چکیده سابقه و هدف امروزه وارفارین به طور وسیعی توسط پزشکان تجویز میشود. عوامل مختلفی هم‌چون سن، جنس، رژیمغذایی، داروهای مصرفی و از همه مهمتر عوامل ژنتیکی در تعیین دوز وارفارین مؤثر میباشند. از عوامل مؤثر ژنتیکی میتوان به سه آلل اصلی ژنCYP2C9اشاره نمود. با توجه به روند رو به پیشرفت بیماری قلبی، این مطالعه جهت ارزیابی پلیمورفیسمهای رایج در بیماران تحت درمان با وارفارین انجام شد. مواد و روش‌ها مطالعهتجربی حاضر در سال 1390-1389در آزمایشگاه پیوند انجام گرفت. بیماران به دلایل مختلف از جمله مشکلات قلبی وارفارین دریافت میکردند. پلیمورفیسمهای ژن CYP2C9 به روش PCR-RFLP مورد بررسی قرار گرفتند و در نهایت یافته‌ها توسط نرمافزار 13 SPSS و آزمون آماری t-test تجزیه و تحلیل شدند. یافته‌ها مطالعه بر روی 100 بیمار انجام شده بود که 3/47% آن‌ها مؤنث و 7/52% آن‌ها مذکربودند. فراوانی افراد با آلل *1*1 ، *1*2 ، *1*3 و *2*3 برای ژن CYP2C9 به ترتیب 42/68% ، 52/10%، 94/18% و 1/2% بود. دوز روزانه وارفارین مصرفی در افراد با آلل *1*1 بیشتر از افراد با آلل *1*2 ، *1*3 و *2*3 بود(02/0 p= ؛ 57/1 ± 58/4 میلیگرم در روز). نتیجه گیری نتایج تحقیق نشان داد حضور پلیمورفیسم ژن CYP2C9 اثر مهمی بر دوز وارفارین مورد نیاز برای حفظ INR در محدوده 3-2 دارد. در این مطالعه آلل *1*2CYP2C9شایعترین پلیمورفیسمهای موجود بود ولی افراد با ژنوتیپهای *2*2 و *2*3نیز وجود دارند که اهمیت نیاز به بررسی ژنوتیپ وارفارین را در جامعه ایرانی نشان میدهد. کلمات کلیدی:وارفارین، ژنتیکپلیمورفیسم، پروتئینCYP2C9 انسانی ، ویتامین K
تاریخ دریافت : 12/12/93 تاریخ پذیرش : 3 /3 /94
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ دانشگاه علوم پزشکی یاسوج ـ یاسوج ـ ایران 2- PhD هماتولوژی ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران 3- متخصص قلب و عروق ـ استاد دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات قلب و عروق ـ بیمارستان شهید مدرس ـ تهران ـ ایران 4- مؤلف مسئول: PhD هماتولوژی و بانک خون ـ استادیار دانشگاه آزاد اسلامی ـ واحد پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1495/19395
مقدمه وارفارین متداولترین ضد انعقاد خوراکی برای پیشگیری و درمان بیماریهای ترومبوتیک است که در مواردی چون فیبریلاسیون دهلیزی، آریتمی قلبی، بیماری دریچه قلب، جراحیهای ارتوپدی و ترومبوفیلی به منظور کاهش خطر ترومبوز مورد استفاده قرار می‌گیرد. تجویز دوز مناسب وارفارین برای هر بیمار اهمیت فراوانی دارد زیرا مقادیر کمتر از دوز مورد نیاز بیمار منجر به وقوع ترومبوزهای تهدیدکننده حیات شده و مقادیر بیش از حد با خونریزیهای جدی همراه خواهند بود. بررسیها نشان دادهاند که حدود 1% بیماران دریافت کننده وارفارین در اثر مصرف دارو به خونریزیهای شدید دچار شده و فوت میکنند، علاوه بر این به دنبال مصرف وارفارین در 15% بیماران خونریزی با درجات خفیفتر مشاهده میشود(3-1). امروزه برای تنظیم دوز وارفارین از آزمایش PT-INR استفاده میشود که برای به حداقل رساندن عوارض دارویی وارفارین و نیز دستیابی به بهترین دوز درمانی و حفظ INR در محدوده 2 تا 3 بیماریهای ترومبوتیک ضروری است. براساس اکثر دستورالعمل‌ها، دستیابی به INR هدف به خصوص در هفتههای اول درمان نیازمند تجویز دوزهای در حدود 5 میلیگرم در روز (دوز نزدیک به دوز نگهداری) میباشد که پزشکان معالج با اندازهگیری متناوب PT-INR ، دوز مورد نیاز بیمار را تنظیم میکنند. مطالعه‌های مختلف نشان دادهاند تجویز دوز ثابت و مشخصی از وارفارین برای شروع درمان در تمام بیماران نیازمند وارفارین، منجر به مسمومیت دارویی در گروهی از بیماران شده و باعث عوارض خونریزی دهنده مرگبار به خصوص در هفتههای اول درمان میشود. بررسیهای بیشتر نشان میدهد به غیر از عواملی مانند سن، جنس، وزن، میزان تحرک و رژیم غذایی بیمار، ویژگیهای ژنتیکی (پلیمورفیسم ژنی) نیز در پاسخ بیمار به دارو، نقش تعیین کننده و بسیار مهمی دارند(2، 1). وارفارین یک مخلوط راسمیک میباشد واز دو ایزومر S و R به نسبت مساوی ( R-Warfarin 50% وS-Warfarin 50%) تشکیـل شـده است کـه قدرت S- وارفارین در مهار ویتامین K ،3 تا 5 مرتبه بیشتراز ایزومر R وارفارین میباشد، ولی حذف S وارفارین از بدن 3 مرتبه سریع‌تر از R وارفارین است. سیتوکروم P4502C9 ، آنزیم اصلی (بیش از 90%) جهت متابولیسم یا تجزیه کبدی S- انانتیومر وارفارین میباشد(4-2). ژن CYP2C9 بر روی کرومزوم 10 در محل بازوی بلند (q23.23) قرار دارد که آللهای آن در فرد نرمال به صورت CYP2C9 (*1*1) شناخته میشود. محصول این ژن پروتئینی با فعالیت آنزیمی بنام سیتوکروم P4502C9 میباشد. تحت تاثیر این آنزیم، S وارفارین به متابولیت‌های غیرفعال خود یعنی 6- هیدروکسی- S - وارفارین و 7- هیدروکسی- S - وارفارین تبدیل میشود و بدین طریق سطح پلاسمایی آن را کاهش میدهد. چندین پلیمورفیسم در ژن CYP2C9 وجود دارد که بر میزان فعالیت آنزیمهای متابولیزه کننده وارفارین اثر به سزایی دارند. تنوع در ژن CYP2C9 در افراد سفید پوست قابل توجه بوده(13%-8%) در حالی که در افرادی با تبار آسیایی و آفریقایی به ندرت دیده میشود. در پلیمورفیسم جایگاه 430، تیمیدین جایگزین سیتوزین شده(179985 rs ، C>T 430) و به عنوان آلل CYP2C9*2 شناخته میشود. این جابهجایی نوکلئوتیدی سبب ایجاد پروتئینی می‌گردد که در جایگاه 144 آن به جای آرژنین، سیستئین قرار گرفته است. پروتئین فعالیت آنزیمی کاهش یافته دارد. فعالیت این پروتئین نسبت به فرم طبیعی خود در حالت هتروزیگوت 20% و در حالت هموزیگوت میزان فعالیت پروتئین آن نسبت به فرم طبیعی خود 50 % کاهش مییابد(7-5). در پلی مورفیسم جایگاه 1075 ، سیتوزین جایگزین آدنین شـده(1057910 rs ، A>C 1075) و به عنوان آلل *3CYP2C9 شناخته میشود. در اثر این جایگزینی، اسید آمینه لوسین به جای اسید آمینه ایزولوسین در جایگاه 359 مینشیند که پروتئین اخیر دارای فعالیت آنزیمی حداقل بوده، میزان فعالیت آن نسبت به فرم طبیعی خود در حالت هتروزیگوت 10% کاهش مییابد. فراوانی این آلل در افراد سفیدپوست 10%-6% است. در صورتی که فرد یک آلل CYP2C9*2 و CYP2C9*3 را هم زمان داشته باشد (هتروزیگوت باشد)، دوز روزانه وارفارین به ترتیب 17% و 37% نسبت به زمانی که آلل طبیعی را به شکل هموزیگوت داشته باشد کاهش مییابد. در نتیجه در افراد حاوی آلل *3*2 عوارض خونریزی بیشتر از آلل *1 بوده و میزان دوز وارفارین کمتری نسبت به آلل *1 مورد نیاز است(8). زمانی که فرد به طور هم زمان آللهای *2 و *3 را داشته باشد، دوز وارفارین مورد نیاز بسیار پایینتر از میزانی است که فرد هر یک از این آللها را به تنهایی داشته باشد. بیماران بر اساس این پلیمورفیسمها در سه گروه متابولیزه کننده طبیعی، (با آلل CYP2C9*1)، کند (با آلل CYP2C9*2)و بسیار کند (با آلل CYP2C9*3) قرار میگیرند. سطح وارفارین در خون بیماران متابولیزه کننده کند و بسیار کند با همان دوز معمول، بالاتر از بیماران طبیعی است به همین جهت این افراد مستعد به خونریزی با شدت مختلف میباشند که ممکن است خطرناک بوده یا حتی منجر به مرگ شود(9، 8). باتوجه به روند رو به پیشرفت بیماری قلبی وعوارض ناشی از تزریق دوز نامناسب دارو و هم چنین جهت پیبردن به پلیمورفیسمهای شایع در این بیماران، این تحقیق انجام شد.
مواد و روش‌ها این مطالعه تجربی بر روی 100 بیمار که به بیمارستان مدرس تهران مراجعه کردند، انجام شد(5 بیمار به دلیل عدم اطلاع کافی از سوابق دموگرافی و بالینی خود از مطالعه خارج شدند). معیار ورود به این مطالعه مصرف داروی وارفارین بود. در ابتدای ورود، از بیماران فرم رضایت نامه کتبی گرفته شد سپس پرسشنامه مطالعه تکمیـل گردید. پس از تکمیل فرم، جهت انجام آزمایش، mL 5 خون محیطی )ضد انعقاد (EDTA-K2 جمع‌آوری شد. لولهها به آزمایشگاه منتقل و در آن جا لایه بافی‌کوت جدا شده وDNA با استفاده از کیت شرکت فرمنتاز طبق دستورالعمل کیت استخراج گردید. سپس برای اطمینان از کیفیت DNA استخراج شده، DNA کنترل کیفی شده و به روش واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) برای ژن بتا گلوبین از نظر سلامت (Integrity) DNA چک شد. PCR به طور عمومی با حجم نهایی 25 میکرولیتر که شامل 100 نانوگرم DNA ، 1 میکرولیتر از هر آغازگر، 5/2 میکرولیتر بافر X 10 ، 5/2 میکرولیتر MgCl2 ، 5/0 میکرولیتر dNTPs و 1 واحد از آنزیم پلیمراز Taq انجام شد(جدول 1).
جدول 1: شرایط انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز
تکرار
زمان
دما(درجه سانتیگراد)
1 سیکل
5 دقیقه
95
30 ثانیه
95
25 سیکل
30 ثانیه
55
20 ثانیه
72
1 سیکل
8 دقیقه
72
سپس 10 میکرولیتر از محصول PCR ، با 10 واحد از آنزیم اندونوکلئاز AvaII برای CYP2C9*2 در یک واکنش 25 میکرولیتری در 37 درجه سانتیگراد ، با 10 واحد آنزیم اندونوکلئاز AvaIII برای CYP2C9*3 در 37 درجه سانتیگراد و هم چنین با 10 واحد آنزیم Kpn1 برای CYP2C9*3 در 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شب هضم شد. محصولات PCR هضم آنزیمی شده روی ژل پلی‌آکریل آمید6% از هم جدا شدند(جدول 2).
جدول 2: محصولات PCR هضم آنزیمی شده
آلل
آنزیم
PCR قطعه
قطعه نرمال
قطعه جهش نرمال
CYP2C9*2
AvaII
690
521+169
690
CYP2C9*3
AvaIII
166
29+112
144+31
CYP2C9*3
Kpn1
166
166
135
پس از تکمیل اطلاعات بیماران، یافتههای آزمایشگاهی و پرسشنامه وارد نرمافراز 13 SPSS شد و آنالیز آماری صورت گرفت.
یافته‌ها ایـن مطالعـه بر روی 100 بیمار مصرف کننده وارفارین که شرایط ورود به مطالعه را داشتند انجام شد. میانگین سن در بیماران 3/61 سال (از 35 سال تا 84 سال) بود. 3/47% از بیماران مؤنث و 7/52% مذکر بودند. میانگین وزن در این گروه 8/68 کیلوگرم (40 تا 118کیلوگرم) بود. بیماران به دلایل گوناگون(10% به دلیل فشار خون بالا، 14% آریتمی قلبی، 22% تعویض دریچه قلب، 10% به دلیل سکته مغزی و قلبی، 4% به دلیل فیبروز دهلیزی، 14% فشار خون و سکته قلبی و 26% به دلیل سایر مشکلات قلبی) وارفارین مصرف میکردند. بر اساس این مطالعه، سن بر دوز وارفارین تاثیر قابل توجهی نداشت.
نمودار 1: درصد فراوانی آللهای ژن CYP2C9 در بیماران تحت مطالعه
جدول 3: میانگین وارفارین مصرفی در افراد مورد مطالعه با ژنوتیپ CYP2C9
ژنوتیپ CYP2C9
دوز وارفارین (میلیگرم/روز)
میانگین INR
*1*1
57/1 ± 58/4
25/2
*1*2
48/1 ± 9/2
51/2
*1*3
26/1 ± 72/2
57/2
*2*3
67/0 ± 65/2
5/2
در بیماران تحت مطالعه، فراوانی افراد با آلل طبیعی *1*1، *1*2، *1*3 و *2*3 برای ژن CYP2C9 به ترتیب 42/68%، 52/10%، 94/18% و 1/2% میباشد(نمودار1). با استفاده از نرمافزار 13 SPSS ، میانگین وارفارین مصرفی در افراد با ژنوتیپ CYP2C9 ، مشخص شد(جدول 3). دوز وارفـاریـن مصرفـی در افــراد با آلل طبیعی *1*1 و *1*2 بیشتر از افراد با آلل *1*3 بود.
بحث وارفارین رایج‌ترین داروی مورد استفاده برای پیشگیری و درمان بیماریهای ترومبوتیک است. سالانه افراد زیادی کاندید دریافت وارفارین به دلایلی چون فیبریلاسیون دهلیزی، آریتمی قلبی، بیماری دریچه قلب، ترومبوفیلی و غیره میباشند(10، 1). همان طور که مصرف دوز مناسب وارفارین میتواند کمک‌کننده باشد، دوز نامناسب آن نیز میتواند عوارض ناخواستهای را در پی داشته باشد. بنابراین تعیین دوز مناسب و پایش آن و هم چنین یافتن فاکتورهای خطر مؤثر برای هر بیمار، اهمیت فراوانی دارد. اگر چه سن، جنس، وزن، سابقه بیماری و بعضی از داروها از فاکتورهای مؤثر بر دوز مورد نیاز وارفارین میباشند اما امروزه نقش ژنتیک بسیار مطرح است(11، 10). هم اکنون در بسیاری از کشورها بررسیهای مولکولی ژنCYP2C9 به عنوان بیومارکری جهت تجویز دوز مناسب وارفارین و کاهش زمان رسیدن به دوز هدف و در نتیجه کاهش عوارض ناخواسته دارو، کاربرد دارد که این امر خود سبب کاهش مدت زمان بستری بیماران در بیمارستان و در نتیجه کاهش هزینه درمان میشود. مطالعه حاضر سه پلیمورفیسم مهم ژن CYP2C9 را مورد بررسی قرار داد که اهمیت پلیمورفیسمهای مذکور و نیز نتایج سایر مطالعه‌ها با تفصیل بیشتر به شرح زیر میباشد: بر اساس این مطالعه، سن بیماران بر دوز وارفارین مورد نیاز تاثیر قابل توجهی نداشت. در مطالعه حاضر فراوانی افراد با آلل طبیعی *1*1 42/68% ، *1*2 52/10% ، *1*3 94/18% و با آلل *2*3 1/2% بود که نشان میدهد آلل طبیعی*1*1 در جمعیت ایرانی هم چون سایر نژادها فراوانترین آلل بوده ولی بر خلاف بیماران چینی، کره‌ای، ژاپنی و مالزیایی که تنها آلل موتانت *3 را دارا میباشند و فاقد آلل موتانت *2 هستند، در جمعیت ایرانی هر دو آلل موتانت *3 و *2 حضور دارد کـه نشان‌دهنده تنوع بیشتر ژن CYP2C9 در جمعیت ایرانی میباشد(15-12). در جمعیت مورد مطالعه حاضر، آلل *3 از *2 شایعتر بوده در حالی که مطالعه‌های انجام شده در جمعیتهای ایتالیایی، بریتانیایی، هلندی، آمریکایی-آفریقایی، ترکیهای و اتیوپی، نشان دادند که آلل موتانت *2 شایعتر از *3 است. در این جمعیتها، جامعه مورد بررسی 184 نفر تا 1122 نفر بودند. جامعه مورد بررسی در مطالعه حاضر 100 بیمار میباشد پس با توجه به این که آلل طبیعی، شایعترین آلل در جوامع گوناگون میباشد و تعداد بیماران از نظر آلل موتانت نسبت به آلل طبیعی کمتر است، در جمعیت ایرانی جهت پیبردن به شایعترین آلل موتانت CYP2C9 نیاز به جامعه آماری بزرگتری است. در این مطالعه مشخص شد، برای حفظ INR در محدوده 3-2 در بیماران با آلل طبیعی *1*1 و *1*2 ، دوز بالاتری از وارفارین نسبت به افراد با آلل *1*3 و *2*3 مورد نیاز میباشد که این یافته با بسیاری از مطالعه‌ها در جمعیتهای دیگر که نشان میدهند پلیمورفیسم ژن CYP2C9 دوز روزانه وارفارین را نسبت به آلل طبیعی آن کاهش میدهد، هم‌خوانی دارد و برخلاف مطالعه‌های انجام شده در افراد هندی و سنگاپوری که نشان دادند پلیمورفیسم ژن CYP2C9 در تعیین دوز وارفارین مورد نیاز بی‌تاثیر میباشد، نشان داد که این پلیمورفیسمها در تعیین دوز وارفارین مصرفی مهم هستند(21-16). از مطالعه فوق چنین نتیجهگیری میشود که فراوانترین پلیمورفیسم در جمعیت مورد مطالعه *1*1 میباشد. ژنوتیپ ژن CYP2C9 در تعیین دوز وارفارین مورد نیاز بیماران مؤثر است و میتوان از ژن CYP2C9 به عنوان بیومارکر جهت تعیین دوز وارفارین استفاده نمود.
نتیجهگیری از مطالعه فوق چنین نتیجهگیری میشود که فراوانترین پلیمورفیسم در جمیعیت مورد مطالعه *1*1 میباشد. ژنوتیپ ژن CYP2C9در تعیین دوز وارفارین مورد نیاز بیماران مؤثر است و میتوان از CYP2C9 به عنوان بیومارکر جهت تعیین دوز وارفارین استفاده نمود.
تشکر و قدردانی بدین وسیله از کارکنان آزمایشگاه تشخیص طبی و تخصصی پیوند که ما را در انجام امور یاری نمودند، تشکر مینماییم.
Rad F, Hamidpour M, Saadat H, Poopak B. Evaluation of common polymorphism of CYP2C9 in Warfarin-treated patients. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2016; 12 (4) :340-346 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-943-fa.html
راد فریبا، حمیدپور محسن، سعادت حبیب‌اله، پوپک بهزاد. ارزیابی پلیمورفیسمهای رایج ژن CYP2C9 در بیماران تحت درمان با داروی وارفارین. فصلنامه پژوهشی خون. 1394; 12 (4) :340-346
