیکهای ذوب با نقاط ماکزیمم واحد فلورسانس دلالت بر این امر دارد که رشته DNA تکثیر شده به طور اختصاصی رشته ژن مورد هدف 2Bax ,Bcl- و ژن مرجع HPRTمیباشد. از آنجا که دمای ذوب محصولات PCR با طول و توالیهای مختلف متفاوت است، لذا با استفاده از نمودار دمای ذوب (Melting Curve) میتوان DNA دو رشته‌ای هدف را شناسایی کرد. ΔRN : افزایش فلئورسانس نرمالیزه شده (Rn) در طول PCR
نمودار 2: تغییرات سطوح mRNA ژنهای Bax و 2 Bcl-در تیمار دارویی با الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز: نتایج به دست آمده از تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز و اثر آن بر روی بیان ژنهای 2Bax , Bcl- مبین این موضوع است که غلظت بهینه/µL pMol 40 الیگونوکلئوتید سبب افزایش بیان ژن Bax به میزان 2/1 برابر و کاهش بیان ژن 2Bcl- به میزان 3/. برابر در مقایسه با سلولهای تیمار نشده شده است. همان طور که در این نمودار نشان داده شده است، الیگونوکلئوتیدکنترل در غلظت /µL pMol 40 اثری بر روی بیان ژن Bax و 2Bcl- نداشته است. میانگین و انحراف معیار نتایج به دست آمده از دو ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه شد. هم چنین مقادیر p value به دست آمده آزمایش(001/0 p< *** ؛ 01/0 p< ** ؛ 05/0 p< *) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل میباشد. مقادیر p value به دست آمده برای ژن Bax و 2Bcl- در تیمار با غلظت 40 پیکومولار الیگونوکلئوتید به ترتیب 0126/0 و 0324/0 است.
نمودار 3 : تغییرات نسبت ژنهای 2Bax/Bcl- در تیمار سلولهایNB4 با الیگونوکلئوتید تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز باعث افزایش نسبت ژنهای 2Bax/Bcl- در غلظت اپتیموم/µL pMol 40 میشود. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از دو ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دست آمده (001/0 p< *** ، 01/0 p< ، 05/0 p< *) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
بحث
مشخـص شـده است که سلولهایی با تلومر کوتاهتر و
فعالیت تلومراز بالاتر، بیشتر از درمان ضد تلومراز بهرهمند خواهند شد؛ لذا چشمانداز اضافهکردن درمانهای مبتنی بر مهار تلومراز میتواند در بیماران APL امیدوار کننده باشد(17). الیگونوکلئوتیدهای مختلفی طراحی شدهاند که بهعنوان یک آنتاگونیست تلومراز عمل کرده و تمایل زیادی به منطقه الگوی RNA تلومراز (hTR) دارند. در واقع این مهارکنندهها با ممانعت از مونتاژ آنزیم تلومراز، مانع از فعالیت این آنزیم میشوند (18). با توجه به مطالعات گذشته و به منظور بررسی استراتژی کارایی درمان آنتی تلومراز در لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، در این مطالعه سلولهای لوسمیک NB4 تحت غلظتهای متفاوتی از الیگونوکلئوتید طراحی شده قرار داده شد. پس از انجام آزمایشها مشخص گردید که دوز بهینه الیگونوکلئوتید قادر است در کوتاه مدت منجر به افزایش مرگ سلولهای NB4 و کاهش درصد زندهمانی این سلولها شود. مطالعه‌هایی که بـر روی سلولهای سرطانی مری و مالتیپل میلوما انجام گرفت نیز حاکی از این واقعیت است که تیمار کوتاه مدت سلولهای سرطانی و توموری با الیگوکلئوتیدGRN163 ، موجب افزایش نقاط آسیب دیده و شکستهای DNA (DSB) و لذا افزایش پاسخ های آسیب DNA (DDR) و در نتیجه افزایش مرگسلولی و مهار رشد سلولهای توموری این سلولها میشود(19، 17). مشخص شده است که در برخی موارد، مهار تلومراز مستقل از کوتاهشدن تلومر و احتمالاً از طریق پاسخ آسیب DNA (DNA damage response) سبب القای مرگ سلولی می‌گردد(20). تحقیقات نشان میدهند برهم خوردن آرایش ساختمانی تلومرها و باز شدن T Loop تلومر تحت تاثیر الیگونوکلئوتیدها و در دسترس قرارگرفتن پروتئینهای TRF2 و POT1 از کمپلکس شلترین(Shelterin) تلومر میتواند باعث فعالشدن مکانیسمهای ترمیم آسیب DNA شود(22، 21). هم چنین فعال شدن این پاسخها باعث به خدمت گرفتن پروتئین p53 و فعالسازی پاسخ ATM میشود که به نوبه خود منجر به تشکیل کانونهایی ناشی از اختلال عملکرد تلومر و شکستهایی بر روی DNA می‌گردد که این مناطق موجب فعال شدن مکانیسمهای ترمیم آسیبDNA و سبب القای پدیده پیری و آپوپتوز در سلولها میشود(24، 23). هم چنین جهت مطالعه مکانیسم مولکولی دخیل در القای مرگ سلولی در سلولهای NB4 ، در این مطالعه به بررسی تغییرات بیان ژن Bax و 2Bcl-پرداخته شد. ژن Bax یکی از اعضای پروآپوپتوتیک خانواده 2Bcl- است که باعث پیشبرد آپوپتوز با نقش آنتاگونیستی برای 2Bcl- میشود(26، 25). نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز باعث افزایش بیان ژن Bax و کاهش بیان ژن 2Bcl- در سطح mRNA میشود. بنابراین میتوان متصور شد که الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز احتمالاً از طریق تنظیم فعالیت رونویسی 2Bcl- و Bax ، که نقش مرکزی را در تنظیم مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده دارند، سبب القای آپوپتوز در سلولهای لوسمیک پرومیلوسیتی میگردند. هم چنین در این بررسی افزایش نسبت 2Bax/Bcl ، بیانکننده سیر پروآپوپتوتیک در سلولهایNB4 در اثر تیمار با این دارو میباشد. در نتیجه در مطالعه انجام شده مشخص شد که الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز در کوتاهمدت دارای اثرات سایتوتوکسیک و آپوپتوتیک بر روی سلولهای پرومیلوسیتیک حاد NB4 میباشد که احتمالاً این اثرات میتواند به واسطه افزایش ژنهای پروآپوپتوتیکی هم چون Bax و کاهش ژنهای آنتی‌آپوپتوتیک کلیدی مانند2Bcl- در این سلولها باشد.
نتیجه‌گیری
با توجه به طول تلومر بیماران APL و فعالیت بالای آنزیم تلومراز و همچنین اثر بخشی الیگونوکلئوتید طراحی شده بر روی سلولهای پرومیلوسیتیک NB4 ، به نظر میرسد استفاده از الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز میتواند راه‌کاری جدید در درمان این بیماران باشد.
متن کامل: (1932 مشاهده)
القای آپوپتوز در سلولهای لوسمیک پرومیلوسیتی(NB4) توسط الیگونوکلئوتید
ضد آنزیم تلومراز
لیلا اصغری کیا1، داود بشاش2، سید حمیداله غفاری3، محسن حمیدپور4، اردشیر قوام‌زاده5
چکیده
سابقه و هدف
به دلیل فعالیت بالای آنزیم تلومراز در تکثیر اغلب سرطانها از جمله لوسمی پرومیلوسیتیکی حاد(APL)، مهار تلومراز روش مناسبی جهت درمان میباشد. در این مطالعه به بررسی اثر الیگونوکلئوتید ضد تلومراز بر روی القای مرگ سلولی و آپوپتوز سلولهای NB4 پرداختیم.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه تجربی، به منظور بررسی اثر الیگونوکلئوتید آنتاگونیست تلومراز، سلولها تحت دوزهای مختلف الیگونوکلئوتید قرار گرفتند. جهت بررسی اثر این دارو بر زندهمانی سلولها، آزمایش MTT انجام شد و جهت بررسی مولکولی القای آپوپتوز، بیان ژنهای دخیل در این روند به روش Real-Time PCR ارزیابی گردید.
یافته‌ها
الیگونوکلئوتید قادر به کاهش درصد زندهمانی و القای مرگ سلولی میباشد. تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید در غلظتهای 5، 10، 20، 30 و 40 پیکومولار، به صورت وابسته به دوز پس از طی 48 ساعت باعث کاهش درصد زندهمانی سلولها و مرگ سلولی گردید. شایان ذکر است میانگین درصد زنده مانی در غلظت 40 پیکومولار، 64% بود، در حالی که این درصد در تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید کنترل 94% میباشد. علاوه بر این، نتایج حاصل از این تحقیق نشان می دهد که مرگ سلولی القا شده با این الیگونوکلئوتید با افزایش بیان ژن Bax و کاهش بیان 2Bcl- همراه میباشد.
نتیجه گیری
با توجه به طول تلومر کوتاه و فعالیت بالای آنزیم تلومراز در بیماران APL و همچنین اثربخشی الیگونوکلئوتید در القای مرگ سلولی در سلولهای پرومیلوسیتیک NB4، میتوان درمانهای مبتنی بر استراتژی مهار آنزیم تلومراز را به عنوان راهکار مناسب در این بیماران مدنظر قرار داد.
کلمات کلیدی: لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، آپوپتوز، مرگ سلولی
تاریخ دریافت : 27/12/93
تاریخ پذیرش : 6 /8 /94
1- کارشناس ارشد خون‌شناسی و بانک خون ـ گروه هماتولوژی دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
2- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار گروه هماتولوژی دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
3- مؤلف مسئول: PhD ژنتیـک مولکولی ـ دانشیار مرکز تحقیقات خـون، انکولوژی و پیونـد سلولهای بنیادی بیمارستان شریعتی و دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ کارگر شمالی ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 14111
4- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
5- فوق تخصص خون و انکولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلولهای بنیادی بیمارستان شریعتی و دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
ضد آنزیم تلومراز
لیلا اصغری کیا1، داود بشاش2، سید حمیداله غفاری3، محسن حمیدپور4، اردشیر قوام‌زاده5
چکیده
سابقه و هدف
به دلیل فعالیت بالای آنزیم تلومراز در تکثیر اغلب سرطانها از جمله لوسمی پرومیلوسیتیکی حاد(APL)، مهار تلومراز روش مناسبی جهت درمان میباشد. در این مطالعه به بررسی اثر الیگونوکلئوتید ضد تلومراز بر روی القای مرگ سلولی و آپوپتوز سلولهای NB4 پرداختیم.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه تجربی، به منظور بررسی اثر الیگونوکلئوتید آنتاگونیست تلومراز، سلولها تحت دوزهای مختلف الیگونوکلئوتید قرار گرفتند. جهت بررسی اثر این دارو بر زندهمانی سلولها، آزمایش MTT انجام شد و جهت بررسی مولکولی القای آپوپتوز، بیان ژنهای دخیل در این روند به روش Real-Time PCR ارزیابی گردید.
یافته‌ها
الیگونوکلئوتید قادر به کاهش درصد زندهمانی و القای مرگ سلولی میباشد. تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید در غلظتهای 5، 10، 20، 30 و 40 پیکومولار، به صورت وابسته به دوز پس از طی 48 ساعت باعث کاهش درصد زندهمانی سلولها و مرگ سلولی گردید. شایان ذکر است میانگین درصد زنده مانی در غلظت 40 پیکومولار، 64% بود، در حالی که این درصد در تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید کنترل 94% میباشد. علاوه بر این، نتایج حاصل از این تحقیق نشان می دهد که مرگ سلولی القا شده با این الیگونوکلئوتید با افزایش بیان ژن Bax و کاهش بیان 2Bcl- همراه میباشد.
نتیجه گیری
با توجه به طول تلومر کوتاه و فعالیت بالای آنزیم تلومراز در بیماران APL و همچنین اثربخشی الیگونوکلئوتید در القای مرگ سلولی در سلولهای پرومیلوسیتیک NB4، میتوان درمانهای مبتنی بر استراتژی مهار آنزیم تلومراز را به عنوان راهکار مناسب در این بیماران مدنظر قرار داد.
کلمات کلیدی: لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، آپوپتوز، مرگ سلولی
تاریخ دریافت : 27/12/93
تاریخ پذیرش : 6 /8 /94
 |
1- کارشناس ارشد خون‌شناسی و بانک خون ـ گروه هماتولوژی دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
2- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار گروه هماتولوژی دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
3- مؤلف مسئول: PhD ژنتیـک مولکولی ـ دانشیار مرکز تحقیقات خـون، انکولوژی و پیونـد سلولهای بنیادی بیمارستان شریعتی و دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ کارگر شمالی ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 14111
4- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
5- فوق تخصص خون و انکولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلولهای بنیادی بیمارستان شریعتی و دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
مقدمه
لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، زیر گروهی از لوسمیهای میلوئیدی حاد (Acute Myeloid Leukemia) است که با جابه‌جایی کروموزومی t (15:17) در 90%-85% موارد همراه بوده و منجر به تشکیل انکوپروتئین PML-RARα میشود (2، 1). تاکنون پنج ترانسلوکیشن کروموزومی درارتباط با این بیماری شناسایی شدهاند که همگی با درگیری ژن گیرنده رتینوئیک اسید (متابولیت فعال ویتامین A) یا همان RARα همراه هستند(3). این بیماری یکی از شدیدترین انواع بیماری AML همراه با خونریزی بوده و در کمتر از چندین هفته میتواند سبب مرگ بیماران شود(3). در بیماران تازه تشخیصداده شده، شیمیدرمانی خط اول دفاعی در این بیماران را تشکیل میدهد. با این رژیم درمانی فقط 45%-35% بیماران به بهبودی کامل حدود 25-11 ماه رسیده و خونریزیهای شدید در بعضی موارد مرگ بیماران را نیز به دنبال دارد. در سال 1985 معرفی ATRA سبب تحولی عظیم در درمان بیماریAPL شد. ATRA که ایزومری از ویتامین A میباشد، با القای تمایز و پیشبرد مراحل بلوغ باعث افزایش بهبودی کامل به حدود 85% میشود. با این حال درمان با ATRA در بعضی از بیماران حالت مقاومت دارویی را ایجاد میکند که سبب عود بیماری، بالا رفتن تعداد گلبولهای سفید و ایجاد سندرم کشنده رتینوئیک اسید (RAS) میشود(4).
مشخص شده است که مهم‌ترین تفاوت بین سلولهای سرطانی و طبیعی، توانایی تکثیر و رشد غیرقابل کنترل، تهاجم به بافتها و انتشار متاستاتیک این سلولها میباشد. فعالیت تلومراز و حفظ طول تلومرها، کلید اصلی توانایی سلولهای سرطانی برای نامیرا شدن میباشد(5). تلومرها توالیهای تکراریTTAGGG میباشند و به عنوان کلاهکی
در انتهای DNA ، از کروموزوم سلولهای یوکاریوتی محافظت میکنند. مشخص شده است که از دست رفتن تلومر به بیثباتی ژنتیکی، پیری و آپوپتوز منجر شده و وجود آنزیم تلومراز مانع از کوتاهی و فرسایش تلومرها شده و مسئول نامیرایی سلولهای تومورال و قابلیت تکثیر نامحدود این سلولها است(6). این آنزیم در بسیاری از سلولهـای سـوماتیـک بیـان نمـیشود، امـا در سلـولهای
سریع‌التکثیر مانند استم سلها (HSC)، سلولهای جنسی مردان و سلولهای سرطانی بیان میشود(5). این آنزیم از دو زیر واحـد کاتالیتیک تحت عنوان hTERT و یـک جـزء RNA به نام hTERC تشکیل شده است(6). با توجه به افزایش فعالیت آنزیم تلومراز در بیش از ۸۵% بدخیمی‌های انسان، این آنزیم به عنوان هدف درمانی بسیار امیدوار کننده جهت درمان سرطانها معرفی شده و اخیراً مهارکنندگان تلومراز به عنوان راهکارهای درمانی جدید مورد توجه شایانی قرار گرفتهاند(7).
از مهم‌ترین داروهای مهارکننده تلومراز میتوان به ترکیبات الیگونوکلئوتیدی مهارکننده hTERC اشارهکرد. ترکیبات الیگونوکلئوتیدی هم چون GRN163L با هدف قراردادن 11 نوکلئوتید واحد RNA تلومراز و با مهار رقابتی، از تشکیل کمپلکس hTERC با واحد کاتالیتیک TERT جلوگیری به عمل میآورد؛ روندی که با کوتاه شدن طول تلومر، الحاق کروموزومی، شکستهای کروموزومی و توقف تقسیم میتوزی همراه میشود(9، 8). تحقیقات مختلف نشان میدهند که GRN163L ، داروی مناسبی در مهار تلومراز و جلوگیری از تکثیر سلولهای سرطانی در بدخیمیهایی هم چونCLL ، سرطان پروستات، سرطان مری، مالتیپل میلوما و بسیاری دیگر از بدخیمیها میباشد(10، 9).
علی‌رغم این که درمان بیماران APL با سه استراتژی ATRA ،ATO و داروهای شیمیدرمانی موجب تحولی عظیم در درمان بیماران شده است، با این حال مواردی از بیماری مشاهده میشود که در برابر این درمانها مقاومت میکنند(12، 11). مطالعههای قبلی نشان دادهاند که نزدیک به 90 % از بیماران APL، به طور قابل توجهی دارای تلومرهای کوتاه(متوسط TRF: kb 5/3) میباشند که این امر بـازگوکننده افزایش فعالیـت پـرولیفراتیو سلولها در این بیماری است(13). هم چنین بیان شدهاست که طول تلومری کوتاه و افزایش فعالیت تلومراز در بیماران APL ، با پیشرفت و عود بیماری مرتبط بوده و نشاندهنده زیر مجموعهای از بیماران با بیماری تهاجمیتر و علائم بالینی شدیدتر است(14، 13). از طرفی دیگر تحقیقات مختلف نشان میدهند که سلولهایی با تلومر کوتاهتر و فعالیت تلومراز بالاتر، بیشتر از درمان ضد تلومراز بهرهمند خواهند شد(15)؛ لذا چشمانداز اضافهکردن درمانهای مبتنی بر مهار تلومراز میتواند در بیماران APL امیدوارکننده باشد و به نظر میرسد این بیماران، کاندید مناسبی برای درمان با مهارکنندگان تلومراز باشند(16). به این منظور و برای بررسی کارآیی استفاده از استراتژی درمان آنتیتلومراز در بیماری APL ، نوعی الیگونوکلئوتید در این مطالعه طراحی و نتایج حاصل از تیمار سلولهای NB4 با غلظتهای متفاوت این الیگونوکلئوتید مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
کشت سلولی:
در این مطالعه تجربی، سلولهایNB4 (رده سلولی انسانی (APL به صورت سوسپانسیون در محیط کشت 1640 RPMI حاوی mM2 از L- گلوتامین، FBS %10، پنیسیلین به میزان U/mL100 و استرپتومایسین به میزان µg/mL 100 در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و فشار ۵% از CO2 کشت داده شدند. سلولهای NB4از بانک سلولی انستیتو پاستور تهیه شد و برای بررسی حضور (15:17)t ، روش استاندارد کاریوتایپینگ انجام شد. همچنین این رده سلولی برای حضورmRNA ژن ترکیبی PML/RARα نیز مورد مطالعه قرار گرفت.
طراحی الیگونوکلئوتید:
در این مطالعه با توجه به تحقیق و مطالعه فراوان بر روی ساختار الیگونوکلئوتیدهای تجاری و اعمال تغییرات بر روی ساختار شیمیایی آنها، الیگونوکلئوتید جدیدی برای مهار آنزیم تلومراز طراحی شد. بدین ترتیب که الیگونوکلئوتید از 13 واحد نوکلئوتیدی 3' 5'-TAGGGTTAGACAA- اصلاح شده با ساختار N3'→P5' تیوفسفرآمید(phosphothioate linkage) تشکیل شده که مکمل منطقه RNA تلومراز میباشد. شایان ذکر است اصلاح جایگاههای تیو فسفرآمید، ارتباط داخل نوکلئوزیدی با RNA را برای ثبات ترمودینامیکی بالا و نیمه عمر طولانی الیگونوکلئوتید فراهم میکند؛ همچنین اصلاحات تیوفسفرآمید سبب مقاومت الیگونوکلئوتید در شرایط اسیدی و در برابر نوکلئازها میشود. در ضمن لازم به ذکر است که با تغییر در سکانس نوکلئوتیدی، الیگونوکلئوتید دیگری به عنوان الیگونوکلئوتید کنترل طراحی شد.
تیمار دارویی سلولها با الیگونوکلئوتید به روش ترانسفکشن :
برای تیمار دارویی سلولها با الیگونوکلئوتید طراحی شده از روش ترانسفکشن با لیپوفکتامین 2000 تهیه شده از شرکت اینویتروژن استفاده شد. در این روش سلولهای NB4 به تعداد 7000 سلول با استفاده از محیط RPMI حاوی FBS بدون آنتی بیوتیک در هر چاهک پلیت 96 خانه ریخته شدند. طبق دستورالعمل ارایه شده توسط شرکت اینویتروژن، عمل ترانسفکشن با الیگونوکلئوتید در غلظتهای مختلف 5، 10، 20، 30، 40 و 50 پیکومولار و غلظت ثابت µL 25/0 لیپوفکتامین بر روی سلولهای NB4 انجام گرفت؛ سلولها در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد حاوی 5% CO2 انکوبه شده و پس از گذشت 6 ساعت محیط کشت سلولها که حاوی الیگونوکلئوتید بود با محیط RPMI حاوی FBS بدون آنتی‌بیوتیک جایگزین شده و سلولها به مدت 48 ساعت دیگر انکوبه شدند.
کسب غلظت بهینه الیگونوکلئوتید و بررسی درصد زندهمانی سلولها:
در این مطالعه به منظور بهدست آوردن غلظت بهینه الیگونوکلئوتید طراحی شده مهارکننده تلومراز و همچنین بررسی تاثیر سایتوتوکسیک الیگونوکلئوتید بر میزان زندهمانی سلولها، از روش MTT استفاده شد. برای این کار از پلیت 96 چاهکی و با مقادیرمتفاوت 5 ،10 ،20، 30، 40 و 50 پیکومولار الیگونوکلئوتید و 25/0 میکرولیتر لیپوفکتامین 2000 استفاده شد. پلیتها در انکوباتور قرار داده شدند و 6 ساعت بعد از ترانسفکشن، محیط سلولها با محیط RPMI دارای FBS 10% تعویض شد و 48 ساعت بعد از ترانسفکشن، آزمون MTT انجام شد. به هر چاهک 100 میکرولیتر محلول MTT اضافه شده و پلیت به مدت 5 دقیقه شیک و به مدت 3 ساعت دیگر انکوبه شد. سپس پلیت به مدت 10 دقیقه با دور g350 سانتریفوژ گردید. سپس مایع رویی را دور ریخته و به رسوب سلولی ته هر چاهک 100 میکرولیتر محلول DMSO اضافه گردید. پس از مخلوط نمودن به مدت 5 دقیقه، پلیت را به مدت 5 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد انکوبه نمودیم. سپس جهت خواندن جذب نوری چاهکها، پلیت را در دستگاه الایزا ریدر قرار داده و در طول موج 570 نانومتر جذب نوری قرائت شد. به منظور افزایش بهره وری و بررسی مقایسهای، تمامی آزمایشها برای هر دوز به صورت تریپلیکیت انجام شد. میزان زندهمانی ایجاد شده با توجه به میانگین مقادیر OD از پلیت MTT که توسط دستگاه الایزا ریدر به دست‌آمده است طبق فرمول زیر محاسبه شد:
تعداد سلولهای زنده
100 * ـــــــــــــــــــــــــــ = درصد زندهمانی سلولها
مجموع سلولهای زنده و مرده
استخراج RNA :
برای استخراج RNA ابتدا سلولها با لیپوفکتامین 2000 و الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز ترانسفکت شده و بعد از 6 ساعت از ترانسفکشن، با محیط RPMI60 حاوی FBS 10% تعویض محیط صورت گرفت و به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از تیمار، سلولها جمعآوری شده و RNA سلولها با استفاده از کیتHigh Pure RNA Isolation شرکت روش استخراج شد و مقدار RNA با روش تعیین جذب نوری (OD) و میزان جذب در طول موج nm260 توسط دستگاه نانودراپ ND-1000 (نانودراپ تکنولوژیس - ویل مینگتون) اندازهگیری شد. هم چنین برای بررسی کیفیتRNA استخراج شده، 2 میکرولیتر از RNA استخراج شده را بر روی ژل آگاروز 5/1% با ولتاژ 140ولت در تانک الکتروفورز به مدت 15 دقیقه الکتروفورز کردیم.
ساخت cDNA :
برای ساخت cDNA در این تحقیق از کیت PrimeScript™ RT reagent (تاکارا بیو) استفاده شد. برای هر نمونه استخراج شده RNA ، یک لوله نیم میلی‌لیتری انتخاب شد. برای ساخت cDNA با توجه به تعداد نمونهها میزان مورد نیاز Master Mix تهیه گردید. حجم مورد نظر برای ساخت cDNA ، 20 میکرولیتر بوده و محتویات Master Mix برای هر واکنش شامل µL4 بافر X 5 PrimeScript™ ، µL1 از PrimeScript™ RT Enzyme ، µL 1 از آغازگر Oligo dT (µM 50)، µL 1 از mers 6 Random (µL 100) و µg 1 ازRNA مورد نظر میباشد که در نهایت با آب DEPC حجم مورد نظر به 20 میکرولیتر رسانده میشود. سپس لولهها 15 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد جهت انجام رونویسی معکوس و 5 ثانیه در 85 درجه سانتیگراد جهت غیرفعال شدن آنزیم نسخهبردار معکوس توسط تیمار حرارتی در دستگاه PCR قرار گرفتند. cDNA ساخته شده در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
ارزیابی بیان ژن با Real-Time PCR :
آزمون Real-Time PCR با استفاده از دستگاه Applied Biosystems StepOnePlus™ و در حجم 20 میکرولیتر انجام شد. به ازای هر واکنش، μL 10 از SYBR® Premix Ex Taq ™ ( 2X ) ، μL 2 از محصول cDNA ، μL5/0 از هر یک از آغازگرها( pMol10) و μL7 آب عاری از نوکلئاز اضافه شد(جدول1). شرایط دمایی مورد استفاده شامل یک مرحله آمادهسازی اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و سپس 40 چرخه برای دناتوراسیون(۵ ثانیه در ۹۵ درجه سانتیگراد) و مرحله آنیلینگ/اکستنشن توأم (20 ثانیه در ۶۰ درجه سانتیگراد) بود. برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت. از جمله مزایای Real-Time PCR ، ترسیم منحنی ذوب است که این عمل پس از اتمام فرآیند PCR انجام میشود و در واقع نوعی بررسی کیفی محسوب می‌گردد. دمایی که در آن DNA دو رشته‌ای دناتوره یا از هم باز میشود، نقطه ذوب خوانده میشود. از آن جایی که SYBR Green نمی‌تواند بین محصولات مختلف تفاوتی قائل باشد، میتوان با استفاده از منحنی ذوب(Melting Curve) تنوع محصولات را در فرآیند PCR مشخص کرد. در این آزمون از ژن HPRT به عنوان ژن مرجع استفاده شد. از آن جایی که سایبرگرین نمی‌تواند بین محصولات مختلـف تفـاوتی قائل باشد، با استفاده از منحنی
جدول 1: توالی آغازگرهای به کار رفته در مطالعه جهت آزمون Real-Time PCR
| ژن | آغازگر جلوبرنده(5'-3') | آغازگر معکوس(5'-3') | اندازه(bp) |
| HPRT | TGGACAGGACTGAACGTCTTG | CCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTA | 111 |
| Bax | CGAGAGGTCTTTTTCCGAGTG | GTGGGCGTCCCAAAGTAGG | 242 |
| 2Bcl- | CGGTGGGGTCATGTGTGTG | CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC | 90 |
ذوب اختصاصیت محصولات در فرآیند PCR مشخص گشت. در انتها برای محاسبه تعداد نسخه mRNAتکثیر شده، از فرمول DDct -2 استفاده شد.
آنالیز آماری:
برای انجام مطالعههای آماری از ۱۸ SPSS استفاده شد. اختلاف معنادار بین متغیرهای آزمایش با استفاده از آزمون student two tailed تعییـن شد. مقادیر به دست آمده با 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز به صورت وابسته به دوز باعث کاهش زندهمانی سلولهای NB4 میشود:
با استفاده از روش MTT ، مقادیر غلظت بهینه الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز تعیین شد. در این روش مقادیر متفاوتی از الیگونوکلئوتید مورد استفاده قرار گرفت و زندهمانی سلولها پس از گذشت 48 ساعت محاسبه شد. نتایـج زنـدهمانی بـه دسـت آمـده از MTT در غلظتهای 5 ، 10، 20 ،30 ،40 و 50 پیکومـولار الیگونوکلئوتید به ترتیب: 82%، 78% ، 74% ،70% ، 64% و 89% بودند(نمودار 1).
با توجه به نتایج، دوز pMol 40 این مهارکننده به عنوان دوز بهینه در نظر گرفته شد. از الیگونوکلئوتید کنترل و سلولهای NB4 که عمل تیمار بر روی آنها انجام نگرفته بود، به عنوان کنترل استفاده شد و برای بررسی اثر سمیت لیپوفکتامین بر روی سلولها، خود لیپوفکتامین نیز به تنهایی بر روی سلولها ریخته شد. طی نتایج به دست آمده مشاهده شد که لیپوفکتامین بر روی سلولها اثر سمی نداشته و نتیجه زندهمانی حاصل از الیگونوکلئوتید کنترل در غلظت pMol 40 نیز 94% میباشد.
تاثیر الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز بر روی بیان ژن Bax و 2Bcl- :
به دنبال اثرات سایتوتوکسیک الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز، در این مطالعه به بررسی ژنهای کلیدی دخیل در القای مرگ سلولی و آپوپتوز پرداختیم. پس از انجام Real-Time PCR ، آنالیز منحنی ذوب نشان میدهد که هیچ گونه آغازگر دایمر و یا تکثیر DNAهای اضافی وجود نداشته و رشته DNAتکثیر شده به طور اختصاصی رشته DNA ژن هدف (Bax) میباشد(شکل 1). غلظت بهینه /µL pMol 40 به دست آمده از الیگونوکلئوتید طراحی شده سبب افزایش بیان ژن Bax به میزان 2/1 برابر در مقایسه با سلولهای تیمار نشده NB4 شده است، این در حالیاست که تغییر معناداری در بیان این ژن به واسطه تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید کنترل مشاهده نمیشود(نمودار 2). هم چنین بررسی بیان ژنها نشان داد که غلظت بهینه pMol40 الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز، موجب کاهش بیان ژن 2Bcl به میزان 3/0 برابر شده است، این در حالی است که الیگونوکلئوتید کنترل تاثیری در کاهش بیان این ژن نداشته است(نمودار 2). به منظور بررسی تغییر بیان ژنهای Bax و 2Bcl در تعیین سرنوشت سلول، نسبت 2Bax/Bcl اندازهگیری شد. نتیجه به دست آمده نشان داد که نسبت 2Bax/Bcl- در سلولهای NB4 تیمار شده با الیگونوکلئوتید به میزان 7/1 برابر افزایش داشته است، ولی در تیمار این سلولها با الیگونوکلئوتید کنترل، افزایشی مشاهده نشد(نمودار 3). هر چند که تغییرات ژنهای Baxو 2Bcl به تنهایی تفاوت چشمگیری با کنترل نداشته است اما نسبت 2Bax/Bcl که تعیین کننده بقا یا مرگ سلول میباشد، به طور معناداری افزایش پیدا کرده است که بیانگر القای مرگ سلولی میباشد.
آنالیز آماری:
برای انجام مطالعههای آماری از ۱۸ SPSS استفاده شد. اختلاف معنادار بین متغیرهای آزمایش با استفاده از آزمون student two tailed تعییـن شد. مقادیر به دست آمده با 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز به صورت وابسته به دوز باعث کاهش زندهمانی سلولهای NB4 میشود:
با استفاده از روش MTT ، مقادیر غلظت بهینه الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز تعیین شد. در این روش مقادیر متفاوتی از الیگونوکلئوتید مورد استفاده قرار گرفت و زندهمانی سلولها پس از گذشت 48 ساعت محاسبه شد. نتایـج زنـدهمانی بـه دسـت آمـده از MTT در غلظتهای 5 ، 10، 20 ،30 ،40 و 50 پیکومـولار الیگونوکلئوتید به ترتیب: 82%، 78% ، 74% ،70% ، 64% و 89% بودند(نمودار 1).
با توجه به نتایج، دوز pMol 40 این مهارکننده به عنوان دوز بهینه در نظر گرفته شد. از الیگونوکلئوتید کنترل و سلولهای NB4 که عمل تیمار بر روی آنها انجام نگرفته بود، به عنوان کنترل استفاده شد و برای بررسی اثر سمیت لیپوفکتامین بر روی سلولها، خود لیپوفکتامین نیز به تنهایی بر روی سلولها ریخته شد. طی نتایج به دست آمده مشاهده شد که لیپوفکتامین بر روی سلولها اثر سمی نداشته و نتیجه زندهمانی حاصل از الیگونوکلئوتید کنترل در غلظت pMol 40 نیز 94% میباشد.
تاثیر الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز بر روی بیان ژن Bax و 2Bcl- :
به دنبال اثرات سایتوتوکسیک الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز، در این مطالعه به بررسی ژنهای کلیدی دخیل در القای مرگ سلولی و آپوپتوز پرداختیم. پس از انجام Real-Time PCR ، آنالیز منحنی ذوب نشان میدهد که هیچ گونه آغازگر دایمر و یا تکثیر DNAهای اضافی وجود نداشته و رشته DNAتکثیر شده به طور اختصاصی رشته DNA ژن هدف (Bax) میباشد(شکل 1). غلظت بهینه /µL pMol 40 به دست آمده از الیگونوکلئوتید طراحی شده سبب افزایش بیان ژن Bax به میزان 2/1 برابر در مقایسه با سلولهای تیمار نشده NB4 شده است، این در حالیاست که تغییر معناداری در بیان این ژن به واسطه تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید کنترل مشاهده نمیشود(نمودار 2). هم چنین بررسی بیان ژنها نشان داد که غلظت بهینه pMol40 الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز، موجب کاهش بیان ژن 2Bcl به میزان 3/0 برابر شده است، این در حالی است که الیگونوکلئوتید کنترل تاثیری در کاهش بیان این ژن نداشته است(نمودار 2). به منظور بررسی تغییر بیان ژنهای Bax و 2Bcl در تعیین سرنوشت سلول، نسبت 2Bax/Bcl اندازهگیری شد. نتیجه به دست آمده نشان داد که نسبت 2Bax/Bcl- در سلولهای NB4 تیمار شده با الیگونوکلئوتید به میزان 7/1 برابر افزایش داشته است، ولی در تیمار این سلولها با الیگونوکلئوتید کنترل، افزایشی مشاهده نشد(نمودار 3). هر چند که تغییرات ژنهای Baxو 2Bcl به تنهایی تفاوت چشمگیری با کنترل نداشته است اما نسبت 2Bax/Bcl که تعیین کننده بقا یا مرگ سلول میباشد، به طور معناداری افزایش پیدا کرده است که بیانگر القای مرگ سلولی میباشد.
نمودار 1 : تعیین دوز بهینه الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز سلولهای NB4 در تعداد 7000 سلول در پلیت 96 خانهای به روش ترانسفکشن تحت تاثیر مقادیر مختلف 5 ،10 ،20 ، 30 ،40 و50 پیکومولار الیگونوکلئوتید و 25/0 میکرولیتر لیپوفکتامین 2000 قرارگرفته و پس از مدت زمان 48 ساعت انکوباسیون، درصد زندهمانی آنها محاسبه شد. نتایج نشان داد که با بالارفتن غلظت الیگونوکلئوتید مرگ سلولی در این سلولها بیشتر شده و بیشترین مرگ سلولی در غلظت pMol/µL 40 مشاهده شد. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از سه ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دست آمده(001/0 p< *** ؛ 01/0 p< ** ؛ 05/0 p< *) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل میباشد.
شکل 1 : منحنی ذوب(راست) و منحنی تکثیر (چپ) ژنهای مورد بررسی: همان طور که در شکل دیده میشود، پس از مشتق‌‌گیری منحنی درجه دومی به دست میآید که وجود پیکهای ذوب با نقاط ماکزیمم واحد فلورسانس دلالت بر این امر دارد که رشته DNA تکثیر شده به طور اختصاصی رشته ژن مورد هدف 2Bax ,Bcl- و ژن مرجع HPRTمیباشد. از آنجا که دمای ذوب محصولات PCR با طول و توالیهای مختلف متفاوت است، لذا با استفاده از نمودار دمای ذوب (Melting Curve) میتوان DNA دو رشته‌ای هدف را شناسایی کرد. ΔRN : افزایش فلئورسانس نرمالیزه شده (Rn) در طول PCR
نمودار 2: تغییرات سطوح mRNA ژنهای Bax و 2 Bcl-در تیمار دارویی با الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز: نتایج به دست آمده از تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز و اثر آن بر روی بیان ژنهای 2Bax , Bcl- مبین این موضوع است که غلظت بهینه/µL pMol 40 الیگونوکلئوتید سبب افزایش بیان ژن Bax به میزان 2/1 برابر و کاهش بیان ژن 2Bcl- به میزان 3/. برابر در مقایسه با سلولهای تیمار نشده شده است. همان طور که در این نمودار نشان داده شده است، الیگونوکلئوتیدکنترل در غلظت /µL pMol 40 اثری بر روی بیان ژن Bax و 2Bcl- نداشته است. میانگین و انحراف معیار نتایج به دست آمده از دو ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه شد. هم چنین مقادیر p value به دست آمده آزمایش(001/0 p< *** ؛ 01/0 p< ** ؛ 05/0 p< *) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل میباشد. مقادیر p value به دست آمده برای ژن Bax و 2Bcl- در تیمار با غلظت 40 پیکومولار الیگونوکلئوتید به ترتیب 0126/0 و 0324/0 است.
نمودار 3 : تغییرات نسبت ژنهای 2Bax/Bcl- در تیمار سلولهایNB4 با الیگونوکلئوتید تیمار سلولها با الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز باعث افزایش نسبت ژنهای 2Bax/Bcl- در غلظت اپتیموم/µL pMol 40 میشود. میانگین و انحراف معیار نتایج حاصل از دو ران کاری مختلف(mean ± SD) محاسبه و p value به دست آمده (001/0 p< *** ، 01/0 p< ، 05/0 p< *) نشاندهنده معنادار بودن نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل بود.
بحث
مشخـص شـده است که سلولهایی با تلومر کوتاهتر و
فعالیت تلومراز بالاتر، بیشتر از درمان ضد تلومراز بهرهمند خواهند شد؛ لذا چشمانداز اضافهکردن درمانهای مبتنی بر مهار تلومراز میتواند در بیماران APL امیدوار کننده باشد(17). الیگونوکلئوتیدهای مختلفی طراحی شدهاند که بهعنوان یک آنتاگونیست تلومراز عمل کرده و تمایل زیادی به منطقه الگوی RNA تلومراز (hTR) دارند. در واقع این مهارکنندهها با ممانعت از مونتاژ آنزیم تلومراز، مانع از فعالیت این آنزیم میشوند (18). با توجه به مطالعات گذشته و به منظور بررسی استراتژی کارایی درمان آنتی تلومراز در لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، در این مطالعه سلولهای لوسمیک NB4 تحت غلظتهای متفاوتی از الیگونوکلئوتید طراحی شده قرار داده شد. پس از انجام آزمایشها مشخص گردید که دوز بهینه الیگونوکلئوتید قادر است در کوتاه مدت منجر به افزایش مرگ سلولهای NB4 و کاهش درصد زندهمانی این سلولها شود. مطالعه‌هایی که بـر روی سلولهای سرطانی مری و مالتیپل میلوما انجام گرفت نیز حاکی از این واقعیت است که تیمار کوتاه مدت سلولهای سرطانی و توموری با الیگوکلئوتیدGRN163 ، موجب افزایش نقاط آسیب دیده و شکستهای DNA (DSB) و لذا افزایش پاسخ های آسیب DNA (DDR) و در نتیجه افزایش مرگسلولی و مهار رشد سلولهای توموری این سلولها میشود(19، 17). مشخص شده است که در برخی موارد، مهار تلومراز مستقل از کوتاهشدن تلومر و احتمالاً از طریق پاسخ آسیب DNA (DNA damage response) سبب القای مرگ سلولی می‌گردد(20). تحقیقات نشان میدهند برهم خوردن آرایش ساختمانی تلومرها و باز شدن T Loop تلومر تحت تاثیر الیگونوکلئوتیدها و در دسترس قرارگرفتن پروتئینهای TRF2 و POT1 از کمپلکس شلترین(Shelterin) تلومر میتواند باعث فعالشدن مکانیسمهای ترمیم آسیب DNA شود(22، 21). هم چنین فعال شدن این پاسخها باعث به خدمت گرفتن پروتئین p53 و فعالسازی پاسخ ATM میشود که به نوبه خود منجر به تشکیل کانونهایی ناشی از اختلال عملکرد تلومر و شکستهایی بر روی DNA می‌گردد که این مناطق موجب فعال شدن مکانیسمهای ترمیم آسیبDNA و سبب القای پدیده پیری و آپوپتوز در سلولها میشود(24، 23). هم چنین جهت مطالعه مکانیسم مولکولی دخیل در القای مرگ سلولی در سلولهای NB4 ، در این مطالعه به بررسی تغییرات بیان ژن Bax و 2Bcl-پرداخته شد. ژن Bax یکی از اعضای پروآپوپتوتیک خانواده 2Bcl- است که باعث پیشبرد آپوپتوز با نقش آنتاگونیستی برای 2Bcl- میشود(26، 25). نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز باعث افزایش بیان ژن Bax و کاهش بیان ژن 2Bcl- در سطح mRNA میشود. بنابراین میتوان متصور شد که الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز احتمالاً از طریق تنظیم فعالیت رونویسی 2Bcl- و Bax ، که نقش مرکزی را در تنظیم مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده دارند، سبب القای آپوپتوز در سلولهای لوسمیک پرومیلوسیتی میگردند. هم چنین در این بررسی افزایش نسبت 2Bax/Bcl ، بیانکننده سیر پروآپوپتوتیک در سلولهایNB4 در اثر تیمار با این دارو میباشد. در نتیجه در مطالعه انجام شده مشخص شد که الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز در کوتاهمدت دارای اثرات سایتوتوکسیک و آپوپتوتیک بر روی سلولهای پرومیلوسیتیک حاد NB4 میباشد که احتمالاً این اثرات میتواند به واسطه افزایش ژنهای پروآپوپتوتیکی هم چون Bax و کاهش ژنهای آنتی‌آپوپتوتیک کلیدی مانند2Bcl- در این سلولها باشد.
نتیجه‌گیری
با توجه به طول تلومر بیماران APL و فعالیت بالای آنزیم تلومراز و همچنین اثر بخشی الیگونوکلئوتید طراحی شده بر روی سلولهای پرومیلوسیتیک NB4 ، به نظر میرسد استفاده از الیگونوکلئوتید مهارکننده تلومراز میتواند راه‌کاری جدید در درمان این بیماران باشد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
