جلد 12، شماره 3 - ( پاييز 1394 )
جلد 12 شماره 3 صفحات 254-244 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Balagholi S, Amini-Kafi Abad S, Soheili Z, Samiee S, Ahmadiyeh H, Rezaei Kanavi M, et al . Retinal cells development through transfection of CD133+ HSC derived from human cord blood by PAX6 master gene. bloodj 2015; 12 (3) :244-254
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-861-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-861-fa.html
بالاقلی سحر، امینی کافی‌آباد صدیقه، سهیلی زهرا سهیلا، سمیعی شهرام، احمدیه حمید، رضایی کنوی مژگان، و همکاران.. چگونگی تکوین سلولهای شبکیه از طریق انتقال ژن PAX6 به سلولهای CD133+ به دست آمده از بند ناف انسان. فصلنامه پژوهشی خون. 1394; 12 (3) :244-254
سحر بالاقلی 
، صدیقه امینی کافی‌آباد* ، زهرا سهیلا سهیلی ، شهرام سمیعی ، حمید احمدیه ، مژگان رضایی کنوی ، مهین نیکوگفتار ظریف ، نارسیس دفتریان
، صدیقه امینی کافی‌آباد* ، زهرا سهیلا سهیلی ، شهرام سمیعی ، حمید احمدیه ، مژگان رضایی کنوی ، مهین نیکوگفتار ظریف ، نارسیس دفتریان
تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
متن کامل [PDF 456 kb]
(2204 دریافت)
| چکیده (HTML) (8361 مشاهده)
مقدمه
امروزه با وجود پیشرفتهای حاصل شده در علم چشم پزشکی، هنوز بیماریهای ناشی از تخریب سلولهای شبکیه به جهت ایجاد نابینایی برگشت ناپذیر، بزرگترین دغدغه چشم پزشکان محسوب میشود. از میان این بیماریها، تخریب ماکولا وابسته به سن(AMD = Age related macular degeneration) که شایعترین عامل نابینایی در بیماران بالای 60 سال است و هم چنین رتینیت پیگمنتوزا (RP = Retinit pigmentoza) که شایعترین بیماری دژنراتیو وراثتی در شبکیه است، را می‌توان نام برد. لازم به ذکر است که در هر دو مورد سلولهای Retinal Pigment Epithelium (RPE)، فتورسپتورهای مخروطی(Cone photoreceptor) و فتورسپتور استوانه‌ای (Rod photoreceptor) تخریب می‌شوند(1). متاسفانه درمانهای کنونی تنها توانستهاند سیر پیشرفت بیماری را کند کنند، بدیهی است که این گونه درمانها برای مراحل پیشرفته بیماری کارآیی ندارد. به همین دلیل امروزه توجه محققان به درمانهای ترمیمی و جایگزینی سلولهای شبکیه معطوف شده است، در میان این درمانها، روشهای استفاده از سلولهای بنیادی بسیار مورد توجه قرار گرفته است(3، 2).
از زمانی که کارآیی استفاده از خون بند ناف در درمان بیماریهای خونی اثبات شد، فکر ایجاد بانک خون‌های بند ناف شکل گرفت. با ایجاد تشکیلات و برقراری استانداردهای جهانی، محققان به گام‌های بلندتری می‌اندیشند که یکی از آن‌ها دسترسی به سلولهای سایر بافتها از طریق تمایز سلولهای موجود در بند ناف است. امروزه ثابت شده سلولهای موجود در بند ناف به جهت اولیه‌تر بودن نسبت به سلولهای بنیادی به دست آمده از بالغین، پتانسیل دگر تمایزی خوبی دارند(6-4). در این مطالعه سلولهای بنیادی CD133+ موجود در خون بند ناف انسان، به عنوان منبعی جهت دستیابی به انواع سلولهای شبکیه مورد بررسی قرار گرفته است.
با توجه به آن که تمایز سلول بنیادی به تعادل حساسی بین فاکتورهای داخلی و خارجی نیاز دارد، در این مطالعه بـا القـای بیـان ژن PAX6 در سلولهـای بنیـادی خـونساز CD133+ به دست آمده از بندناف علاوه بر اثر محیط، تاثیر این ژن نیز به عنوان یک فاکتور داخلی اثرگذار بررسی شد.
ژن PAX6 جزیی از خانواده چند ژنی PAX و از فاکتورهای رونویسی است. پروتئینهای حاصل از این خانواده در تکامل اولیه جانوران و برای اختصاصی شدن بعضی بافتهای خاص ضروری هستند. از میان ژنهای این خانواده ژن PAX6 به عنوان ژن کنترلکننده برای تکامل چشم و اندامهای حسی بافتهای اپیدرمی و عصبی خاص کـه همگـی منشاء اکتودرمی دارند، محسوب میشود(8، 7).
ژن PAX6 ژن کنترلکننده در تکوین چشم بوده و در تشکیل عدسی، عنبیه، شبکیه و قرنیه نقش اساسی دارد(10، 9). شواهدی وجود دارد که نشان میدهد PAX6 در بافتهای آسیب‌دیده چشم بیان میشود تا به ترمیم این بافتها کمک کند. هم چنین دیده شده تنظیم مصنوعی بیان PAX6 میتواند منجر به القای بازسازی بافت آسیب دیده چشم شود(8، 7). ژن PAX6 دارای دو ایزوفرم می‌باشد که در این مطالعه از ایزوفرم PAX6(5a) استفاده شده است. این ایزوفرم دارای 14 آمینو اسید اضافی نسبت به ایزوفرم دیگر این ژن PAX(5b) می‌باشد که توسط اگزون 5a کد میشود و به نظر می‌رسد نقش مؤثرتری در تکوین سلولهای چشم بازی می‌کند(11).
هدف این طرح بررسی اثر ژن PAX6(5a) بر سلولهای خونساز CD133+ به دست آمده از خون بند ناف انسان بود. سلولهای CD133+ به علت پتانسیل بالایی که در تمایز به سلولهای بافتهای مختلف از جمله سلولهای عصبی داشتهاند، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند.
هم چنین در مطالعه‌ها دیده شده که سلولهای CD133+ به دست آمده از مغز استخوان به تعمیر RPE کمک میکنند و در مطالعهای که در سال 2007 بر روی خون بند ناف انجام شد، مشاهده گردید که سلولهای رده منفی (Negative Lineage) موجود در بند ناف در in vivo به سلولهای عصبی شبکیه متمایز می‌شوند(12). ژن PAX6(5a) به واسطه وکتور(لنتی ویروس) به این سلولها منتقل شده سپـس مسیرهـای تمایزی سلول مورد بررسی قرار می‌گیرد.
مواد و روش‌ها
جداسازی سلولهای CD133+ از خون بند ناف:
در یک مطالعه تجربی ﺑﺮای ﺟﺪاﺳﺎزی ﺳﻠﻮل‌های ﺗﮏ ﻫﺴﺘﻪای، ﻧﻤﻮﻧﻪ خون ﺑﻨﺪ ﻧﺎف ﮐﻪ ﺣﺠﻤﯽ ﺣﺪود 150 میلی‌لیتر دارد ﺑﺎ ﻧﺴﺒﺖ یک ﺑﻪ یک ﺑﺎ ﺑﺎﻓﺮ ﻫﻨﮑﺲ رقیق و ﺑﺎ ﻧﺴﺒﺘﯽ ﺣﺪود یک ﺑﻪ دو ﺗﺎ یک ﺑﻪ ﺳﻪ(ﻓﺎیکول: ﺧﻮن ﺑﻨﺪ ﻧﺎف) روی ﻓﺎیکول ﺑﺮده ﺷﺪ. ﺑﺮای این ﮐﺎر از ﻣﺤﻠﻮل فایکول ﺑﺎ دانسیته 1/077 اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ.
بدین ترتیب که از محلول فایکول مقدار 3 تا 4 میلی‌لیتر در یک لوله فالکون 15 میلی‌لیتری ریخته، سپس سوسپانسیون سلولی را آرام به آن اضافه نموده و به مدت 40 دقیقه با دور g 400 سانتریفوژ میشود. بعد از این که زمان سانتریفوژ پایان یافت، محتویات لوله فالکون به 4 قسمت مجزا از هم تقسیم میشود که از پایین به بالا عبارتند از: 1- گلبول‌های قرمز 2- فایکول 3- لایه سلولهای تک هسته‌ای 4- پلاسما با برداشت لایه سلولهای تک هسته‌ای. سلولها به حالت سوسپانسیون در آورده شده و از نمونه خون بند ناف جدا شدند. در مرحله بعد 200 لاندا محلول بلوکه کننده به سلولها اضافه شد، 5 دقیقه بعد 200 لاندا CD133+ microbead Ab به لوله اضافه شد و به مدت یک ساعت در 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. سپس سوسپانسیون سلولی به ستون(MACS = Magnetic activated cell sorting) منتقل شد. در مرحله بعد ستون از دستگاه جدا شده و محتویات آن به یک لوله فالکون منتقل شد سپس لوله فالکون سانتریفوژ شد و سلولهای حاصل در محیط مخصوص Stem Span و حاوی ng SCF 50 + ng FLT3 50 + ng TPO 40 کشت داده شدند. در نهایت جهت ارزیابی درجه خلوص سلولهای CD133+ جدا شده، فلوسایتومتری با استفاده از آنتی‌بادی‌های آنتی CD34 و آنتی CD133 انجام شد.
انتقال سازه نوترکیب لنتی PAX6- و پلاسمیدهای کدکننده پروتئینهای پوششی و ساختاری ویروس به سلولهای 293 T :
تقریباً حدود24 ساعت پیش از آلوده‌سازی(Transfection)،
سلـول‌هـای 293 T کشـت شبانـه داده شدنـد تـا به تراکم
سطحی 70% برسند. آلوده‌سازی هم‌زمان پلاسمید نوترکیب لنتی PAX6- ، پلاسمید PMD2 (کد کننده پروتئینهای پوششی) و پلاسمید PAX2 (کد کننده پروتئینهای ساختاری gag و pol) توسط روش کلسیم فسفات انجام شد. محیط کشت پس از 12 ساعت تعویض شد.
تغلیظ ذرات ویروسی و تعیین تیتر ویروسی:
پس از 72 ساعت از جمع‌آوری محیط کشت، محیط رویی سلولها که حاوی ویروس‌های تولید شده است، جمع‌آوری و سوسپانسیون ویروسی حاصل از دوره‌های مختلف کار با هم مخلوط شد. در مرحله بعد 6000 Peg (Polyethylene glycol) با غلظت نهایی 8% به محلول اضافه شد. سپس محلول را به مدت 5/1 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده و بعد از این مدت محلول برای 15 دقیقه در g 7000 سانتریفوژ شد. در نهایت به میزان 01/0 حجم اولیه X 1 PBS اضافه و در 70- درجه سانتی‌گراد ذخیره شد. به منظور تعیین تیتر ویروس‌های تولید و تغلیظ شده، سلولهای 293 T با رقت‌های مختلف ویروس(از 2/1 تا 4096/1) آلوده و پس از 48 ساعت میزان بیان پروتئین گزارشگر GFP (green fluorescent protein) توسط میکروسکوپ فلورسنت بررسی شد.
آلوده‌سازی سلولهای CD133+ جهت بررسی‌های مورفولوژیکی:
میزان 400 میکرولیتر از تیتر مورد نظر ویروس در 1 ویـال حـاوی محیـط کشت Stem Span + ng SCF 50 + ng Flt3 50 + ng TPO 40 تهیه و تعداد 500000 سلول به آن اضافه شد، پس از یک ساعت انکوباسیون در انکوباتور CO2 ، محتویات ویال‌ها به پلیت 6 خانه‌ای منتقل شده و 1600 میکرولیتر محیط Stem Span به چاهک‌ها اضافه شد.
1- میزان 200 میکرولیتر از تیتر مورد نظر در ویال 5/0 و در محیط کشت Stem Span + ng SCF 50 + ng Flt3 50 ng TPO 40 تهیه و تعداد 100000 سلول به آن اضافه شد. پس از یک ساعت انکوباسیون در انکوباتور CO2 ، محتویات ویال‌ها به چاهک‌های پلیت 24 خانه‌ای منتقل شده و 800 میکرولیتـر محیـط Stem Span بـه چـاهـک‌ها
اضافه شد.
تیمار سلولهای ترانسداکت شده با آنتیبیوتیک پرومایسین:
برای حذف سلولهای ترانسداکت نشده، بعد از گذشت 3 روز از ترانسداکشن یک بار محیط سلولها تعویض شد (روز سوم). روز بعد(روز چهارم) سلولهای ترانسداکت شده به مدت 6 روز در مجاورت آنتیبیوتیک پرومایسین با غلظت µg/mL 4/0 قرار گرفتند.
آزمایش ایمنوسیتوشیمی:
این آزمایش در چاهک‌های پلیت 24 خانه‌ای انجام شد به این ترتیب که:
تعداد 50000 سلول در هر چاهک ریخته شد. روز بعد محیط رویی چاهک‌ها تخلیه شده و هر چاهک با 500 میکرولیتر PBS شستشو داده شد.
سلولهای موجود در هر چاهک با متانول به مدت 5 دقیقه تثبیت شدند. میزان 500 میکرولیتر از محلول(1% PBS – blocking TritonX100/BSA) به هر چاهک اضافه شد و 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. بعد از تخلیه محلول blocking آنتی‌بادی اولیه(بر علیه مارکرهای اختصاصی سلولی از قبیل: Rabbit AntiThy1 IgG ، Rabbit AntiRhodopsin IgG ، Rabbit AntiCHX10 IgG ، Gout Anti Pax6 IgG ، Rabbit AntiNestin IgG) به هر چاهک به جز چاهک کنترل اضافه شد و پلیت یک شب در 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد.
روز بعد آنتی‌بادی اولیه تخلیه و هر چاهک سه بار و هر بار به مدت 3 دقیقه با PBS شستشو داده شد. آنتی‌بادی ثانویه(بر علیه Fc آنتی‌بادی اولیه از قبیل: Gout Anti Rabbit antibody ، Donkey Anti gout Antibody) که کونژوگه به FITC (Fluorescein Isothiocyanat) می‌باشد، به همه چاهک‌ها از جمله چاهک کنترل اضافه و به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
نکته آن که برای جلوگیری از خنثی‌شدن FITC در مقابل نور، پلیت در فویل پیچیده شد. بعد از این زمان آنتی‌بادی ثانویه تخلیه و هر چاهک سه بار و هر بار به مدت 1 دقیقه با PBS شستشو داده شد. در این زمان DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) و mounting media (رنگ زمینه) اضافه شد و بعد از 5 دقیقه چاهک‌ها با میکروسکوپ فلورسانس از نظر بیان مورد بررسی قرار داده شدند.
یافته‌ها
بررسی خصوصیات مورفولوژیکی رده سلولی CD133+ توسط مشاهدات میکروسکوپی با میکروسکوپ معکوس:
پس از جداسازی و کشت سلولهای CD133+ در محیط کشت اختصاصیStem Span ، این سلولها از نظر مورفولوژی بررسی شدند. مشخص شد که تعدادی از سلولهای CD133+ در محیط کشت به صورت سلولهای گرد غیر چسبنده و تعدادی دارای زوائد کوچک و نیمه چسبنده هستند که به مرور زمان تعداد این سلولهای نیمه چسبنده زائده‌دار افزایش می‌یابد(شکل 1).
تایید حضور مارکرهای سطحی اختصاصی سلولهای بنیادی CD133+ با استفاده از آنتی‌بادی اختصاصی و دستگاه فلوسایتومتری:
پس از مشاهدات میکروسکوپی، این سلولها از نظر بیان مارکر CD133+ و CD34+ مورد بررسی قرار گرفت. حضور 90% مارکر CD133 و 95% مارکر CD34 تاییدکننده سلولهای CD133+ می‌باشد.
تعیین تیتر لنتی ویروس حاوی GFP با استفاده از سلول HEK293T :
بعد از مجاورت سلولهای CD133+ با رقت‌های مختلف ویروس طبق آن چه که توضیح داده شد، این سلولها 3 روز بعد از ترانسداکشن از نظر بیان GFP در رقت‌های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند و مشاهده شد که در رقت 2/1 ، سلولها تحت تاثیر غلظت بالای ویروس آسیب دیده بودند. در رقت 4/1 نیز سلولها تا حدودی آسیب دیده بودند. رقت 8/1 بهترین کارآیی ویروس و کمترین آسیب را به همراه داشت گر چه در رقت‌های بالاتر 16/1 تا 64/1 بیان GFP وجود داشت ولی بالاترین کارآیی در رقت 8/1 مشاهده شد(شکل 2).
شکل 1: سلولهای CD133+ جدا شده از بند ناف 2 روز بعد از جداسازی نشاندهنده جمعیتی از سلولهای غیر چسبنده و نیمه چسبنده می‌باشد. (بزرگ‌نمایی X400)
شکل 2: سلولهای HEK293T 3 روز بعد از مجاور شدن با رقت 8/1 ویروس نشاندهنده بالاترین میزان بیان GFP و کمترین آسیب سلولی می‌باشد(بزرگ نمایی X200)
شکل 3: تصویر A: سلولهای CD133+ 3 روز بعد از مجاورت با رقت 4/1 لنتی ویروس حاوی GFP نشاندهنده بیان GFP و آسیب در اثر دوز بالای ویروس می‌باشد تصویر B: سلولهای CD133+ 3 روز بعد از مجاورت با رقت 8/1 لنتی ویروس حاویGFP نشاندهنده بالاترین میزان بیان GFPو کمترین آسیب سلولی می‌باشد(بزرگ نمایی X 200)
تعیین تیتر لنتی ویروس حاوی GFP با استفاده از سلول HEK293T :
بعد از مجاورت سلولهای CD133+ با رقت‌های مختلف ویروس طبق آن چه که توضیح داده شد، این سلولها 3 روز بعد از ترانسداکشن از نظر بیان GFP در رقت‌های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند و مشاهده شد که در رقت 2/1 ، سلولها تحت تاثیر غلظت بالای ویروس آسیب دیده بودند. در رقت 4/1 نیز سلولها تا حدودی آسیب دیده بودند. رقت 8/1 بهترین کارآیی ویروس و کمترین آسیب را به همراه داشت گر چه در رقت‌های بالاتر از 16/1 تا 64/1 بیان GFP وجود داشت ولی بالاترین کارآیی در رقت 8/1 مشاهده شد(شکل 2).
تایید تیتر لنتی ویروس GFP دار با استفاده از سلولهای هدف:
بعد از به دست آوردن تیتر مطلوب ویروس GFP دار با استفاده از سلولهای HEK293T برای اثبات کارآیی این رقت بر سلولهای هدف، این سلولها با رقت مطلوب ویروس GFP دار(8/1) و دو رقت بالا و پایین‌تر از آن (16/1 ، 4/1) مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشاندهنده
کارآیی مطلوب در رقت 8/1 بود. ضمن آن که در رقت‌های 16/1 و 4/1 نیز بیان GFP مشاهده می‌شد ولی در رقت 4/1 سلولها تا حد زیادی تحت تاثیر ویروس آسیب‌دیده بودند و GFP در رقت 16/1 بسیار ضعیف بیـان شـده بود(شکل 3).
بررسی تغییرات مورفولوژیکی بعد از ترانسداکت سلولهـای CD133+ با رقت 8/1 ویروس حاوی ژن PAX6 :
سلولهای CD133+ در مجاورت تیتر مورد نظر ویروس حاوی ژن PAX6 قرار داده شد. بعد از آن هر 24 ساعت تغییرات بررسی و ثبت گردید. نتایج نشاندهنده ایجاد تغییرات مورفولوژیکی از 48 ساعت بعد از آلوده‌سازی بود. 2 روز پس از آلوده‌سازی، سلولهای CD133+ زوائد مویی شکلی که از یک قطب سلول کشیده می‌شد در آوردند. روز سوم سلولهای تعویض محیط شده و از روز چهارم این سلولها در مجاورت پرومایسین قرار داده شدند. همان طور که مشاهده میشود، پس از سه روز مجاورت با پرومایسین سلولهای آلوده شده قابل افتراق از سلولهای آلوده نشده (درحال مرگ) هستند(شکل 4).
شکل 4: سلولهای CD133+ 14 روز پس از آلوده‌سازی با ویروس حاوی ژن PAX6 و 7 روز پس از مجاورت با آنتیبیوتیک پرومایسین(A,B) کنترل 7 روز پس از مجاورت با آنتی‌بیوتک پرومایسین(C)
شکل5: سلولهای آلوده شده با ویروس حاوی ژن PAX6 پروتئین Chx10 را به صورت هسته‌ای(irregular) بیان میکنند(B:DAPI)،(A:FITC)، کنترل (C,D)(بزرگ‌نمایی X200)
شکل 6: سلولهای آلوده شده با ویروس حاوی ژن PAX6 پروتئینPAX6 را به صورت هسته‌ای بیان میکنند(A:FITC) (B:DAPI)، کنترل (C,D) (بزرگ نمایی X 200)
ارزیابی بیان پروتئینهای Chx10 ، Thy-1 ، Nestin ، Rhodopsin ، PAX6 در سلولهای آلوده شده با ویروس حاوی ژن PAX6 با استفاده از آزمایش ایمنوسیتوشیمی (ICC):
جهت ارزیابی بیان پروتئینهای Chx10 ، Thy-1 ، Nestin ، Rhodopsin ، PAX6 در سلولهای آلوده شده با ویروس حاوی ژن PAX6 ، این سلولها 6 روز پس از مجاورت با پرومایسین تثبیت شده و با استفاده از آزمایش ICC مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشاندهنده بیان پروتئینهای Chx10 ، PAX6 و Ty-1 در گروه آزمون و بیان پروتئینهای Rhodopsin و Nestin هم در گروه آزمون و هم در گروه شاهد بود(شکل‌های 5 و 6).
بحث
همان طور که در مقدمه عنوان شد، بیماری‌هایی از قبیل ماکولای وابسته به جنس(AMD)، رتینیت پیگمنتوزا و گلوکوما که همگی شبکیه چشم را درگیر میکنند، علل شایع نابینایی در دنیا هستند و درمانهای مربوط به این بیماریها تنها سیر صعودی آن‌ها را کند می‌کند. از این رو امروزه جهت درمان قطعی این بیماریها محققان به روشهای سلول درمانی متوسل شده‌اند. پیرو این هدف در این تحقیق سلولهای CD133+ به دست آمده از بند ناف به دلیل ظرفیت بالا برای تمایز به سلولهای عصبی انتخاب شده و ژن PAX6(5a)که ژن اصلی کنترل کننده تکوین چشم می‌باشد به این سلولها با استفاده از وکتور لنتی ویروس منتقل شد.
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که القای ژن PAX6 به سلولهای بنیادی CD133+ به دست آمده از بند ناف، باعث القای تمایز به سمت سلولهای شبه عصبی شبکیه میشود.
بیان مارکرهای اختصاصی سلولهای شبکیه نظیر Thy-1 (به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای گانگلیونی)، Chx10 (به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای دو قطبی و سلولهای پروژنیتوری شبکیه) و Rhodopsin (به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای فتورسپتوری)، بیانگر وجود جمعیتی هتروژن از سلولهای عصبی شبکیه می‌باشد(14، 13). هم چنین بیان مارکرهای پروژنیتوری عصبی نظیر Chx10 و Nestin و PAX6 میتواند بیانگر وجود جمعیت‌های پروژنیتوری عصبی نیز باشد. با توجه به قابلیت تکثیر بیشتر این نوع سلولهای پروژنیتوری در مقایسه با سلولهای سوماتیک نظیر فیبروبلاست که در مطالعه‌های دیگر از نظر دگر تمایز به عصب مورد بررسی قرار گرفتهاند، این موضوع یک مزیت مهم به حساب می‌آید(15). هم چنین قابلیت تمایز به سلولهای عصبی با القای تنها یکی از ژنهای کنترل کننده عصبی در مقایسه با نیاز به به کارگیری چندین فاکتور برای تمایز سلولهای سوماتیک به سلولهای عصبی، بیانگر قابلیت انعطاف‌پذیری بیشتر سلولهای بنیادی در مقایسه با سلولهای سوماتیک مطالعه شده می‌باشد(16).
اگر چه ژن PAX6 در تمام سلولهایOptic Cup شبکیه بیان میشود، ولی بیان پایدار این ژن در سلولهای گانگلیونی و آماکراین مشاهده میشود(17). هم چنین مشاهده شده که کاهش بیان PAX6 با کاهش سلولهای گانگلیونی و افزایش سلولهای فتورسپتوری استوانه‌ای همراه است(11). این موارد به همراه بیان واضح Thy-1 در نمونه‌های آزمایش و عدم بیان آن در نمونه‌های کنترل، احتمالاً بیانگر تمایز به سمت سلولهای شبه گانگلیونی می‌باشد. گرچه بیانNestin در سلولهای پروژنیتوری شبکیه و هم چنین سلولهای گانگلیونی قابل مشاهده است و بدین ترتیب نقض‌کننده نتایج حاصل نمی‌باشد ولی بیان این مارکر در سلولهای کنترل بیانگر عدم اختصاصیت آن و بیشتر تاییدکننده پتانسیل سلولهای CD133+ به تمایز به سمت سلولهای با ماهیت پروژنیتوری عصبی می‌باشد(19، 18). بیان رودوپسین به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای فتورسپتوری هم در سلولهای کنترل و هم سلولهای تمایز یافته ممکن است نشان گر تمایز خودبه‌خودی سلولهای CD133+ آلوده نشده به سمت سلولهای فتورسپتوری باشد زیرا مشخص شده که بیان PAX6 با کاهش تمایز به سلولهای فتورسپتوری همراه است(11). PAX6 به موازات Chx10 در سلولهای پروژنیتوری عصبی شبکیه بیان میشود و مشخص شده که ژن PAX6اثر تنظیمی بر بیان این ژن دارد(17). هر چند Chx10 اختصاصی سلولهای دو قطبی نیز می‌باشد ولی در این جا احتمالاً بیان Chx10 به موازات PAX6 در نمونه‌های آزمایش و عدم بیان آن در نمونه‌های کنترل تاییدکننده وجود سلولهای پروژنیتوری عصبی شبکیه است، به این علت که بیان پایدار PAX6 همان طور که ذکر شد با افزایش تمایز به سلولهای گانگلیونی و آماکراین و کاهش تمایز به سمت سلولهای دو قطبی و فتورسپتوری همراه است(11).
نتایج مطالعه حاضر در راستای مطالعه صورت گرفته در سال 2012 که توسط جیورگتی و همکارانش انجام گرفت می‌باشد در این مطالعه آن‌ها نشان دادند که القای SOX-2 به سلولهای بنیادی CD133+ با از دست دادن ماهیت خونسازی و تبدیل به سلولهای شبه عصبی همراه است(20). ژانگ و همکارانش نیز در مطالعهای نشان دادند که تیمار سلولهای CD133+ با رتینوئیک اسید منجر به تمایز این سلولها به سمت سلولهای شبه عصبی، سلولهای آستروسیتی و الیگودندروسیت میشود(21). در مطالعهای دیگر که توسط فقیهی و همکارانش در سال 2008 انجام شد، مشخص شد که تیمار سلولهای CD133+ با staurosporine (STS) باعث تمایز آن‌ها به سلولهای شبه عصبی و آستروسیت میشود(6). اسلووینسکا و همکارانش نیز در مطالعهای با مجاورت سلولهای CD133+ و CD133- به دست آمده از بند ناف با فاکتورهای رشدی نظیر EGF, bFGF و سپس جایگزین کردن آن با FBS نشان دادند که بین دو جمعیت سلولهای CD133- و CD133+ از نظر بیان مارکرهای عصبی اختلاف معناداری وجود دارد که نشاندهنده پتانسیل بیشتر سلولهای CD133+ به سمت تمایز به سلولهای شبه عصبی می‌باشد(22). زانگیاکومی و همکاران نیز در مطالعهای به نقش مؤثر جمعیت CD34- بند ناف بر تمایز سلولهای CD133+ به سمت سلولهای شبه عصبی پی بردند(23). با توجه به مطالعه‌های ذکر شده نتایج مطالعه حاضر نیز تایید کننده پتانسیل سلولهای CD133+ جهت تمایز به سمت سلولهای پروژنیتوری عصبی و شبه عصبی می‌باشد.
این مطالعه هم چنین با مطالعه‌های صورت گرفته که اثر ژن PAX6 را بر سلولهای مختلف ارزیابی میکنند هم‌خوانی دارد. از جمله این مطالعه‌ها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
در مطالعهای که نوریوکی آزوما و همکارانش در سال 2005 انجام دادند مشخص شد که با انتقال ژن PAX6 به سلولهای اپیتلیوم پیگمانته شبکیه(RPE)، این سلولها دچار دگر تمایزی شده و خصوصیات سلولهای عصبی شبکیه را به دست می‌آورند(24) .
در مطالعهای دیگر لاتی‌تیا کارتیر و همکارانش نشان دادند که آلوده‌سازی سلولهای Hela با لنتی ویروس حاوی ژن PAX6 ، منجر به بیان آلفا 3 توبولین عصبی و در نتیجه تغییرات مورفولوژیکی عصبی میشود. این مطالعه از نظر تغییرات مورفولوژیکی اعمال شده توسط ژن PAX6 با مطالعه حاضر قابل مقایسه است(25).
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر تمایز سلولهای CD133+ با استفاده از تلقیح ژن PAX6 به این سلولها به سمت سلولهای پروژنیتوری عصبی با در نظر گرفتن بیان مارکرهای پروژنیتوری از قبیل Chx10 ، Nestin و PAX6 و هم چنین تمایز به سمت سلولهای شبه گانگلیونی با در نظر گرفتن تغییرات مورفولوژیکی و بیان مارکرهای اختصاصی گانگلیون نظیر Thy-1 و PAX6 می باشد. جهت تایید قطعی‌تر بیان این مارکرها بهتر است که در مطالعه‌های بعدی بیان این مارکرهای مذکور به صورت مولکولی نیز بررسی شود.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد مصوب مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون می‌باشد که با حمایت مرکز تحقیقات چشم دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی انجام شده است.
متن کامل: (3265 مشاهده)
چگونگی تکوین سلولهای شبکیه از طریق انتقال ژن PAX6 به سلولهای
CD133+ به دست آمده از بند ناف انسان
سحر بالاقلی1، صدیقه امینی کافی‌آباد2، زهرا سهیلا سهیلی3، شهرام سمیعی4، حمید احمدیه5،
مژگان رضایی کنوی6، مهین نیکوگفتار ظریف7، نارسیس دفتریان6
چکیده
سابقه و هدف
سلولهای بنیادی CD133+ بند ناف، زیر گروهی از سلولهای خونساز را تشکیل می‌دهند. ثابت شده که این سلولها از توانایی تمایز خوبی به سمت سلولهای عصبی برخوردار هستند. ژنPAX6 جزیی از خانواده چند ژنی PAX و از فاکتورهای رونویسی است. ژن PAX6 ژن کنترلکننده اصلی تکامل چشم و اندامهای حسی بافتهای اپیدرمی و عصبی می‌باشد. هدف از این مطالعه، بررسی روند تمایزی سلولهایCD133+ به دست آمده از بند ناف که ژن PAX6(5a) به آن‌ها انتقال یافته است بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، ابتدا سلولهای تک هسته‌ای خون بند ناف به وسیله فایکول جدا شدند، سپس سلولهای CD133+ موجود در آن با روش MACS جدا ْو در محیط کشت Stem Span کشت داده شدند. سپس به منظور ساخت ویروس، وکتور ناقل ژن PAX6 و وکتورهای کمکی(pMD2G ، psPAX2) به سلولهای HEK293T ترانسفکت شدند. پس از تغلیظ ویروس و تیتر کردن آن، سلولهای CD133+ با تیتر مطلوب ویروس آلوده شدند. سلولهای حاوی ویروس مورد نظر، از نظر وجود پروتئینهای PAX6 ، Rhodopsin ، Chx10 ، Thy1 و Nestin توسط روش ایمنوسایتوشیمی ارزیابی شدند.
یافته‌ها
پس از دو هفته پروتئینهای Thy-1 ، Chx10 ، Nestin و PAX6 در سلولهای آلوده شده بیان شدند. هم چنین بیان مارکرهای Rhodopsin و Nestin در سلولهای کنترل مشاهده شد.
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر تمایز سلولهای CD133+ به سلولهای پروژنیتوری عصبی و سلولهای شبه عصبی شبکیه از جمله سلولهای گانگلیونی می‌باشد.
کلمات کلیدی: پروتئین PAX6 ، آنتی‌ژن CD133 ، خون بند ناف
تاریخ دریافت : 6 /2 /93
تاریخ پذیرش : 9/12/93
1- کارشناس ارشد خون‌شناسی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای آموزشی انتقال خون تهران ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- PhD بیوشیمی ـ استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و تکنولوژی زیستی ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس ارشد بیوشیمی ـ مربی مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
5- فوق تخصص شبکیه ـ استاد مرکز تحقیقات چشم دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
6- فوق تخصص شبکیه ـ دانشیار مرکز تحقیقات چشم دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
7- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
CD133+ به دست آمده از بند ناف انسان
سحر بالاقلی1، صدیقه امینی کافی‌آباد2، زهرا سهیلا سهیلی3، شهرام سمیعی4، حمید احمدیه5،
مژگان رضایی کنوی6، مهین نیکوگفتار ظریف7، نارسیس دفتریان6
چکیده
سابقه و هدف
سلولهای بنیادی CD133+ بند ناف، زیر گروهی از سلولهای خونساز را تشکیل می‌دهند. ثابت شده که این سلولها از توانایی تمایز خوبی به سمت سلولهای عصبی برخوردار هستند. ژنPAX6 جزیی از خانواده چند ژنی PAX و از فاکتورهای رونویسی است. ژن PAX6 ژن کنترلکننده اصلی تکامل چشم و اندامهای حسی بافتهای اپیدرمی و عصبی می‌باشد. هدف از این مطالعه، بررسی روند تمایزی سلولهایCD133+ به دست آمده از بند ناف که ژن PAX6(5a) به آن‌ها انتقال یافته است بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، ابتدا سلولهای تک هسته‌ای خون بند ناف به وسیله فایکول جدا شدند، سپس سلولهای CD133+ موجود در آن با روش MACS جدا ْو در محیط کشت Stem Span کشت داده شدند. سپس به منظور ساخت ویروس، وکتور ناقل ژن PAX6 و وکتورهای کمکی(pMD2G ، psPAX2) به سلولهای HEK293T ترانسفکت شدند. پس از تغلیظ ویروس و تیتر کردن آن، سلولهای CD133+ با تیتر مطلوب ویروس آلوده شدند. سلولهای حاوی ویروس مورد نظر، از نظر وجود پروتئینهای PAX6 ، Rhodopsin ، Chx10 ، Thy1 و Nestin توسط روش ایمنوسایتوشیمی ارزیابی شدند.
یافته‌ها
پس از دو هفته پروتئینهای Thy-1 ، Chx10 ، Nestin و PAX6 در سلولهای آلوده شده بیان شدند. هم چنین بیان مارکرهای Rhodopsin و Nestin در سلولهای کنترل مشاهده شد.
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر تمایز سلولهای CD133+ به سلولهای پروژنیتوری عصبی و سلولهای شبه عصبی شبکیه از جمله سلولهای گانگلیونی می‌باشد.
کلمات کلیدی: پروتئین PAX6 ، آنتی‌ژن CD133 ، خون بند ناف
تاریخ دریافت : 6 /2 /93
تاریخ پذیرش : 9/12/93
1- کارشناس ارشد خون‌شناسی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای آموزشی انتقال خون تهران ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- PhD بیوشیمی ـ استادیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و تکنولوژی زیستی ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس ارشد بیوشیمی ـ مربی مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
5- فوق تخصص شبکیه ـ استاد مرکز تحقیقات چشم دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
6- فوق تخصص شبکیه ـ دانشیار مرکز تحقیقات چشم دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
7- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه
امروزه با وجود پیشرفتهای حاصل شده در علم چشم پزشکی، هنوز بیماریهای ناشی از تخریب سلولهای شبکیه به جهت ایجاد نابینایی برگشت ناپذیر، بزرگترین دغدغه چشم پزشکان محسوب میشود. از میان این بیماریها، تخریب ماکولا وابسته به سن(AMD = Age related macular degeneration) که شایعترین عامل نابینایی در بیماران بالای 60 سال است و هم چنین رتینیت پیگمنتوزا (RP = Retinit pigmentoza) که شایعترین بیماری دژنراتیو وراثتی در شبکیه است، را می‌توان نام برد. لازم به ذکر است که در هر دو مورد سلولهای Retinal Pigment Epithelium (RPE)، فتورسپتورهای مخروطی(Cone photoreceptor) و فتورسپتور استوانه‌ای (Rod photoreceptor) تخریب می‌شوند(1). متاسفانه درمانهای کنونی تنها توانستهاند سیر پیشرفت بیماری را کند کنند، بدیهی است که این گونه درمانها برای مراحل پیشرفته بیماری کارآیی ندارد. به همین دلیل امروزه توجه محققان به درمانهای ترمیمی و جایگزینی سلولهای شبکیه معطوف شده است، در میان این درمانها، روشهای استفاده از سلولهای بنیادی بسیار مورد توجه قرار گرفته است(3، 2).
از زمانی که کارآیی استفاده از خون بند ناف در درمان بیماریهای خونی اثبات شد، فکر ایجاد بانک خون‌های بند ناف شکل گرفت. با ایجاد تشکیلات و برقراری استانداردهای جهانی، محققان به گام‌های بلندتری می‌اندیشند که یکی از آن‌ها دسترسی به سلولهای سایر بافتها از طریق تمایز سلولهای موجود در بند ناف است. امروزه ثابت شده سلولهای موجود در بند ناف به جهت اولیه‌تر بودن نسبت به سلولهای بنیادی به دست آمده از بالغین، پتانسیل دگر تمایزی خوبی دارند(6-4). در این مطالعه سلولهای بنیادی CD133+ موجود در خون بند ناف انسان، به عنوان منبعی جهت دستیابی به انواع سلولهای شبکیه مورد بررسی قرار گرفته است.
با توجه به آن که تمایز سلول بنیادی به تعادل حساسی بین فاکتورهای داخلی و خارجی نیاز دارد، در این مطالعه بـا القـای بیـان ژن PAX6 در سلولهـای بنیـادی خـونساز CD133+ به دست آمده از بندناف علاوه بر اثر محیط، تاثیر این ژن نیز به عنوان یک فاکتور داخلی اثرگذار بررسی شد.
ژن PAX6 جزیی از خانواده چند ژنی PAX و از فاکتورهای رونویسی است. پروتئینهای حاصل از این خانواده در تکامل اولیه جانوران و برای اختصاصی شدن بعضی بافتهای خاص ضروری هستند. از میان ژنهای این خانواده ژن PAX6 به عنوان ژن کنترلکننده برای تکامل چشم و اندامهای حسی بافتهای اپیدرمی و عصبی خاص کـه همگـی منشاء اکتودرمی دارند، محسوب میشود(8، 7).
ژن PAX6 ژن کنترلکننده در تکوین چشم بوده و در تشکیل عدسی، عنبیه، شبکیه و قرنیه نقش اساسی دارد(10، 9). شواهدی وجود دارد که نشان میدهد PAX6 در بافتهای آسیب‌دیده چشم بیان میشود تا به ترمیم این بافتها کمک کند. هم چنین دیده شده تنظیم مصنوعی بیان PAX6 میتواند منجر به القای بازسازی بافت آسیب دیده چشم شود(8، 7). ژن PAX6 دارای دو ایزوفرم می‌باشد که در این مطالعه از ایزوفرم PAX6(5a) استفاده شده است. این ایزوفرم دارای 14 آمینو اسید اضافی نسبت به ایزوفرم دیگر این ژن PAX(5b) می‌باشد که توسط اگزون 5a کد میشود و به نظر می‌رسد نقش مؤثرتری در تکوین سلولهای چشم بازی می‌کند(11).
هدف این طرح بررسی اثر ژن PAX6(5a) بر سلولهای خونساز CD133+ به دست آمده از خون بند ناف انسان بود. سلولهای CD133+ به علت پتانسیل بالایی که در تمایز به سلولهای بافتهای مختلف از جمله سلولهای عصبی داشتهاند، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند.
هم چنین در مطالعه‌ها دیده شده که سلولهای CD133+ به دست آمده از مغز استخوان به تعمیر RPE کمک میکنند و در مطالعهای که در سال 2007 بر روی خون بند ناف انجام شد، مشاهده گردید که سلولهای رده منفی (Negative Lineage) موجود در بند ناف در in vivo به سلولهای عصبی شبکیه متمایز می‌شوند(12). ژن PAX6(5a) به واسطه وکتور(لنتی ویروس) به این سلولها منتقل شده سپـس مسیرهـای تمایزی سلول مورد بررسی قرار می‌گیرد.
مواد و روش‌ها
جداسازی سلولهای CD133+ از خون بند ناف:
در یک مطالعه تجربی ﺑﺮای ﺟﺪاﺳﺎزی ﺳﻠﻮل‌های ﺗﮏ ﻫﺴﺘﻪای، ﻧﻤﻮﻧﻪ خون ﺑﻨﺪ ﻧﺎف ﮐﻪ ﺣﺠﻤﯽ ﺣﺪود 150 میلی‌لیتر دارد ﺑﺎ ﻧﺴﺒﺖ یک ﺑﻪ یک ﺑﺎ ﺑﺎﻓﺮ ﻫﻨﮑﺲ رقیق و ﺑﺎ ﻧﺴﺒﺘﯽ ﺣﺪود یک ﺑﻪ دو ﺗﺎ یک ﺑﻪ ﺳﻪ(ﻓﺎیکول: ﺧﻮن ﺑﻨﺪ ﻧﺎف) روی ﻓﺎیکول ﺑﺮده ﺷﺪ. ﺑﺮای این ﮐﺎر از ﻣﺤﻠﻮل فایکول ﺑﺎ دانسیته 1/077 اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ.
بدین ترتیب که از محلول فایکول مقدار 3 تا 4 میلی‌لیتر در یک لوله فالکون 15 میلی‌لیتری ریخته، سپس سوسپانسیون سلولی را آرام به آن اضافه نموده و به مدت 40 دقیقه با دور g 400 سانتریفوژ میشود. بعد از این که زمان سانتریفوژ پایان یافت، محتویات لوله فالکون به 4 قسمت مجزا از هم تقسیم میشود که از پایین به بالا عبارتند از: 1- گلبول‌های قرمز 2- فایکول 3- لایه سلولهای تک هسته‌ای 4- پلاسما با برداشت لایه سلولهای تک هسته‌ای. سلولها به حالت سوسپانسیون در آورده شده و از نمونه خون بند ناف جدا شدند. در مرحله بعد 200 لاندا محلول بلوکه کننده به سلولها اضافه شد، 5 دقیقه بعد 200 لاندا CD133+ microbead Ab به لوله اضافه شد و به مدت یک ساعت در 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. سپس سوسپانسیون سلولی به ستون(MACS = Magnetic activated cell sorting) منتقل شد. در مرحله بعد ستون از دستگاه جدا شده و محتویات آن به یک لوله فالکون منتقل شد سپس لوله فالکون سانتریفوژ شد و سلولهای حاصل در محیط مخصوص Stem Span و حاوی ng SCF 50 + ng FLT3 50 + ng TPO 40 کشت داده شدند. در نهایت جهت ارزیابی درجه خلوص سلولهای CD133+ جدا شده، فلوسایتومتری با استفاده از آنتی‌بادی‌های آنتی CD34 و آنتی CD133 انجام شد.
انتقال سازه نوترکیب لنتی PAX6- و پلاسمیدهای کدکننده پروتئینهای پوششی و ساختاری ویروس به سلولهای 293 T :
تقریباً حدود24 ساعت پیش از آلوده‌سازی(Transfection)،
سلـول‌هـای 293 T کشـت شبانـه داده شدنـد تـا به تراکم
سطحی 70% برسند. آلوده‌سازی هم‌زمان پلاسمید نوترکیب لنتی PAX6- ، پلاسمید PMD2 (کد کننده پروتئینهای پوششی) و پلاسمید PAX2 (کد کننده پروتئینهای ساختاری gag و pol) توسط روش کلسیم فسفات انجام شد. محیط کشت پس از 12 ساعت تعویض شد.
تغلیظ ذرات ویروسی و تعیین تیتر ویروسی:
پس از 72 ساعت از جمع‌آوری محیط کشت، محیط رویی سلولها که حاوی ویروس‌های تولید شده است، جمع‌آوری و سوسپانسیون ویروسی حاصل از دوره‌های مختلف کار با هم مخلوط شد. در مرحله بعد 6000 Peg (Polyethylene glycol) با غلظت نهایی 8% به محلول اضافه شد. سپس محلول را به مدت 5/1 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده و بعد از این مدت محلول برای 15 دقیقه در g 7000 سانتریفوژ شد. در نهایت به میزان 01/0 حجم اولیه X 1 PBS اضافه و در 70- درجه سانتی‌گراد ذخیره شد. به منظور تعیین تیتر ویروس‌های تولید و تغلیظ شده، سلولهای 293 T با رقت‌های مختلف ویروس(از 2/1 تا 4096/1) آلوده و پس از 48 ساعت میزان بیان پروتئین گزارشگر GFP (green fluorescent protein) توسط میکروسکوپ فلورسنت بررسی شد.
آلوده‌سازی سلولهای CD133+ جهت بررسی‌های مورفولوژیکی:
میزان 400 میکرولیتر از تیتر مورد نظر ویروس در 1 ویـال حـاوی محیـط کشت Stem Span + ng SCF 50 + ng Flt3 50 + ng TPO 40 تهیه و تعداد 500000 سلول به آن اضافه شد، پس از یک ساعت انکوباسیون در انکوباتور CO2 ، محتویات ویال‌ها به پلیت 6 خانه‌ای منتقل شده و 1600 میکرولیتر محیط Stem Span به چاهک‌ها اضافه شد.
1- میزان 200 میکرولیتر از تیتر مورد نظر در ویال 5/0 و در محیط کشت Stem Span + ng SCF 50 + ng Flt3 50 ng TPO 40 تهیه و تعداد 100000 سلول به آن اضافه شد. پس از یک ساعت انکوباسیون در انکوباتور CO2 ، محتویات ویال‌ها به چاهک‌های پلیت 24 خانه‌ای منتقل شده و 800 میکرولیتـر محیـط Stem Span بـه چـاهـک‌ها
اضافه شد.
تیمار سلولهای ترانسداکت شده با آنتیبیوتیک پرومایسین:
برای حذف سلولهای ترانسداکت نشده، بعد از گذشت 3 روز از ترانسداکشن یک بار محیط سلولها تعویض شد (روز سوم). روز بعد(روز چهارم) سلولهای ترانسداکت شده به مدت 6 روز در مجاورت آنتیبیوتیک پرومایسین با غلظت µg/mL 4/0 قرار گرفتند.
آزمایش ایمنوسیتوشیمی:
این آزمایش در چاهک‌های پلیت 24 خانه‌ای انجام شد به این ترتیب که:
تعداد 50000 سلول در هر چاهک ریخته شد. روز بعد محیط رویی چاهک‌ها تخلیه شده و هر چاهک با 500 میکرولیتر PBS شستشو داده شد.
سلولهای موجود در هر چاهک با متانول به مدت 5 دقیقه تثبیت شدند. میزان 500 میکرولیتر از محلول(1% PBS – blocking TritonX100/BSA) به هر چاهک اضافه شد و 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. بعد از تخلیه محلول blocking آنتی‌بادی اولیه(بر علیه مارکرهای اختصاصی سلولی از قبیل: Rabbit AntiThy1 IgG ، Rabbit AntiRhodopsin IgG ، Rabbit AntiCHX10 IgG ، Gout Anti Pax6 IgG ، Rabbit AntiNestin IgG) به هر چاهک به جز چاهک کنترل اضافه شد و پلیت یک شب در 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد.
روز بعد آنتی‌بادی اولیه تخلیه و هر چاهک سه بار و هر بار به مدت 3 دقیقه با PBS شستشو داده شد. آنتی‌بادی ثانویه(بر علیه Fc آنتی‌بادی اولیه از قبیل: Gout Anti Rabbit antibody ، Donkey Anti gout Antibody) که کونژوگه به FITC (Fluorescein Isothiocyanat) می‌باشد، به همه چاهک‌ها از جمله چاهک کنترل اضافه و به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
نکته آن که برای جلوگیری از خنثی‌شدن FITC در مقابل نور، پلیت در فویل پیچیده شد. بعد از این زمان آنتی‌بادی ثانویه تخلیه و هر چاهک سه بار و هر بار به مدت 1 دقیقه با PBS شستشو داده شد. در این زمان DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) و mounting media (رنگ زمینه) اضافه شد و بعد از 5 دقیقه چاهک‌ها با میکروسکوپ فلورسانس از نظر بیان مورد بررسی قرار داده شدند.
یافته‌ها
بررسی خصوصیات مورفولوژیکی رده سلولی CD133+ توسط مشاهدات میکروسکوپی با میکروسکوپ معکوس:
پس از جداسازی و کشت سلولهای CD133+ در محیط کشت اختصاصیStem Span ، این سلولها از نظر مورفولوژی بررسی شدند. مشخص شد که تعدادی از سلولهای CD133+ در محیط کشت به صورت سلولهای گرد غیر چسبنده و تعدادی دارای زوائد کوچک و نیمه چسبنده هستند که به مرور زمان تعداد این سلولهای نیمه چسبنده زائده‌دار افزایش می‌یابد(شکل 1).
تایید حضور مارکرهای سطحی اختصاصی سلولهای بنیادی CD133+ با استفاده از آنتی‌بادی اختصاصی و دستگاه فلوسایتومتری:
پس از مشاهدات میکروسکوپی، این سلولها از نظر بیان مارکر CD133+ و CD34+ مورد بررسی قرار گرفت. حضور 90% مارکر CD133 و 95% مارکر CD34 تاییدکننده سلولهای CD133+ می‌باشد.
تعیین تیتر لنتی ویروس حاوی GFP با استفاده از سلول HEK293T :
بعد از مجاورت سلولهای CD133+ با رقت‌های مختلف ویروس طبق آن چه که توضیح داده شد، این سلولها 3 روز بعد از ترانسداکشن از نظر بیان GFP در رقت‌های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند و مشاهده شد که در رقت 2/1 ، سلولها تحت تاثیر غلظت بالای ویروس آسیب دیده بودند. در رقت 4/1 نیز سلولها تا حدودی آسیب دیده بودند. رقت 8/1 بهترین کارآیی ویروس و کمترین آسیب را به همراه داشت گر چه در رقت‌های بالاتر 16/1 تا 64/1 بیان GFP وجود داشت ولی بالاترین کارآیی در رقت 8/1 مشاهده شد(شکل 2).
شکل 1: سلولهای CD133+ جدا شده از بند ناف 2 روز بعد از جداسازی نشاندهنده جمعیتی از سلولهای غیر چسبنده و نیمه چسبنده می‌باشد. (بزرگ‌نمایی X400)
شکل 2: سلولهای HEK293T 3 روز بعد از مجاور شدن با رقت 8/1 ویروس نشاندهنده بالاترین میزان بیان GFP و کمترین آسیب سلولی می‌باشد(بزرگ نمایی X200)
شکل 3: تصویر A: سلولهای CD133+ 3 روز بعد از مجاورت با رقت 4/1 لنتی ویروس حاوی GFP نشاندهنده بیان GFP و آسیب در اثر دوز بالای ویروس می‌باشد تصویر B: سلولهای CD133+ 3 روز بعد از مجاورت با رقت 8/1 لنتی ویروس حاویGFP نشاندهنده بالاترین میزان بیان GFPو کمترین آسیب سلولی می‌باشد(بزرگ نمایی X 200)
تعیین تیتر لنتی ویروس حاوی GFP با استفاده از سلول HEK293T :
بعد از مجاورت سلولهای CD133+ با رقت‌های مختلف ویروس طبق آن چه که توضیح داده شد، این سلولها 3 روز بعد از ترانسداکشن از نظر بیان GFP در رقت‌های مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند و مشاهده شد که در رقت 2/1 ، سلولها تحت تاثیر غلظت بالای ویروس آسیب دیده بودند. در رقت 4/1 نیز سلولها تا حدودی آسیب دیده بودند. رقت 8/1 بهترین کارآیی ویروس و کمترین آسیب را به همراه داشت گر چه در رقت‌های بالاتر از 16/1 تا 64/1 بیان GFP وجود داشت ولی بالاترین کارآیی در رقت 8/1 مشاهده شد(شکل 2).
تایید تیتر لنتی ویروس GFP دار با استفاده از سلولهای هدف:
بعد از به دست آوردن تیتر مطلوب ویروس GFP دار با استفاده از سلولهای HEK293T برای اثبات کارآیی این رقت بر سلولهای هدف، این سلولها با رقت مطلوب ویروس GFP دار(8/1) و دو رقت بالا و پایین‌تر از آن (16/1 ، 4/1) مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج نشاندهنده
کارآیی مطلوب در رقت 8/1 بود. ضمن آن که در رقت‌های 16/1 و 4/1 نیز بیان GFP مشاهده می‌شد ولی در رقت 4/1 سلولها تا حد زیادی تحت تاثیر ویروس آسیب‌دیده بودند و GFP در رقت 16/1 بسیار ضعیف بیـان شـده بود(شکل 3).
بررسی تغییرات مورفولوژیکی بعد از ترانسداکت سلولهـای CD133+ با رقت 8/1 ویروس حاوی ژن PAX6 :
سلولهای CD133+ در مجاورت تیتر مورد نظر ویروس حاوی ژن PAX6 قرار داده شد. بعد از آن هر 24 ساعت تغییرات بررسی و ثبت گردید. نتایج نشاندهنده ایجاد تغییرات مورفولوژیکی از 48 ساعت بعد از آلوده‌سازی بود. 2 روز پس از آلوده‌سازی، سلولهای CD133+ زوائد مویی شکلی که از یک قطب سلول کشیده می‌شد در آوردند. روز سوم سلولهای تعویض محیط شده و از روز چهارم این سلولها در مجاورت پرومایسین قرار داده شدند. همان طور که مشاهده میشود، پس از سه روز مجاورت با پرومایسین سلولهای آلوده شده قابل افتراق از سلولهای آلوده نشده (درحال مرگ) هستند(شکل 4).
شکل 4: سلولهای CD133+ 14 روز پس از آلوده‌سازی با ویروس حاوی ژن PAX6 و 7 روز پس از مجاورت با آنتیبیوتیک پرومایسین(A,B) کنترل 7 روز پس از مجاورت با آنتی‌بیوتک پرومایسین(C)
شکل5: سلولهای آلوده شده با ویروس حاوی ژن PAX6 پروتئین Chx10 را به صورت هسته‌ای(irregular) بیان میکنند(B:DAPI)،(A:FITC)، کنترل (C,D)(بزرگ‌نمایی X200)
شکل 6: سلولهای آلوده شده با ویروس حاوی ژن PAX6 پروتئینPAX6 را به صورت هسته‌ای بیان میکنند(A:FITC) (B:DAPI)، کنترل (C,D) (بزرگ نمایی X 200)
ارزیابی بیان پروتئینهای Chx10 ، Thy-1 ، Nestin ، Rhodopsin ، PAX6 در سلولهای آلوده شده با ویروس حاوی ژن PAX6 با استفاده از آزمایش ایمنوسیتوشیمی (ICC):
|
A
|
بحث
همان طور که در مقدمه عنوان شد، بیماری‌هایی از قبیل ماکولای وابسته به جنس(AMD)، رتینیت پیگمنتوزا و گلوکوما که همگی شبکیه چشم را درگیر میکنند، علل شایع نابینایی در دنیا هستند و درمانهای مربوط به این بیماریها تنها سیر صعودی آن‌ها را کند می‌کند. از این رو امروزه جهت درمان قطعی این بیماریها محققان به روشهای سلول درمانی متوسل شده‌اند. پیرو این هدف در این تحقیق سلولهای CD133+ به دست آمده از بند ناف به دلیل ظرفیت بالا برای تمایز به سلولهای عصبی انتخاب شده و ژن PAX6(5a)که ژن اصلی کنترل کننده تکوین چشم می‌باشد به این سلولها با استفاده از وکتور لنتی ویروس منتقل شد.
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که القای ژن PAX6 به سلولهای بنیادی CD133+ به دست آمده از بند ناف، باعث القای تمایز به سمت سلولهای شبه عصبی شبکیه میشود.
بیان مارکرهای اختصاصی سلولهای شبکیه نظیر Thy-1 (به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای گانگلیونی)، Chx10 (به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای دو قطبی و سلولهای پروژنیتوری شبکیه) و Rhodopsin (به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای فتورسپتوری)، بیانگر وجود جمعیتی هتروژن از سلولهای عصبی شبکیه می‌باشد(14، 13). هم چنین بیان مارکرهای پروژنیتوری عصبی نظیر Chx10 و Nestin و PAX6 میتواند بیانگر وجود جمعیت‌های پروژنیتوری عصبی نیز باشد. با توجه به قابلیت تکثیر بیشتر این نوع سلولهای پروژنیتوری در مقایسه با سلولهای سوماتیک نظیر فیبروبلاست که در مطالعه‌های دیگر از نظر دگر تمایز به عصب مورد بررسی قرار گرفتهاند، این موضوع یک مزیت مهم به حساب می‌آید(15). هم چنین قابلیت تمایز به سلولهای عصبی با القای تنها یکی از ژنهای کنترل کننده عصبی در مقایسه با نیاز به به کارگیری چندین فاکتور برای تمایز سلولهای سوماتیک به سلولهای عصبی، بیانگر قابلیت انعطاف‌پذیری بیشتر سلولهای بنیادی در مقایسه با سلولهای سوماتیک مطالعه شده می‌باشد(16).
اگر چه ژن PAX6 در تمام سلولهایOptic Cup شبکیه بیان میشود، ولی بیان پایدار این ژن در سلولهای گانگلیونی و آماکراین مشاهده میشود(17). هم چنین مشاهده شده که کاهش بیان PAX6 با کاهش سلولهای گانگلیونی و افزایش سلولهای فتورسپتوری استوانه‌ای همراه است(11). این موارد به همراه بیان واضح Thy-1 در نمونه‌های آزمایش و عدم بیان آن در نمونه‌های کنترل، احتمالاً بیانگر تمایز به سمت سلولهای شبه گانگلیونی می‌باشد. گرچه بیانNestin در سلولهای پروژنیتوری شبکیه و هم چنین سلولهای گانگلیونی قابل مشاهده است و بدین ترتیب نقض‌کننده نتایج حاصل نمی‌باشد ولی بیان این مارکر در سلولهای کنترل بیانگر عدم اختصاصیت آن و بیشتر تاییدکننده پتانسیل سلولهای CD133+ به تمایز به سمت سلولهای با ماهیت پروژنیتوری عصبی می‌باشد(19، 18). بیان رودوپسین به عنوان مارکر اختصاصی سلولهای فتورسپتوری هم در سلولهای کنترل و هم سلولهای تمایز یافته ممکن است نشان گر تمایز خودبه‌خودی سلولهای CD133+ آلوده نشده به سمت سلولهای فتورسپتوری باشد زیرا مشخص شده که بیان PAX6 با کاهش تمایز به سلولهای فتورسپتوری همراه است(11). PAX6 به موازات Chx10 در سلولهای پروژنیتوری عصبی شبکیه بیان میشود و مشخص شده که ژن PAX6اثر تنظیمی بر بیان این ژن دارد(17). هر چند Chx10 اختصاصی سلولهای دو قطبی نیز می‌باشد ولی در این جا احتمالاً بیان Chx10 به موازات PAX6 در نمونه‌های آزمایش و عدم بیان آن در نمونه‌های کنترل تاییدکننده وجود سلولهای پروژنیتوری عصبی شبکیه است، به این علت که بیان پایدار PAX6 همان طور که ذکر شد با افزایش تمایز به سلولهای گانگلیونی و آماکراین و کاهش تمایز به سمت سلولهای دو قطبی و فتورسپتوری همراه است(11).
نتایج مطالعه حاضر در راستای مطالعه صورت گرفته در سال 2012 که توسط جیورگتی و همکارانش انجام گرفت می‌باشد در این مطالعه آن‌ها نشان دادند که القای SOX-2 به سلولهای بنیادی CD133+ با از دست دادن ماهیت خونسازی و تبدیل به سلولهای شبه عصبی همراه است(20). ژانگ و همکارانش نیز در مطالعهای نشان دادند که تیمار سلولهای CD133+ با رتینوئیک اسید منجر به تمایز این سلولها به سمت سلولهای شبه عصبی، سلولهای آستروسیتی و الیگودندروسیت میشود(21). در مطالعهای دیگر که توسط فقیهی و همکارانش در سال 2008 انجام شد، مشخص شد که تیمار سلولهای CD133+ با staurosporine (STS) باعث تمایز آن‌ها به سلولهای شبه عصبی و آستروسیت میشود(6). اسلووینسکا و همکارانش نیز در مطالعهای با مجاورت سلولهای CD133+ و CD133- به دست آمده از بند ناف با فاکتورهای رشدی نظیر EGF, bFGF و سپس جایگزین کردن آن با FBS نشان دادند که بین دو جمعیت سلولهای CD133- و CD133+ از نظر بیان مارکرهای عصبی اختلاف معناداری وجود دارد که نشاندهنده پتانسیل بیشتر سلولهای CD133+ به سمت تمایز به سلولهای شبه عصبی می‌باشد(22). زانگیاکومی و همکاران نیز در مطالعهای به نقش مؤثر جمعیت CD34- بند ناف بر تمایز سلولهای CD133+ به سمت سلولهای شبه عصبی پی بردند(23). با توجه به مطالعه‌های ذکر شده نتایج مطالعه حاضر نیز تایید کننده پتانسیل سلولهای CD133+ جهت تمایز به سمت سلولهای پروژنیتوری عصبی و شبه عصبی می‌باشد.
این مطالعه هم چنین با مطالعه‌های صورت گرفته که اثر ژن PAX6 را بر سلولهای مختلف ارزیابی میکنند هم‌خوانی دارد. از جمله این مطالعه‌ها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
در مطالعهای که نوریوکی آزوما و همکارانش در سال 2005 انجام دادند مشخص شد که با انتقال ژن PAX6 به سلولهای اپیتلیوم پیگمانته شبکیه(RPE)، این سلولها دچار دگر تمایزی شده و خصوصیات سلولهای عصبی شبکیه را به دست می‌آورند(24) .
در مطالعهای دیگر لاتی‌تیا کارتیر و همکارانش نشان دادند که آلوده‌سازی سلولهای Hela با لنتی ویروس حاوی ژن PAX6 ، منجر به بیان آلفا 3 توبولین عصبی و در نتیجه تغییرات مورفولوژیکی عصبی میشود. این مطالعه از نظر تغییرات مورفولوژیکی اعمال شده توسط ژن PAX6 با مطالعه حاضر قابل مقایسه است(25).
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر تمایز سلولهای CD133+ با استفاده از تلقیح ژن PAX6 به این سلولها به سمت سلولهای پروژنیتوری عصبی با در نظر گرفتن بیان مارکرهای پروژنیتوری از قبیل Chx10 ، Nestin و PAX6 و هم چنین تمایز به سمت سلولهای شبه گانگلیونی با در نظر گرفتن تغییرات مورفولوژیکی و بیان مارکرهای اختصاصی گانگلیون نظیر Thy-1 و PAX6 می باشد. جهت تایید قطعی‌تر بیان این مارکرها بهتر است که در مطالعه‌های بعدی بیان این مارکرهای مذکور به صورت مولکولی نیز بررسی شود.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد مصوب مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون می‌باشد که با حمایت مرکز تحقیقات چشم دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی انجام شده است.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
