جلد 11، شماره 1 - ( بهار 93 1393 )
جلد 11 شماره 1 صفحات 22-12 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Abbasi P, Shams Asanjan K, Movasaghpour A, Akbarzadeh Laleh P, Dehdilani N. The effect of Baicalin, a PPARy activator, on erythroid differentiation of CD133+ cord blood hematopoietic stem cells. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2015; 11 (1) :12-22
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-850-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-850-fa.html
عباسی پروانه، شمس اسنجان کریم، مؤثق‌پور علی‌اکبر، اکبرزاده لاله پروین، دهدیلانی نیما. تاثیر عصاره بایکالین، فعال‌کننده PPARγ بر تمایز اریتروئیدی سلولهای بنیادی خونساز CD133+ بند ناف. فصلنامه پژوهشی خون. 1393; 11 (1) :12-22
استادیار مرکز تحقیقات خون و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای آموزشی انتقال خون تبریز
متن کامل [PDF 771 kb]
(2189 دریافت)
| چکیده (HTML) (10465 مشاهده)
مقدمه
گیاه اسکوتلاریا بایکالنزیس جورجی (Scutellariabaicalensisgeorgi)، یک گیاه گل‌دار چند ساله از خانواده Lamiaceae میباشد که در ژاپن، چین، کره و نیز به صورت سازگار شده با شرایط اروپای مرکزی مثل آلمان و لهستان کشت داده میشود(1).
ریشه خشک شده این گیاه Radix scutellariae ، مقادیر بالایی از فلاونوئیدها شامل بایکالین(5 و 6 دی‌هیدروکسی 8- متوکسی فلاون) بیشتر از 14% ، بایکالئین(5 ،6 و7 تری‌‌هیدروکسیفلاون) بیشتر از 7% وگونین(5 و7 دی‌هیدروکسی 8- متوکسیفلاون) 7% و ... دارد(1). بایکالین، فلاونوئید اصلی یافت شده درScutellaria radix میباشد. در تعدادی از مطالعه‌ها اثرات ضد سرطانی و حفاظتی بایکالین در برابر آسیب‌های بافتی و ارگان‌ها نشان داده شده است. تاکنون در مورد اثرات بایکالین بر سیستم عصبی و عضله- اسکلتی، تاثیرات ضد التهابی و آنتی‌اکسیدان، درمان بیماری‌های قلبی، فعالیت‌های ضد میکروبی، ضد ویروسی و ضد سرطانی، تاثیر آن بر توقف چرخه سلولی در فاز G1 و آپوپتوز سلولهای سرطانی بررسیهایی انجام شده است(8-2). به علاوه اثرات ضد تکثیری آن در سرطان‌های مختلف نظیر ریه، هپاتوکارسینوما، پروستات و نیز سل لاین‌های سرطانی مختلف توسط گروه‌های تحقیقاتی مختلف نشان داده شده است(11-9). افزودن بایکالین به سل لاین اریترولوسمی K562 ، تمایز به سمت رده اریتروئیدی را مهار می‌کند و توانایی ایجاد کلنی را ازطریق تاثیر بر مسیر سیگنالینگ Notch کاهش می‌دهد(12).
بایکالین یکی از آگونیست‌های PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ) می باشد. PPARγ یک فاکتور نسخه‌برداری فعال شونده توسط لیگاند، متعلق به سوپر فامیلی نوکلئورسپتورها است(13). نوکلئورسپتورهای انسانی، خانواده‌ای متشکل از 49 عضو بوده که درون هسته یا سیتوپلاسم یافت می‌شوند، مسؤول پاسخگویی به هورمون‌های تیروئیدی یا استروئیدی می‌باشند و در کنترل توسعه، هموستاز و متابولیسم ارگانیسم نقش دارند(14). نوکلئورسپتور PPARγ در سطوح بالا در بافت‌های چربی بیان شده و نقش اصلی در تمایز ادیپوسیت‌ها دارد(15). علاوه بر آن، در بسیاری سل لاین‌های دیگر شامل هپاتوسیت‌ها، فیبروبلاست‌ها و سلولهای اپی‌تلیال سینه و کلون نیز یافت شده است. در مورد بافت‌های هماتوپوئتیک، بیان PPARγ در سلولهای استرومال مغز استخوان، سلولهای پروژنیتور CD34+ ، سلولهای مونوسیت/ماکروفاژ نرمال، لنفوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها گزارش شده است که نشان می‌دهد PPARγ ، نقش حیاتی در اریتروژنز علاوه بر آدیپوژنز دارد(17، 16). علاوه بر این PPARγ در فرآیندهای تکثیرHSC ، استئوکلاستوژنز و تمایـز بـه رده مـونوسیتی نقش دارد(18).
لیگاندهای PPARγ اثرات تعدیل‌کننده‌ای بر تکثیر و تمایز سل لاین‌های سرطانی مختلف نشان داده‌اند و لذا بسیاری از آن‌ها کاربرد بالینی مختلف و گسترده‌ای پیدا کرده‌اند(19).
لیگاندهایی مثل تروگلیتازون و پلی‌گلیتازون که به طور گسترده در درمان دیابت ملیتوس تیپ 2 و مشتقات جدید آن که به علت اثرات آنتی‌پرولیفراتیو در درمان سرطان‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند، تکثیر سلولهای پروژنیتور اریتروئیدی اولیه را سرکوب و دچار تاخیر می‌کنند(22-20). تروگلیتازون مشابه سایر تیازولیدازون‌ها TZD (پیاگلیتازونوروزگلیتازون)، از طریق فعال‌سازی PPAR عمل می‌کند و از این طریق بر متابولیسم استخوان نیز تاثیر دارد(23).
تروگلیتازون لیگاندی برای هر دو PPARα و به طور قوی‌تر برای PPARγ میباشد. عصاره گیاهی بایکالین فعال‌کننده PPARγ است که به دلیل اثرات ضد سرطانی خود، مورد توجه در درمان بسیاری از بیماری‌ها است. فعال شدن PPARγ می‌تواند منجر به کاهش تمایز رده اریتروئیدی شود لذا در این تحقیق اثرات این مولکول در تمایز، بقا و تکثیر سلولهای بنیادی خونساز به رده اریتروئیدی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
جداسازی و نشاندار کردن سلولهای CD133+ :
در این مطالعه تجربی، نمونه‌هـای خون بند ناف، پس از
تکمیل فرم رضایت‌نامه توسط مادران، از نوزادان زنان سالم و نرمال به طور تصادفی انتخاب شدند. به این منظور، از بند ناف‌های تازه در هنگام زایمان فول ترم و حداکثر تا چهار ساعت پس از آن استفاده شد. خون با استفاده از هیدروکسی اتیل استارچ(HES)(6% HAES-steril ، Freeflex) در غلظت نهایی 5/2% ، رقیق و در دمای 22 درجه سانتی‌گراد در لوله‌هایی با قطر 12 میلی‌متر با قدرت g 50 سانتریفیوژ شد. سپس لایه پلاسمایی حاوی سلولهای تک هسته‌ای جمع‌آوری و پس از سانتریفیوژ، رسوب سلولی در محلول PBS سوسپانسیونه شده به روی فایکول(ایران، بهار افشان)(g/mL 077/1) برده شد و با قدرت g 800 به مدت 35 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سوسپانسیون سلولهای تک هسته‌ای به دست آمده از فایکول، با آنتی‌بادی‌های CD133 مگنتیک مجاور شد و در دمای 8-4 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شد. بعد از شستشو، از سلول‌ها در حجم مناسب PBS سوسپانسیون تهیه شد. غنی‌سازی و جداسازی سلولهای CD133+ با ستون(آلمان، میلتنی بیوتک)(107) LS و به روش انتخاب مثبت انجام شد. پس از آماده‌سازی ستون با PBS و افزودن سلول‌ها، سلولهای نشاندار نشده از ستون عبور کرده و خارج شدند. سپس ستون از جداکننده مگنتیک(Separator) خارج و سلولهای نشاندار با جریان سریع شسته شد و بعد از سانتریفیوژ، با قدرت g 300 به مدت 10 دقیقه در حجم 500 میکرولیتر مایع به صورت سوسپانسیون در آمد.
کشت سلولهای بنیادی خونساز(HSC):
سلولهای CD133+ جدا شده در محیط کشت(آلمان، سیگما) IMDM حاوی 20% سرم جنین گاوی(FBS)، در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد در حضور CO25% تکثیر پیدا کردند. سیتوکاین‌های ng/mL 100 TPO ، ng/mL 100 SCF و ng/mL 100 FLT3L (کانادا ، ونکوور ، استم سل تکنولوژیس) و نیز U/mL 100 پنی‌سیلین و µg/mL 100 استرپتومایسین(جیبکو) جهت تکثیر این سلول‌ها مورد استفاده قرار گرفت. سلولهای تکثیر یافته به منظور تمایز اریتروئیدی در محیط کشت IMDM درپلیت 96 خانه‌ای در حضور سیتوکاین‌های ng/mL 20 SCF و U/mL 5/4 EPO کشت داده شدند و از روز چهارم هر سه روز یک بار محیط کشت کاملاً تعویض و سیتوکاین تازه افزوده شد. جهت بررسی اثرات آگونیست‌های PPARγ از قبیل بایکالین(سیگما ، آلمان) و تروگلیتازون(سیگما، آلمان) بر روند تمایز اریتروئیدی، تکثیر و تمایز سلول‌ها در حضور و فقدان این مواد سنجیده شد. بایکالین و تروگلیتازون در دی‌متیل‌سولفوکسید(DMSO) به صورت محلول درآمدند و غلظت‌های مختلف بایکالین(1، 10، 20 و 50 میکرومول) و نیز تروگلیتازون(1/0 ، 1، 3 و 10 میکرومول) مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی تمایز سلولی با فلوسیتومتری:
جهت تعیین میزان تمایز اریتروئیدی، بیان CD71 (رسپتور ترانسفرین(TfR)) و گلیکوپروتئینA(GPA) بر سطح سلولهای تمایز یافته با کمک فلوسیتومتری بررسی شد. تعداد 105سلول با PBS دو بار شستشو داده شد و سپس با آنتی‌بادی مونوکلونال آنتی-GPA کنژوگه شده با FITC (دانمارک، داکو) و آنتی‌بادی مونوکلونال آنتی- CD71 کنژوگه شده با PE(دانمارک، داکو) به مدت 30 دقیقه در دمای یخچال انکوبه شد و سپس با کمک فلوسیتومتری آنالیز شد.
ارزیابی توانایی تشکیل کلنی(CFU-assay):
توانایی سلولهای HSC جهت ایجاد کلنی با افزودن آن‌ها به محیط متیل سلولز(MC) بر پایه IMDM بررسی شد. جهت تهیه محیط MC ، 26 گرم از MC (281-M ، فیشر) اتوکلاو شده به 500 میلی‌لیتر آب مقطر استریل(90 درجه سانتی‌گراد ـ 70 درجه سانتی‌گراد) افزوده شد. به مدت 10 دقیقه با استفاده از تیغه مگنتیک به هم زده شد و سپس با افزودن تدریجی mL 500 از محیط 2x IMDM به محیط، فرآیند تشکیل ژل آغاز شد و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 24-6 ساعت به طور کامل به صورت ژل در آمد. جهت بررسی توانایی تشکیل کلنی، 104 * 1 سلول را در 100 میکرولیتر محیط IMDM حل کرده و غلظت µM 50 بایکالین و µM 3 تروگلیتازون همراه با سیتوکاین‌های U/mL rh EPO 4 و ng/mL rhSCF 20 به 1 میلی لیتر از محیط MC آماده شده اضافه شد. سپس این محیط با نیدل G16 به درون پلیت کشت سلولی ریخته شده و پلیت به مدت 14 روز در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 و در محیط مرطوب قرار داده شد. آزمایش سنجش کلنی در مقایسه با کنترل بدون حضور آگونیست‌ها انجام شد.
بررسی مورفولوژیک سلولهای تمایز یافته اریتروئیدی:
جهت بررسی تغییرات تمایزی، رنگ‌آمیزی سلول‌ها با رنگ رایت-گیمسا انجام گرفت و سپس بررسی میکروسکوپی سلول‌ها انجام پذیرفت.
ارزیابی تعداد سلولهای زنده و غیر زنده از طریق فلوسیتومتری:
سلولهای کشت داده شده در حضور آگونیست‌های PPARγ و تعداد سلولهای زنده و مرده از طریق برداشت حجم ثابت از سوسپانسیون سلولی از این سلول‌ها و آنالیز آن از طریق فلوسیتومتری(Epics Elite ESP) انجام شد. از طریق نمودار خصوصیات سلولی در FS و SS ، می‌توان تعداد سلولهای زنده و غیر زنده موجود در نمونه را محاسبه کرد(25، 24). همه داده‌ها به صورت SD ± mean گزارش شدند.
آنالیز داده‌ها با استفاده از آزمون t-Student در نرم‌افزار 17 SPSS انجام شد.
یافته‌ها
بررسی مورفولوژیک سلولهای تمایز یافته اریتروئیدی:
جهت بررسی تغییرات مورفولوژیک سلولهای حاصل از تکثیر و تمایز CD133+ به سلولهای تمایز یافته رده اریتروئیدی، رنگ‌آمیزی رایت ـ گیمسا انجام شد و تمایز پیش‌سازها به رده‌های اریتروئیدی نیز مشاهده شد، که مورفولوژی تاییدی بر روند تمایزی این سلول‌ها میباشد(شکل 1).
اثر بایکالین بر بیان رسپتور ترانسفرین(TfR) و گلیکوپروتئینA(GPA) بر سطح سلولهای تمایز یافته در مقایسه با تروگلیتازون:
بـه منظـور بـررسی اثـرات بایکالیـن بـه عنـوان یکی از
لیگاندهای PPARγ بر تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی هماتوپوئتیک جدا شده از خون بند ناف و تاثیر آن بر روند تمایز اریتروئیدی، سلولهای CD133+ با غلظت‌های مختلف بایکالین(10، 20 و 50 میکرومول) و نیز تروگلیتازون(1/0 ،1) در محیط کشت IMDM حاوی 20% FBS به مدت هفت روز انکوبه شدند و سپس بیان GPA و TfR با فلوسیتومتری بررسی شد. فلوسیتومتری در بیمارستان قاضی دانشگاه علوم پزشکی تبریز با دستگاه فلوسیتومتری(BD ، FACSCalibur) انجام شد. سلولهای بنیادی هماتوپوئتیک CD133+ در محیط کشت IMDM کنترل به همراه سیتوکاین‌های EPO و SCF به رده اریتروئیدی تمایز پیدا کردند که با تغییر در بیان GPA و
شکل1: سلولهای رنگ‌آمیزی شده با رنگ گیمسا در روز هفتم تمایز اریتروئیدی a) HSC های جدا شده از بند ناف در روز صفر 10×b ) سلولهای پیش‌ساز اریتروئیدی در روز هفتم تمایز بزرگ‌نمایی40×c ) سلولهای پیش‌ساز اریتروئیدی در روز هفتم تمایز بزرگ‌نمایی100×
شکل2: بیان رسپتورهای سطحی (a) GPA و (b) CD71 از طریق فلوسیتومتری در روز هفتم تمایز اریتروئیدی در محیط کشت IMDM حاوی سیتوکاین‌های ng/mL 20 SCF و U/mL 5/4 EPO در غلظت‌های(20 و 50 میکرومول) بایکالین و در حضور کنترل مورد ارزیابی قرار گرفت.
شکل3: بیان رسپتورهای سطحی GPA و CD71 از طریق فلوسیتومتری در روز هفتم تمایز اریتروئیدی در محیط کشت IMDM حاوی سیتوکاین‌های ng/mL 20 SCF و U/mL 5/4 EPO در غلظت‌های مختلف تروگلیتازون(1/0 ، 1 میکرومول) و در حضور آنتی‌بادی ایزوتیپیک کنترل مورد ارزیابی قرار گرفت.
شکل 4: کلنی‌های ایجاد شده پس از 9 روز در محیط نیمه جامد متیل سلولز a) کلنی‌های مختلف در بزرگ‌نمایی10× b) کلنی گرانولوسیتی با بزرگ‌نمایی40× c) کلنی اریتروئیدی با بزرگ‌نمایی40 ×
نمودار 1: ارزیابی اثر بایکالین و تروگلیتازون بر توانایی تشکیل کلنی سلولهای CD133+ . تعدادکلنی‌های تشکیل شده در روز نهم به ازای 10000 سلول اولیه در حضور غلظت 50 میکرومول بایکالین و غلظت 3 میکرومول تروگلیتازون با مدرج کردن پلیت کشت و شمردن زیر عدسی با بزرگ‌نمایی 100 مشخص شد(3 n= ، 001/0 p=).
شکل 5: درصد سلولهای زنده تیمار شده با بایکالین و تروگلیتازون در روز هفتم توسط آنالیز فلوسیتومتری. نمودار A غلظت‌های مختلف بایکالین و نمودار B غلظت‌های تروگلیتازون را نمایش می‌دهد. شمارش درصد سلولهای زنده در غلظت 50 میکرومول بایکالین و 1 میکرومول تروگلیتازون کاهش معناداری نشان می‌دهد به ترتیب(3 n= ، 01/0 p=)، (3 n= ، 02/0 p=).
پس از تیمار سلولهای CD133+ با غلظت 1، 10، 20 و 50 میکرومول بایکالین، درصد نسبت سلولهای زنـده بـه مرده در روز هفتم به ترتیب 100% ، 11 ± 85% ، 26 ± 75% و 12 ± 44% و در غلظت‌های 1/0 ، 1 میکرومول تروگلیتازون درصد سلولهای زنده 9 ± 71% و 10 ± 50% بود و در غلظت‌های 3 و 10 میکرومول، تمامی سلول‌ها مرده و قابل ارزیابی با فلوسیتومتری نبودند(شکل 5).
بحث
تاکنـون در مورد اثرات لیگاندهای PPARγ بر سلولهای
مختلـف، مطالعه‌هـای زیـادی انجام شده است . لیگاندهای PPARγ رشد سلولی را با القای آپوپتوز در سـل لاین‌هـای
لنفومـا و لوسمیـک انسانـی مختلـف سرکوب می‌کنند(26،
19). هم چنین آگونیست‌هایی هم چون تروگلیتازون، پیوگلیتازون و تیازولیدین سبب القای آپوپتوز در سلولهای سرطانی کولون انسانی و سلول سرطانی سینه می‌شوند(28، 27). در مطالعه هیراس و همکارانش در سال 2000 ، نشان داده شد که لیگاندهای سنتتیک PPARγ هم چون تروگلیتازون و پیازولیدازون سبب سرکوب تکثیر سلولی و بیان مارکرهای سطحی اریتروئیدی GPA در سل لاین اریترولوسمی K562 می‌شوند(29). هم چنین این لیگاندها باعث القای تمایز مونوسیتی در برخی سل لاین‌های سرطانی میلوژنز می‌شوند(29). در ادامه در مطالعه ناگاساوا و همکارانش در سال 2005 نیز مشخص شد که تیازولیدازون‌ها بلوغ اریتروئیدی و تکثیر سلولهای تشکیل‌دهنده کلنی اریتروئید(erythroid colony-forming cells) را در سلولهای بنیادی خونساز جدا شده از خون محیطی، دچار تاخیر می‌کنند(20). هم چنین مشخص شد به دنبال استفاده از تیازولیدازون‌ها در بیماران دیابتی، هموگلوبین و هماتوکریت در آن‌ها کاهش پیدا می‌کند(30). در سال‌های اخیر نیز مشتقات سنتتیک جدیدتر و گلیتازون که اثرات آنتی پرولیفراتیو خوب و اثرات توکسیک کمتری دارند، به منظور درمان استفاده می‌شوند(28). علاوه بر تروگلیتازون لیگاندهای طبیعی PPARγ مثل dPGJ2 15، تکثیر سلولی ECFCs را سرکوب می‌کنند که بیانگر اثرات ضد تکثیری با واسطه PPARγ است(20). تاکنون در مورد اثرات آگونیست‌های مختلفPPARγ در سل لاین‌های سرطانی و نیز اریتروپوئز، مطالعه‌های زیادی انجام شده است ولی برای اولین بار است که اثر بایکالین بر اریتروپوئز نرمال بررسی و اثر سرکوب‌کننده آن اثبات میشود. اثر ضد سرطانی بایکالین و نیز بایکالئین توسط مطالعه‌های بسیاری اثبات شده است(34-31، 24، 11، 6). پس از شکست نیمه گلیکوزید در محیط زنده، بایکالین تبدیل به بایکالئین میشود. بایکالین سبب توقف در فاز G1 چرخه سلولی و آپوپتوز سلولهای سرطانی پروستات میشود(11). در سلولهای هپاتومای انسانی، بایکالین سبب القای آپوپتوز و مهار تکثیر می‌گردد(10). هم چنین بایکالین و بایکالئین دارای اثرات بالقوه آنتی‌آنژیوژنز می‌باشند(33). اثرات ضد تکثیری بایکالین بر سل لاین‌های سرطانی مختلف توسط دانشمندان مختلف گزارش شده و در مطالعه‌ها تاکید شده که اثرات مهار رشد فلاونوئیدها از جمله بایکالین در بین سلولهای سرطانی انسانی و نه در سلولهای دیپلوئید نرمال مشاهده شده است(1). با این حال در مطالعه هیم‌جی و همکاران در سال 2007 ، نشان داده شد که علاوه بر اثرات توکسیک و سمی بر سلولهای سرطانی، بایکالین اثر توکسیک کمی بر سلولهای نرمال دارد(35). تعدادی از مطالعه‌ها نشان می‌دهند که لیگاندهای PPARγ ، رشد سلول‌ها را در سل لاین‌های لوسمیک و لنفوما از طریق القای آپوپتوز سرکوب می‌کنند(37، 36، 19). با این حال مطالعه ناواگاسا و همکارانش نشان داد که لیگاندهای PPARγ ، تکثیر سلولهای پیش‌ساز اریتروئیدی را بدون کاهش قابلیت حیات و افزایش آپوپتوز، سرکوب می‌نمایند(20).
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که کاهش چشمگیر درصد سلولهای بیان‌کننده رسپتورهای سطحی در غلظت µM 50 بایکالین و µM 3 تروگلیتازون مشاهده شد. کاهش میانگین درصد سلولهای بیان‌کننده مارکرهای اریتروئیدی GPA و TfR در روز هفتم نشان می‌دهد تعداد سلولهای بیان‌کننده این مارکرها به طور معناداری به شیوه وابسته به دوز کاهش پیدا کرده که خود نمایانگر تاخیر بلوغ اریتروئیدی سلولهای پیش‌ساز میباشد. درصد بیان TfR همانند بیان GPA در غلظت 10 میکرومول بایکالین، مشابه نمونه کنترل میباشد که نشان می‌دهد این غلظت تاثیری بر روند تمایز HSC و قابلیت حیات آن ندارد. در مقایسه، در تیمار با تروگلیتازون به عنوان فعال‌کننده PPARγ در روز هفتم، میانگین درصد بیان مارکر اریتروئیدی GPA در غلظت 1/0 و 1 میکرومول به ترتیب 3 ± 49% و 5 ± 32% و مارکر CD71 به ترتیب 4 ± 68% و 2 ± 45% بوده و هیچ سلول زنده‌ای در روز هفتم در غلظت 3 و 10 تروگلیتازون باقی نماند.
در این مطالعه مشاهده شد که میزان سلولهای زنده پس از افزودن بایکالین به تدریج کاهش می‌یابد و تعداد این سلول‌ها در موارد افزودن آگونیست تروگلیتازون در مقایسه با بایکالین بیشتر می‌باشند. بنابراین مشاهده میشود همان طور که حساسیت سلولهای سرطانی در برابر عصاره بایکالین متفاوت است، حساسیت سلولهای نرمال مانند HSC در حین تمایز به رده اریتروئیدی نیز متفاوت میباشد(35). تکثیر سلول‌ها در تروگلیتازون به میزان بیشتری در مقایسه با بایکالین مهار میشود و مهار تکثیر با افزایش مقدار این آگونیست‌ها افزایش می‌یابد. هم چنین با مقایسه میزان سلولهای بیان‌کننده مارکرهای سطحی اریتروئیدی GPA و TFR، مشاهده شد که میزان سلولهای بیان‌کننده این مارکرها در سلولهای تیمار شده با بایکالین و نیز تروگلیتازون در مقایسه با کنترل کاهش پیدا کرده است و این کاهش به صورت وابسته به دوز میباشد. نتایج به دست آمده از آزمون سنجش کلنی حاکی از آن است که سلولهای بنیادی CD133+ جدا شده و تکثیر یافته، توانایی مناسب کمی و کیفی برای تمایز به سمت رده‌های مختلف سلولی از جمله رده اریتروئیدی را داشته و از این رو نتایج مربوط به سلولهای بیان‌کننده مارکرهای سطحی مربوط به این سلول‌ها را تایید می‌کند.
نتیجه‌گیری
در مقالات مختلف اثرات ضد باکتریایی، ضد ویروسی، فعالیت ضد التهابی و اثرات ضد توموری بایکالین در زمینه ایمنی ذاتی و نیز به عنوان راه حلی برای درمان تب،
بیماری‌های آلرژیک و التهابی، فعالیت ضد ویروسی، اثر ضد تکثیر بر سل لاین‌های مختلف و اثر بر درمان بیماری‌های نورودژنراتیو گزارش شده است(38، 1). لیکن در تمام این مطالعه‌ها، اثر توکسیک احتمالی این عصاره بر سلولهای نرمال در نظر گرفته نشده است. یافته‌های این تحقیق نشان می‌دهد که بایکالین دارای اثرات قابل ملاحظه وابسته به دوزی بر روند خونسازی اریتروئید است و لذا باید در تجویز و مصرف آن، این اثرات جانبی و هم چنین دوز مورد استفاده آن مورد توجه قرار گیرد. این مساله به ویژه با توجه به منشا گیاهی بایکالین و نیز گزارش‌های متعدد مبتنی براثرات ضد سرطانی آن و احتمال مصرف خودسرانه بایکالین توسط افراد جامعه حایز اهمیت میباشد.
متن کامل: (1895 مشاهده)
تاثیر عصاره بایکالین، فعال‌کننده PPARγ بر تمایز اریتروئیدی سلولهای
بنیادی خونساز CD133+ بند ناف
پروانه عباسی1، کریم شمس اسنجان2، علی‌اکبر مؤثق‌پور3، پروین اکبرزاده لاله4، نیما دهدیلانی5
چکیده
سابقه و هدف
ریشه خشک شده گیاه بایکالین، اثرات ضد ویروسی و ضد سرطانی دارد. این مطالعه جهت آشکارسازی اثر عصاره این گیاه بر روند تمایز سلولهای بنیادی خونساز CD133+ به رده اریتروئیدی انجام شد.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، جهت تعیین اثر لیگاندهایPPARγ (بایکالین و تروگلیتازون) بر روند تمایز سلولهای بنیادی در حین اریتروپوئز، سلولهای CD133+ از خون بند ناف جدا شدند و پس از مجاورت با غلظت‌های مختلف بایکالین، تروگلیتازون، سیتوکاین‌های اریتروپویتین (EPO) و استم سل فاکتور(SCF)، در انکوباتور کشت سلولی قرار داده شدند. پس از 9 روز بررسی تغییرات مورفولوژی توسط رنگ‌آمیزی رایت گیمسا، تغییرات درصد سلولهای بیان‌کننده مارکرهای سطحی با فلوسیتومتری و ارزیابی کلنی‌های تشکیل شده در محیط نیمه جامد متیل سلولز انجام شد.
یافته‌ها
بررسی میکروسکوپی سلولهای رنگ‌آمیزی شده با رنگ رایت گیمسا، نمایانگر بلوغ اریتروئیدی سلولهای بنیادی CD133+ در حضور سیتوکاین‌های SCF و EPO بود. بررسی فلوسیتومتری سلول‌ها نشانگر کاهش درصد سلولهای بیان‌کننده مارکرهای اریتروئیدی گیرنده ترانسفرین(TfR) و گلیکوفورین A (GPA) در مجاورت تروگلیتازون و بایکالین بود(03/0 p<). اثر بازدارنده بر اریترپوئز تروگلیتازون بیشتر از بایکالین بود. آزمایش سنجش کلنی نیز کاهش چشمگیر کلنی‌ها را در مجاورت تروگلیتازون و بایکالین نشان می‌دهد(02/0 p<).
نتیجه گیری
نتایج حاصل از این مطالعه نشان می‌دهد که آگونیست‌های PPARγ ، تعدیل‌کننده روند تمایز سلولهای بنیادی CD133+ به رده اریتروئیدی بوده و نقش مهمی در تنظیم روند اریتروپوئز نرمال به عهده دارند. لذا با توجه به استفاده این عصاره گیاهی جهت درمان برخی بیماری‌ها، باید اثر بازدارندگی آن بر اریتروپوئز طبیعی مورد توجه قرار گیرد.
کلمات کلیدی: بایکالین، اریتروپوئز، سلولهای بنیادی خونساز، PPAR گاما
تاریخ دریافت : 17/10/91
تاریخ پذیرش : 25/4 /92
1- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
2- مؤلف مسؤول: PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات خون و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای آموزشی انتقال خون تبریز ـ تبریز ـ ایران ـ صندوق پستی: 51335
3- PhD هماتولوژی ـ استادیار دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
4- دکترای بیوتکنولوژی دارو ـ استادیار دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
5- دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی ـ دانشگاه علوم پزشکی مشهد ـ مشهد ـ ایران
بنیادی خونساز CD133+ بند ناف
پروانه عباسی1، کریم شمس اسنجان2، علی‌اکبر مؤثق‌پور3، پروین اکبرزاده لاله4، نیما دهدیلانی5
چکیده
سابقه و هدف
ریشه خشک شده گیاه بایکالین، اثرات ضد ویروسی و ضد سرطانی دارد. این مطالعه جهت آشکارسازی اثر عصاره این گیاه بر روند تمایز سلولهای بنیادی خونساز CD133+ به رده اریتروئیدی انجام شد.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، جهت تعیین اثر لیگاندهایPPARγ (بایکالین و تروگلیتازون) بر روند تمایز سلولهای بنیادی در حین اریتروپوئز، سلولهای CD133+ از خون بند ناف جدا شدند و پس از مجاورت با غلظت‌های مختلف بایکالین، تروگلیتازون، سیتوکاین‌های اریتروپویتین (EPO) و استم سل فاکتور(SCF)، در انکوباتور کشت سلولی قرار داده شدند. پس از 9 روز بررسی تغییرات مورفولوژی توسط رنگ‌آمیزی رایت گیمسا، تغییرات درصد سلولهای بیان‌کننده مارکرهای سطحی با فلوسیتومتری و ارزیابی کلنی‌های تشکیل شده در محیط نیمه جامد متیل سلولز انجام شد.
یافته‌ها
بررسی میکروسکوپی سلولهای رنگ‌آمیزی شده با رنگ رایت گیمسا، نمایانگر بلوغ اریتروئیدی سلولهای بنیادی CD133+ در حضور سیتوکاین‌های SCF و EPO بود. بررسی فلوسیتومتری سلول‌ها نشانگر کاهش درصد سلولهای بیان‌کننده مارکرهای اریتروئیدی گیرنده ترانسفرین(TfR) و گلیکوفورین A (GPA) در مجاورت تروگلیتازون و بایکالین بود(03/0 p<). اثر بازدارنده بر اریترپوئز تروگلیتازون بیشتر از بایکالین بود. آزمایش سنجش کلنی نیز کاهش چشمگیر کلنی‌ها را در مجاورت تروگلیتازون و بایکالین نشان می‌دهد(02/0 p<).
نتیجه گیری
نتایج حاصل از این مطالعه نشان می‌دهد که آگونیست‌های PPARγ ، تعدیل‌کننده روند تمایز سلولهای بنیادی CD133+ به رده اریتروئیدی بوده و نقش مهمی در تنظیم روند اریتروپوئز نرمال به عهده دارند. لذا با توجه به استفاده این عصاره گیاهی جهت درمان برخی بیماری‌ها، باید اثر بازدارندگی آن بر اریتروپوئز طبیعی مورد توجه قرار گیرد.
کلمات کلیدی: بایکالین، اریتروپوئز، سلولهای بنیادی خونساز، PPAR گاما
تاریخ دریافت : 17/10/91
تاریخ پذیرش : 25/4 /92
1- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
2- مؤلف مسؤول: PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات خون و انکولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و پایگاه منطقه‌ای آموزشی انتقال خون تبریز ـ تبریز ـ ایران ـ صندوق پستی: 51335
3- PhD هماتولوژی ـ استادیار دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
4- دکترای بیوتکنولوژی دارو ـ استادیار دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تبریز ـ تبریز ـ ایران
5- دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی ـ دانشگاه علوم پزشکی مشهد ـ مشهد ـ ایران
مقدمه
گیاه اسکوتلاریا بایکالنزیس جورجی (Scutellariabaicalensisgeorgi)، یک گیاه گل‌دار چند ساله از خانواده Lamiaceae میباشد که در ژاپن، چین، کره و نیز به صورت سازگار شده با شرایط اروپای مرکزی مثل آلمان و لهستان کشت داده میشود(1).
ریشه خشک شده این گیاه Radix scutellariae ، مقادیر بالایی از فلاونوئیدها شامل بایکالین(5 و 6 دی‌هیدروکسی 8- متوکسی فلاون) بیشتر از 14% ، بایکالئین(5 ،6 و7 تری‌‌هیدروکسیفلاون) بیشتر از 7% وگونین(5 و7 دی‌هیدروکسی 8- متوکسیفلاون) 7% و ... دارد(1). بایکالین، فلاونوئید اصلی یافت شده درScutellaria radix میباشد. در تعدادی از مطالعه‌ها اثرات ضد سرطانی و حفاظتی بایکالین در برابر آسیب‌های بافتی و ارگان‌ها نشان داده شده است. تاکنون در مورد اثرات بایکالین بر سیستم عصبی و عضله- اسکلتی، تاثیرات ضد التهابی و آنتی‌اکسیدان، درمان بیماری‌های قلبی، فعالیت‌های ضد میکروبی، ضد ویروسی و ضد سرطانی، تاثیر آن بر توقف چرخه سلولی در فاز G1 و آپوپتوز سلولهای سرطانی بررسیهایی انجام شده است(8-2). به علاوه اثرات ضد تکثیری آن در سرطان‌های مختلف نظیر ریه، هپاتوکارسینوما، پروستات و نیز سل لاین‌های سرطانی مختلف توسط گروه‌های تحقیقاتی مختلف نشان داده شده است(11-9). افزودن بایکالین به سل لاین اریترولوسمی K562 ، تمایز به سمت رده اریتروئیدی را مهار می‌کند و توانایی ایجاد کلنی را ازطریق تاثیر بر مسیر سیگنالینگ Notch کاهش می‌دهد(12).
بایکالین یکی از آگونیست‌های PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ) می باشد. PPARγ یک فاکتور نسخه‌برداری فعال شونده توسط لیگاند، متعلق به سوپر فامیلی نوکلئورسپتورها است(13). نوکلئورسپتورهای انسانی، خانواده‌ای متشکل از 49 عضو بوده که درون هسته یا سیتوپلاسم یافت می‌شوند، مسؤول پاسخگویی به هورمون‌های تیروئیدی یا استروئیدی می‌باشند و در کنترل توسعه، هموستاز و متابولیسم ارگانیسم نقش دارند(14). نوکلئورسپتور PPARγ در سطوح بالا در بافت‌های چربی بیان شده و نقش اصلی در تمایز ادیپوسیت‌ها دارد(15). علاوه بر آن، در بسیاری سل لاین‌های دیگر شامل هپاتوسیت‌ها، فیبروبلاست‌ها و سلولهای اپی‌تلیال سینه و کلون نیز یافت شده است. در مورد بافت‌های هماتوپوئتیک، بیان PPARγ در سلولهای استرومال مغز استخوان، سلولهای پروژنیتور CD34+ ، سلولهای مونوسیت/ماکروفاژ نرمال، لنفوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها گزارش شده است که نشان می‌دهد PPARγ ، نقش حیاتی در اریتروژنز علاوه بر آدیپوژنز دارد(17، 16). علاوه بر این PPARγ در فرآیندهای تکثیرHSC ، استئوکلاستوژنز و تمایـز بـه رده مـونوسیتی نقش دارد(18).
لیگاندهای PPARγ اثرات تعدیل‌کننده‌ای بر تکثیر و تمایز سل لاین‌های سرطانی مختلف نشان داده‌اند و لذا بسیاری از آن‌ها کاربرد بالینی مختلف و گسترده‌ای پیدا کرده‌اند(19).
لیگاندهایی مثل تروگلیتازون و پلی‌گلیتازون که به طور گسترده در درمان دیابت ملیتوس تیپ 2 و مشتقات جدید آن که به علت اثرات آنتی‌پرولیفراتیو در درمان سرطان‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند، تکثیر سلولهای پروژنیتور اریتروئیدی اولیه را سرکوب و دچار تاخیر می‌کنند(22-20). تروگلیتازون مشابه سایر تیازولیدازون‌ها TZD (پیاگلیتازونوروزگلیتازون)، از طریق فعال‌سازی PPAR عمل می‌کند و از این طریق بر متابولیسم استخوان نیز تاثیر دارد(23).
تروگلیتازون لیگاندی برای هر دو PPARα و به طور قوی‌تر برای PPARγ میباشد. عصاره گیاهی بایکالین فعال‌کننده PPARγ است که به دلیل اثرات ضد سرطانی خود، مورد توجه در درمان بسیاری از بیماری‌ها است. فعال شدن PPARγ می‌تواند منجر به کاهش تمایز رده اریتروئیدی شود لذا در این تحقیق اثرات این مولکول در تمایز، بقا و تکثیر سلولهای بنیادی خونساز به رده اریتروئیدی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
جداسازی و نشاندار کردن سلولهای CD133+ :
در این مطالعه تجربی، نمونه‌هـای خون بند ناف، پس از
تکمیل فرم رضایت‌نامه توسط مادران، از نوزادان زنان سالم و نرمال به طور تصادفی انتخاب شدند. به این منظور، از بند ناف‌های تازه در هنگام زایمان فول ترم و حداکثر تا چهار ساعت پس از آن استفاده شد. خون با استفاده از هیدروکسی اتیل استارچ(HES)(6% HAES-steril ، Freeflex) در غلظت نهایی 5/2% ، رقیق و در دمای 22 درجه سانتی‌گراد در لوله‌هایی با قطر 12 میلی‌متر با قدرت g 50 سانتریفیوژ شد. سپس لایه پلاسمایی حاوی سلولهای تک هسته‌ای جمع‌آوری و پس از سانتریفیوژ، رسوب سلولی در محلول PBS سوسپانسیونه شده به روی فایکول(ایران، بهار افشان)(g/mL 077/1) برده شد و با قدرت g 800 به مدت 35 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سوسپانسیون سلولهای تک هسته‌ای به دست آمده از فایکول، با آنتی‌بادی‌های CD133 مگنتیک مجاور شد و در دمای 8-4 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شد. بعد از شستشو، از سلول‌ها در حجم مناسب PBS سوسپانسیون تهیه شد. غنی‌سازی و جداسازی سلولهای CD133+ با ستون(آلمان، میلتنی بیوتک)(107) LS و به روش انتخاب مثبت انجام شد. پس از آماده‌سازی ستون با PBS و افزودن سلول‌ها، سلولهای نشاندار نشده از ستون عبور کرده و خارج شدند. سپس ستون از جداکننده مگنتیک(Separator) خارج و سلولهای نشاندار با جریان سریع شسته شد و بعد از سانتریفیوژ، با قدرت g 300 به مدت 10 دقیقه در حجم 500 میکرولیتر مایع به صورت سوسپانسیون در آمد.
کشت سلولهای بنیادی خونساز(HSC):
سلولهای CD133+ جدا شده در محیط کشت(آلمان، سیگما) IMDM حاوی 20% سرم جنین گاوی(FBS)، در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد در حضور CO25% تکثیر پیدا کردند. سیتوکاین‌های ng/mL 100 TPO ، ng/mL 100 SCF و ng/mL 100 FLT3L (کانادا ، ونکوور ، استم سل تکنولوژیس) و نیز U/mL 100 پنی‌سیلین و µg/mL 100 استرپتومایسین(جیبکو) جهت تکثیر این سلول‌ها مورد استفاده قرار گرفت. سلولهای تکثیر یافته به منظور تمایز اریتروئیدی در محیط کشت IMDM درپلیت 96 خانه‌ای در حضور سیتوکاین‌های ng/mL 20 SCF و U/mL 5/4 EPO کشت داده شدند و از روز چهارم هر سه روز یک بار محیط کشت کاملاً تعویض و سیتوکاین تازه افزوده شد. جهت بررسی اثرات آگونیست‌های PPARγ از قبیل بایکالین(سیگما ، آلمان) و تروگلیتازون(سیگما، آلمان) بر روند تمایز اریتروئیدی، تکثیر و تمایز سلول‌ها در حضور و فقدان این مواد سنجیده شد. بایکالین و تروگلیتازون در دی‌متیل‌سولفوکسید(DMSO) به صورت محلول درآمدند و غلظت‌های مختلف بایکالین(1، 10، 20 و 50 میکرومول) و نیز تروگلیتازون(1/0 ، 1، 3 و 10 میکرومول) مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی تمایز سلولی با فلوسیتومتری:
جهت تعیین میزان تمایز اریتروئیدی، بیان CD71 (رسپتور ترانسفرین(TfR)) و گلیکوپروتئینA(GPA) بر سطح سلولهای تمایز یافته با کمک فلوسیتومتری بررسی شد. تعداد 105سلول با PBS دو بار شستشو داده شد و سپس با آنتی‌بادی مونوکلونال آنتی-GPA کنژوگه شده با FITC (دانمارک، داکو) و آنتی‌بادی مونوکلونال آنتی- CD71 کنژوگه شده با PE(دانمارک، داکو) به مدت 30 دقیقه در دمای یخچال انکوبه شد و سپس با کمک فلوسیتومتری آنالیز شد.
ارزیابی توانایی تشکیل کلنی(CFU-assay):
توانایی سلولهای HSC جهت ایجاد کلنی با افزودن آن‌ها به محیط متیل سلولز(MC) بر پایه IMDM بررسی شد. جهت تهیه محیط MC ، 26 گرم از MC (281-M ، فیشر) اتوکلاو شده به 500 میلی‌لیتر آب مقطر استریل(90 درجه سانتی‌گراد ـ 70 درجه سانتی‌گراد) افزوده شد. به مدت 10 دقیقه با استفاده از تیغه مگنتیک به هم زده شد و سپس با افزودن تدریجی mL 500 از محیط 2x IMDM به محیط، فرآیند تشکیل ژل آغاز شد و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 24-6 ساعت به طور کامل به صورت ژل در آمد. جهت بررسی توانایی تشکیل کلنی، 104 * 1 سلول را در 100 میکرولیتر محیط IMDM حل کرده و غلظت µM 50 بایکالین و µM 3 تروگلیتازون همراه با سیتوکاین‌های U/mL rh EPO 4 و ng/mL rhSCF 20 به 1 میلی لیتر از محیط MC آماده شده اضافه شد. سپس این محیط با نیدل G16 به درون پلیت کشت سلولی ریخته شده و پلیت به مدت 14 روز در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 و در محیط مرطوب قرار داده شد. آزمایش سنجش کلنی در مقایسه با کنترل بدون حضور آگونیست‌ها انجام شد.
بررسی مورفولوژیک سلولهای تمایز یافته اریتروئیدی:
جهت بررسی تغییرات تمایزی، رنگ‌آمیزی سلول‌ها با رنگ رایت-گیمسا انجام گرفت و سپس بررسی میکروسکوپی سلول‌ها انجام پذیرفت.
ارزیابی تعداد سلولهای زنده و غیر زنده از طریق فلوسیتومتری:
سلولهای کشت داده شده در حضور آگونیست‌های PPARγ و تعداد سلولهای زنده و مرده از طریق برداشت حجم ثابت از سوسپانسیون سلولی از این سلول‌ها و آنالیز آن از طریق فلوسیتومتری(Epics Elite ESP) انجام شد. از طریق نمودار خصوصیات سلولی در FS و SS ، می‌توان تعداد سلولهای زنده و غیر زنده موجود در نمونه را محاسبه کرد(25، 24). همه داده‌ها به صورت SD ± mean گزارش شدند.
آنالیز داده‌ها با استفاده از آزمون t-Student در نرم‌افزار 17 SPSS انجام شد.
یافته‌ها
بررسی مورفولوژیک سلولهای تمایز یافته اریتروئیدی:
جهت بررسی تغییرات مورفولوژیک سلولهای حاصل از تکثیر و تمایز CD133+ به سلولهای تمایز یافته رده اریتروئیدی، رنگ‌آمیزی رایت ـ گیمسا انجام شد و تمایز پیش‌سازها به رده‌های اریتروئیدی نیز مشاهده شد، که مورفولوژی تاییدی بر روند تمایزی این سلول‌ها میباشد(شکل 1).
اثر بایکالین بر بیان رسپتور ترانسفرین(TfR) و گلیکوپروتئینA(GPA) بر سطح سلولهای تمایز یافته در مقایسه با تروگلیتازون:
بـه منظـور بـررسی اثـرات بایکالیـن بـه عنـوان یکی از
لیگاندهای PPARγ بر تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی هماتوپوئتیک جدا شده از خون بند ناف و تاثیر آن بر روند تمایز اریتروئیدی، سلولهای CD133+ با غلظت‌های مختلف بایکالین(10، 20 و 50 میکرومول) و نیز تروگلیتازون(1/0 ،1) در محیط کشت IMDM حاوی 20% FBS به مدت هفت روز انکوبه شدند و سپس بیان GPA و TfR با فلوسیتومتری بررسی شد. فلوسیتومتری در بیمارستان قاضی دانشگاه علوم پزشکی تبریز با دستگاه فلوسیتومتری(BD ، FACSCalibur) انجام شد. سلولهای بنیادی هماتوپوئتیک CD133+ در محیط کشت IMDM کنترل به همراه سیتوکاین‌های EPO و SCF به رده اریتروئیدی تمایز پیدا کردند که با تغییر در بیان GPA و
شکل1: سلولهای رنگ‌آمیزی شده با رنگ گیمسا در روز هفتم تمایز اریتروئیدی a) HSC های جدا شده از بند ناف در روز صفر 10×b ) سلولهای پیش‌ساز اریتروئیدی در روز هفتم تمایز بزرگ‌نمایی40×c ) سلولهای پیش‌ساز اریتروئیدی در روز هفتم تمایز بزرگ‌نمایی100×
شکل2: بیان رسپتورهای سطحی (a) GPA و (b) CD71 از طریق فلوسیتومتری در روز هفتم تمایز اریتروئیدی در محیط کشت IMDM حاوی سیتوکاین‌های ng/mL 20 SCF و U/mL 5/4 EPO در غلظت‌های(20 و 50 میکرومول) بایکالین و در حضور کنترل مورد ارزیابی قرار گرفت.
TfR همراه بود. میانگین درصد سلول‌ها، بیان‌کننده GPA در روز هفتم در غلظت 10 میکرومول بایکالین مشابه نمونه کنترل و 2 ± 84 درصد بود(3 n= ، 03/0 p=). هم چنین در غلظت‌های 20 و 50 میکرومول به ترتیب 4 ± 5/79% و 3 ± 44% بوده که نشان‌دهنده کاهش معنادار تعداد سلولهای عرضه‌کننده GPA به طور وابسته به دوز است(3 n= ، 01/0 p<). علاوه بر آن در بررسی سلولهای عرضه‌کننده TfR نیز کاهش میزان این سلول‌ها به صورت وابسته به دوز مشاهده شد. میانگیـن درصد سلولهای بیان‌کننده TfR در روز هفتم در بررسی فلوسیتومتری در غلظت‌های مختلف(10، 20 و 50 میکرومول) به ترتیب 4 ± 80% ، 5 ± 73% و 3 ± 17% بود. درصد سلولهای بیان کننده TfR همانند بیان GPA در غلظت 10 میکرومـول بایکالیـن مشابـه نمونـه کنترل بود (3 n=). در مقایسه، در تیمار با تروگلیتازون به عنوان فعال‌کننده PPARγ در روز هفتم، میانگین درصد سلولهای بیان‌کننده مارکر اریتروئیدی GPA در غلظت 1/0 و 1 میکرومول به ترتیب 3 ± 49% و 5 ± 32% و مارکـر CD71 به ترتیب 4 ± 68% و 2 ± 45% بود. بنابراین کاهش معنادار درصد سلولهای بیان‌کننده رسپتورهای سطحی در غلظت µM 50 بایکالیـن و µM3 تروگلیتازون روی داد(3 n= ، 02/0 (p< و (3 n= ، 01/0 p=)(شکل 2 و 3).
اثر بایکالین بر توانایی تشکیل کلنی اریتروئیدی در محیط نیمه جامد متیل سلولز در مقایسه با تروگلیتازون:
آزمون سنجش کلنی به منظور بررسی فعالیت عملکردی سلولهای بنیادی خونساز انجام شد. غلظت‌هایی از بایکالین و تروگلیتازون که سرکوب معنادار بیان رسپتورهای سطحی را نشان دادند(غلظت µM 50 بایکالین و µM 3 تروگلیتازون) انتخاب شد و همراه با سیتوکاین‌های rhEPO U/mL 4 و rhSCF ng/mL 20 در انکوباتور با 5% CO2 قرار داده شد. مقایسه با کنترل آزمون سنجش کلنی انجام شد(3 n= ، 001/0 p=)(نمودار 1). شکل 4 تشکیل کلنی‌های اریتروئیدی را بعد از 9 روز نشان
اثر بایکالین بر توانایی تشکیل کلنی اریتروئیدی در محیط نیمه جامد متیل سلولز در مقایسه با تروگلیتازون:
آزمون سنجش کلنی به منظور بررسی فعالیت عملکردی سلولهای بنیادی خونساز انجام شد. غلظت‌هایی از بایکالین و تروگلیتازون که سرکوب معنادار بیان رسپتورهای سطحی را نشان دادند(غلظت µM 50 بایکالین و µM 3 تروگلیتازون) انتخاب شد و همراه با سیتوکاین‌های rhEPO U/mL 4 و rhSCF ng/mL 20 در انکوباتور با 5% CO2 قرار داده شد. مقایسه با کنترل آزمون سنجش کلنی انجام شد(3 n= ، 001/0 p=)(نمودار 1). شکل 4 تشکیل کلنی‌های اریتروئیدی را بعد از 9 روز نشان
شکل3: بیان رسپتورهای سطحی GPA و CD71 از طریق فلوسیتومتری در روز هفتم تمایز اریتروئیدی در محیط کشت IMDM حاوی سیتوکاین‌های ng/mL 20 SCF و U/mL 5/4 EPO در غلظت‌های مختلف تروگلیتازون(1/0 ، 1 میکرومول) و در حضور آنتی‌بادی ایزوتیپیک کنترل مورد ارزیابی قرار گرفت.
شکل 4: کلنی‌های ایجاد شده پس از 9 روز در محیط نیمه جامد متیل سلولز a) کلنی‌های مختلف در بزرگ‌نمایی10× b) کلنی گرانولوسیتی با بزرگ‌نمایی40× c) کلنی اریتروئیدی با بزرگ‌نمایی40 ×
می‌دهد.
ارزیابی تعداد سلول های زنده و غیر زنده با روش فلوسیتومتری:
مجاورت سلولهای CD133+ با آنتاگونیست‌های PPARγ )بایکالین و تروگلیتازون( باعث کاهش تعداد سلولهای زنده شد. ارزیابی از طریق برداشت حجم ثابت از سوسپانسیون سلولی از همه غلظت‌های آگونیست‌ها و آنالیز آن‌ها از طریق فلوسیتومتری(Epics Elite ESP) انجام شد. از طریق هیستوگرام خصوصیات سلولی در FS و SS ، تعداد سلولهای زنده و غیر زنده موجود در نمونه محاسبه شد، شد(25، 24).
ارزیابی تعداد سلول های زنده و غیر زنده با روش فلوسیتومتری:
مجاورت سلولهای CD133+ با آنتاگونیست‌های PPARγ )بایکالین و تروگلیتازون( باعث کاهش تعداد سلولهای زنده شد. ارزیابی از طریق برداشت حجم ثابت از سوسپانسیون سلولی از همه غلظت‌های آگونیست‌ها و آنالیز آن‌ها از طریق فلوسیتومتری(Epics Elite ESP) انجام شد. از طریق هیستوگرام خصوصیات سلولی در FS و SS ، تعداد سلولهای زنده و غیر زنده موجود در نمونه محاسبه شد، شد(25، 24).
نمودار 1: ارزیابی اثر بایکالین و تروگلیتازون بر توانایی تشکیل کلنی سلولهای CD133+ . تعدادکلنی‌های تشکیل شده در روز نهم به ازای 10000 سلول اولیه در حضور غلظت 50 میکرومول بایکالین و غلظت 3 میکرومول تروگلیتازون با مدرج کردن پلیت کشت و شمردن زیر عدسی با بزرگ‌نمایی 100 مشخص شد(3 n= ، 001/0 p=).
شکل 5: درصد سلولهای زنده تیمار شده با بایکالین و تروگلیتازون در روز هفتم توسط آنالیز فلوسیتومتری. نمودار A غلظت‌های مختلف بایکالین و نمودار B غلظت‌های تروگلیتازون را نمایش می‌دهد. شمارش درصد سلولهای زنده در غلظت 50 میکرومول بایکالین و 1 میکرومول تروگلیتازون کاهش معناداری نشان می‌دهد به ترتیب(3 n= ، 01/0 p=)، (3 n= ، 02/0 p=).
پس از تیمار سلولهای CD133+ با غلظت 1، 10، 20 و 50 میکرومول بایکالین، درصد نسبت سلولهای زنـده بـه مرده در روز هفتم به ترتیب 100% ، 11 ± 85% ، 26 ± 75% و 12 ± 44% و در غلظت‌های 1/0 ، 1 میکرومول تروگلیتازون درصد سلولهای زنده 9 ± 71% و 10 ± 50% بود و در غلظت‌های 3 و 10 میکرومول، تمامی سلول‌ها مرده و قابل ارزیابی با فلوسیتومتری نبودند(شکل 5).
بحث
تاکنـون در مورد اثرات لیگاندهای PPARγ بر سلولهای
مختلـف، مطالعه‌هـای زیـادی انجام شده است . لیگاندهای PPARγ رشد سلولی را با القای آپوپتوز در سـل لاین‌هـای
لنفومـا و لوسمیـک انسانـی مختلـف سرکوب می‌کنند(26،
19). هم چنین آگونیست‌هایی هم چون تروگلیتازون، پیوگلیتازون و تیازولیدین سبب القای آپوپتوز در سلولهای سرطانی کولون انسانی و سلول سرطانی سینه می‌شوند(28، 27). در مطالعه هیراس و همکارانش در سال 2000 ، نشان داده شد که لیگاندهای سنتتیک PPARγ هم چون تروگلیتازون و پیازولیدازون سبب سرکوب تکثیر سلولی و بیان مارکرهای سطحی اریتروئیدی GPA در سل لاین اریترولوسمی K562 می‌شوند(29). هم چنین این لیگاندها باعث القای تمایز مونوسیتی در برخی سل لاین‌های سرطانی میلوژنز می‌شوند(29). در ادامه در مطالعه ناگاساوا و همکارانش در سال 2005 نیز مشخص شد که تیازولیدازون‌ها بلوغ اریتروئیدی و تکثیر سلولهای تشکیل‌دهنده کلنی اریتروئید(erythroid colony-forming cells) را در سلولهای بنیادی خونساز جدا شده از خون محیطی، دچار تاخیر می‌کنند(20). هم چنین مشخص شد به دنبال استفاده از تیازولیدازون‌ها در بیماران دیابتی، هموگلوبین و هماتوکریت در آن‌ها کاهش پیدا می‌کند(30). در سال‌های اخیر نیز مشتقات سنتتیک جدیدتر و گلیتازون که اثرات آنتی پرولیفراتیو خوب و اثرات توکسیک کمتری دارند، به منظور درمان استفاده می‌شوند(28). علاوه بر تروگلیتازون لیگاندهای طبیعی PPARγ مثل dPGJ2 15، تکثیر سلولی ECFCs را سرکوب می‌کنند که بیانگر اثرات ضد تکثیری با واسطه PPARγ است(20). تاکنون در مورد اثرات آگونیست‌های مختلفPPARγ در سل لاین‌های سرطانی و نیز اریتروپوئز، مطالعه‌های زیادی انجام شده است ولی برای اولین بار است که اثر بایکالین بر اریتروپوئز نرمال بررسی و اثر سرکوب‌کننده آن اثبات میشود. اثر ضد سرطانی بایکالین و نیز بایکالئین توسط مطالعه‌های بسیاری اثبات شده است(34-31، 24، 11، 6). پس از شکست نیمه گلیکوزید در محیط زنده، بایکالین تبدیل به بایکالئین میشود. بایکالین سبب توقف در فاز G1 چرخه سلولی و آپوپتوز سلولهای سرطانی پروستات میشود(11). در سلولهای هپاتومای انسانی، بایکالین سبب القای آپوپتوز و مهار تکثیر می‌گردد(10). هم چنین بایکالین و بایکالئین دارای اثرات بالقوه آنتی‌آنژیوژنز می‌باشند(33). اثرات ضد تکثیری بایکالین بر سل لاین‌های سرطانی مختلف توسط دانشمندان مختلف گزارش شده و در مطالعه‌ها تاکید شده که اثرات مهار رشد فلاونوئیدها از جمله بایکالین در بین سلولهای سرطانی انسانی و نه در سلولهای دیپلوئید نرمال مشاهده شده است(1). با این حال در مطالعه هیم‌جی و همکاران در سال 2007 ، نشان داده شد که علاوه بر اثرات توکسیک و سمی بر سلولهای سرطانی، بایکالین اثر توکسیک کمی بر سلولهای نرمال دارد(35). تعدادی از مطالعه‌ها نشان می‌دهند که لیگاندهای PPARγ ، رشد سلول‌ها را در سل لاین‌های لوسمیک و لنفوما از طریق القای آپوپتوز سرکوب می‌کنند(37، 36، 19). با این حال مطالعه ناواگاسا و همکارانش نشان داد که لیگاندهای PPARγ ، تکثیر سلولهای پیش‌ساز اریتروئیدی را بدون کاهش قابلیت حیات و افزایش آپوپتوز، سرکوب می‌نمایند(20).
نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که کاهش چشمگیر درصد سلولهای بیان‌کننده رسپتورهای سطحی در غلظت µM 50 بایکالین و µM 3 تروگلیتازون مشاهده شد. کاهش میانگین درصد سلولهای بیان‌کننده مارکرهای اریتروئیدی GPA و TfR در روز هفتم نشان می‌دهد تعداد سلولهای بیان‌کننده این مارکرها به طور معناداری به شیوه وابسته به دوز کاهش پیدا کرده که خود نمایانگر تاخیر بلوغ اریتروئیدی سلولهای پیش‌ساز میباشد. درصد بیان TfR همانند بیان GPA در غلظت 10 میکرومول بایکالین، مشابه نمونه کنترل میباشد که نشان می‌دهد این غلظت تاثیری بر روند تمایز HSC و قابلیت حیات آن ندارد. در مقایسه، در تیمار با تروگلیتازون به عنوان فعال‌کننده PPARγ در روز هفتم، میانگین درصد بیان مارکر اریتروئیدی GPA در غلظت 1/0 و 1 میکرومول به ترتیب 3 ± 49% و 5 ± 32% و مارکر CD71 به ترتیب 4 ± 68% و 2 ± 45% بوده و هیچ سلول زنده‌ای در روز هفتم در غلظت 3 و 10 تروگلیتازون باقی نماند.
در این مطالعه مشاهده شد که میزان سلولهای زنده پس از افزودن بایکالین به تدریج کاهش می‌یابد و تعداد این سلول‌ها در موارد افزودن آگونیست تروگلیتازون در مقایسه با بایکالین بیشتر می‌باشند. بنابراین مشاهده میشود همان طور که حساسیت سلولهای سرطانی در برابر عصاره بایکالین متفاوت است، حساسیت سلولهای نرمال مانند HSC در حین تمایز به رده اریتروئیدی نیز متفاوت میباشد(35). تکثیر سلول‌ها در تروگلیتازون به میزان بیشتری در مقایسه با بایکالین مهار میشود و مهار تکثیر با افزایش مقدار این آگونیست‌ها افزایش می‌یابد. هم چنین با مقایسه میزان سلولهای بیان‌کننده مارکرهای سطحی اریتروئیدی GPA و TFR، مشاهده شد که میزان سلولهای بیان‌کننده این مارکرها در سلولهای تیمار شده با بایکالین و نیز تروگلیتازون در مقایسه با کنترل کاهش پیدا کرده است و این کاهش به صورت وابسته به دوز میباشد. نتایج به دست آمده از آزمون سنجش کلنی حاکی از آن است که سلولهای بنیادی CD133+ جدا شده و تکثیر یافته، توانایی مناسب کمی و کیفی برای تمایز به سمت رده‌های مختلف سلولی از جمله رده اریتروئیدی را داشته و از این رو نتایج مربوط به سلولهای بیان‌کننده مارکرهای سطحی مربوط به این سلول‌ها را تایید می‌کند.
نتیجه‌گیری
در مقالات مختلف اثرات ضد باکتریایی، ضد ویروسی، فعالیت ضد التهابی و اثرات ضد توموری بایکالین در زمینه ایمنی ذاتی و نیز به عنوان راه حلی برای درمان تب،
بیماری‌های آلرژیک و التهابی، فعالیت ضد ویروسی، اثر ضد تکثیر بر سل لاین‌های مختلف و اثر بر درمان بیماری‌های نورودژنراتیو گزارش شده است(38، 1). لیکن در تمام این مطالعه‌ها، اثر توکسیک احتمالی این عصاره بر سلولهای نرمال در نظر گرفته نشده است. یافته‌های این تحقیق نشان می‌دهد که بایکالین دارای اثرات قابل ملاحظه وابسته به دوزی بر روند خونسازی اریتروئید است و لذا باید در تجویز و مصرف آن، این اثرات جانبی و هم چنین دوز مورد استفاده آن مورد توجه قرار گیرد. این مساله به ویژه با توجه به منشا گیاهی بایکالین و نیز گزارش‌های متعدد مبتنی براثرات ضد سرطانی آن و احتمال مصرف خودسرانه بایکالین توسط افراد جامعه حایز اهمیت میباشد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
