جلد 11، شماره 1 - ( بهار 93 1393 )
جلد 11 شماره 1 صفحات 31-23 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rajabi A, Ahmadinejad M, Mashkooli M, Tabatabaie S, Seyed Mortaz S, Ran-Balooch S, et al . The prevalence of platelet function defects in patients referred to the special reference coagulation laboratory of Iranian Blood Transfusion Organization. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2015; 11 (1) :23-31
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-851-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-851-fa.html
رجبی علی، احمدی‌نژاد مینو، مشکولی مریم، طباطبایی سید محمدرضا، سید مرتاض سیده لادن، رن بلوچ سمیه، و همکاران.. اختلالات عملکرد پلاکتی در بیماران مراجعهکننده به آزمایشگاه مرجع انعقاد سازمان انتقال خون ایران. فصلنامه پژوهشی خون. 1393; 11 (1) :23-31
علی رجبی 
، مینو احمدی‌نژاد* ، مریم مشکولی ، سید محمدرضا طباطبایی ، سیده لادن سید مرتاض ، سمیه رن بلوچ ، سیده سمیه معززی نکویی اصل ، زهره مختاری ، مهسا مجتبوی نائینی
، مینو احمدی‌نژاد* ، مریم مشکولی ، سید محمدرضا طباطبایی ، سیده لادن سید مرتاض ، سمیه رن بلوچ ، سیده سمیه معززی نکویی اصل ، زهره مختاری ، مهسا مجتبوی نائینی
استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
واژه‌های کلیدی: کلمات کلیدی : اختلالات پلاکتی، آزمونهای عملکرد پلاکتی، تجمع پلاکتی، سندروم برنارد سولیر، ترومباستنی
متن کامل [PDF 312 kb]
(3795 دریافت)
| چکیده (HTML) (17242 مشاهده)
مقدمه
اختلالات پلاکتی، از شایعترین اختلالات خونریزیدهنده هستند. پلاکتها تعدادی از گیرندههای غشایی گلیکوپرتئینی را بیان میکنند که چسبندگی(adhesion) و تجمع(aggregation) پلاکتی را میانجیگری می‌نمایند. بیشترین میزان گیرنده غشایی پلاکتها، مربوط به اینتگرین αIIbβ3 است که بیشتر به نام گلیکوپروتئین IIb/IIIa شناخته میشود. این گیرنده در مرحله تجمع پلاکتی نقش اصلی را به عهده دارد. کمبود یا عملکرد ناقص αIIbβ3 منجر به اختلال شدید خونریزیدهنده به نام ترومباستنی گلانزمن(Glanzmann thrombasthenia, GT) میشود. گیرندههای دیگری هم بر روی پلاکتها وجود دارند که برای عملکرد پلاکتی اهمیت دارند. در این میان، گیرنده حاوی تکرارهای غنی از لوسین به نام گلیکوپروتئین Ib/IX/V برای چسبندگی پلاکتی با واسطه عامل فونویلبراند نقش حیاتی دارد. کمبود یا اختلال عملکرد گیرنده Ib/IX/V نیز با یک اختلال پلاکتی شدید به نام سندروم برنارد سولیر(Bernard Soulier Syndrome, BSS) همراه است(1).
آزمونهای عملکرد پلاکتی شامل تجمع و ترشح پلاکتی اغلب در ارزیابی بالینی بیماران دارای مشکلات خونریزیدهنده درخواست میشود(2).
در آزمایشگاههای بالینی، به طور معمول از آگونیستهای تجاری ADP ، اپینفرین، کلاژن و اسید آراشیدونیک و به علاوه آگونیست صناعی ریستوستین استفاده میگردد. ADP و اپینفرین جزو آگونیستهای ضعیف پلاکتی محسوب میشوند. آگونیستهای متنوع دیگری هم وجود دارند که هر آزمایشگاه بسته به برنامه و بودجه و تجارب کاری خود از آنها استفاده میکند، اما هیچ الگوی استانداردی برای انجام آزمایش، مقادیر مرجع و تفسیر آزمونهای کیفی پلاکتی وجود ندارد. البته در این بین، دو بیماری ترومباستنی گلانزمن و سندروم برنارد سولیر الگوی تجمع پلاکتی مشخصی دارند. بنابراین هر آزمایشگاه باید با توجه به امکانات و بیماران خود، الگوی مطلوب آزمایشهای خود را به دست بیاورد(3، 2).
بررسـی ترشح گرانولهای پلاکتی، در ارزیابی اختلالات
عملکرد پلاکتها از اهمیت ویژهای برخوردار است. ترشح محتویات گرانولهای متراکم پلاکتها به وسیله رهاسازی سروتونین- کربن 14 متعاقب تحریک توسط آگونیستهای پلاکتی و یا به روش سادهتر توسط رهاسازی ATP از گرانولها به وسیله یک روش کمیلومینسانس قابل ارزیابی است. ناهنجاریهای ترشحی پلاکتها، به دلیل عدم رهاسازی گرانولهای پلاکتی، اغلب به وسیله هر دو آزمون تجمع و ترشح پلاکتی قابل شناسایی هستند. به طوری که در آزمون تجمع پلاکتی، موج دوم تجمع به ویژه با آگونیستهای ADP و اپینفرین که به طور اساسی وابسته به ترشح گرانولهای متراکم است، دیده نمیشود. بررسی اختلالات ترشحی بر خلاف آزمون تجمع پلاکتی، به دلیل هزینه بالا و وقتگیر بودن آن تنها در آزمایشگاههای مرجع انعقادی قابل انجام است(6-2).
به خاطر این که آزمونهای تشخیصی اختلالات عملکرد پلاکتی گران و وقتگیر هستند و به طور گسترده در دسترس نیستند، تاکنون مطالعهای مبتنی بر جمعیت برای تعیین شیوع اختلالات یادشده انجام نشده است. با این حال، اطلاعاتی در مورد شیوع نسبی اختلالات پلاکتی در مقایسه با دیگر مشکلات خونریزیدهنده(مثل بیماری فونویلبراند) وجود دارد که بیانگر این هستند که اختلالات پلاکتی در جمعیت بسیار معمول میباشند و امکان دارد که شیوعی معادل و یا حتی بیشتر از بیماری فونویلبراند داشته باشند(7، 3).
در ایران نیز هر چند بررسیهایی روی انواع شدید بیماریهای پلاکتی یعنی ترومباستنی گلانزمن و سندروم برنارد سولیر صورت گرفته است، اما به دلیل محدودیت روشهای تشخیصی بیماریهای پلاکتی در ایران، شیوع این گروه از اختلالات خونریزی دهنده به خوبی شناخته شده نیست(11-8). هم چنین تاکنون هیچ گزارشی از بررسی اختلالات ترشح پلاکتی در کشور در دست نمی‌باشد. در آزمایشگاه مرجع انعقاد ستاد مرکزی سازمان انتقال خون ایران، از دو سال پیش تاکنون، در بیماران دارای مشکلات خونریزیدهنده که برای بررسی عملکرد پلاکتی مراجعه کرده بودند، علاوه بر بررسی تجمع پلاکتی، اقدام به بررسی میزان ترشح ATP در موارد مشکوک به اختلالات ترشح پلاکتی شد. در این مطالعه از آگونیستهای ADP ، کلاژن، اسید آراشیدونیک و ریستوستین برای ارزیابی تجمع پلاکتی و از ماده لومینسانس محتوی لوسیفرین- لوسیفراز برای بررسی وضعیت ترشح پلاکتی استفاده شد.
مواد و روشها
بر اساس یک مطالعه توصیفی و گذشتهنگر (descriptive retrospective)، طی هفت ماه(از اول آبان 1390 تا آخر اردیبهشت 1391)، تعداد 195 فرد(66 مرد و 129 زن، 1/2 F/M= ) مشکوک به اختلالات خونریزی دهنده که با درخواست آزمایش بررسی عملکرد پلاکتی به آزمایشگاه انعقاد ستاد مرکزی سازمان انتقال خون ایران مراجعه کرده بودند، با مراجعه به پرونده‌های بالینی و آزمونهای آزمایشگاهی بیماران، مورد بررسی قرار گرفتند.
نمونهگیری و انجام آزمون تجمع و ترشح پلاکتی، بر اساس دستورالعمل‌های موجود در بخش انعقاد، برای همه بیماران انجام شد. بر این اساس، نمونهگیری توسط لوله‌های خلاء (Vacutainer) مربوط به شرکت BD انگلستان حاوی ضد انعقاد سیترات سدیم 105/0 مولار انجام شد.
پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) با استفاده از نمونه خون سیتراته و سانتریفیوژ با دور پایین(RCF بین g 150-30 بر اساس شمارش پلاکت اولیه فرد) و پلاسمای فاقد پلاکت (PPP) با استفاده از سانتریفیوژ با دور بالا(RCF بین g 3000-2500) به دست آمد. جمع‌آوری، انتقال و سانتریفیوژ نمونه‌ها در دمای اتاق صورت گرفت.
بر اساس درخواست پزشک معالج، برای همه بیماران آزمایش تجمع پلاکتی در دستگاه اگریگومتر ساخت شرکت کرونولوگ آمریکا(Chronolog model 700 x, Havertown, Pennsylvania (PA)) و با پانل اولیه آگونیستهای زیر انجام شد: ADP (غلظت µM5)، کلاژن(µg/mL 2)، آراشیدونیک اسید (mM 5/0) و ریستوستین(mg/mL 5/1). در صورتی که پاسخ پلاکتهای بیمار با غلظتهای معمول ADP و یا کلاژن در پانل اولیه، در مقایسه با مقادیر مرجع، ضعیف و یا برگشتپذیر بود، ADP با غلظتهای بالا(µM 10 و µM 20) و کلاژن با غلظت بالا(µg/mL 5) نیز بررسی شد تا پاسخهای ضعیف شناسایی شوند. برای بیمارانی که پاسخ برگشتپذیر به آگونیستها میدادند، بررسی ترشح ATP پلاکتی با استفاده از ماده لومینسانس محتوی لوسیفرین- لوسیفراز انجام میشد. همه معرفهای مورد استفاده از شرکت Helena فرانسه خریداری شدند. آزمون سنجش ترشح پلاکتی نیز با معرف Chemi-Lume از شرکت کرونولوگ انجام پذیرفت و با استفاده از یک ATP standard مربوط به همان شرکت، میزان رهاسازی نور حاصل از عملکرد آنزیم- سوبسترا استانداردسازی شد. برای بیمارانی که نیاز به بررسی ترشح پلاکتی داشتند، پس از افزودن ماده لومینسانس(محتوی لوسیفرین و لوسیفراز) به PRP و افزودن آگونیست مورد نظر، به طور هم زمان تجمع و ترشح پلاکتی بررسی شد. نتیجه این واکنش بر روی سیستم مانیتورینگ به صورت دو نمودار با رنگهای مجزا برای هر آگونیست ظاهر میشد.
تعیین مقادیر طبیعی پاسخدهی به آگونیستها:
فاصله اطمینان مقادیر طبیعی برای آزمونهای تجمع پلاکتی با آزمایش 22 فرد سالم که با گرفتن شرح حال، فاقد مشکلات خونریزی دهنده و یا بیماریهای مزمن بودند و طی 10 روز قبل از نمونهگیری هیچ گونه دارو و یا عوامل شناخته شده تاثیرگذار بر روی عملکرد پلاکت مصرف نکرده بودند، به دست آمد.
پس از انجام آزمایش تجمع با آگونیستهای ADP (µM 20، 10 و 5)، اسید آراشیدونیک(mM 5/0)، کلاژن (µg/mL 5 و 2) و ریستوستین(mg/mL 5/1)، میانگین پاسخدهی به هر غلظت از آگونیست به صورت SD ± Mean تعیین شد. در زمان انجام این مطالعه به دلیل هزینه بالای ماده لومینسانس، بررسی تعیین محدوده طبیعی پاسخ ترشح پلاکتی انجام نشد و لذا جهت تفسیر نتایج، فاصله اطمینان طبیعی ترشح پلاکتی گزارش شده بر اساس بروشور شرکت سازنده دستگاه کرونولوگ تعریف و تنها با انجام یک نمونه کنترل تایید شد. بر اساس فاصله اطمینان مقادیر طبیعی پاسخدهی به آگونیستها و لوسیفرین- لوسیفراز، نتایج پاسخدهی بیمارانی که خارج از محدوده طبیعی هر آگونیست قرار میگرفت، به عنوان "غیرطبیعی" در نظر گرفته میشد. نتایج مطالعه با نرمافزار SPSS نسخه 16 مربوط به شرکت Polar Engineering تجزیه و تحلیل شد.
یافته‌ها
این پژوهش بر پایه یک مطالعه گذشتهنگر بر روی 195 فرد دارای مشکلات خونریزیدهنده طراحی شده که به منظور بررسی عملکرد پلاکتی به آزمایشگاه مرجع انعقاد ستاد مرکزی سازمان انتقال خون ایران مراجعه کرده بودند. سن بیماران مراجعهکننده از یک ماه تا 81 سال و با میانگین 28 سال بود. 5/61% بیماران، بالغین بین سنین 18 تا 50 سال بودند.
علت مراجعه 46% بیماران مراجعه کننده(89 نفر)، مشکلات خونریزی جلدی - مخاطی مانند خونریزی بینی و لثه، اکیموز و خونریزیهای قاعدگی(منوراژی) بود. دیگر بیماران با عللی مانند بررسی علت ترومبوسیتوپنی(39 مورد)، ترمبوسیتوز شدید(یک مورد)، خونریزی دستگاه گوارش(یک مورد) و دیگر علل متفرقه(65 مورد) مانند بررسی چکآپ روتین، چکآپ قبل یا بعد از جراحی و سابقه خانوادگی مشکلات خونریزیدهنده یا کمبود فاکتورهای انعقادی به این مرکز ارجاع داده شده بودند. 129 نفر(15/66%) از مراجعین را زنان و 66 نفر(85/33%) را مردان تشکیل میدادند.
بر اساس شرح حال بیماران، درجه خونریزی (bleeding score) بر اساس معیار توزتو و همکاران، در 62% بیماران کمتـر از 2، 4/28% بین 5-3 و در 6/9% موارد بیشتر یا مساوی 6 بود(12). از میان 195 مراجعهکننده، 4 بیمار داروهای ضد پلاکت مانند آسپیرین و پلاویکس و 9 بیمار داروهای ضدالتهاب غیراستروئیدی مصرف میکردند. در این میان، 2 بیمار مصرفکننده آسپیرین و یک بیمار مصرفکننده ایبوپروفن دارای آزمون تجمع پلاکتی مختل شده بودند. دیگر بیماران این گروه، آزمون تجمع طبیعی داشتند.
نتایج آزمایشگاهی:
شمـارش پـلاکـت اولیـه بیمـاران بـر روی خون دارای
EDTA ، بین L/109×482-12 و فاصله اطمینان L/109× 100 ± 204 (SD ± Mean) بود. البته یک بیمار دارای ترمبوسیتوز شدید با شمارش پلاکتی L/109×1900 از محاسبه فوق حذف گردید. از میان 195 مراجعهکننده، 67 بیمار(4/34%) دارای ترومبوسیتوپنی(پلاکت اولیه کمتر از L/109×150) بودند.
پس از تهیه PRP (بر روی خون سیتراته)، شمارش پلاکتی بین L/109 × 671-9 و فاصله اطمینان L/109× 139 ± 295 در تغییر بود.
به طور کلی از میان 195 مراجعهکننده، 105 مورد (8/53%) از نظر شمارش و عملکرد پلاکتی کاملا طبیعی و 90 مورد(1/46%) دارای اختلال کمی و/یا کیفی پلاکتی بودند. بیماران دارای اختلال کمی و کیفی پلاکتی شامل موارد زیر بودند: 44 بیمار(6/22%) اختلالات عملکردی پلاکتی دستهبندی نشده، 16 بیمار(2/8%) ترومبوسیتوپنی با عملکرد طبیعی پلاکتی، 13 بیمار(7/6%) اختلال ترشح ATP (رهاسازی گرانولی)، 9 بیمار(6/4%) ترومباستنی گلانزمن، 4 بیمار(2%) برنارد سولیر، 3 بیمار(5/1%) اختلالات پلاکتی به دلیل مصرف دارو(اختلال پلاکتی اکتسابی) و یک بیمار(5/0%) اختلال پلاکتی به دلیل آفیبرینوژنمی(نمودار 1). 6 مورد از 9 بیمارِ دارای الگوی ترومباستنی گلانزمن، و 3 مورد از 4 بیمارِ دارای الگوی برنارد سولیر در آزمون تجمع پلاکتی، توسط بررسی فلوسیتومتری تایید شدند.
بیماران دارای پاسخ برگشتپذیر به آگونیستها به ویژه
نسبت به ADP ، مورد ارزیابی آزادسازی ATP قرار گرفتند.
همه این بیماران(13 مورد)، در پاسخ به ترشح القا شده توسط ADP مختل بودند. در این میان، 5 بیمار به هر سه آگونیست ADP ، اسید آراشیدونیک و کلاژن، 4 بیمار به ADP و کلاژن، یک بیمار به ADP و اسید آراشیدونیک و 3 بیمار تنها به ADP پاسخ ترشحی منفی دادند.
والدین بیماران گلانزمن از نظر خویشاوندی، سه مورد فامیل نزدیک و شش مورد غریبه بودند، اما در مورد بیماران برنارد سولیر، دو مورد از بیماران دارای والدین با نسبت فامیلی نزدیک، یک مورد فامیل دور و یک مورد هم غریبه بودند.
نمودار 1: توزیع فراوانی اختلالات پلاکتی در بیماران دارای مشکلات خونریزیدهنده
جدول 1: فاصله اطمینان پاسخدهی نمونههای کنترل افراد سالم به آگونیستهای مورد استفاده در آزمون تجمع پلاکتی
جدول 2: فاصله اطمینان پاسخ طبیعی ترشح پلاکتی بر اساس بروشور دستگاه کرونولوگ
نتایج نمونههای کنترل طبیعی بر اساس آزمایش تجمع پلاکتی بر روی افراد سالم با مشخصات ذکر شده در قسمت مواد و روشها به دست آمد و فاصله اطمینان مقادیر طبیعی به صورت Mean ± SD محاسبه گردید. افرادی که میزان پاسخدهی خارج از این فاصله داشتند بــه
عنوان "غیر طبیعی" در نظر گرفته شدند(جدول 1).
فاصله اطمینان طبیعی آزمون ترشح پلاکتی(ATP release) بر اساس کتابچه دستگاه اگریگومتر تعیین شد(جدول 2).
بحث
شیوع دقیق اختلالات عملکرد پلاکتی در دنیا مشخص نشده است اما در کل، ترومباستنی گلانزمن و سندروم برنارد سولیر جزو اختلالات نادر محسوب میشوند. به نظر میرسد که شیوع گلانزمن حدود یک مورد در هر یک میلیون نفر جمعیت است(13). با این حال، شیوع آن میتواند به اندازه هموفیلی و بیماری فون ویلبراند در جمعیتهایی که ازدواجهای فامیلی معمول است نیز برسد (15-13، 8)، مثلاً در یهودیان عراقی و یا اعراب فلسطین و اردن که میتواند تا 6 مورد در هر 700 نفر جمعیت هم رخ دهد (17، 16).
شیوع سندروم برنارد سولیر در جوامع عمومی کمتر از یک در یک میلیون است(18). در گروههای نژادی خاصی مانند بیماران عراقی و در نواحی که ازدواجهای فامیلی معمول است مثل جنوب هند و شمال ایران، شیوع برنارد سولیر بیشتر است(13، 10).
اگر چه بر اساس مطالعه‌های قبلی انجام شده در ایران، این فرضیه مطرح شده بود که شیوع بیماران گلانزمن و برنارد سولیر در جمعیت ایرانی بالاتر از میانگین دنیا است، اما در این مطالعه، از 9 بیمار گلانزمن تنها والدین 3 بیمار و از 4 بیمار برنارد سولیر نیز والدین 3 بیمار با هم خویشاوندی نزدیک داشتند(11-8). بنابراین برای تعیین شیوع این اختلالات در ایران، باید بررسیهای جامع و دقیقی از بیماران سراسر کشور را توسط ترکیبی از آزمونهای تجمع، ترشح و بررسیهای فلوسیتومتری در دستور کار قرار داد.
اختلالات اکتسابی پلاکتها، درصد قابل توجهی از ناهنجاریهای عملکردی پلاکتها را تشکیل میدهند(2). علی‌رغم این موضوع، به نظر میرسد که اختلالات اکتسابی، سهم قابل توجهی را از عملکرد معیوب پلاکتها در مطالعه حاضر نداشتند. در این پژوهش با اخذ شرح حال از همه افراد مراجعه کننده، مشخص شد که 9 بیمار داروهای NSAIDs ، 3 بیمار آسپیرین، یک بیمار پلاویکس و یک بیمار هم به طور هم زمان آسپیرین و پلاویکس مصرف میکردند. از میان این 14 بیمار، 2 بیمار مصرف کننده آسپیرین و یک بیمار مصرفکننده ایبوپروفن و به طور کلی 5/1% بیماران مراجعهکننده، در آزمون تجمع پلاکتی پاسخ غیر طبیعی به ویژه در مقابل اسید آراشیدونیک نشان دادند. در واقع از میان 14 بیماری که داروهای ضد پلاکتی مصرف میکردند، 11 بیمار و به عبارت دیگر 79% این افراد فاقد الگوی غیر طبیعی تجمع پلاکتی بودند. به نظر میرسد که در بیشتر افراد دارای تجمع پلاکتی طبیعی، مصرف دارو در زمانی بوده است که بر روی عملکرد پلاکتها اثری نداشته است(به عنوان مثال بیش از یک هفته قبل از انجام آزمایش).
هیچ توافقی بر سر این که از چه روشی برای انجام و تفسیر آزمونهای تجمع و ترشح پلاکتی استفاده شود و نیز از چه غلظتی از آگونیست در هر آزمایش استفاده گردد وجود ندارد(21-19، 13، 7، 2). در پژوهش حاضر با توجه به بررسی منابع مختلف، غلظت ADP از سطح mMol/L 5 شروع شده و بیمارانی که به این غلظت پاسخ نمیدادند، با غلظتهای mMol/L 10 و mMol/L 20 نیز بررسی گردیدند. معیار طبیعی یا غیر طبیعی بودن پاسخ بیماران به ADP، بر اساس میزان پاسخدهی به دوز ADP mMol/L 5 در مقایسه با نمونههای کنترل افراد سالم بود. در مورد کلاژن، از دوز µg/mL 2 برای تمامی بیماران استفاده شد و بیمارانی که با این دوز پاسخ ضعیف یا عدم پاسخ را نشان میدادند، با دوز µg/mL 5 نیز بررسی شدند. با این حال معیار تشخیص موارد طبیعی یا غیر طبیعی، میزان پاسخدهی به دوز µg/mL 2 کلاژن در مقایسه با نمونههای کنترل بود. آگونیستهای اسید آراشیدونیک(mM 5/0) و ریستوستین(mg/mL 5/1) نیز هر کدام در یک دوز واحد در این پژوهش استفاده شدند و معیار پاسخ طبیعی یا غیر طبیعی به این آگونیستها، میزان پاسخ به آگونیست در مقایسه با نمونههای کنترل بود.
تاکنون مطالعه‌های تجمع پلاکتی در ایران به صورت محدود انجام شده است. به علاوه، هیچ مطالعهای در مورد ترشح پلاکتی و نیز ترکیب تجمع و ترشح پلاکتی صورت نگرفته و مطالعه‌های محدود یاد شده، صرفاً بر روی بیماران دارای اختلالات مشخصی مانند گلانزمن و برنارد سولیر بوده است.
رازجو و همکاران در سال 1380، پرونده 342 بیمار مبتلا به گلانزمن را که در طی 21 سال به آزمایشگاه انعقاد سازمان انتقال خون ایران مراجعه کرده بودند، جهت ارزیابیهای بالینی و آزمایشگاهی بررسی نمودند(8). تعداد و شکل طبیعی پلاکتها، پاسخ طبیعی به ریستوستین به همراه طولانی بودن زمان خونروی(BT) در همه بیماران و کاهش پاسخ به کلاژن، ADP و ترومبین را در اغلب بیماران مورد تاکید قرار دادند و چنین نتیجهگیری کردند که با توجه به شیوع ازدواجهای فامیلی در ایران، گلانزمن یک بیماری نادر در کشور محسوب نمیشود. تعداد بیماران مذکر در این مطالعه 16% بیش از بیماران مونث بود و والدین 90% بیماران نیز خویشاوند بودند. خونریزیهای مخاطی و اکیموز، علامت بالینی عمده در بیماران محسوب میشد.
در مطالعه افراسیابی و همکاران در سال 1386، سه خانـواده ایرانـی(7 بیمار) مبتـلا بـه سندروم برنارد سولیر از جنـوب ایـران، از نظـر بروز کمپلکس گلیکوپروتئینی GP Ib/IX/V بررسی شدند(10). این افراد دریافتند که کمپلکس یاد شده در 6 مورد کمتر از 2% و به میزان 12% در یک مـورد دیگـر اسـت. بـا بررسیهـای ژنتیکـی مشخـص شد که جهش بد معنی (missense) Ser > 55 Phe GP IX در دو خانـواده و یـک جـاگذاری(insertion) تک بازی GP 1BA C3221 ins در ژن GP Iba در خانوده سوم وجود دارد. در میان اعضای خانوادههای مورد بررسی نیز چندین مورد هتروزیگوت مشاهده کردند.
فارسی‌نژاد و همکاران در سال 1390، 123 بیمار گلانزمن ایرانی را از نظر گلیکوپروتئین سطحی GP IIb/IIIa با استفاده از فلوسیتومتری مورد بررسی قرار دادند و بیماران را با توجه به شدت علایم خونریزی دستهبندی کرده و دریافتند که گلانزمن تیپ I (نبود GP IIb/IIIa) شایعترین نوع در ایران است، به طوری که 75% بیماران را تشکیل میدهد(11). 16% بیماران در تیپ II (دارای کاهش GP IIb/IIIa) و 6% در گروه واریان گلانزمن(ناتوانی GP IIb/IIIa در اتصال به فیبرینوژن) جای گرفتند.
نوشتار حاضر نخستین گزارش بررسی اولیه و همزمان تجمع و ترشح پلاکتی در بیماران مراجعهکننده مبتلا به اختلالات خونریزیدهنده در ایران میباشد.
به طور کلی در دنیا شیوع اختلالات عملکردی پلاکتی و از جمله اختلالات ترشحی به وضوح مشخص نشده است، اگر چه به نظر میرسد که اختلالات مربوط به ترشح و نیز انتقال پیام پلاکتی شایعتر از دیگر اختلالات باشد (24-22). به دلیل محدودیت تهیه مواد لومینسانس، امکان بررسی همه بیماران مشکوک به اختلال ترشح پلاکتی مقدور نبود و تنها 13 بیمار (7/6%) که واکنش برگشتپذیر به آگونیستها نشان دادند، مورد بررسی رهاسازی ATP قرار گرفتند که همه این افراد اختلال ترشح را نشان دادند. بنابراین جامعه هدف مورد مطالعه در این زمینه کافی نبوده و برای ارزیابی دقیق میزان شیوع اختلالات ترشحی، نیاز به بررسی گروه هدف وسیعتری وجود دارد.
اختلال دستهبندی نشده عملکردی پلاکتها در 44 بیمار(6/22%) از مجموع 90 بیمار مبتلا به اختلال عملکرد پلاکتی دیده شد. این بیماران شامل بیمارانی میشدند که به یک یا چند آگونیست مورد استفاده در این پژوهش پاسخ کمتر از حداقل میزان قابل قبول در افراد طبیعی دادند. درجه خونریزی در 66% این بیماران بر اساس معیارهای توزتو کمتر از 3 بود.
میتوان در پژوهشهای آتی با ترکیب آگونیستهای متعدد دیگر به همراه بررسیهای مولکولی و فراساختاری پلاکتها، به اختلال دقیقتر بیماران مانند نقص در مسیر ساخت ترومبوکسان، اختلال در مسیر پیامرسانی پلاکتها و یا نقص در پروتئینهای ساختاری پلاکت پی برد.
اختلال پلاکتی به دلیل آفیبرینوژنمی نیز در یک بیمار یافت شد. بیماران فاقد فیبرینوژن قادر به تجمع پلاکتها نمیباشند. این موضوع بیانگر اهمیت فیبرینوژن در ایجاد تجمع پلاکتی در درون بدن میباشد. به نظر میرسد که اختلال تجمع پلاکتی به دلیل کمبود و یا نبود فیبرینوژن پدیدهی نادری باشد، اما برای اثبات این موضوع لازم است حجم بیشتری از بیماران مختلف مورد بررسی قرار بگیرند.
در 16 بیمار(2/8%) با وجود ترومبوسیتوپنی، پاسخ پلاکتها در آزمون تجمع پلاکتی طبیعی بود که نشان‌دهنده عملکرد طبیعی پلاکتها در این بیماران میباشد.
در شمار قابل توجهی از مراجعهکنندگان یعنی 105 مورد(85/53%)، پلاکتها هم از نظر کمی(شمارش) و هم کیفی(تجمع) طبیعی بودند. درجه خونریزی بر اساس معیارهای توزتو، در 79% بیماران مذکور کمتر از 3 بود. هم چنین به طور کلی درجه خونریزی در 77% جامعه بیماران مورد بررسی(195/150) نیز کمتر از 3 بود. این موضوع بیانگر این است که اغلب بیماران مراجعهکننده به این مرکز، مشکل خونریزیدهنده جدی نداشتند. بنابراین لازم است که درخواست آزمون تجمع پلاکتی برای بیماران از سوی پزشکان معالج با تجدید نظر بیشتری صـورت گرفتـه و به طور اساسی هدفمنـد و تعدیـل شـود.
نتیجهگیری
به دلیل این که تاکنون هیچ توافقی بر روی روش انجام، استانداردسازی و گزارش آزمونهای عملکرد پلاکتی در دنیا وجود ندارد، تفسیر و مقایسه این آزمون‌ها بین آزمایشگاههای مختلف ناممکن خواهد بود. هر چند ایجاد یک روش بینالمللی ضرورت دارد، اما قبل از آن باید تلاش شود که یک روش واحد و استاندارد کشوری و یا دست کم درون آزمایشگاهی برای بررسی و تفسیر مطالعه‌های تجمع و ترشح پلاکتی ایجاد گردد.
با توجه به درصد بالای افراد دارای پاسخ طبیعی به آزمون تجمع پلاکتی در بیماران مورد بررسی، توصیه میشود که انتخاب گروه هدف بیماران توسط پزشکان معالج با دقت و بررسی بیشتری صورت پذیرد. این امر از اتلاف وقت و هزینه آزمایشگاه و نیز تخمین بالاتر بیماران خونریزی دهنده مبتلا به اختلالات عملکرد پلاکتی در کشور جلوگیری میکند.
ما در نظر داریم که بسته به امکانات سازمان، در پژوهشهای بعدی پانل آگونیستی مورد استفاده در آزمونهای عملکرد پلاکتی را گسترش دهیم. این امر به ما کمک میکند که بسته به نوع آگونیست مورد استفاده، به
طور دقیقتری بتوانیم اختلالات مختلف عملکرد پلاکتی مانند نقص در مسیر ساخت اسید آراشیدونیک و ترومبوکسان، اختلالات پیامدهی و یا اختلالات گیرندههای پلاکتی و دیگر اختلالات عملکردی را از هم تفکیک نماییم.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله بدین وسیله مراتب تقدیر و تشکر خود را از خانم دکتر مهتاب مقصودلو به خاطر مشاوره در زمینه SPSS اعلام می‌دارد.
متن کامل: (17927 مشاهده)
اختلالات عملکرد پلاکتی در بیماران مراجعهکننده به آزمایشگاه
مرجع انعقاد سازمان انتقال خون ایران
علی رجبی1، مینو احمدی‌نژاد2، مریم مشکولی3، سید محمدرضا طباطبایی4، سیده لادن سید مرتاض5، سمیه رن بلوچ3،
سیده سمیه معززی نکویی اصل6، زهره مختاری3، مهسا مجتبوی نائینی7
چکیده
سابقه و هدف
اختلالات ارثی عملکرد پلاکتی در دنیا معمول میباشند اما در ایران به دلیل محدودیت امکانات تشخیصی، به جز موارد شدید بیماری، این اختلالات به طور دقیق بررسی نشدهاند. در این تحقیق، طی دو سال اخیر در آزمایشگاه مرجع انعقاد سازمان انتقال خون ایران، به کمک دستگاه لومی اگریگومتر، اقدام به بررسی آزمونهای عملکرد پلاکتی در بیماران مشکوک به اختلالات مذکور شده است.
مواد و روشها
در یک مطالعه توصیفی گذشتهنگر، پرونده 195 مراجعهکننده به آزمایشگاه یاد شده، طی مدت هفت ماه در فاصله آبان 1390 تا اردیبهشت 1391، توسط آزمون تجمع پلاکتی بررسی شدند و در بیماران مشکوک به اختلال ترشح پلاکتی، بررسی آزادسازی ATP نیز انجام گرفت. از آگونیستهای ADP، کلاژن، اسید آراشیدونیک و ریستوستین و ماده لومینسانس برای بررسی تجمع و ترشح پلاکتی استفاده گردید. یافتههای حاصل با استفاده از 16 SPSS مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند.
یافته‌ها
از میان 195 مراجعهکننده، 90 مورد(1/46%) دارای اختلال پلاکتی بودند. این افراد شامل بیماران مبتلا به ترومبوسیتوپنی با عملکرد طبیعی(2/8%)، اختلال ترشحی(7/6%)، ترومباستنی گلانزمن(6/4%)، سندروم برنارد سولیر(2%)، اختلال اکتسابی پلاکتی(5/1%)، آفیبرینوژنمی(5/0%) و اختلال عملکردی دستهبندی نشده (6/22%) بودند. 105 مورد باقی‌مانده(8/53%)، هیچ نقص کمی و کیفی پلاکتی نداشتند.
نتیجه گیری
تحقیق حاضر حاصل نخستین مطالعه بررسی همزمان اختلالات عملکرد و ترشح پلاکتی در ایران است. برای پی بردن به شیوع دقیق این بیماریها، بررسیهای بیشتر و دارای حجم بالاتر بیماران، استفاده از پانل آگونیستی متنوعتر و نیز بررسی ترشح پلاکتی در تمامی بیماران دارای اختلالات تجمع پلاکتی در مطالعه‌های آتی توصیه میشود.
کلمات کلیدی: اختلالات پلاکتی، آزمونهای عملکرد پلاکتی، تجمع پلاکتی، سندروم برنارد سولیر، ترومباستنی
تاریخ دریافت : 17/2/92
تاریخ پذیرش : 20/5/92
1- دانشجوی PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسؤول: متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- کارشناس علوم آزمایشگاهی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
5- کارشناس علوم سلولی و مولکولی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
6- کارشناس ارشد انگل‌شناسی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
7- کارشناس شیمی کاربردی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مرجع انعقاد سازمان انتقال خون ایران
علی رجبی1، مینو احمدی‌نژاد2، مریم مشکولی3، سید محمدرضا طباطبایی4، سیده لادن سید مرتاض5، سمیه رن بلوچ3،
سیده سمیه معززی نکویی اصل6، زهره مختاری3، مهسا مجتبوی نائینی7
چکیده
سابقه و هدف
اختلالات ارثی عملکرد پلاکتی در دنیا معمول میباشند اما در ایران به دلیل محدودیت امکانات تشخیصی، به جز موارد شدید بیماری، این اختلالات به طور دقیق بررسی نشدهاند. در این تحقیق، طی دو سال اخیر در آزمایشگاه مرجع انعقاد سازمان انتقال خون ایران، به کمک دستگاه لومی اگریگومتر، اقدام به بررسی آزمونهای عملکرد پلاکتی در بیماران مشکوک به اختلالات مذکور شده است.
مواد و روشها
در یک مطالعه توصیفی گذشتهنگر، پرونده 195 مراجعهکننده به آزمایشگاه یاد شده، طی مدت هفت ماه در فاصله آبان 1390 تا اردیبهشت 1391، توسط آزمون تجمع پلاکتی بررسی شدند و در بیماران مشکوک به اختلال ترشح پلاکتی، بررسی آزادسازی ATP نیز انجام گرفت. از آگونیستهای ADP، کلاژن، اسید آراشیدونیک و ریستوستین و ماده لومینسانس برای بررسی تجمع و ترشح پلاکتی استفاده گردید. یافتههای حاصل با استفاده از 16 SPSS مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند.
یافته‌ها
از میان 195 مراجعهکننده، 90 مورد(1/46%) دارای اختلال پلاکتی بودند. این افراد شامل بیماران مبتلا به ترومبوسیتوپنی با عملکرد طبیعی(2/8%)، اختلال ترشحی(7/6%)، ترومباستنی گلانزمن(6/4%)، سندروم برنارد سولیر(2%)، اختلال اکتسابی پلاکتی(5/1%)، آفیبرینوژنمی(5/0%) و اختلال عملکردی دستهبندی نشده (6/22%) بودند. 105 مورد باقی‌مانده(8/53%)، هیچ نقص کمی و کیفی پلاکتی نداشتند.
نتیجه گیری
تحقیق حاضر حاصل نخستین مطالعه بررسی همزمان اختلالات عملکرد و ترشح پلاکتی در ایران است. برای پی بردن به شیوع دقیق این بیماریها، بررسیهای بیشتر و دارای حجم بالاتر بیماران، استفاده از پانل آگونیستی متنوعتر و نیز بررسی ترشح پلاکتی در تمامی بیماران دارای اختلالات تجمع پلاکتی در مطالعه‌های آتی توصیه میشود.
کلمات کلیدی: اختلالات پلاکتی، آزمونهای عملکرد پلاکتی، تجمع پلاکتی، سندروم برنارد سولیر، ترومباستنی
تاریخ دریافت : 17/2/92
تاریخ پذیرش : 20/5/92
1- دانشجوی PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسؤول: متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- کارشناس علوم آزمایشگاهی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
5- کارشناس علوم سلولی و مولکولی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
6- کارشناس ارشد انگل‌شناسی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
7- کارشناس شیمی کاربردی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه
اختلالات پلاکتی، از شایعترین اختلالات خونریزیدهنده هستند. پلاکتها تعدادی از گیرندههای غشایی گلیکوپرتئینی را بیان میکنند که چسبندگی(adhesion) و تجمع(aggregation) پلاکتی را میانجیگری می‌نمایند. بیشترین میزان گیرنده غشایی پلاکتها، مربوط به اینتگرین αIIbβ3 است که بیشتر به نام گلیکوپروتئین IIb/IIIa شناخته میشود. این گیرنده در مرحله تجمع پلاکتی نقش اصلی را به عهده دارد. کمبود یا عملکرد ناقص αIIbβ3 منجر به اختلال شدید خونریزیدهنده به نام ترومباستنی گلانزمن(Glanzmann thrombasthenia, GT) میشود. گیرندههای دیگری هم بر روی پلاکتها وجود دارند که برای عملکرد پلاکتی اهمیت دارند. در این میان، گیرنده حاوی تکرارهای غنی از لوسین به نام گلیکوپروتئین Ib/IX/V برای چسبندگی پلاکتی با واسطه عامل فونویلبراند نقش حیاتی دارد. کمبود یا اختلال عملکرد گیرنده Ib/IX/V نیز با یک اختلال پلاکتی شدید به نام سندروم برنارد سولیر(Bernard Soulier Syndrome, BSS) همراه است(1).
آزمونهای عملکرد پلاکتی شامل تجمع و ترشح پلاکتی اغلب در ارزیابی بالینی بیماران دارای مشکلات خونریزیدهنده درخواست میشود(2).
در آزمایشگاههای بالینی، به طور معمول از آگونیستهای تجاری ADP ، اپینفرین، کلاژن و اسید آراشیدونیک و به علاوه آگونیست صناعی ریستوستین استفاده میگردد. ADP و اپینفرین جزو آگونیستهای ضعیف پلاکتی محسوب میشوند. آگونیستهای متنوع دیگری هم وجود دارند که هر آزمایشگاه بسته به برنامه و بودجه و تجارب کاری خود از آنها استفاده میکند، اما هیچ الگوی استانداردی برای انجام آزمایش، مقادیر مرجع و تفسیر آزمونهای کیفی پلاکتی وجود ندارد. البته در این بین، دو بیماری ترومباستنی گلانزمن و سندروم برنارد سولیر الگوی تجمع پلاکتی مشخصی دارند. بنابراین هر آزمایشگاه باید با توجه به امکانات و بیماران خود، الگوی مطلوب آزمایشهای خود را به دست بیاورد(3، 2).
بررسـی ترشح گرانولهای پلاکتی، در ارزیابی اختلالات
عملکرد پلاکتها از اهمیت ویژهای برخوردار است. ترشح محتویات گرانولهای متراکم پلاکتها به وسیله رهاسازی سروتونین- کربن 14 متعاقب تحریک توسط آگونیستهای پلاکتی و یا به روش سادهتر توسط رهاسازی ATP از گرانولها به وسیله یک روش کمیلومینسانس قابل ارزیابی است. ناهنجاریهای ترشحی پلاکتها، به دلیل عدم رهاسازی گرانولهای پلاکتی، اغلب به وسیله هر دو آزمون تجمع و ترشح پلاکتی قابل شناسایی هستند. به طوری که در آزمون تجمع پلاکتی، موج دوم تجمع به ویژه با آگونیستهای ADP و اپینفرین که به طور اساسی وابسته به ترشح گرانولهای متراکم است، دیده نمیشود. بررسی اختلالات ترشحی بر خلاف آزمون تجمع پلاکتی، به دلیل هزینه بالا و وقتگیر بودن آن تنها در آزمایشگاههای مرجع انعقادی قابل انجام است(6-2).
به خاطر این که آزمونهای تشخیصی اختلالات عملکرد پلاکتی گران و وقتگیر هستند و به طور گسترده در دسترس نیستند، تاکنون مطالعهای مبتنی بر جمعیت برای تعیین شیوع اختلالات یادشده انجام نشده است. با این حال، اطلاعاتی در مورد شیوع نسبی اختلالات پلاکتی در مقایسه با دیگر مشکلات خونریزیدهنده(مثل بیماری فونویلبراند) وجود دارد که بیانگر این هستند که اختلالات پلاکتی در جمعیت بسیار معمول میباشند و امکان دارد که شیوعی معادل و یا حتی بیشتر از بیماری فونویلبراند داشته باشند(7، 3).
در ایران نیز هر چند بررسیهایی روی انواع شدید بیماریهای پلاکتی یعنی ترومباستنی گلانزمن و سندروم برنارد سولیر صورت گرفته است، اما به دلیل محدودیت روشهای تشخیصی بیماریهای پلاکتی در ایران، شیوع این گروه از اختلالات خونریزی دهنده به خوبی شناخته شده نیست(11-8). هم چنین تاکنون هیچ گزارشی از بررسی اختلالات ترشح پلاکتی در کشور در دست نمی‌باشد. در آزمایشگاه مرجع انعقاد ستاد مرکزی سازمان انتقال خون ایران، از دو سال پیش تاکنون، در بیماران دارای مشکلات خونریزیدهنده که برای بررسی عملکرد پلاکتی مراجعه کرده بودند، علاوه بر بررسی تجمع پلاکتی، اقدام به بررسی میزان ترشح ATP در موارد مشکوک به اختلالات ترشح پلاکتی شد. در این مطالعه از آگونیستهای ADP ، کلاژن، اسید آراشیدونیک و ریستوستین برای ارزیابی تجمع پلاکتی و از ماده لومینسانس محتوی لوسیفرین- لوسیفراز برای بررسی وضعیت ترشح پلاکتی استفاده شد.
مواد و روشها
بر اساس یک مطالعه توصیفی و گذشتهنگر (descriptive retrospective)، طی هفت ماه(از اول آبان 1390 تا آخر اردیبهشت 1391)، تعداد 195 فرد(66 مرد و 129 زن، 1/2 F/M= ) مشکوک به اختلالات خونریزی دهنده که با درخواست آزمایش بررسی عملکرد پلاکتی به آزمایشگاه انعقاد ستاد مرکزی سازمان انتقال خون ایران مراجعه کرده بودند، با مراجعه به پرونده‌های بالینی و آزمونهای آزمایشگاهی بیماران، مورد بررسی قرار گرفتند.
نمونهگیری و انجام آزمون تجمع و ترشح پلاکتی، بر اساس دستورالعمل‌های موجود در بخش انعقاد، برای همه بیماران انجام شد. بر این اساس، نمونهگیری توسط لوله‌های خلاء (Vacutainer) مربوط به شرکت BD انگلستان حاوی ضد انعقاد سیترات سدیم 105/0 مولار انجام شد.
پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) با استفاده از نمونه خون سیتراته و سانتریفیوژ با دور پایین(RCF بین g 150-30 بر اساس شمارش پلاکت اولیه فرد) و پلاسمای فاقد پلاکت (PPP) با استفاده از سانتریفیوژ با دور بالا(RCF بین g 3000-2500) به دست آمد. جمع‌آوری، انتقال و سانتریفیوژ نمونه‌ها در دمای اتاق صورت گرفت.
بر اساس درخواست پزشک معالج، برای همه بیماران آزمایش تجمع پلاکتی در دستگاه اگریگومتر ساخت شرکت کرونولوگ آمریکا(Chronolog model 700 x, Havertown, Pennsylvania (PA)) و با پانل اولیه آگونیستهای زیر انجام شد: ADP (غلظت µM5)، کلاژن(µg/mL 2)، آراشیدونیک اسید (mM 5/0) و ریستوستین(mg/mL 5/1). در صورتی که پاسخ پلاکتهای بیمار با غلظتهای معمول ADP و یا کلاژن در پانل اولیه، در مقایسه با مقادیر مرجع، ضعیف و یا برگشتپذیر بود، ADP با غلظتهای بالا(µM 10 و µM 20) و کلاژن با غلظت بالا(µg/mL 5) نیز بررسی شد تا پاسخهای ضعیف شناسایی شوند. برای بیمارانی که پاسخ برگشتپذیر به آگونیستها میدادند، بررسی ترشح ATP پلاکتی با استفاده از ماده لومینسانس محتوی لوسیفرین- لوسیفراز انجام میشد. همه معرفهای مورد استفاده از شرکت Helena فرانسه خریداری شدند. آزمون سنجش ترشح پلاکتی نیز با معرف Chemi-Lume از شرکت کرونولوگ انجام پذیرفت و با استفاده از یک ATP standard مربوط به همان شرکت، میزان رهاسازی نور حاصل از عملکرد آنزیم- سوبسترا استانداردسازی شد. برای بیمارانی که نیاز به بررسی ترشح پلاکتی داشتند، پس از افزودن ماده لومینسانس(محتوی لوسیفرین و لوسیفراز) به PRP و افزودن آگونیست مورد نظر، به طور هم زمان تجمع و ترشح پلاکتی بررسی شد. نتیجه این واکنش بر روی سیستم مانیتورینگ به صورت دو نمودار با رنگهای مجزا برای هر آگونیست ظاهر میشد.
تعیین مقادیر طبیعی پاسخدهی به آگونیستها:
فاصله اطمینان مقادیر طبیعی برای آزمونهای تجمع پلاکتی با آزمایش 22 فرد سالم که با گرفتن شرح حال، فاقد مشکلات خونریزی دهنده و یا بیماریهای مزمن بودند و طی 10 روز قبل از نمونهگیری هیچ گونه دارو و یا عوامل شناخته شده تاثیرگذار بر روی عملکرد پلاکت مصرف نکرده بودند، به دست آمد.
پس از انجام آزمایش تجمع با آگونیستهای ADP (µM 20، 10 و 5)، اسید آراشیدونیک(mM 5/0)، کلاژن (µg/mL 5 و 2) و ریستوستین(mg/mL 5/1)، میانگین پاسخدهی به هر غلظت از آگونیست به صورت SD ± Mean تعیین شد. در زمان انجام این مطالعه به دلیل هزینه بالای ماده لومینسانس، بررسی تعیین محدوده طبیعی پاسخ ترشح پلاکتی انجام نشد و لذا جهت تفسیر نتایج، فاصله اطمینان طبیعی ترشح پلاکتی گزارش شده بر اساس بروشور شرکت سازنده دستگاه کرونولوگ تعریف و تنها با انجام یک نمونه کنترل تایید شد. بر اساس فاصله اطمینان مقادیر طبیعی پاسخدهی به آگونیستها و لوسیفرین- لوسیفراز، نتایج پاسخدهی بیمارانی که خارج از محدوده طبیعی هر آگونیست قرار میگرفت، به عنوان "غیرطبیعی" در نظر گرفته میشد. نتایج مطالعه با نرمافزار SPSS نسخه 16 مربوط به شرکت Polar Engineering تجزیه و تحلیل شد.
یافته‌ها
این پژوهش بر پایه یک مطالعه گذشتهنگر بر روی 195 فرد دارای مشکلات خونریزیدهنده طراحی شده که به منظور بررسی عملکرد پلاکتی به آزمایشگاه مرجع انعقاد ستاد مرکزی سازمان انتقال خون ایران مراجعه کرده بودند. سن بیماران مراجعهکننده از یک ماه تا 81 سال و با میانگین 28 سال بود. 5/61% بیماران، بالغین بین سنین 18 تا 50 سال بودند.
علت مراجعه 46% بیماران مراجعه کننده(89 نفر)، مشکلات خونریزی جلدی - مخاطی مانند خونریزی بینی و لثه، اکیموز و خونریزیهای قاعدگی(منوراژی) بود. دیگر بیماران با عللی مانند بررسی علت ترومبوسیتوپنی(39 مورد)، ترمبوسیتوز شدید(یک مورد)، خونریزی دستگاه گوارش(یک مورد) و دیگر علل متفرقه(65 مورد) مانند بررسی چکآپ روتین، چکآپ قبل یا بعد از جراحی و سابقه خانوادگی مشکلات خونریزیدهنده یا کمبود فاکتورهای انعقادی به این مرکز ارجاع داده شده بودند. 129 نفر(15/66%) از مراجعین را زنان و 66 نفر(85/33%) را مردان تشکیل میدادند.
بر اساس شرح حال بیماران، درجه خونریزی (bleeding score) بر اساس معیار توزتو و همکاران، در 62% بیماران کمتـر از 2، 4/28% بین 5-3 و در 6/9% موارد بیشتر یا مساوی 6 بود(12). از میان 195 مراجعهکننده، 4 بیمار داروهای ضد پلاکت مانند آسپیرین و پلاویکس و 9 بیمار داروهای ضدالتهاب غیراستروئیدی مصرف میکردند. در این میان، 2 بیمار مصرفکننده آسپیرین و یک بیمار مصرفکننده ایبوپروفن دارای آزمون تجمع پلاکتی مختل شده بودند. دیگر بیماران این گروه، آزمون تجمع طبیعی داشتند.
نتایج آزمایشگاهی:
شمـارش پـلاکـت اولیـه بیمـاران بـر روی خون دارای
EDTA ، بین L/109×482-12 و فاصله اطمینان L/109× 100 ± 204 (SD ± Mean) بود. البته یک بیمار دارای ترمبوسیتوز شدید با شمارش پلاکتی L/109×1900 از محاسبه فوق حذف گردید. از میان 195 مراجعهکننده، 67 بیمار(4/34%) دارای ترومبوسیتوپنی(پلاکت اولیه کمتر از L/109×150) بودند.
پس از تهیه PRP (بر روی خون سیتراته)، شمارش پلاکتی بین L/109 × 671-9 و فاصله اطمینان L/109× 139 ± 295 در تغییر بود.
به طور کلی از میان 195 مراجعهکننده، 105 مورد (8/53%) از نظر شمارش و عملکرد پلاکتی کاملا طبیعی و 90 مورد(1/46%) دارای اختلال کمی و/یا کیفی پلاکتی بودند. بیماران دارای اختلال کمی و کیفی پلاکتی شامل موارد زیر بودند: 44 بیمار(6/22%) اختلالات عملکردی پلاکتی دستهبندی نشده، 16 بیمار(2/8%) ترومبوسیتوپنی با عملکرد طبیعی پلاکتی، 13 بیمار(7/6%) اختلال ترشح ATP (رهاسازی گرانولی)، 9 بیمار(6/4%) ترومباستنی گلانزمن، 4 بیمار(2%) برنارد سولیر، 3 بیمار(5/1%) اختلالات پلاکتی به دلیل مصرف دارو(اختلال پلاکتی اکتسابی) و یک بیمار(5/0%) اختلال پلاکتی به دلیل آفیبرینوژنمی(نمودار 1). 6 مورد از 9 بیمارِ دارای الگوی ترومباستنی گلانزمن، و 3 مورد از 4 بیمارِ دارای الگوی برنارد سولیر در آزمون تجمع پلاکتی، توسط بررسی فلوسیتومتری تایید شدند.
بیماران دارای پاسخ برگشتپذیر به آگونیستها به ویژه
نسبت به ADP ، مورد ارزیابی آزادسازی ATP قرار گرفتند.
همه این بیماران(13 مورد)، در پاسخ به ترشح القا شده توسط ADP مختل بودند. در این میان، 5 بیمار به هر سه آگونیست ADP ، اسید آراشیدونیک و کلاژن، 4 بیمار به ADP و کلاژن، یک بیمار به ADP و اسید آراشیدونیک و 3 بیمار تنها به ADP پاسخ ترشحی منفی دادند.
والدین بیماران گلانزمن از نظر خویشاوندی، سه مورد فامیل نزدیک و شش مورد غریبه بودند، اما در مورد بیماران برنارد سولیر، دو مورد از بیماران دارای والدین با نسبت فامیلی نزدیک، یک مورد فامیل دور و یک مورد هم غریبه بودند.
نمودار 1: توزیع فراوانی اختلالات پلاکتی در بیماران دارای مشکلات خونریزیدهنده
جدول 1: فاصله اطمینان پاسخدهی نمونههای کنترل افراد سالم به آگونیستهای مورد استفاده در آزمون تجمع پلاکتی
| آگونیست(غلظت) | Mean ± SD |
| ADP (µM 5) | 91-75 |
| ADP (µM 10) | 95-73 |
| ADP (µM 20) | 97-80 |
| اسید آراشیدونیک(mM 5/0) | 98-82 |
| کلاژن(µg/mL 2) | 95-81 |
| کلاژن(µg/mL 5) | 95-79 |
| ریستوستین(µg/mL 5/1) | 96-78 |
جدول 2: فاصله اطمینان پاسخ طبیعی ترشح پلاکتی بر اساس بروشور دستگاه کرونولوگ
| آگونیست القا کننده ترشح ATP | فاصله اطمینان پاسخ طبیعی ترشح (nMole) |
| ADP µM 10 | 06/1-5/0 |
| کلاژن µg/mL 5 | 92/1-74/0 |
| اسید آراشیدونیک mM 5/0 | 4/1-56/0 |
نتایج نمونههای کنترل طبیعی بر اساس آزمایش تجمع پلاکتی بر روی افراد سالم با مشخصات ذکر شده در قسمت مواد و روشها به دست آمد و فاصله اطمینان مقادیر طبیعی به صورت Mean ± SD محاسبه گردید. افرادی که میزان پاسخدهی خارج از این فاصله داشتند بــه
عنوان "غیر طبیعی" در نظر گرفته شدند(جدول 1).
فاصله اطمینان طبیعی آزمون ترشح پلاکتی(ATP release) بر اساس کتابچه دستگاه اگریگومتر تعیین شد(جدول 2).
بحث
شیوع دقیق اختلالات عملکرد پلاکتی در دنیا مشخص نشده است اما در کل، ترومباستنی گلانزمن و سندروم برنارد سولیر جزو اختلالات نادر محسوب میشوند. به نظر میرسد که شیوع گلانزمن حدود یک مورد در هر یک میلیون نفر جمعیت است(13). با این حال، شیوع آن میتواند به اندازه هموفیلی و بیماری فون ویلبراند در جمعیتهایی که ازدواجهای فامیلی معمول است نیز برسد (15-13، 8)، مثلاً در یهودیان عراقی و یا اعراب فلسطین و اردن که میتواند تا 6 مورد در هر 700 نفر جمعیت هم رخ دهد (17، 16).
شیوع سندروم برنارد سولیر در جوامع عمومی کمتر از یک در یک میلیون است(18). در گروههای نژادی خاصی مانند بیماران عراقی و در نواحی که ازدواجهای فامیلی معمول است مثل جنوب هند و شمال ایران، شیوع برنارد سولیر بیشتر است(13، 10).
اگر چه بر اساس مطالعه‌های قبلی انجام شده در ایران، این فرضیه مطرح شده بود که شیوع بیماران گلانزمن و برنارد سولیر در جمعیت ایرانی بالاتر از میانگین دنیا است، اما در این مطالعه، از 9 بیمار گلانزمن تنها والدین 3 بیمار و از 4 بیمار برنارد سولیر نیز والدین 3 بیمار با هم خویشاوندی نزدیک داشتند(11-8). بنابراین برای تعیین شیوع این اختلالات در ایران، باید بررسیهای جامع و دقیقی از بیماران سراسر کشور را توسط ترکیبی از آزمونهای تجمع، ترشح و بررسیهای فلوسیتومتری در دستور کار قرار داد.
اختلالات اکتسابی پلاکتها، درصد قابل توجهی از ناهنجاریهای عملکردی پلاکتها را تشکیل میدهند(2). علی‌رغم این موضوع، به نظر میرسد که اختلالات اکتسابی، سهم قابل توجهی را از عملکرد معیوب پلاکتها در مطالعه حاضر نداشتند. در این پژوهش با اخذ شرح حال از همه افراد مراجعه کننده، مشخص شد که 9 بیمار داروهای NSAIDs ، 3 بیمار آسپیرین، یک بیمار پلاویکس و یک بیمار هم به طور هم زمان آسپیرین و پلاویکس مصرف میکردند. از میان این 14 بیمار، 2 بیمار مصرف کننده آسپیرین و یک بیمار مصرفکننده ایبوپروفن و به طور کلی 5/1% بیماران مراجعهکننده، در آزمون تجمع پلاکتی پاسخ غیر طبیعی به ویژه در مقابل اسید آراشیدونیک نشان دادند. در واقع از میان 14 بیماری که داروهای ضد پلاکتی مصرف میکردند، 11 بیمار و به عبارت دیگر 79% این افراد فاقد الگوی غیر طبیعی تجمع پلاکتی بودند. به نظر میرسد که در بیشتر افراد دارای تجمع پلاکتی طبیعی، مصرف دارو در زمانی بوده است که بر روی عملکرد پلاکتها اثری نداشته است(به عنوان مثال بیش از یک هفته قبل از انجام آزمایش).
هیچ توافقی بر سر این که از چه روشی برای انجام و تفسیر آزمونهای تجمع و ترشح پلاکتی استفاده شود و نیز از چه غلظتی از آگونیست در هر آزمایش استفاده گردد وجود ندارد(21-19، 13، 7، 2). در پژوهش حاضر با توجه به بررسی منابع مختلف، غلظت ADP از سطح mMol/L 5 شروع شده و بیمارانی که به این غلظت پاسخ نمیدادند، با غلظتهای mMol/L 10 و mMol/L 20 نیز بررسی گردیدند. معیار طبیعی یا غیر طبیعی بودن پاسخ بیماران به ADP، بر اساس میزان پاسخدهی به دوز ADP mMol/L 5 در مقایسه با نمونههای کنترل افراد سالم بود. در مورد کلاژن، از دوز µg/mL 2 برای تمامی بیماران استفاده شد و بیمارانی که با این دوز پاسخ ضعیف یا عدم پاسخ را نشان میدادند، با دوز µg/mL 5 نیز بررسی شدند. با این حال معیار تشخیص موارد طبیعی یا غیر طبیعی، میزان پاسخدهی به دوز µg/mL 2 کلاژن در مقایسه با نمونههای کنترل بود. آگونیستهای اسید آراشیدونیک(mM 5/0) و ریستوستین(mg/mL 5/1) نیز هر کدام در یک دوز واحد در این پژوهش استفاده شدند و معیار پاسخ طبیعی یا غیر طبیعی به این آگونیستها، میزان پاسخ به آگونیست در مقایسه با نمونههای کنترل بود.
تاکنون مطالعه‌های تجمع پلاکتی در ایران به صورت محدود انجام شده است. به علاوه، هیچ مطالعهای در مورد ترشح پلاکتی و نیز ترکیب تجمع و ترشح پلاکتی صورت نگرفته و مطالعه‌های محدود یاد شده، صرفاً بر روی بیماران دارای اختلالات مشخصی مانند گلانزمن و برنارد سولیر بوده است.
رازجو و همکاران در سال 1380، پرونده 342 بیمار مبتلا به گلانزمن را که در طی 21 سال به آزمایشگاه انعقاد سازمان انتقال خون ایران مراجعه کرده بودند، جهت ارزیابیهای بالینی و آزمایشگاهی بررسی نمودند(8). تعداد و شکل طبیعی پلاکتها، پاسخ طبیعی به ریستوستین به همراه طولانی بودن زمان خونروی(BT) در همه بیماران و کاهش پاسخ به کلاژن، ADP و ترومبین را در اغلب بیماران مورد تاکید قرار دادند و چنین نتیجهگیری کردند که با توجه به شیوع ازدواجهای فامیلی در ایران، گلانزمن یک بیماری نادر در کشور محسوب نمیشود. تعداد بیماران مذکر در این مطالعه 16% بیش از بیماران مونث بود و والدین 90% بیماران نیز خویشاوند بودند. خونریزیهای مخاطی و اکیموز، علامت بالینی عمده در بیماران محسوب میشد.
در مطالعه افراسیابی و همکاران در سال 1386، سه خانـواده ایرانـی(7 بیمار) مبتـلا بـه سندروم برنارد سولیر از جنـوب ایـران، از نظـر بروز کمپلکس گلیکوپروتئینی GP Ib/IX/V بررسی شدند(10). این افراد دریافتند که کمپلکس یاد شده در 6 مورد کمتر از 2% و به میزان 12% در یک مـورد دیگـر اسـت. بـا بررسیهـای ژنتیکـی مشخـص شد که جهش بد معنی (missense) Ser > 55 Phe GP IX در دو خانـواده و یـک جـاگذاری(insertion) تک بازی GP 1BA C3221 ins در ژن GP Iba در خانوده سوم وجود دارد. در میان اعضای خانوادههای مورد بررسی نیز چندین مورد هتروزیگوت مشاهده کردند.
فارسی‌نژاد و همکاران در سال 1390، 123 بیمار گلانزمن ایرانی را از نظر گلیکوپروتئین سطحی GP IIb/IIIa با استفاده از فلوسیتومتری مورد بررسی قرار دادند و بیماران را با توجه به شدت علایم خونریزی دستهبندی کرده و دریافتند که گلانزمن تیپ I (نبود GP IIb/IIIa) شایعترین نوع در ایران است، به طوری که 75% بیماران را تشکیل میدهد(11). 16% بیماران در تیپ II (دارای کاهش GP IIb/IIIa) و 6% در گروه واریان گلانزمن(ناتوانی GP IIb/IIIa در اتصال به فیبرینوژن) جای گرفتند.
نوشتار حاضر نخستین گزارش بررسی اولیه و همزمان تجمع و ترشح پلاکتی در بیماران مراجعهکننده مبتلا به اختلالات خونریزیدهنده در ایران میباشد.
به طور کلی در دنیا شیوع اختلالات عملکردی پلاکتی و از جمله اختلالات ترشحی به وضوح مشخص نشده است، اگر چه به نظر میرسد که اختلالات مربوط به ترشح و نیز انتقال پیام پلاکتی شایعتر از دیگر اختلالات باشد (24-22). به دلیل محدودیت تهیه مواد لومینسانس، امکان بررسی همه بیماران مشکوک به اختلال ترشح پلاکتی مقدور نبود و تنها 13 بیمار (7/6%) که واکنش برگشتپذیر به آگونیستها نشان دادند، مورد بررسی رهاسازی ATP قرار گرفتند که همه این افراد اختلال ترشح را نشان دادند. بنابراین جامعه هدف مورد مطالعه در این زمینه کافی نبوده و برای ارزیابی دقیق میزان شیوع اختلالات ترشحی، نیاز به بررسی گروه هدف وسیعتری وجود دارد.
اختلال دستهبندی نشده عملکردی پلاکتها در 44 بیمار(6/22%) از مجموع 90 بیمار مبتلا به اختلال عملکرد پلاکتی دیده شد. این بیماران شامل بیمارانی میشدند که به یک یا چند آگونیست مورد استفاده در این پژوهش پاسخ کمتر از حداقل میزان قابل قبول در افراد طبیعی دادند. درجه خونریزی در 66% این بیماران بر اساس معیارهای توزتو کمتر از 3 بود.
میتوان در پژوهشهای آتی با ترکیب آگونیستهای متعدد دیگر به همراه بررسیهای مولکولی و فراساختاری پلاکتها، به اختلال دقیقتر بیماران مانند نقص در مسیر ساخت ترومبوکسان، اختلال در مسیر پیامرسانی پلاکتها و یا نقص در پروتئینهای ساختاری پلاکت پی برد.
اختلال پلاکتی به دلیل آفیبرینوژنمی نیز در یک بیمار یافت شد. بیماران فاقد فیبرینوژن قادر به تجمع پلاکتها نمیباشند. این موضوع بیانگر اهمیت فیبرینوژن در ایجاد تجمع پلاکتی در درون بدن میباشد. به نظر میرسد که اختلال تجمع پلاکتی به دلیل کمبود و یا نبود فیبرینوژن پدیدهی نادری باشد، اما برای اثبات این موضوع لازم است حجم بیشتری از بیماران مختلف مورد بررسی قرار بگیرند.
در 16 بیمار(2/8%) با وجود ترومبوسیتوپنی، پاسخ پلاکتها در آزمون تجمع پلاکتی طبیعی بود که نشان‌دهنده عملکرد طبیعی پلاکتها در این بیماران میباشد.
در شمار قابل توجهی از مراجعهکنندگان یعنی 105 مورد(85/53%)، پلاکتها هم از نظر کمی(شمارش) و هم کیفی(تجمع) طبیعی بودند. درجه خونریزی بر اساس معیارهای توزتو، در 79% بیماران مذکور کمتر از 3 بود. هم چنین به طور کلی درجه خونریزی در 77% جامعه بیماران مورد بررسی(195/150) نیز کمتر از 3 بود. این موضوع بیانگر این است که اغلب بیماران مراجعهکننده به این مرکز، مشکل خونریزیدهنده جدی نداشتند. بنابراین لازم است که درخواست آزمون تجمع پلاکتی برای بیماران از سوی پزشکان معالج با تجدید نظر بیشتری صـورت گرفتـه و به طور اساسی هدفمنـد و تعدیـل شـود.
نتیجهگیری
به دلیل این که تاکنون هیچ توافقی بر روی روش انجام، استانداردسازی و گزارش آزمونهای عملکرد پلاکتی در دنیا وجود ندارد، تفسیر و مقایسه این آزمون‌ها بین آزمایشگاههای مختلف ناممکن خواهد بود. هر چند ایجاد یک روش بینالمللی ضرورت دارد، اما قبل از آن باید تلاش شود که یک روش واحد و استاندارد کشوری و یا دست کم درون آزمایشگاهی برای بررسی و تفسیر مطالعه‌های تجمع و ترشح پلاکتی ایجاد گردد.
با توجه به درصد بالای افراد دارای پاسخ طبیعی به آزمون تجمع پلاکتی در بیماران مورد بررسی، توصیه میشود که انتخاب گروه هدف بیماران توسط پزشکان معالج با دقت و بررسی بیشتری صورت پذیرد. این امر از اتلاف وقت و هزینه آزمایشگاه و نیز تخمین بالاتر بیماران خونریزی دهنده مبتلا به اختلالات عملکرد پلاکتی در کشور جلوگیری میکند.
ما در نظر داریم که بسته به امکانات سازمان، در پژوهشهای بعدی پانل آگونیستی مورد استفاده در آزمونهای عملکرد پلاکتی را گسترش دهیم. این امر به ما کمک میکند که بسته به نوع آگونیست مورد استفاده، به
طور دقیقتری بتوانیم اختلالات مختلف عملکرد پلاکتی مانند نقص در مسیر ساخت اسید آراشیدونیک و ترومبوکسان، اختلالات پیامدهی و یا اختلالات گیرندههای پلاکتی و دیگر اختلالات عملکردی را از هم تفکیک نماییم.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله بدین وسیله مراتب تقدیر و تشکر خود را از خانم دکتر مهتاب مقصودلو به خاطر مشاوره در زمینه SPSS اعلام می‌دارد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
