جلد 12، شماره 2 - ( تابستان 1394 )
جلد 12 شماره 2 صفحات 152-143 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Beiki B, Zarrabi M, Radmanesh M. A rapid, simple and economical method for the isolationof mesenchymal stem cells from Wharton’s jellyby phosphate buffer saline. bloodj 2015; 12 (2) :143-152
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-863-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-863-fa.html
بیکی بهاره، ضرابی مرتضی، رادمنش مریم. یک روش سریع، ساده و مقرون به صرفه برای جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون با استفاده از فسفات بافر سالین(PBS). فصلنامه پژوهشی خون. 1394; 12 (2) :143-152
تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1665666311
متن کامل [PDF 749 kb]
(1931 دریافت)
| چکیده (HTML) (6741 مشاهده)
مقدمه
سلول‌های بنیادی مزانشیمی یا MSCs ، سلول‌های استرومایی چندتوانی هستند که می توانند به انواع سلول‌های مختلف از جمله: استئوبلاست‌ها(سلول‌های استخوانی)، کندروسیت‌ها(سلول‌های غضروفی) و آدیپوسیت‌ها (سلول‌های چربی) تمایز یابند.
مغز استخوان بالغ (BM)، رایج‌ترین منبع سلول‌های بنیادی مزانشیمی برای کاربردهای بالینی است(1). این سلول‌های بنیادی را می‌توان از بافت‌های مختلفی از جمله بافت چربی، خون بند ناف، پالپ دندان و بافت پیوندی بند ناف که ژله وارتون(WJ) نام دارد نیز به دست آورد(2). ژله وارتون بافت همبند مخاطی ابتدایی بند ناف است که بین اپیتلیوم آمنیوتیک و عروق بند ناف قرار گرفته است. این بافت برای اولین بار توسط توماس وارتون در سال 1656 شناسایی شد، این ماده ژلاتینی از پروتئوگلیکان‌ها و ایزوفرم‌های متفاوتی از کلاژن تشکیل شده است. نقش اصلی ژله وارتون جلوگیری از فشرده شدن، چرخش و خم شدن عروق بند ناف است(5-3). سلول‌های موجود در ژله وارتون، سلول‌های بنیادی مزانشیمی اولیه هستند که به احتمال زیاد درماتریکس بافت همبند طی مهاجرت از منطقه آئورت، گناد و مزونفروس(AGM ) جنین طی تکوین بند ناف به دام افتاده‌اند(5).
جوان‌ترین و ابتدایی‌ترین سلول‌های بنیادی مزانشیمی را می‌توان از ژله وارتون و خون بند ناف به دست آورد(5). بند ناف پس از تولد نوزاد به راحتی به دست آمده و به طور معمول به عنوان زباله پزشکی دور ریخته می‌شود(6). سلول‌های بنیادی به دست آمده از این بافت، منبعی ایمن و غیر تهاجمی را برای درمان با سلول‌های بنیادی ارایه می‌دهد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف دارای خصوصیات ابتدایی بیشتری نسبت به دیگر سلول‌های بنیادی مزانشیمی بزرگسالان که در مراحل بعدی زندگی به دست می‌آیند، می‌باشند. این سلول‌های بنیادی نه سلول‌های بنیادی جنینی(ESCs) و نه سلول‌های بنیادی سوماتیک بالغ(ASCs) هستند؛ آن‌ها دارای خصوصیاتی مابین سلول‌های بنیادی جنینی و بالغ بوده و ویژگی‌های هر دو نوع سلول بنیادی جنینی و سلول‌های بنیادی بالغ را نشان می‌دهند، این سلول‌ها هم دارای خواص پرتوانی، و هم ترمیم و نگهداری بافت‌های چند توان هستند، که این می‌تواند آن‌ها را به عنوان منبع مفیدی از سلول‌های بنیادی برای کاربردهای بالینی قرار دهد(7).
جداسازی این سلول‌های فیبروبلاست شکل از ژله وارتون در اصل به سال 1991 برمی‌گردد(8). از آغاز شناسایی این منبع، تعداد مطالعه‌های نسبتاً محدودی بر روی این سلول‌ها انجام شده است. روش‌های فنی برای جداسازی این سلول‌های بنیادی از ژله وارتون به میزان کمی بررسی شده و به طور چشمگیری با یکدیگر متفاوت است. اگر چه تیمار آنزیمی با کلاژناز روشی است که به طور گسترده برای جداسازی این سلول‌های استرومایی استفاده می‌شود، این تیمار نیز در مقالات مختلف بسیار متفاوت است(14-9). چندین گروه نیز از تیمار غیر آنزیمی استفاده کرده‌اند که مستلزم صرف مدت زمان زیادی می‌باشد(16، 15).
در این مطالعه از روش غیر آنزیمی، ساده و منحصر به فردی در حداقل زمان و بر اساس اثر PBS بر سست کردن و شکستن اتصالات بین سلولی برای رهایی سلول‌های مزانشیمی از ماتریکس کلاژنی ژله وارتون استفاده گردید.
مواد و روش‌ها
1- جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف از ژله وارتون و کشت آن‌ها:
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. تعداد 7 نمونه بند ناف از بانک خصوصی خون بند ناف رویان تهیه گردید. اهداکنندگان بند ناف، مادران سالم(بر اساس پرسشنامه پزشکی فاقد بیماری‌های زمینه‌ای و ژنتیکی و بر اساس آزمایش‌های سرولوژی، عاری از بیماری‌های ویروسی، سیفلیس، HTLV I/II ، HBV ، HCV ، HIV و CMV) با دوره حاملگی کامل بودند. بند ناف هنگام زایمان جمع‌آوری و در شرایط استریل، داخل PBS (آلمان، گیبکو) حاوی mg/mL 100 آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و استرپتومایسین (آلمان، گیبکو) به آزمایشگاه منتقل شد. در آزمایشگاه، بند ناف با الکل شسته شده و با PBS خون باقیمانده در رگ‌های بند ناف به طور کامل تخلیه گردید. بند ناف به قطعات 2 سانتی‌متری بریده شده و رگ‌های آن که شامل یک سیاهرگ بزرگ و دو سرخرگ کوچک است جدا گردید و بافت ژله وارتون به دست آمد. قطعات کوچک بافت ژله وارتون در بافر PBS قرار داده شد و به مدت 2 ساعت با دستگاه هموشیکر (شرکت دانش پژوهش فجر) با هم مخلوط و بر روی هم ساییده شدند. قطعات ژله وارتون دور انداخته شده و سوسپانسیون باقیمانده به مدت 5 دقیقه در 1500 دور بر دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب حاصله که حاوی سلول‌های بنیادی مزانشیمی است در محیط DMEM-LG (آلمان، گیبکو) حاوی 10% سرم جنین گاو(Fetal Bovin Serum) (گیبکو) شستشو داده شد و تعداد و میزان سلول‌های زنده (Viability) با استفاده از لام نئوبار و تریپان بلو 4% تعیین گردید.
سلول‌های جداسازی شده در پلیت 6 خانه و در محیط DMEM-LG شامل FBS (10%)، ال‌گلوتامین(آلمان، گیبکو) (mM2) و آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و استرپتومایسین، به مدت 5 روز در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 کشت داده شدند. پس از آن سلول‌های مزانشیمی چسبیده به پلیت کشت جهت تکثیر، با استفاده از مخلوط 05/0% تریپسین ـ EDTA (آلمان، گیبکو) جدا شده و به میزان 105 سلول در فلاسک 25 سانتی‌متر مربع کشت و پاساژ داده شدند.
سلول‌ها در پاساژهای 3 تا 7 توسط لام نئوبار شمارش شدند و جهت اثبات سلول‌های بنیادی مزانشیمی، این سلول‌ها به سه رده استخوان، غضروف و چربی تمایز داده شد و از روش فلوسایتومتری برای بررسی ایمونوفنوتایپینگ و درصد بیان مارکرهای اختصاصی سلول‌های بنیادی مزانشیمی استفاده شد.
تعیین زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی:
به منظور مقایسه سرعت رشد سلول‌های حاصل از هر پاساژ سلولی، زمان دو برابر شدن سلول‌ها در طول دوره کشت(پاساژ اول تا هفتم) اندازه‌گیری شد. برای این منظور از فرمول زیر استفاده گردید. در این رابطه ، PDT تعداد دو برابر شدن جمعیت سلولی(Population Doubling Time)، N0 تعداد سلول در شروع کشت، N تعداد سلول در پایان کشت و CT مدت زمان دوره کشت(Culture Time) به ساعت می‌باشد.
PDT=
بررسی ایمونوفنوتیپ سلول‌ها:
برای بررسی ایمونوفنوتایپینگ سلول‌های کشت یافته، تعداد 106 سلول مورد استفاده قرار گرفت. 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی دو رنگ Mouse IgG1-FITC/Mouse IgG1-RPE/Isotype control (داکو) به 105 سلول در 100 میکرولیتر PBS به عنوان ایزوتایپ کنترل و 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های Mouse Anti Human CD105-PE ، Mouse Anti Human CD90-FITC، Mouse Anti Human CD44-PE ، Mouse Anti Human CD73-PE ، Mouse Anti Human CD34/45-PE/FITC ، Mouse Anti Human HLA DR-PE و Mouse Anti Human CD133-PE (همه از شرکت بکتون دیکینسون آمریکا) به همان تعداد سلول در لوله‌های جداگانه اضافه شد. پس از 45 دقیقه انکوباسیون در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و اتاق تاریک، 1 میلیلیتر از محلول PBS جهت شستشو به لوله‌ها اضافه گردید و پس از 5 دقیقه سانتریفوژ در 1500 دور بر دقیقه، محلول رویی جدا و به رسوب سلولی حاصل 300 میکرولیتر محلول PBS اضافه شد. نمونه‌های آماده شده در دستگاه فلوسایتومتری BD (آمریکا، بکتون دیکینسون)FACS Calibur در طـول مـوج 488 نانومتر، با فیلترهای nm BP 30/530 برای FITC وnm BP 42/585 برای PE به وسیله نرم‌افزارFlowing software مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
بررسی توان تمایزی سلول‌ها:
برای اثبات ماهیت مزانشیمی، سلول‌های تخلیص شده از ژله وارتون پس از 5 روز کشت، پاساژ داده شدند، سپس سلول‌های جمع‌آوری شده، از پاساژ 3 وارد محیط‌های تمایزی غضروف، چربی واستخوان شدند.
تمایز به استخوان:
برای تمایز به استخوان، سلول‌ها با تراکم 100000 سلول در چاهک یک پلیت 12خانه و در محیط DMEM کشت شدند. بعد از 24 ساعت، محیط تمایزی استخوان که شامل DMEMمکمل با 50 میلی‌گرم در میلیلیتر آسکوربیک 2- فسفات، 10 نانو مولار دگزامتازون و 10 نانومول بتا گلیسرول فسفات(همه از شرکت سیگما آمریکا) بود، به کشت سلول‌ها اضافه شد. هر سه روز یک بار تعویض محیط انجام گرفت، پس از سه هفته، از رنگ‌آمیزی آلیزارین رد، برای رنگ‌آمیزی و مشاهده ماتریکس معدنی شده استفاده شد.
تمایز به چربی:
برای تمایز به چربی، محیط DMEM حاوی 100 نانومولار دگزامتازون و50 میلی‌گرم در میلیلیتر ایندومتاسین(همه از شرکت سیگما آمریکا) به کشت سلول‌ها در پاساژ 3 افزوده شد. سه هفته بعد از شروع کشت، سلول‌ها در فرمالین 4% در دمای اتاق فیکس شد و سپس با اتانول 70% شسته شده ، با محلول اویل رد در 99% ایـزوپـروپانـول بـه مـدت 15 دقیقـه رنگ‌آمیـزی شد.
تمایز به غضروف:
برای القای تمایز به غضروف، سلول‌های پاساژ 3 در دور g 300 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد، به رسوب حاصله محیـط DMEM حـاوی 10 نانـوگرم در میلیلیتر
TGF-β3 ، 10 نانوگرم در میلیلیتر BMP6 ، 50 میلی‌گرم در میلیلیتر انسولین+ ترانسفرین+ سلنیوم + پرمیکس، 25/1 میلی‌گرم آلبومین سرم گاوی (همه از شرکت سیگما آلمان) و 1% FBS کشت شدند. سه هفته بعد از کشت، رسوب سلولی برداشته شد و وارد فرایند فیکس شدن با فرمالین 10%، آبگیری با غلظت‌های تصاعدی اتانول، شستشو در زایلن، قرارگیری در موم پارافین و برش‌گیری در برش‌های 5 میکرومتری شد. این برش‌ها سپس به وسیله تولیدین‌بلو به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق رنگ‌آمیزی شد.
آنالیز آماری:
به منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار SPSS نسخه 13 استفاده شد و نتایج بر اساس روش One-way ANOVA با میزان 05/0 p< گزارش شد.
یافته‌ها
کشـت سلول‌های بنیادی مزانشیمی به روش استفاده از PBS :
در کشت اولیه پس از 5 روز سلول‌های دوکی شکل مزانشیمی چسبیده به ظرف ظاهر شدند که در هفته دوم تکثیر شده و تمامی سطح ظرف کشت را پر کردند (شکل 1).
جدول 1: میانگین PDT سلول‌های مزانشیمی در پاساژهای متوالی طی 7 تکرار
زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی:
بر اساس نتایج حاصل، سلول‌های پاساژ اول به طور متوسط هر 21 ± 97 ساعت یک بار دوبله شدند، سلول‌های پاساژ دوم هر 22 ± 75 ساعت یک بار، سلول‌های پاساژ سوم هر 6 ± 31 ساعت یک بار، سلول‌های پاساژ چهارم هر 15 ± 58 ساعت یک بار، سلول‌های پاساژ پنجم هر 18 ± 87 ساعت یک بار و سلول‌های پاساژ ششم هر 28 ± 115 ساعت یک بار دوبله شدند که در مجموع این زمان در پاساژ سوم از همه پاساژهای دیگر کوتاهتر بوده و این تفاوت از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<). این نتایج نشان‌دهنده خلوص و افزایش توانمندی تکثیر این سلول ها در پاساژ سوم نسبـت
به پاساژهای دیگر است(نمودار 1 و جدول 1).
بررسی مارکرهای سطحی سلول:
به منظور بررسی جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون، بیان مارکرهای سطحی مزانشیمی در سه نمونه بند ناف با دستگاه فلوسایتومتری مورد آنالیز قرار گرفت. نتایج نشان داد که این سلول‌ها مارکرهای مزانشیمی CD44 (44/98%)، CD105 (6/96%) ، CD90 (65/98%) و CD73 (94/85%) را بیان کرده و از نظر بیان مارکرهای خونی CD34/CD45 (02/0%)، CD133 (64/0%) و آنتی‌ژن لوکوسیت انسانی HLA-DR (01/0%) منفی هستند (نمودارهای 2 و 3).
بررسی ویژگی‌های تمایزی:
در کشت سلول‌های مزانشیمی در پاساژ سوم که به مدت سه هفته در محیط تمایزی استخوان قرار گرفته بودند، به تدریج تجمعات سلولی به شکل گره پدیدار شد که رنگ‌آمیزی با آلیزارین رد در پایان 21 روز القاء تمایز، حاکی از معدنی شدن گره‌ها بود(شکل A 2).
در کشت سلول‌های مزانشیمی تحت تیمار محیط تمایزی چربی، پس از 2-3 روز اولین وزیکول‌های چربی مشاهده شـد و بـا گذشـت زمـان تعداد آن‌ها زیاد شد، به
نمودار 1: مقایسه زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی(PDT). در پاساژهای متوالی کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی، سلول‌های پاساژ سوم به طور معناداری PDT کوتاهتری داشتند(05/0 p<).
طوری که پس از 10 روز سیتوپلاسم سلول‌ها از چربی انباشته شد. برای اثبات ماهیت چربی وزیکول‌های مشاهده شده، سلول‌ها پس از 21 روز با اویل رد رنگ شدند و قرمز شدن سیتوپلاسم آن‌ها آدیپوسیت بودن آن‌ها را تایید
کرد(شکل B2).
سلول‌های مزانشیمی پس از 21 روز کشت در محیط تمایزی غضروف و رنگ‌آمیزی با رنگ تولوییدن بلو، خاصیت متاکرومازی از خود نشان دادند(شکل C 2).
نمودار 2 : نمودارهای فوق بیان مارکرهای سطحی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را طبق نتایج فلوسایتومتری نشان می‌دهد.
نمودار 3: میانگین درصد بیان مارکرهای سطحی سلول‌های بنیادی مزانشیمی. در این سلول‌ها درصد بیان مارکرهای مزانشیمی (CD105 ، CD73 ، CD90 ، CD44) بالا و درصد بیان مارکرهای خونی (HLA-DR ، CD133 ، CD34/45) پایین است.
شکل 2: (A تمایز سلول‌های مزانشیمی انسانی به بافت استخوان، رسوب‌های کلسیمی استخوان با رنگ آلیزارین رد به رنگ قرمز درآمده است. (B تمایز سلول‌های مزانشیمی انسانی به بافت چربی و رنگ‌آمیزی واکوئل‌های چربی موجود در سیتوپلاسم با اویل رد. (C تمایز سلول‌های مزانشیمی به بافت غضروف، سلول‌های غضروفی با رنگ تولوییدین‌بلو به رنگ آبی درآمده است.
بحث
از بین منابع سلول‌های بنیادی پری‌ناتال، ژله وارتون دارای پتانسیل بسیار زیادی به عنوان یک منبع مفید سلول‌های بنیادی برای درمان بیماری‌های مختلف است. این بافت دارای مزایای متعددی از جمله در دسترس بودن، امکان جمع‌آوری بدون درد از اهداکنندگان، امکان استفاده برای پیوند اتولوگ در سلول درمانی و در معرض خطر آلودگی کمتر می‌باشد.
تعاریف و روش‌های زیادی برای جداسازی و شناسایی ایـن سلول‌هـای بنیادی توسط محققان ارایه شده است. در
سال 2006، بـه منظـور استانداردسازی این تعاریف ، کمیته
سلول‌های بنیادی بافت و مزانشیم (ISCT)،
معیارهای حداقلی را برای شناسایی این سلول‌های بنیادی پیشنهاد داد که شامل قابلیت چسبیدن به سطح ظرف کشت، بیان مارکرهای سطحی ویژه(CD44 ، CD73 ، CD105 و CD90) و توانایی تمایز به انواع بافت‌ها از جمله رده‌های غضروف، استخوان و چربی می‌باشد. تحقیقات نشان داده است که سلول‌های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون برخلاف سلول‌های مزانشیمی بالغ، دارای توانایی بیان مارکرهای ویژه سلول‌های بنیادی جنینی (SOX-2 ، Nanog،
Tral-60 ، SSEA-4 ، Oct-4) بوده و آنتی‌ژن لوکوسیت انسانـی کلاس دو HLA-DR- (MHC class II) را که در رد
پیوند دخیل می‌باشد، بسیار کم بیان می‌کنند(17، 5، 3). استفاده از این سلول‌های مزانشیمی همانند سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان نیاز به تطبیق بافتی ندارند، در نتیجه می‌توانند به عنوان منبع سلول‌های آلوژنیک از هر اهداکننده‌ای به فرد دیگر بدون خطر رد پیوند و یا نیاز به داروهای مهارکننده سیستم ایمنی پیوند شوند(17). این مشخصه نشان می‌دهد که این بافت را می‌توان به عنوان یک منبع جامع و کافی از سلول‌های بنیادی در نظر گرفت. مطالعه‌های متعدد حضور این سلول‌های بنیادی را در 100٪ نمونه‌های مورد مطالعه ژله وارتون ثابت کرده‌اند(19، 18، 13). با این حال، هیچ روش استانداردی برای جداسازی این سلول‌های بنیادی از بافت ژله وارتون وجود ندارد. تا به امروز، بسیاری از گروه‌ها از تیمارآنزیمی با استفاده از پروتئازهایی مانند کلاژناز، هیالورونیداز و یا تریپسین با یا بدون حذف مکانیکی عروق خونی برای به دست آوردن این سلول‌ها استفاده کرده‌اند، به عنوان مثال ونگ و همکارانش از تیمارکلاژناز به مدت 16 ساعت برای جداسازی سلول‌های مزانشیمی استفاده کردند(9). پیررا و همکارانش نیز از تیماری مشابه اما بر روی همزن در مدت زمان کمتر و دمای 37 درجه سانتی‌گراد استفاده کردند(11). اما مشخص شده که هضم بیش از حد بافت توسط آنزیم ممکن است سبب کاهش زنده ماندن و عملکرد سلولی، تخریب گیرنده‌های سطح سلول و تغییرساختار سلول شود(20). علاوه‌بر این، می‌بایست از آنزیم‌های به دست آمده از گونه‌های غیرانسان برای تهیه سلول‌ها به منظور مقاصد درمانی اجتناب شود. امکان به دست آوردن MSCs از بافت بند ناف با روش‌های غیر آنزیمی که اولین بار توسط روکا و همکارانش در سال 2009 توضیح داده شد، نیز روش دیگری است که هنوز به صورت استاندارد درنیامده است(15). او و همکارانش در این روش بند ناف را به قطعات 1-2 سانتی‌متری برش داده و آن‌ها را در ظرف مخصوص کشت به مدت 15 روز در انکوباتور قرار دادند و منتظر ماندند که سلول‌ها از بافت به درون ظرف مهاجرت کنند. گروه‌های دیگری نیز همین روش را با حذف عروق خونی بند ناف انجام داده‌اند(23-21). این روش با وجودی که معایب استفاده از تیمار آنزیمی را ندارد اما مستلزم صرف مدت زمان زیادی است. بنابراین یافتن روشی ساده، ایمن با حداقل صرف زمان که بیشترین تعداد سلول‌ها را جداسازی کرده و کمترین آسیب را به این سلول‌ها وارد کند، دارای اهمیت زیادی است.
در این مطالعه از روشی غیر آنزیمی، ساده و منحصر به فرد براساس اثر بافر نمکی فسفات بافر سالین(PBS) بر سست کردن و شکستن اتصالات بین سلولی برای رهایی سلول‌های مزانشیمی از ماتریکس کلاژنی ژله وارتون استفاده کردیم که بدون استفاده از آنزیم و صرف هزینه زیاد، توانستیم سلول‌های مزانشیمی را از تمامی نمونه‌های بند ناف طی مدت زمان کوتاه 5 روز جداسازی کنیم. بررسی ایمونوفنوتیپ این سلول‌ها بیان بالای مارکرهای سطحی سلول‌های مزانشیمی را نشان داد و محاسبه مدت زمان دو برابر شدگی سلول‌ها اثبات کرد که این سلول‌ها توانایی تکثیر خود را طی پاساژهای متوالی حفظ کرده و در پاساژهای 3 و 4، بهترین توانمندی را دارا هستند. هم چنین نشان داده شد که این سلول‌ها مانند سلول‌های مزانشیمی منابع بافتی دیگر دارای ویژگی چندتوانی(تمایز به استخوان، غضروف و چربی) هستند. در مجموع با توجه به نتایج تحقیق حاضر به نظر می‌رسد سلول‌های بنیادی مزانشیمی جداسازی شده با روش فوق‌الذکر بتوانند بعد از مطالعه خصوصیات سلولی، جهت کارآزمایی‌های بالینی و پژوهشی مورد استفاده قرار گیرند.
نتیجه‌گیری
به نظر می‌رسد که استفاده از روش غیر آنزیمی جداسازی سلول‌ها با بافر PBS ، روشی مناسب و مقرون به صرفه برای جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون باشد و می‌تواند این سلول‌ها را در مدت زمان کوتاه 5 روز، از 100% نمونه‌های بند ناف جداسازی کند.
تشکر و قدردانی
این روش جدید در سال 91 در اداره کل مالکیت صنعتـی ایـران بـه ثبت رسیده است. بدین‌وسیله نویسندگان مقاله از حمایت‌های مالی شرکت فن‌آوری بن یاخته‌های رویان تشکر و قدردانی می‌نمایند. هم چنین از مهندس اشکان مزدگیر مسئول تضمین کیفیت بانک خون بند ناف رویان که در تجزیه و تحلیل آماری نتایج این طرح همکاری داشته‌اند و آقای فاضل سامانی مسؤول آزمایشگاه فلوسایتومتری رویان سپاسگزاریم.
متن کامل: (4857 مشاهده)
یک روش سریع، ساده و مقرون به صرفه برای جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی
ژله وارتون با استفاده از فسفات بافر سالین(PBS)
بهاره بیکی1، مرتضی ضرابی2، مریم رادمنش2
چکیده
سابقه و هدف
جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون بدون آسیب رساندن به ساختار و گیرنده‌های سطح سلول با حفظ عملکرد، قدرت تکثیر، بقای سلول و صرف حداقل زمان برای مصارف تحقیقاتی و بالینی مهم است. در این مطالعه از روشی ساده، بدون تیمار آنزیمی و در مدت زمان کوتاه برای جداسازی این سلول‌ها از ژله وارتون استفاده گردید.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، بند ناف هنگام زایمان جمع‌آوری و رگ‌های آن جدا گردید. قطعات بافت ژله وارتون در بافر PBS قرار داده شده و به مدت 2 ساعت با دستگاه همزن بر روی هم ساییده شدند. پس از دور انداختن قطعات، سوسپانسیون باقیمانده سانتریفوژ شده و در محیط DMEM-LG حاوی 10% سرم FBS به مدت 5 روزکشت داده شد. سلول‌های مزانشیمی چسبیده به ظرف، از نظر وجود مارکرهای سطحی مزانشیمی مورد بررسی قرار گرفتند. برای اثبات ماهیت مزانشیمی، از تمایز به استخوان، غضروف و چربی استفاده شد.
یافته‌ها
5 روز پس از کشت اولیه، جمعیت خالصی از سلول‌های مزانشیمی ظاهر شدند. زمان دو برابر شدگی جمعیت سلولی در پاساژهای دوم(6 ± 31 ساعت) و سوم (15 ± 58 ساعت) از دیگر پاساژها کمتر بود. این سلول‌ها مارکرهای مزانشیمی را بیان کرده، از نظر بیان مارکرهای خونی و آنتی‌ژن لوکوسیت انسانی منفی بودند و توانایی تمایز به هر سه رده استخوان، غضروف و چربی را نیز داشتند.
نتیجه گیری
این مطالعه نشان می‌دهد که با استفاده از این روش غیر آنزیمی، امکان تخلیص سلول‌های مزانشیمی از ژله وارتون با صرف حداقل زمان و هزینه وجود دارد.
کلمات کلیدی: سلول‌های بنیادی مزانشیمی، بند ناف، ژله وارتون
تاریخ دریافت : 31/2/93
تاریخ پذیرش : 5 /9/93
1- مؤلف مسؤول: PhD زیست‌شناسی تکوینی ـ شرکت فن‌آوری بن یاخته‌های رویان ـ بانک خون بند ناف ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1665666311
2- پزشک عمومی ـ شرکت فن‌آوری بن‌یاخته‌های رویان ـ بانک خون بند ناف ـ تهران ـ ایران
ژله وارتون با استفاده از فسفات بافر سالین(PBS)
بهاره بیکی1، مرتضی ضرابی2، مریم رادمنش2
چکیده
سابقه و هدف
جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون بدون آسیب رساندن به ساختار و گیرنده‌های سطح سلول با حفظ عملکرد، قدرت تکثیر، بقای سلول و صرف حداقل زمان برای مصارف تحقیقاتی و بالینی مهم است. در این مطالعه از روشی ساده، بدون تیمار آنزیمی و در مدت زمان کوتاه برای جداسازی این سلول‌ها از ژله وارتون استفاده گردید.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، بند ناف هنگام زایمان جمع‌آوری و رگ‌های آن جدا گردید. قطعات بافت ژله وارتون در بافر PBS قرار داده شده و به مدت 2 ساعت با دستگاه همزن بر روی هم ساییده شدند. پس از دور انداختن قطعات، سوسپانسیون باقیمانده سانتریفوژ شده و در محیط DMEM-LG حاوی 10% سرم FBS به مدت 5 روزکشت داده شد. سلول‌های مزانشیمی چسبیده به ظرف، از نظر وجود مارکرهای سطحی مزانشیمی مورد بررسی قرار گرفتند. برای اثبات ماهیت مزانشیمی، از تمایز به استخوان، غضروف و چربی استفاده شد.
یافته‌ها
5 روز پس از کشت اولیه، جمعیت خالصی از سلول‌های مزانشیمی ظاهر شدند. زمان دو برابر شدگی جمعیت سلولی در پاساژهای دوم(6 ± 31 ساعت) و سوم (15 ± 58 ساعت) از دیگر پاساژها کمتر بود. این سلول‌ها مارکرهای مزانشیمی را بیان کرده، از نظر بیان مارکرهای خونی و آنتی‌ژن لوکوسیت انسانی منفی بودند و توانایی تمایز به هر سه رده استخوان، غضروف و چربی را نیز داشتند.
نتیجه گیری
این مطالعه نشان می‌دهد که با استفاده از این روش غیر آنزیمی، امکان تخلیص سلول‌های مزانشیمی از ژله وارتون با صرف حداقل زمان و هزینه وجود دارد.
کلمات کلیدی: سلول‌های بنیادی مزانشیمی، بند ناف، ژله وارتون
تاریخ دریافت : 31/2/93
تاریخ پذیرش : 5 /9/93
 |
1- مؤلف مسؤول: PhD زیست‌شناسی تکوینی ـ شرکت فن‌آوری بن یاخته‌های رویان ـ بانک خون بند ناف ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1665666311
2- پزشک عمومی ـ شرکت فن‌آوری بن‌یاخته‌های رویان ـ بانک خون بند ناف ـ تهران ـ ایران
مقدمه
سلول‌های بنیادی مزانشیمی یا MSCs ، سلول‌های استرومایی چندتوانی هستند که می توانند به انواع سلول‌های مختلف از جمله: استئوبلاست‌ها(سلول‌های استخوانی)، کندروسیت‌ها(سلول‌های غضروفی) و آدیپوسیت‌ها (سلول‌های چربی) تمایز یابند.
مغز استخوان بالغ (BM)، رایج‌ترین منبع سلول‌های بنیادی مزانشیمی برای کاربردهای بالینی است(1). این سلول‌های بنیادی را می‌توان از بافت‌های مختلفی از جمله بافت چربی، خون بند ناف، پالپ دندان و بافت پیوندی بند ناف که ژله وارتون(WJ) نام دارد نیز به دست آورد(2). ژله وارتون بافت همبند مخاطی ابتدایی بند ناف است که بین اپیتلیوم آمنیوتیک و عروق بند ناف قرار گرفته است. این بافت برای اولین بار توسط توماس وارتون در سال 1656 شناسایی شد، این ماده ژلاتینی از پروتئوگلیکان‌ها و ایزوفرم‌های متفاوتی از کلاژن تشکیل شده است. نقش اصلی ژله وارتون جلوگیری از فشرده شدن، چرخش و خم شدن عروق بند ناف است(5-3). سلول‌های موجود در ژله وارتون، سلول‌های بنیادی مزانشیمی اولیه هستند که به احتمال زیاد درماتریکس بافت همبند طی مهاجرت از منطقه آئورت، گناد و مزونفروس(
جوان‌ترین و ابتدایی‌ترین سلول‌های بنیادی مزانشیمی را می‌توان از ژله وارتون و خون بند ناف به دست آورد(5). بند ناف پس از تولد نوزاد به راحتی به دست آمده و به طور معمول به عنوان زباله پزشکی دور ریخته می‌شود(6). سلول‌های بنیادی به دست آمده از این بافت، منبعی ایمن و غیر تهاجمی را برای درمان با سلول‌های بنیادی ارایه می‌دهد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف دارای خصوصیات ابتدایی بیشتری نسبت به دیگر سلول‌های بنیادی مزانشیمی بزرگسالان که در مراحل بعدی زندگی به دست می‌آیند، می‌باشند. این سلول‌های بنیادی نه سلول‌های بنیادی جنینی(ESCs) و نه سلول‌های بنیادی سوماتیک بالغ(ASCs) هستند؛ آن‌ها دارای خصوصیاتی مابین سلول‌های بنیادی جنینی و بالغ بوده و ویژگی‌های هر دو نوع سلول بنیادی جنینی و سلول‌های بنیادی بالغ را نشان می‌دهند، این سلول‌ها هم دارای خواص پرتوانی، و هم ترمیم و نگهداری بافت‌های چند توان هستند، که این می‌تواند آن‌ها را به عنوان منبع مفیدی از سلول‌های بنیادی برای کاربردهای بالینی قرار دهد(7).
جداسازی این سلول‌های فیبروبلاست شکل از ژله وارتون در اصل به سال 1991 برمی‌گردد(8). از آغاز شناسایی این منبع، تعداد مطالعه‌های نسبتاً محدودی بر روی این سلول‌ها انجام شده است. روش‌های فنی برای جداسازی این سلول‌های بنیادی از ژله وارتون به میزان کمی بررسی شده و به طور چشمگیری با یکدیگر متفاوت است. اگر چه تیمار آنزیمی با کلاژناز روشی است که به طور گسترده برای جداسازی این سلول‌های استرومایی استفاده می‌شود، این تیمار نیز در مقالات مختلف بسیار متفاوت است(14-9). چندین گروه نیز از تیمار غیر آنزیمی استفاده کرده‌اند که مستلزم صرف مدت زمان زیادی می‌باشد(16، 15).
در این مطالعه از روش غیر آنزیمی، ساده و منحصر به فردی در حداقل زمان و بر اساس اثر PBS بر سست کردن و شکستن اتصالات بین سلولی برای رهایی سلول‌های مزانشیمی از ماتریکس کلاژنی ژله وارتون استفاده گردید.
مواد و روش‌ها
1- جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف از ژله وارتون و کشت آن‌ها:
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. تعداد 7 نمونه بند ناف از بانک خصوصی خون بند ناف رویان تهیه گردید. اهداکنندگان بند ناف، مادران سالم(بر اساس پرسشنامه پزشکی فاقد بیماری‌های زمینه‌ای و ژنتیکی و بر اساس آزمایش‌های سرولوژی، عاری از بیماری‌های ویروسی، سیفلیس، HTLV I/II ، HBV ، HCV ، HIV و CMV) با دوره حاملگی کامل بودند. بند ناف هنگام زایمان جمع‌آوری و در شرایط استریل، داخل PBS (آلمان، گیبکو) حاوی mg/mL 100 آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و استرپتومایسین (آلمان، گیبکو) به آزمایشگاه منتقل شد. در آزمایشگاه، بند ناف با الکل شسته شده و با PBS خون باقیمانده در رگ‌های بند ناف به طور کامل تخلیه گردید. بند ناف به قطعات 2 سانتی‌متری بریده شده و رگ‌های آن که شامل یک سیاهرگ بزرگ و دو سرخرگ کوچک است جدا گردید و بافت ژله وارتون به دست آمد. قطعات کوچک بافت ژله وارتون در بافر PBS قرار داده شد و به مدت 2 ساعت با دستگاه هموشیکر (شرکت دانش پژوهش فجر) با هم مخلوط و بر روی هم ساییده شدند. قطعات ژله وارتون دور انداخته شده و سوسپانسیون باقیمانده به مدت 5 دقیقه در 1500 دور بر دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب حاصله که حاوی سلول‌های بنیادی مزانشیمی است در محیط DMEM-LG (آلمان، گیبکو) حاوی 10% سرم جنین گاو(Fetal Bovin Serum) (گیبکو) شستشو داده شد و تعداد و میزان سلول‌های زنده (Viability) با استفاده از لام نئوبار و تریپان بلو 4% تعیین گردید.
سلول‌های جداسازی شده در پلیت 6 خانه و در محیط DMEM-LG شامل FBS (10%)، ال‌گلوتامین(آلمان، گیبکو) (mM2) و آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و استرپتومایسین، به مدت 5 روز در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 کشت داده شدند. پس از آن سلول‌های مزانشیمی چسبیده به پلیت کشت جهت تکثیر، با استفاده از مخلوط 05/0% تریپسین ـ EDTA (آلمان، گیبکو) جدا شده و به میزان 105 سلول در فلاسک 25 سانتی‌متر مربع کشت و پاساژ داده شدند.
سلول‌ها در پاساژهای 3 تا 7 توسط لام نئوبار شمارش شدند و جهت اثبات سلول‌های بنیادی مزانشیمی، این سلول‌ها به سه رده استخوان، غضروف و چربی تمایز داده شد و از روش فلوسایتومتری برای بررسی ایمونوفنوتایپینگ و درصد بیان مارکرهای اختصاصی سلول‌های بنیادی مزانشیمی استفاده شد.
تعیین زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی:
به منظور مقایسه سرعت رشد سلول‌های حاصل از هر پاساژ سلولی، زمان دو برابر شدن سلول‌ها در طول دوره کشت(پاساژ اول تا هفتم) اندازه‌گیری شد. برای این منظور از فرمول زیر استفاده گردید. در این رابطه ، PDT تعداد دو برابر شدن جمعیت سلولی(Population Doubling Time)، N0 تعداد سلول در شروع کشت، N تعداد سلول در پایان کشت و CT مدت زمان دوره کشت(Culture Time) به ساعت می‌باشد.
PDT=
بررسی ایمونوفنوتیپ سلول‌ها:
برای بررسی ایمونوفنوتایپینگ سلول‌های کشت یافته، تعداد 106 سلول مورد استفاده قرار گرفت. 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی دو رنگ Mouse IgG1-FITC/Mouse IgG1-RPE/Isotype control (داکو) به 105 سلول در 100 میکرولیتر PBS به عنوان ایزوتایپ کنترل و 10 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های Mouse Anti Human CD105-PE ، Mouse Anti Human CD90-FITC، Mouse Anti Human CD44-PE ، Mouse Anti Human CD73-PE ، Mouse Anti Human CD34/45-PE/FITC ، Mouse Anti Human HLA DR-PE و Mouse Anti Human CD133-PE (همه از شرکت بکتون دیکینسون آمریکا) به همان تعداد سلول در لوله‌های جداگانه اضافه شد. پس از 45 دقیقه انکوباسیون در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و اتاق تاریک، 1 میلیلیتر از محلول PBS جهت شستشو به لوله‌ها اضافه گردید و پس از 5 دقیقه سانتریفوژ در 1500 دور بر دقیقه، محلول رویی جدا و به رسوب سلولی حاصل 300 میکرولیتر محلول PBS اضافه شد. نمونه‌های آماده شده در دستگاه فلوسایتومتری BD (آمریکا، بکتون دیکینسون)FACS Calibur در طـول مـوج 488 نانومتر، با فیلترهای nm BP 30/530 برای FITC وnm BP 42/585 برای PE به وسیله نرم‌افزارFlowing software مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
بررسی توان تمایزی سلول‌ها:
برای اثبات ماهیت مزانشیمی، سلول‌های تخلیص شده از ژله وارتون پس از 5 روز کشت، پاساژ داده شدند، سپس سلول‌های جمع‌آوری شده، از پاساژ 3 وارد محیط‌های تمایزی غضروف، چربی واستخوان شدند.
تمایز به استخوان:
برای تمایز به استخوان، سلول‌ها با تراکم 100000 سلول در چاهک یک پلیت 12خانه و در محیط DMEM کشت شدند. بعد از 24 ساعت، محیط تمایزی استخوان که شامل DMEMمکمل با 50 میلی‌گرم در میلیلیتر آسکوربیک 2- فسفات، 10 نانو مولار دگزامتازون و 10 نانومول بتا گلیسرول فسفات(همه از شرکت سیگما آمریکا) بود، به کشت سلول‌ها اضافه شد. هر سه روز یک بار تعویض محیط انجام گرفت، پس از سه هفته، از رنگ‌آمیزی آلیزارین رد، برای رنگ‌آمیزی و مشاهده ماتریکس معدنی شده استفاده شد.
تمایز به چربی:
برای تمایز به چربی، محیط DMEM حاوی 100 نانومولار دگزامتازون و50 میلی‌گرم در میلیلیتر ایندومتاسین(همه از شرکت سیگما آمریکا) به کشت سلول‌ها در پاساژ 3 افزوده شد. سه هفته بعد از شروع کشت، سلول‌ها در فرمالین 4% در دمای اتاق فیکس شد و سپس با اتانول 70% شسته شده ، با محلول اویل رد در 99% ایـزوپـروپانـول بـه مـدت 15 دقیقـه رنگ‌آمیـزی شد.
تمایز به غضروف:
برای القای تمایز به غضروف، سلول‌های پاساژ 3 در دور g 300 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد، به رسوب حاصله محیـط DMEM حـاوی 10 نانـوگرم در میلیلیتر
TGF-β3 ، 10 نانوگرم در میلیلیتر BMP6 ، 50 میلی‌گرم در میلیلیتر انسولین+ ترانسفرین+ سلنیوم + پرمیکس، 25/1 میلی‌گرم آلبومین سرم گاوی (همه از شرکت سیگما آلمان) و 1% FBS کشت شدند. سه هفته بعد از کشت، رسوب سلولی برداشته شد و وارد فرایند فیکس شدن با فرمالین 10%، آبگیری با غلظت‌های تصاعدی اتانول، شستشو در زایلن، قرارگیری در موم پارافین و برش‌گیری در برش‌های 5 میکرومتری شد. این برش‌ها سپس به وسیله تولیدین‌بلو به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق رنگ‌آمیزی شد.
آنالیز آماری:
به منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار SPSS نسخه 13 استفاده شد و نتایج بر اساس روش One-way ANOVA با میزان 05/0 p< گزارش شد.
یافته‌ها
کشـت سلول‌های بنیادی مزانشیمی به روش استفاده از PBS :
در کشت اولیه پس از 5 روز سلول‌های دوکی شکل مزانشیمی چسبیده به ظرف ظاهر شدند که در هفته دوم تکثیر شده و تمامی سطح ظرف کشت را پر کردند (شکل 1).
شکل 1: کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از ژله وارتون: A) کشت اولیه سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از 5 روز که سلول‌های منفرد چسبیده به ظرف قابل مشاهده می‌باشند. (B کشت تک لایه سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پاساژ 2. (C کلنی‌های سلول‌های مزانشیمی در پاساژ 3.
جدول 1: میانگین PDT سلول‌های مزانشیمی در پاساژهای متوالی طی 7 تکرار
| پاساژ | شماره | متوسط PDT |
SD |
| P1→ P2 | 7 | 73/97 | 71/21 |
| P2→ P3 | 7 | 15/75 | 27/22 |
| P3→ P4 | 7 | 81/31 | 92/6 |
| P4→ P5 | 7 | 64/58 | 85/15 |
| P5→ P6 | 7 | 1/87 | 83/18 |
| P6→ P7 | 7 | 89/115 | 93/28 |
زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی:
بر اساس نتایج حاصل، سلول‌های پاساژ اول به طور متوسط هر 21 ± 97 ساعت یک بار دوبله شدند، سلول‌های پاساژ دوم هر 22 ± 75 ساعت یک بار، سلول‌های پاساژ سوم هر 6 ± 31 ساعت یک بار، سلول‌های پاساژ چهارم هر 15 ± 58 ساعت یک بار، سلول‌های پاساژ پنجم هر 18 ± 87 ساعت یک بار و سلول‌های پاساژ ششم هر 28 ± 115 ساعت یک بار دوبله شدند که در مجموع این زمان در پاساژ سوم از همه پاساژهای دیگر کوتاهتر بوده و این تفاوت از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<). این نتایج نشان‌دهنده خلوص و افزایش توانمندی تکثیر این سلول ها در پاساژ سوم نسبـت
به پاساژهای دیگر است(نمودار 1 و جدول 1).
بررسی مارکرهای سطحی سلول:
به منظور بررسی جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون، بیان مارکرهای سطحی مزانشیمی در سه نمونه بند ناف با دستگاه فلوسایتومتری مورد آنالیز قرار گرفت. نتایج نشان داد که این سلول‌ها مارکرهای مزانشیمی CD44 (44/98%)، CD105 (6/96%) ، CD90 (65/98%) و CD73 (94/85%) را بیان کرده و از نظر بیان مارکرهای خونی CD34/CD45 (02/0%)، CD133 (64/0%) و آنتی‌ژن لوکوسیت انسانی HLA-DR (01/0%) منفی هستند (نمودارهای 2 و 3).
بررسی ویژگی‌های تمایزی:
در کشت سلول‌های مزانشیمی در پاساژ سوم که به مدت سه هفته در محیط تمایزی استخوان قرار گرفته بودند، به تدریج تجمعات سلولی به شکل گره پدیدار شد که رنگ‌آمیزی با آلیزارین رد در پایان 21 روز القاء تمایز، حاکی از معدنی شدن گره‌ها بود(شکل A 2).
در کشت سلول‌های مزانشیمی تحت تیمار محیط تمایزی چربی، پس از 2-3 روز اولین وزیکول‌های چربی مشاهده شـد و بـا گذشـت زمـان تعداد آن‌ها زیاد شد، به
نمودار 1: مقایسه زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی(PDT). در پاساژهای متوالی کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی، سلول‌های پاساژ سوم به طور معناداری PDT کوتاهتری داشتند(05/0 p<).
طوری که پس از 10 روز سیتوپلاسم سلول‌ها از چربی انباشته شد. برای اثبات ماهیت چربی وزیکول‌های مشاهده شده، سلول‌ها پس از 21 روز با اویل رد رنگ شدند و قرمز شدن سیتوپلاسم آن‌ها آدیپوسیت بودن آن‌ها را تایید
کرد(شکل B2).
سلول‌های مزانشیمی پس از 21 روز کشت در محیط تمایزی غضروف و رنگ‌آمیزی با رنگ تولوییدن بلو، خاصیت متاکرومازی از خود نشان دادند(شکل C 2).
نمودار 2 : نمودارهای فوق بیان مارکرهای سطحی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را طبق نتایج فلوسایتومتری نشان می‌دهد.
نمودار 3: میانگین درصد بیان مارکرهای سطحی سلول‌های بنیادی مزانشیمی. در این سلول‌ها درصد بیان مارکرهای مزانشیمی (CD105 ، CD73 ، CD90 ، CD44) بالا و درصد بیان مارکرهای خونی (HLA-DR ، CD133 ، CD34/45) پایین است.
شکل 2: (A تمایز سلول‌های مزانشیمی انسانی به بافت استخوان، رسوب‌های کلسیمی استخوان با رنگ آلیزارین رد به رنگ قرمز درآمده است. (B تمایز سلول‌های مزانشیمی انسانی به بافت چربی و رنگ‌آمیزی واکوئل‌های چربی موجود در سیتوپلاسم با اویل رد. (C تمایز سلول‌های مزانشیمی به بافت غضروف، سلول‌های غضروفی با رنگ تولوییدین‌بلو به رنگ آبی درآمده است.
بحث
از بین منابع سلول‌های بنیادی پری‌ناتال، ژله وارتون دارای پتانسیل بسیار زیادی به عنوان یک منبع مفید سلول‌های بنیادی برای درمان بیماری‌های مختلف است. این بافت دارای مزایای متعددی از جمله در دسترس بودن، امکان جمع‌آوری بدون درد از اهداکنندگان، امکان استفاده برای پیوند اتولوگ در سلول درمانی و در معرض خطر آلودگی کمتر می‌باشد.
تعاریف و روش‌های زیادی برای جداسازی و شناسایی ایـن سلول‌هـای بنیادی توسط محققان ارایه شده است. در
سال 2006، بـه منظـور استانداردسازی این تعاریف ، کمیته
سلول‌های بنیادی بافت و مزانشیم (ISCT)،
معیارهای حداقلی را برای شناسایی این سلول‌های بنیادی پیشنهاد داد که شامل قابلیت چسبیدن به سطح ظرف کشت، بیان مارکرهای سطحی ویژه(CD44 ، CD73 ، CD105 و CD90) و توانایی تمایز به انواع بافت‌ها از جمله رده‌های غضروف، استخوان و چربی می‌باشد. تحقیقات نشان داده است که سلول‌های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون برخلاف سلول‌های مزانشیمی بالغ، دارای توانایی بیان مارکرهای ویژه سلول‌های بنیادی جنینی (SOX-2 ، Nanog،
Tral-60 ، SSEA-4 ، Oct-4) بوده و آنتی‌ژن لوکوسیت انسانـی کلاس دو HLA-DR- (MHC class II) را که در رد
پیوند دخیل می‌باشد، بسیار کم بیان می‌کنند(17، 5، 3). استفاده از این سلول‌های مزانشیمی همانند سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان نیاز به تطبیق بافتی ندارند، در نتیجه می‌توانند به عنوان منبع سلول‌های آلوژنیک از هر اهداکننده‌ای به فرد دیگر بدون خطر رد پیوند و یا نیاز به داروهای مهارکننده سیستم ایمنی پیوند شوند(17). این مشخصه نشان می‌دهد که این بافت را می‌توان به عنوان یک منبع جامع و کافی از سلول‌های بنیادی در نظر گرفت. مطالعه‌های متعدد حضور این سلول‌های بنیادی را در 100٪ نمونه‌های مورد مطالعه ژله وارتون ثابت کرده‌اند(19، 18، 13). با این حال، هیچ روش استانداردی برای جداسازی این سلول‌های بنیادی از بافت ژله وارتون وجود ندارد. تا به امروز، بسیاری از گروه‌ها از تیمارآنزیمی با استفاده از پروتئازهایی مانند کلاژناز، هیالورونیداز و یا تریپسین با یا بدون حذف مکانیکی عروق خونی برای به دست آوردن این سلول‌ها استفاده کرده‌اند، به عنوان مثال ونگ و همکارانش از تیمارکلاژناز به مدت 16 ساعت برای جداسازی سلول‌های مزانشیمی استفاده کردند(9). پیررا و همکارانش نیز از تیماری مشابه اما بر روی همزن در مدت زمان کمتر و دمای 37 درجه سانتی‌گراد استفاده کردند(11). اما مشخص شده که هضم بیش از حد بافت توسط آنزیم ممکن است سبب کاهش زنده ماندن و عملکرد سلولی، تخریب گیرنده‌های سطح سلول و تغییرساختار سلول شود(20). علاوه‌بر این، می‌بایست از آنزیم‌های به دست آمده از گونه‌های غیرانسان برای تهیه سلول‌ها به منظور مقاصد درمانی اجتناب شود. امکان به دست آوردن MSCs از بافت بند ناف با روش‌های غیر آنزیمی که اولین بار توسط روکا و همکارانش در سال 2009 توضیح داده شد، نیز روش دیگری است که هنوز به صورت استاندارد درنیامده است(15). او و همکارانش در این روش بند ناف را به قطعات 1-2 سانتی‌متری برش داده و آن‌ها را در ظرف مخصوص کشت به مدت 15 روز در انکوباتور قرار دادند و منتظر ماندند که سلول‌ها از بافت به درون ظرف مهاجرت کنند. گروه‌های دیگری نیز همین روش را با حذف عروق خونی بند ناف انجام داده‌اند(23-21). این روش با وجودی که معایب استفاده از تیمار آنزیمی را ندارد اما مستلزم صرف مدت زمان زیادی است. بنابراین یافتن روشی ساده، ایمن با حداقل صرف زمان که بیشترین تعداد سلول‌ها را جداسازی کرده و کمترین آسیب را به این سلول‌ها وارد کند، دارای اهمیت زیادی است.
در این مطالعه از روشی غیر آنزیمی، ساده و منحصر به فرد براساس اثر بافر نمکی فسفات بافر سالین(PBS) بر سست کردن و شکستن اتصالات بین سلولی برای رهایی سلول‌های مزانشیمی از ماتریکس کلاژنی ژله وارتون استفاده کردیم که بدون استفاده از آنزیم و صرف هزینه زیاد، توانستیم سلول‌های مزانشیمی را از تمامی نمونه‌های بند ناف طی مدت زمان کوتاه 5 روز جداسازی کنیم. بررسی ایمونوفنوتیپ این سلول‌ها بیان بالای مارکرهای سطحی سلول‌های مزانشیمی را نشان داد و محاسبه مدت زمان دو برابر شدگی سلول‌ها اثبات کرد که این سلول‌ها توانایی تکثیر خود را طی پاساژهای متوالی حفظ کرده و در پاساژهای 3 و 4، بهترین توانمندی را دارا هستند. هم چنین نشان داده شد که این سلول‌ها مانند سلول‌های مزانشیمی منابع بافتی دیگر دارای ویژگی چندتوانی(تمایز به استخوان، غضروف و چربی) هستند. در مجموع با توجه به نتایج تحقیق حاضر به نظر می‌رسد سلول‌های بنیادی مزانشیمی جداسازی شده با روش فوق‌الذکر بتوانند بعد از مطالعه خصوصیات سلولی، جهت کارآزمایی‌های بالینی و پژوهشی مورد استفاده قرار گیرند.
نتیجه‌گیری
به نظر می‌رسد که استفاده از روش غیر آنزیمی جداسازی سلول‌ها با بافر PBS ، روشی مناسب و مقرون به صرفه برای جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از ژله وارتون باشد و می‌تواند این سلول‌ها را در مدت زمان کوتاه 5 روز، از 100% نمونه‌های بند ناف جداسازی کند.
تشکر و قدردانی
این روش جدید در سال 91 در اداره کل مالکیت صنعتـی ایـران بـه ثبت رسیده است. بدین‌وسیله نویسندگان مقاله از حمایت‌های مالی شرکت فن‌آوری بن یاخته‌های رویان تشکر و قدردانی می‌نمایند. هم چنین از مهندس اشکان مزدگیر مسئول تضمین کیفیت بانک خون بند ناف رویان که در تجزیه و تحلیل آماری نتایج این طرح همکاری داشته‌اند و آقای فاضل سامانی مسؤول آزمایشگاه فلوسایتومتری رویان سپاسگزاریم.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
سلولهاي بنيادي
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
