|
تنوع آللی واریانت R2185Q اگزون 37 ژن vWF در افراد ایرانی
|
شیرین شهبازی   ، هوشنگ بهاری تاشه کبود |
| تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 331-14115 |
|
| واژه‌های کلیدی: کلمات کلیدی : اگزون‌ها، بیماری فون‌ویلبراند، فراوانی آلل |
|
|
متن کامل [PDF 471 kb]
(1409 دریافت)
| چکیده (HTML) (5913 مشاهده)
|
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
ژنتيك
انتشار: 1394/1/18
|
|
|
|
|
|
|
متن کامل: (1287 مشاهده) |
تنوع آللی واریانت R2185Q اگزون 37 ژن vWF در افراد ایرانی
شیرین شهبازی1، هوشنگ بهاری تاشه کبود2
چکیده
سابقه و هدف
بیماری فون‌ویلبراند(vWD) یک اختلال خونریزی‌دهنده اتوزومی است که به واسطه نقص و نارسایی در فاکتور vWF ایجاد میشود. با توجه به مطالعه‌هایی که در سال 2007 در یک جمعیت کانادایی صورت گرفت، از تغییر R2185Q به عنوان جهش یاد کرده و آن را عاملی برای بیماری vWD نوع 1 در نظر می‌گیرند. تحقیقات اخیر نشان داد که جهش R2185Q و تغییرات دیگری که آن‌ها را عامل بیماری vWD می‌دانستند؛ با درصد مشخصی در افراد سالم هم دیده میشود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی، 297 فرد سالم مورد بررسی قرار گرفتند. سابقه خونریزی یا علایم مرتبط با آن توسط پرسشنامه‌های استانداردسازی شده، ارزیابی گردید. DNA ژنومی با روش Salting out استخراج گردید و با روش PCR-RFLP ژنوتایپ شد. نتایج با تعیین توالی نمونه‌ها تایید گردید.
یافته‌ها
مطالعه بر روی نمونه افراد سالم ایرانی از هر دو جنس و از همه قومیت‌ها صورت گرفت که در بین کل آن‌ها دو فرد سالم بدون سابقه بیماری خونریزی‌دهنده، هتروزیگوت واریانت R2185Q شناسایی شدند. این نتایج نشان داد فراوانی این آلل در مطالعه ما 33/0% است. این میزان از 1% کمتر بوده و با توجه به تعریف پلی‌مورفیسم، نمی‌توان آن را پلی‌مورفیسم جمعیت ایرانی نامید.
نتیجه گیری
ژن vWF واجد جهش‌ها و پلی‌مورفیسم‌های متعددی است که ویژگی جمعیتی دارند. برای دسترسی به الگوی جهش‌های ایرانی، لازم است مطالعه‌های متنوعی بر روی جمعیت افراد سالم صورت پذیرد تا ویژگی‌های پراکندگی تغییرات ژنی را آشکار سازد.
کلمات کلیدی: اگزون‌ها، بیماری فون‌ویلبراند، فراوانی آلل
تاریخ دریافت : 8/6 /93
تاریخ پذیرش : 21/8/93
1- مؤلف مسؤول: PhD ژنتیک ـ استادیار دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 331-14115
2- کارشناس ارشد زیست‌شناسی سلولی مولکولی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
مقدمه
فاکتور فون‌ویلبراند(vWF) در سلولهای اندوتلیال و مگاکاریوسیتها ساخته میشود. ژن vWF بر روی کروموزوم 12p13.2 قرار گرفته است و متشکل از 52 اگزون میباشد(1). محصول اولیه ژن vWF ، یک پروتئین 2813 آمینواسیدی است که نهایتاً به یک پپتید نشانه 22 اسید آمینهای، یک پروپپتید بزرگ 741 اسید آمینهای و یک مولکول vWF بالغ 2050 اسید آمینهای تقسیم میشود. طی یک مسیر دائمی و تنظیم شده،vWF از سلول ترشح میشود. مابقی آن به منظور ترشح سریع در اندامک‌های خاصی به نام اجسام ویبل- پالاده(Weible-palade bodies) که مختص سلولهای اندوتلیال می‌باشند، ذخیره میشود(3، 2).
vWF دارای دو نقش عمده در هموستاز است. نخست در چسبندگی پلاکت‌ها به دیواره رگ‌ها و میانکنش پلاکت - پلاکت ضروری است. دوم یک ناقل اختصاصی فاکتور VIII در پلاسما است. vWF، فاکتور VIII را از تجزیههای پروتئولیتیک حفاظت میکند و در نتیجه نیمه عمر آن را در جریان خون افزایش میدهد و به طور کارآمد و مؤثر، موقعیت آن را در جایگاههای آسیب عروقی تثبیت میکند. هر مونومر vWF یک دومین اتصالی دارد که در 272 اسید آمینه اول زیر واحد بالغ قرار داشته و میتواند به یک مولکول FVIII متصل شود، گرچه تنها 2%-1% مونومرهای در دسترس به وسیله FVIII اشغال میشوند(4).
بیماری فون‌ویلبراند(vWD)، یک اختلال خونریزی دهنده اتوزومی است که به واسطه نقص و نارسایی در فاکتور vWF ایجاد میشود. vWD شیوعی برابر با حدود یک درصد در کل جمعیت دارد. تظاهرات و نشانه‌های خونریزی متفاوتند اگر چه خونریزی‌های جلدی مخاطی در همه موارد vWD به طور تیپیک شایع است. مواردی که نقص نسبی کمی در vWF دارند، نوع 1 vWD را ایجاد می‌کنند که با تظاهرات خونریزی‌دهنده متنوعی روبرو هستند. در حالی که نقصان‌های کیفی در ساختار vWF , نوع 2 vWD را باعث میشود. نوع 3 vWD کمیاب‌تر است و بیماران مبتلا, خونریزی‌های شدید تا متوسط دارند و این امـر بـه دلیـل عـدم حضور vWF به واسطه الگوی مغلوب
وراثتی است(6، 5). تشخیص vWD, به خصوص نوع 1 به سختی انجام میگیرد زیرا فنوتیپ‌های آزمایشگاهی بسیار هتروژنوس هستند و هم چنین فاکتورهایی که خارج از ژن vWF هستند مثل گروه‌های خونی, سطح vWF را تحت تاثیر قرار میدهند. مجموعه‌ای از آزمایش‌ها برای تشخیص نوع vWD و تعیین درمان مناسب مورد استفاده قرار میگیرد. نوع 1 این بیماری حدود 70% همه انواع vWD را در بر میگیرد و به طور معمول در قالب خونریزی‌های مخاطی ملایم بروز میکند. گر چه در این نوع vWD ، در زمانی که سطح vWF کمتر از 15% باشد، علایم شدیدتر است. خونریزی بینی و کبودی نشانه‌های شایع در بچه‌های مبتلاست و منوراژی علامت شایع در زنان مبتلا در سنین باروری است(7). در vWD نوع 1 ، همه پارامترهای vWF کاهش یافتهاند. مولتی‌مرهای vWF از شکل‌های آن در پلاسمای نرمال قابل تشخیص نیست. در اکثر افراد مبتلا به vWD نوع 1 ، جهش‌های missense غالب هستند که ممکن است طی مکانیسم‌های مختلف، vWF را متأثر کنند(8).
تعداد جهش‌ها در ارتباط باvWD بسیار زیاد بوده و تاثیر هر کدام از آن‌ها بر بیان ژن vWF و پروتئین vWF متفاوت میباشد؛ یکی از این تغییرات R2185Q است که در اگزون 37 ژن مذکور قرار دارد و در اثر آن اسیدآمینه آرژنین تبدیل به گلوتامین میشود. با توجه به مطالعه‌هایی که در سال 2007 در یک جمعیت کانادایی صورت گرفت، از تغییر R2185Q به عنوان جهش یاد کرده و آن را عاملی برای بیماری vWD نوع 1 در نظر می‌گیرند(9). اخیراً مطالعه‌های بیشتری در این زمینه بر روی افراد سالم انجام گرفته است. این تحقیقات نشان داد که در بین افراد سالم تغییر یا جهش R2185Q و تغییرات دیگری که آن‌ها را پایه و اساسی برای بیماری vWD می‌دانستند؛ با درصد مشخصی دیده میشود که R2185Q به نسبت سایر تغییرات شایع‌تر است(10).
در مطالعه‌های انجام گرفته، این تغییرات را در جمعیت‌های اروپایی، امریکایی، آسیای شرقی و آفریقایی بررسی کرده‌اند که بیشترین تفاوت در جمعیت آفریقایی دیده شده است. از خاورمیانـه هیچ کشـوری مـورد مطالعه
قرار نگرفته است(11).
شیوع بالای بیماری vWD یادآور این نکته خواهد بود که بیماران زیادی از انواع مختلف این بیماری، بدون تشخیص وجود دارند. برای تشخیص مولکولی این بیماری داشتن الگوی جهش‌های ایرانی از اهمیت بالایی برخوردار است. با روشن شدن نتایج جدید درخصوص پراکندگی جغرافیایی این جهش‌ها در جمعیت‌های مختلف، اهمیت بومی‌سازی الگوهای جهشی درخصوص این بیماری مورد تاکید قرار گرفته است. از آن جا که دو مطالعه قبلی در اقوام مختلف نتایج غیر مشابه‌ای نشان داده است بر آن شدیم تا این مطالعه را در جمعیت ایرانی نیز انجام دهیم(11، 10).
مواد و روش‌ها
مطالعه به صورت توصیفی برای شناسایی میزان شیوع آلل R2185Q در جمعیت ایرانی طراحی شد. از آن جا که مطالعه مشابهی در کشور و منطقه در دسترس نبود و محاسبه آماری حجم نمونه دقیق به نظر نمی‌آمد، مبنا، مطالعه‌های منتشر شده قبلی که بین 150 تا 300 نمونه بود قرار گرفت. پس از اخذ رضایت‌نامه، 297 نمونه خون از افراد سالم بدون سابقه خونریزی از قومیت‌های مختلف ایرانی مراجعه‌کننده به مراکز بهداشتی ـ درمانی شهر تهران در لوله‌های استریل حاوی EDTA جمع‌آوری شد. پرسشنامه‌هایی جهت داشتن اطلاعات فردی و هم چنین آگاهی از عدم خونریزی‌های مشکوک به بیماری‌های انعقادی تدوین و تکمیل شد. استخراج DNA توسط روش Salting-out و بر اساس دستورالعمل مربوطه صورت گرفت. غلظت و کیفیت DNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ و الکتروفورز آگارز مورد بررسی قرار گرفت. توالی ژن vWF روی کروموزوم 12 به عنوان مرجع طراحی آغازگر قرار گرفت و با استفاده از نرم‌افزارهایGene runner و Primer express طراحی آغازگرهای مستقیم و معکوس انجام شد. پس از انتخاب آغازگرها با توالی: مستقیم 5′-AGG TCC TCC TCT CAC TG-3′ و معکوس 5′-CCA GGT CAT ACG AAA TAC AGG G-3′ به منظور اطمینان از اختصاصی بودن آن‌ها در اتصال به ناحیه مکملی خود در ژن مربوطه، توالی آغازگرها با تمامی توالی ژنوم انسانی در پایگاه اطلاعاتی NCBI ، بلاست گردید و صحت انتخاب توالی آغازگرها تایید شد.
واکنش PCR با مقادیر زیر در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: 2X PCR master mix (GenetBio) حاوی MgCl2 با غلظت نهایی 5/1 میلی‌مولار، dNTPs با غلظت نهایی 2/0 میلی‌مولار و 1 واحد آنزیمTaq polymerase ، آغازگرهای مستقیم و معکوس هر کدام با غلظت نهایی 4/0 میلی‌مولار و 40 نانوگرم DNA الگو، صورت پذیرفت. برنامـه PCR با واسرشته‌سازی اولـیه 5 دقیقـه‌ای در دمای 95 درجه سانتیگراد، 30 سیکـل با برنـامه 95 درجه سانتیگراد 1 دقیقه، 65 درجه سانتیگراد 1 دقیقه، 72 درجه سانتیگراد 30 ثانیه و در نهایت به مدت 10 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد در دستگاه PCR محصول شرکت ABI تنظیم گردید. سپس محصولات حاصل از PCR روی ژل آگارز 5/1% الکتروفورز شد.
در این مرحله، محصول PCR طبق دستورالعمل شرکت سازنده تحت تیمار با آنزیم محدود کننده Eco471 (AvaII) (Thermo Scientific) قرار گرفت و به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه و بعد از دو ساعت بر روی ژل 2% بارگذاری شد. نتایج به دست آمده بر اساس اندازه Ladder تفسیر و در هر بار الکتروفورز یک نمونه UN DIGEST هم برای مقایسه در نظر گرفته شد. به منظور تایید تشخیص، تعدادی از نمونه‌ها به صورت تصادفی انتخاب و تعیین توالی گردیدند.
یافته‌ها
پس از استخراج DNA با استفاده از آغازگرهای مستقیم و معکوس اختصاصی، ناحیه ژنی مربوط به واریانت R2185Q ژن vWF توسط PCR تکثیر و سپس تحت هضم آنزیمی (RFLP)قرار گرفتند و نتایج بر روی ژل آگارز 2% تفسیر گردید. در صورتی که فرد مورد نظر هموزیگوت آلل G بود؛ 3 باند با اندازههای 169 ، 98 و 38 bp دیده می‌شد ولی در صورتی که شخص هتروزیگوت آلل AG در آن ناحیه باشد، علاوه بر سه باند فوق‌الذکر، یک باند دیگر با سایز 267bp نیز بر روی ژل دیده می‌شـود. تفکیـک سایـز باندها در شکل 1 آورده شده است.
شکل 1: در تصویر بالا چاهک شماره 1 نمونه undigest ؛ چاهک‌های شماره 2 تا 11 نمونه‌های هموزیگوت آلل G و چاهک‌های شماره 12 و 13 نمونه‌های هتروزیگوت آلل AG می‌باشند.
شکل 2: نتایج تعیین توالی در جهت مستقیم برای دو فرد هتروزیگوت
جهت تایید نتایج PCR-RFLP ، نمونه‌ها برای انجام تعیین توالی از هر دو جهت مستقیم و معکوس آمادهسازی شد که نتایج تعیین توالی مستقیم در شکل 2 نشان داده شده است.
در کل نمونه‌های مورد بررسی تنها دو فرد به صورت هتروزیگوت برای این جهش یافت شدند. نمونه‌های هر دو فرد مجدداً آنالیز گردید و نتایج مورد تایید قرار گرفت. این دو فرد یک خانم 48 ساله و یک آقای 20 ساله بودند که سابقه ابتلا به بیماری خاصی نداشته و تجربه‌ای از اختلال انعقادی مانند کبودی یا خونریزی‌های مکرر نداشتند. علاوه بر آن هیچ سابقه‌ای از بیماری‌های انعقادی در افراد خانواده آن‌ها نیز وجود نداشت. یکی از آن‌ها ساکن تهران و دیگری ساکن رشت بود. با وجود پرسشنامه قبلی که از هر دو فرد تهیه گردیده بود، مجدداً با آن‌ها تماس گرفته شد و درخصوص علایم مورد انتظار که قبلاً گزارش شده بود سؤال گردید. مصاحبه مجدد هم نشان داد که هر دو فرد سابقه خونریزی و علایم انعقادی ندارند که جهت تکمیل تحقیق، درخواست انجام آزمایش‌های انعقـادی بـرای آنـان
آنان داده شد.
از آن جا که ژن vWF اتوزومال میباشد در نتیجه 594 آلل بررسی شده که از میان آن‌ها تنها دو آلل واجد واریانت R2185Q مشاهده شد. این نتایج نشان داد فراوانی آلل R2185Q در مطالعه ما 33/0% است.
بحث
یکی از ویژگی‌هایی که برای تشخیص جهش‌های پر خطر از جهش‌های بیماری‌زا استفاده میشود، فراوانی آلل است. متغیرهای توالی یا واریانت‌های ژنی که در بیش از یک درصد از جمعیتی ظاهر شوند، پلی‌مورفیسم شناخته میشوند. دانش ما از پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی با پروژه هپ‌مپ افزایش یافته است اما دانش ما از SNP هایی که منحصر به یک جمعیت یا یک گروه وراثتی است، هم‌چنان ناقص است. مطالعه‌های انجام شده سطح بالاتری از تنوع نوکلئوتیدی در آفریقایی‌ها در مقایسه با غیر آفریقاییان نشان داده است. این تنوع در همه ژن‌ها از جمله ژن vWF دیده شده است (12).
با وجود پیشرفت‌های مولکولی، تشخیص آلل‌های بیماری‌زا از پلی‌مورفیسم‌های بی‌خطر هم چنان دشوار است. اهمیت واریانت‌ها را می‌توان گاهاً و در صورت امکان با کمک مطالعه عملکردی یا مطالعه بر روی خانواده‌ها و یا به وسیله شناسایی متغیرها، شناسایی کرد.
مطالعه‌های گذشته حاکی از وجود تعداد زیادی پلی‌مورفیسم در ژن vWF میباشد. مطالعه‌های که اخیراً توسط بلیسیمو و همکارانش انجام شده نشان داده جهش‌هایی که پیشتر عامل مؤثر در پیدایش vWD در اروپاییان شناخته می‌شدند، تا 20% فراوانی در بین سرخ‌پوستان آمریکای شمالی دیده میشوند(10). این گونه‌های متفاوت ممکن است در اروپاییان بیماری‌زا و در دیگر افراد با وراثت‌های دیگر غیر بیماری‌زا باشد. مطالعه بلیسیمو گزارشی از 184 فرد کنترل سالم، شامل 118 سفید پوست و 66 سیاه پوست آمریکایی است که تغییرات متنوعی در آن‌ها مشاهده شده است. اغلب این تغییرات توالی به عنوان جهش‌های vWD نوع 1 گزارش شده بودند(قابل دسترسی در پایگاه داده ISTH-SSC vWF ). فراوانی 3 جهش M740I ، H817Q ، R2185Q در جمعیت سالم 15% تا 18% بود. نتیجه‌گیری شد که این جهش‌هایی که قبلاً بیماری‌زا اعلام شده بود، به طور معمول پلی‌مورفیسم‌هایی در سیاهپوستان آمریکایی هستند(10).
با گسترش سریع نسل جدید تکنولوژی‌های تعیین توالی(NGS)، تفسیر پلی‌مورفیسم‌های ژنتیکی در حجم بالای نمونه با سابقه ژنتیکی متفاوت ممکن شده است. با استفاده از این تکنولوژی جدید، تفاوت‌های ژنتیکی در بین 14 قومیت مختلف در سراسر جهان در فاز اول یک پروژه تحقیقاتی بررسی شد که افزایش قابل ملاحظه‌ای از لحاظ شیوع پلی‌مورفیسم‌ها در مقایسه با داده‌های منتشر شده قبلی داشت. این مطالعه که در سال 2013 انجام شده، به توصیف تنوع آللی در ژن vWF میپردازد. در این مطالعه نمونه‌ها و داده‌های مختلف پروژه G 1000 از 1092 فرد از 14 وراثت متفاوت و از 4 قاره به دست آمده است(11). از میان این جهش هایی که در جمعیت طبیعی گزارش شده، R2185Q قبلاً در یک بیمار اروپایی شاخص یافت شده بود، که البته هیچ مطالعه عملکردی در این خصوص اجرا نشده بود. در بین 19 جهش دیگر vWD، 7 عدد از آن‌ها طبق محاسبات نرم‌افزاری، زیان‌آور پیش‌بینی شده بودند(9). بعدها وقتی جهش‌های زیان‌آور با فراوانی آللی G 1000 تفسیر شدند، چهار عدد از آن‌ها در یکی از چهار قاره، MAF (minor Allele frequency) بیشتر از یک درصد داشتند(11).
در مجموع نتایج بررسی‌ها نشان میدهد که ژن vWF از نظر وراثتی تغییر یافته است اما این پیچیدگی وراثتی و سهم آن در بیماری‌ها نیازمند مطالعه‌های بیشتر در گروه‌های بزرگتر است. پنل‌های تشخیص مولکولی vWD ممکن است با در نظر گرفتن تنوع وراثتی انواع ویژه vWF در پیش‌بینی فنوتیپ خونریزی و نقص انعقاد، تکمیل‌تر گردد.
در مطالعه حاضر که بر اساس مطالعه ونگ و همکارانش در سال 2013 ، طراحی شده، در ابتدا پرسشنامه‌ای بر اساس همان پرسش‌هایی که در مطالعه ذکر شده استفاده شده بود مطرح گردید(11). هر دو پرسشنامه بر مبنای «نشانگرهای بالینی و موکلولی اروپایی» برای مطالعه تشخیص و مدیریت vWD نوع 1(MCMDM-1vWD) و نیز چند پرسش اضافی منحصر به ZPMCB-vWD طراحی شدند. در مطالغه‌های قبلی شیوع جهش R2185Q در آفریقایی تبارها 73/20% گزارش شد و در آمریکایی‌ها 21/2% افراد واجد این جهش بودند. در آسیایی‌ها که عمدتاً از شرق آسیا بودند، هیچ موردی دیده نشد. این نتیجه برای اروپایی‌ها هم تکرار شد و در جمعیت سالم آن‌ها نیز هیچ آللی از واریانت R2185Q مشاهده نشد. فراوانی آلل R2185Q در مطالعه ما 33/0% به دست آمد. این میزان از 1% کمتر است و با توجه به تعریف پلی‌مورفیسم نمی‌توان آن را پلی‌مورفیسم جمعیت ایرانی نامید در حالی که آلل بیماری‌زای جمعیت ایرانی نیز نمی‌تواند باشد چون حاملین آن علایم خاص بیماری را ندارند. این میزان از نظر جغرافیایی با شیوع R2185Q در
مطالعه ونگ و همکارانش قابل پیش‌بینی بود. مطالعه‌های بیشتر برای تایید نوع عملکرد جهش، تکمیل‌کننده این تحقیق خواهد بود.
نتیجه‌گیری
ژن vWF واجد جهش‌ها و پلی‌مورفیسم‌های متعددی است که ویژگی جمعیتی دارند. برای دسترسی به الگوی جهش‌های ایرانی، لازم است مطالعه‌های متنوعی بر روی جمعیت افراد سالم صورت پذیرد تا ویژگی‌های پراکندگی تغییرات ژنی را آشکار سازد.
تشکر و قدردانی
از تمام عزیزانی که در انجام این پروژه ما را یاری کردند قدردانی میشود. |
|
| ارسال پیام به نویسنده مسئول |
|
|
|
| ارسال نظر درباره این مقاله |
|
|
|
