نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله: هماتولوژي انتشار: 1392/6/2
متن کامل: (2435 مشاهده)
اثر آپوپتوزی ترکیب آرسنیک تری اکسید و آزیدوتیمیدین در سلول‌های رده لوسمی پرومیلوسیتی حاد(NB4) از طریق تغییرات بیان P21 و توزیع سیکل سلولی
سعید حسنی1، فرهاد ذاکر2، علی ذکری3، اعظم زغل4، کامران علی مقدم5، اردشیر قوام‌زاده5، سید حمیداله غفاری6
چکیده سابقه و هدف داروی آرسنیک تری‌اکسید(ATO) که در درمان لوسمی پرومیلوسیتی حاد(APL) استفاده می‌شود، دارای عوارض جانبی شدیدی می‌باشد. به منظور افزایش اثرات ضد سرطانی و استفاده از دوزهای پایین‌تر ATO، اثر ترکیب آن با داروی آزیدوتیمیدین(AZT) در القای آپوپتوز روی سلول‌های NB4 (رده APL) مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش‌ها در یـک مطالعـه تجربـی، بعـد از کشـت و تیمار سلول‌ها به مدت 48 ساعت با غلظت‌های μM AZT 50 ، µM ATO 1 و ترکیب آن‌ها، آپوپتوز و توزیع سیکل سلولی با فلوسیتومتری و میزان mRNA ژن P21 با Real Time PCR در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده مورد بررسی قرار گرفتند. یافته‌ها ATO به همراه افزایش توقف در مرحله G2/M ، منجر به افزایش آپوپتوز(12/7 ± 14/50%) در مقایسه با کنترل(97/2 ± 9/3%) شده است. میزان آپوپتوز در سلول‌های تیمار شده با ترکیب AZT و ATO (65/4 ± 35/24%) در مقایسه با ATO تنها، همراه با کاهش نسبی سلول‌های موجود در مرحله G2/M و افزایش نسبی سلول‌های موجود در مرحله G1 مهار گشته است. ATO (14/0 ± 27/0) نسبت به کنترل(1/0 ± 1) بر روی بیان ژن P21 اثر مهاری داشته ولی AZT (21/0 ± 81/1) و ترکیب AZT/ATO (32/0 ± 06/2) موجب افزایش آن شده‌اند. نتیجه گیری AZT ، اثر آپوپتوزی ATO رااحتمالاً از طریق القای بیان P21 ، گریز سلول از توقف در مرحله G2/M و افزایش توقف در مرحله G1 مهار میکند. کلمات کلیدی:لوسمی پرومیلوسیتی حاد، آرسنیک تری اکسید، آزیدوتیمیدین، آپوپتوز
تاریخ دریافت : 10/3/91 تاریخ پذیرش : 16/7/91
1- دانشجوی کارشناسی ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 2- PhD هماتولوژی ـ دانشیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 3- دانشجوی دکترای ژنتیک پزشکی ـ دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 4- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی بیمارستان شریعتی و دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 5- فوق تخصص خون و انکولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی بیمارستان شریعتی و دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 6- مؤلف مسؤول: PhD ژنتیـک مولکولی ـ دانشیار مرکز تحقیقات خـون، انکولوژی و پیونـد سلول‌های بنیادی بیمارستان شریعتی و دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران ـ کارگر شمالی ـ کدپستی: 14111
مقدمه لوسمی پرومیلوسیتی حاد (APL) که بر اساس تقسیم‌بندی گروه FAB(French-American-British) به عنوان AML-M3 توصیف می‌شود، از لحاظ سیتوژنتیک دارای(15;17) t بوده که محصول آن فیوژن پروتئین PML/RARα می‌باشد. اگر چه درمان این بیماری با ATRA موفقیت‌آمیز می‌باشد اما در بعضی موارد عود مجدد و مقاومت مشاهده می‌شود که در این موارد از ATO استفاده می‌گردد، البته از ATOدر درمان بیماران تازه تشخیص داده شده نیز استفاده می‌شود(2، 1). ATO حداقل از طریق دو مکانیسم فعالیت ضد لوکمیک خود را انجام می‌دهد: اول، تخریب PML/RARα و در نتیجه القای تمایز نسبی در پرومیلوسیت‌های غیر طبیعی، که به نظر می‌رسد همین مکانیسم مسؤول اثرات درمانی اختصاصی ATO علیه APL نیز باشد(3). دوم، القای آپوپتوز در سلول‌های APL از طریق مکانیسم‌هایی مثل؛ توقف چرخه سلولی در مرحـله میتوز و آپوپتوز نـاشی از توقف میتوزی(MAAA)، از دست رفتن پتانسیل غشای میتوکندری و رهاسازی سیتوکروم C در سیتوزول، افزایش فسفواستیلاسیون هیستون H3 در کروماتین کاسپاز-10، فعال‌سازی سیستم CD95/CD95L ، کاهش pH داخل سلولی از طریق تسهیل فعالیت تعویض‌کننده آنیون 2، افزایش بیان گروهی از ژن‌های مسؤول القای گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، آسیب اکسیداتیو DNA سلولی، مهار ژن‌های hTERT ، c17 و c-MYC به وسیله اکسیداسیون Sp1 توسط ROS ، کاهش فعالیت NF-κB و تغییر بیان ژن‌های پرو و آنتی‌آپوپتوزی در راستای القای آپوپتوز(10-4، 1). ATO در دوزهای پایین به تنهایی نمی‌تواند موجب آپوپتوز شود و برای حذف سلول‌های توموری با آن دوزهای بالا مورد نیاز است، اما دوز بالا موجب عوارض جانبی بر روی بیماران APL از قبیل هیپرلوکوسیتوز، سندرم تمایز APL ، افزایش ترانس آمیناز کبد، مشکلات تنفسی، اختلالات سیستم عصبی، اختلالات پوستی و مشکلات معدی روده‌ای می‌شود(11). به منظور کاهش دوز ATO و دسترسی به افزایش اثرات شیمی درمانی، روش‌های درمانی به صورت استفاده ترکیبی از داروهایی که مکانیسم مشابه‌ای را برای جلوگیری از تکثیر و یا از بین بردن سلول‌های سرطانی دارند باید طراحی شود که از یک طرف موجب افزایش تاثیر درمان و از طرف دیگر موجب کاهش اثرات ناخواسته گردند. اثر سینرژیک بین ویتامین C و ATO، افزایش حساسیت به ATO در اثر بوتیونین سولفوکسیمین(Buthionine sulfoximine) به خاطر تهی شدن سلول از گلوتاتیون، تشدید آپوپتوز ناشی از ATO از طریق تقویت استرس اکسیداتیو با استفاده از ترولوکس (Trolox) و ایجاد تغییر در تلومر با دی‌اتیل‌اکسادی کربوکسانین(Diethyloxadicarbocyanine) مثال‌هایی از تقویت اثرات ATO در ترکیب با دیگر عوامل در in vitro روی سلول‌های سرطانی مختلف می‌باشند(15-12). AZT یک آنالوگ تیمیدین است که هم اکنون برای درمان HIV مورد استفاده قرار می‌گیرد. نشان داده شده است که این دارو دارای خواص ضد سرطانی متعددی نیز می‌باشد. برای مثال، AZT با داخل شدن در DNA می‌تواند منجر به سمیت بیشتری در سلول‌های سرطانی نسبت به سلول‌های طبیعی گردد. چرا که سلول‌های سرطانی دارای تکثیر بالاتر و در نتیجه باز گردش بیشتری در تیمیدین می‌باشند. AZT رشد چهار رده سلولی سرطان پستان و یک رده سلولی پستان طبیعی را در خارج از بدن مهار میکند، اما دسترسی به این اثر روی سلول‌های طبیعی نیاز به غلظت‌های بالاتری دارد(16). هم‌چنین AZT در رده‌های سلولی ملانوما موجب مهار رشد سلول و القای آپوپتوز می‌شود، بدون این که اثری روی رشد سلول‌های غیر توموری بگذارد(17). مهار تکثیر با واسطه AZT همراه با توقف مشهود سیکل سلولی،القای آپوپتوز و یا هردو است(19، 18). به علاوه، سلول‌های سوماتیک طبیعی دارای فعالیت تلومراز کمی بوده و یا این که این فعالیت در آن‌ها قابل شناسایی نیست. در حالی که اکثر سلول‌های سرطانی تلومراز را بیان می‌کنند. تلومراز، یک آنزیم ترانس کریپتاز معکوس است که نقش مهمی در تکثیر نامحدود سلول‌های سرطانی بازی میکند. AZT دارای اثرات مهاری روی فعالیت این آنزیم می‌باشد(18). وقتـی AZT بـا دیگـر عـوامـل شیمـی درمانـی مثل 5- فلوئورویوراسیل و سیس پلاتین ترکیب شد، فعالیت ضد توموری قوی روی سلول‌های سرطانی در محیط کشت داشته است. این نتایج منجر به استفاده از AZT در ترکیب با دیگر داروهای شیمی درمانی در فازهای I و II مطالعه‌های بالینی در بیماران مبتلا به سرطان متاستاتیک کولورکتال و دیگر بدخیمی‌های پیشرفته شده است(21، 20). چندین مکانیسم ضد سرطانی مشترک بین ATO و AZT وجود دارد که می‌تواند اثر تقویتی درمانی احتمالی را در هنگام استفاده ترکیبی از آن‌ها پیشنهاد کند، این اثرات مشترک شامل؛ متوقف ساختن چرخه سلولی، مهار NF-κB، کاهش میزان پروتئین c-MYC، مهار فعالیت تلومراز، کاهش میزان پروتئین آنتی‌آپوپتوزی BCL2و افزایش پروتئین آپوپتوزی کاسپاز 3 می‌باشند(25-22، 18، 10، 9، 4، 1). هدف از این مطالعه؛ ارزیابی اثرات ترکیب AZT/ATO در مقایسه با ATO، بر روی پیشرویچرخه سلولی و القای آپوپتوز سلول‌های رده پرومیلوسیتی حاد (NB4) بوده است تا در صورت دارا بودن اثر تقویتی معنادار روی القای آپوپتوز، بتوان در آینده از ترکیب این دو دارو در درمان APL بهره‌مند شد.
مواد و روش‌ها کشت سلول و تیمار با دارو: مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. رده سلولی APL(NB4) با t (15; 17) از انستیتو پاستور (تهران، ایران) تهیه شد. سپس بیان PML/RARα در آن با RT-PCR تایید شد. سلول‌ها در ابتدا به تعداد 105 * 5 در هر میلی‌لیتر محیط 1640 RPMI (جیبکو) دارای 10% FBS (جیبکو)، U/mL100 پنی‌سیلین و mg/mL 100 استرپتومایسین (بایوسرا - انگلستان) در انکوباتور مرطوب دارای 37 درجه سانتی‌گراد و 5%دی اکسید کربن کشت داده شدند. برای حذف اثرات احتمالی افزایش تعداد سلول بر روی رشد و بقای سلول، سلول‌ها به تعداد کمتر از 106 * 5/1 حفظ می‌شدند. سپس سلول‌ها به مدت 48 ساعت با 50 ماکرومولار AZT (سیگما) و 1 ماکرومولار ATO (سینا دارو) و ترکیب آن‌ها تیمار شدند، از سلول‌های تیمار نشده نیز به عنوان کنترل استفاده شد. در ایـن مـطالعـه دوز هـر دو دارو بــر اسـاس غلظـت‌هــای فارماکولوژیک آن‌ها در پلاسما انتخاب شدند(27، 26).
بررسی کمی آپوپتوز با استفاده از فلوسیتومتری: آپوپتوز با استفاده از Hoechst 33342 و Propidium iodide (اینویتروژن) از طریق فلوسیتومتری، طی مراحل زیر مورد ارزیابی قرار گرفت. ابتدا سلول‌ها با PBS سرد شسته شدند، سپس تعداد آن‌ها در حدود 106 * 1 سلول در هر میلی‌لیتر تنظیم شد. در مرحله بعد، 1 ماکرولیتر از محلول Hoechst (دارای غلظت mg 5 در هر میلی‌لیتر آب) و 1 ماکرولیتر از محلول PI (دارای غلظت mg 1 در هر میلی‌لیتر آب) به هر میلی‌لیتر از سلول‌ها اضافه شد. بعد از 20 دقیقه انکوباسیون روی یخ، سلول‌ها به سرعت با فلوسیتومتری(آلمان، Partec PasIII) به ترتیب با انگیزش/ تشعشع ~ 461/350 و ~ 617/535 نانومتر برای Hoechst و PI ، ارزیابی شدند. در نهایت دادهها با نرم‌افزار FlowMax تجزیه و تحلیل شدند.
ارزیابی چرخه سلولی: برای بررسی توزیع چرخه سلولی، سلول‌ها بعد از شستشو با PBS با اتانول 70% فیکس شدند. در مرحله بعد این سلول‌ها با PI (µg/mL 20) و RNAase A رنگ‌آمیزی و به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند. در نهایت با فلوسیتومتری توزیع چرخه سلولی مورد ارزیابی قرار گرفت.
ارزیابی کمی بیان ژن P21 با RQ-PCR : بعد از استخراج RNA سلول‌ها(رُوش ، High pure RNA isolation kit)، مقدار RNA نمونه‌ها از طریق اسپکتروفتومتری (آمریکا ، 1000 Nanodrop ND -) اندازه‌گیری شد. برای ساخت cDNA ، 1 ماکروگرم از RNA به طور معکوس رونویسی گشت(تاکارابیو، Prime Script RT reagent kit). برای انجام RT-PCR از دستگاه light cycler (آلمان، رُوش) و تکنولوژی SYBR Premix Ex Taq (تاکارابیو) استفاده شد. 10 ماکرولیتـر سایبرگرین،
جدول 1: توالی آغازگرهای ژن مورد هدف(P21) و ژن مرجع(HPRT)
شاخص ژنی
آغازگر
سکانس('3 تا '5)
CCTGTCACTGTCTTGTACCCT
جلوبرنده
P21
GCGTTTGGAGTGGTAGAAATCT
معکوس
P21
TGGACAGGACTGAACGTCTTG
جلوبرنده
HPRT
CCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTA
معکوس
HPRT
2 ماکرولیتر cDNA ، 5/0 ماکرولیتر از آغازگرهای جلـوبـرنـده و معـکــوس ( pmol 10) و 7 مـاکـرولیــتـر آب فاقد نوکلئاز(آلمان، کیاژن) با هم در یک لوله کاپیلاری (رُوش) برای اجرای PCR در واکنشی به حجم 20 ماکرولیتر مخلوط شدند. سپس PCR در مراحل زیر انجام شد: 30 ثانیه انکوباسیون در 95 درجه سانتی‌گراد به عنوان فعال‌سازی اولیه و سپس 40 سیکل که هر سیکل شامل یک مرحله واسرشت به مدت 5 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد و یک مرحله ترکیب شده آنیلینگ/اکستنشن به مدت 20 ثانیه در 60 درجه سانتی‌گراد بود. از هایپوگزانتین فسفوریبوزیل ترانسفراز 1 (HPRT1) به عنوان ژن مرجع استفادهشده است(جدول 1).
آنالیز آماری: به منظور نشان دادن معنادار بودن دادهها از لحاظ آماری، روش student's t test (Microsoft Excel) مورد استفاده قرار گرفت.
یافته‌ها نتایج بررسی آپوپتوز با فلوسیتومتری: فلوسیتومتری با استفاده از دو رنگ Hoechst 33342 و PI ، آزمایشی آسان و سریع را برای ارزیابی آپوپتوز بر پایه میزان فلورسانس حالت جمع شده هسته سلول‌های آپوپتوزی فراهم میکند. این آزمایش نشان داد که ATO در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده(کنترل) موجب افزایش چشمگیر آپوپتوز می‌شود، اما در ترکیب با AZT میزان آپوپتوز به آن شدت نبوده و کمتر از آپوپتوز ناشی از ATO تنها می‌باشد(جدول 2). به این صورت که سلول‌های تیمار شده با ATO در غلظت 1 ماکرو مولار تا 1/50% آپوپتوز داشتند، اما میزان آپوپتوز ناشی از 50 ماکرو مولار AZT به تنهایی و در ترکیب با 1 ماکرو مولار ATO به ترتیب 9/19% و 4/24% بوده است. در سلول‌های تیمار نشده نیز 9/3% آپوپتوز مشاهده می‌شد(شکل 1).
جدول 2: میانگین و انحراف معیار میزان آپوپتوز حاصل از سه آزمایش جداگانه در سلول‌های NB4 تیمار نشده(کنترل) و تیمار شده با ATO و یا AZT
غلظت داروها
میانگین میزان آپوپتوز(%) ± انحراف معیار
p value
سلول‌های تیمار نشده (کنترل)
97/2 ± 9/3
µM ATO 1
12/7 ± 14/50
014/0
µM AZT 50
11/5 ± 89/19
062/0
µM 1 + 50 ATO + AZT
65/4 ± 35/24
034/0
نتایج بررسی چرخه سلولی: برای ارزیابی اثر AZT و ATO روی پیشروی چرخه سلولی از روش فلوسیتومتری با رنگ پروپیدیوم یداید استفاده شد. در سلول‌های تیمار شده با غلظت یک ماکرو مولار ATO (در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده)، کاهش چشمگیری در درصد سلول‌های موجود در فاز G1 مشاهده شد. اما AZT در غلظت 50 ماکرومولار بر عکس ATO موجب افزایش درصد سلول‌های موجود در فاز G1 گشته و در ترکیب با ATO نیز موجب جلوگیری از القای کاهش شدید درصد سلول‌های موجود در فاز G1 ناشی از ATO شده است. بـه طـور هـم‌زمـان، با کاهش درصد سلول‌های موجود در فاز G1 ، ATO به شدت موجب افزایش درصـد
FL2: Propodium Iodide FL6: Hoechest 33342 شکل1: AZT آپوپتوز القا شده توسط ATO در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتی حاد را مهار میکند. Q3 و Q4 به ترتیب نشان‌دهنده سلول‌های نرمال و پیش آپوپتوزی می‌باشند. رنگHoechst 33342 کروماتین متراکم شده سلول‌های آپوپتوزی را بیشتر از کروماتین سلول‌های نرمال رنگ میکند. Q1 و Q2 نشان‌دهنده سلول‌های مرده می‌باشند که به رنگ پروپیدیوم یداید اجازه ورود داده‌اند این رنگ تنها وارد سلول‌های مرده می‌شود و در آن جا می‌ماند.
شکل 2: بررسی توزیع چرخه سلولی به وسیله فلوسیتومتری: منحنی‌ها نشان‌دهنده توزیع چرخه سلولی در سلول‌های NB4 می‌باشند که با دوز 50 ماکرو مولار AZT و دوز 1ماکرومولار ATO به تنهایی و ترکیب این دو دارو با هم به مدت 48 ساعت تیمار شده‌اند. از سلول‌های تیمار نشده به عنوان کنترل استفاده شده است. محور افقی(FL3 ، رنگ PI) نشان‌دهنده محتوای نسبی DNA بوده و محور عمودی نشان‌دهنده تعداد سلول می‌باشد.همان طور که در شکل نشان داده شده نسبت‌های مشخصی از سلول‌ها در فازهای مجزایی از چرخه سلولی شامل G1 ، S و G2/M قرار دارند.
نمودار 2: درصد سلول‌های موجود در فازهای مختلف سیکل سلولی(درصد سلول‌های مرده(Sub G1) نشان داده نشده است). مقادیـر، حاصـل از ±SD میانگیـن دو آزمایش جداگانه می‌باشند. معنادار بودن دادهها از لحاظ آماری در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده(کنترل) بـه صورت 05/0 p<* و 01/0 p<** نشان داده شده است.
سلول‌های موجود در فاز G2/M چرخه سلولی شده است. AZT نیز اگر چه در غلظت 50 ماکرومولار موجب افزایش درصد سلول‌ها در فاز G2/M شده(در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده) ولی در ترکیب با ATO در مقایسه با ATO تنها، از شدت افزایش درصد سلول‌های موجود در فاز G2/M کاسته است. این دو دارو هم‌چنین موجب تغییر درصد سلول‌های موجود در فاز S نیز شده‌اند، ATO و AZT هر دو موجب کاهش سلول‌های موجود در فاز S چرخه سلولی می‌شوند. ولی در ترکیب 1/50 ماکرومولار AZT/ATO، این کاهش درصد در مقایسه با ATO تنها از میزانش کاسته شده است(شکل 2 و نمودار 1). این دادهها به وضـوح نشـان مـی‌دهد کـه AZT در القـای کاهـش درصـد سلول‌های موجود در فاز G1 و S و برعکس القای افزایش درصد سلول‌های موجود در فاز G2/M توسط ATO مداخله کرده و از شدت اثراتش می‌کاهد.
نتایج بررسی میزان mRNA ژن P21 با qRT-PCR : ژن p21 دارای نقـش‌هـای شناختــه شـده‌ای در تنظیـم چرخـه سلولـی وآپوپتـوز مـی‌باشـد(28).پـس از تجزیه و تحلیـل مقادیـر ct های خـوانـده شـده تـوسـط دستگـاه
جدول 2: میزان نسبی mRNA ژن p21 با استفاده از qRT-PCR در سلول‌های NB4 تیمار شده در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده، بعد از نرمالایز کردن ctهای ژن هدف با ژن مرجع (hprt) اندازه‌گیری شد. مقادیر به صورت ± SD میانگیـن دو آزمایش جداگانه می‌باشند.
غلظت داروها
میانگین میزان آپوپتوز(%) ± انحراف معیار
p value
سلول‌های تیمار نشده (کنترل)
1/0 ± 1
µM ATO 1
14/0 ± 27/0
027/0
µM AZT 50
21/0 ± 81/1
039/0
ATO + µM AZT 1 + 50
32/0 ± 06/2
046/0
Light cycler ، مشخـص شـد کـــه ATOدر غلظــت 1 ماکرومولار موجب سرکوب رونویسی از ژن P21 نسبت به سلول‌های کنترل گشته است. این در حالی است که AZT در غلظت 50 ماکرومولار به تنهایی و هم چنین در ترکیب با غلظت 1 ماکرومولار ATO ، موجب افزایش رونویسی از ژن P21 شده است. بحث با توجه به مکانیسم‌های مشابه‌ای که AZT و ATO روی سلول‌های سرطانی دارند مثل اثرات ضد تکثیری ناشی از متوقف کردن چرخه سلولی و القای آپوپتوز، این احتمال وجود داشت که استفاده از AZT به همراه ATO باعث تقویت اثر ATO در القای آپوپتوز سلول‌هایAPL شود، تا در مرحله بعد بتوان از آن به عنوان داروی کمکی به همراه ATO استفاده کرد(18، 1). ولی به طور شگفت‌آوری AZT نه تنها باعث افزایش اثر آپوپتوزی ATO روی سلول‌های NB4 نشده، بلکه حتی اثر آن را مهار کرده است. به منظور یافتن دلیل این یافته، تاثیر AZT و ATO بر روی توزیع چرخه سلولی مورد بررسی قرار گرفت. یکی از مکانیسم‌هایی که ATO به وسیله آن موجب مرگ سلول می‌شود، نوعی فاجعه میتوزی (mitotic catastrophe)است، یعنی ATO با ایجاد توقف چرخه سلولی در مرحـله میتوز و آپوپتوز نـاشی از توقف میتوزی(MAAA ، mitotic arrest-associated apoptosis) موجب مرگ سلول می شود(29، 4). از آن جا که AZT یک آنالوگ نوکلئوتیدی است و می‌تواند با وارد شدن به داخل DNA موجب اختلال در روند طبیعی چرخه سلولی شود، انتظار می‌رفت که در ترکیب با ATO از طریق ایجاد تغییر در توزیع چرخه سلولی در مقایسه با ATO تنها، با کاهش تعداد سلول‌های موجود در فاز G2/M چرخه سلولی، از میزان آپوپتوز ناشی از توقف میتوزی و فاجعه میتوزی ناشی از ATO بکاهد(30، 19، 18). بررسی چرخه سلولی نیز نشان داد که اگر چه ATO تنها، از یک سو موجب افزایش تعداد سلول‌های موجود در فاز G2/M و از سویی دیگر موجب کاهش تعداد سلول‌های موجود در فاز G1 و S شده، ولی ترکیب AZT/ATO در مقایسه با آن به طور نسبی از تعداد سلول‌های متوقف شده در G2/M کاسته و بر عکس به تعداد سلول‌های موجود در G1 افزوده است. این مشاهده می‌تواند با کاهش نسبی آپوپتوز در سلول‌هایی که با AZT/ATO تیمار شده‌اند نسبت به سلول‌هایی که فقـط بـا ATO تیمار شده‌اند قابل مقایسه باشد. بنابراین این احتمال وجود دارد که AZT وقتی با ATO ترکیب می‌شود، به علت ایجـاد تغییـر در تـوزیع چـرخه سلولی در مقایسه با ATO تنها، به صورت کاهش تعداد سلول‌های موجود در مرحله G2/M چرخه سلولی و در نتیجه فرار سلول از آپوپتوز ناشی از توقف میتوزی و فاجعه میتوزی که از مکانیسم‌های ATO برای القای آپوپتوز می‌باشد، موجب کاهش اثر آپوپتوزی ATO روی سلول‌های NB4 می‌شود. برای یافتن دلیل مولکولی این مشاهده، به بررسی میزان سطح mRNA ،p21 پرداختیم. p21 پروتئینی است که دارای نقش شناخته شده‌ای در کنترل سیکل سلولی از طریق اتصال و تشکیل کمپلکس با G1/S-cdk (cyclin E/cdk2) و S-cdk (cyclin A/cdk2) و در نتیجه مهار فعالیت آن‌ها و توقف پیشرفت سیکل سلولی در مرحله G1 است(28). هم‌چنین نشان داده شده که القای بیان این پروتئین موجب گریز از القای توقف در مرحله میتوز در اثر ATO ، آپوپتوز ناشی از توقف میتوزی و فاجعه میتوزی می‌شود. p21 عمل فرار از توقف میتوزی و القای بقای سلول را به وسیله مهار cyclin B/CDC2 (cdk1) از طریق اتصال مستقیم و یا مهار فسفریلاسیون ترئونین 161 که برای فعالیت B/CDC2 لازم است، انجام می‌دهد(4). p21 هم چنین از طریق اتصال به توالی پروموتور و فاکتورهای متصل شونده به پروموتور CDC2(cdk1) نیز موجب مهار رونویسی از آن می‌شود(31). برای پیشرفت چرخه سلولی از مرحله G2 به M ، کمپلکس(cdk1)cyclin B/CDC2 باید فعال شود، ولی از طرف دیگر برای خروج از متافاز و ورود به آنافاز و در نهایت به پایان رساندن میتوز و شروع سیکلی دوباره، لازم است که این کمپلکس غیر فعال شود(31). ATO از طریق آسیب به DNA و میکروتوبول‌ها و همین طور افزایش میزان cyclin B/CDC2 به وسیله ممانعت از تخریب شدن آن، موجب ورود زود هنگام به میتوز و عدم خروج از آن و در نتیجه توقف در مرحله میتوز و در نهایت آپوپتوز ناشی از توقف میتوزی و فاجعه میتوزی می‌شود(32، 4). بررسی میزان mRNA ژن p21 نشان داد که هم AZT تنهـا در غلظت 50 ماکرومولار و هم ترکیب آن با ATO در غلظت 1 ماکرومولار، موجب افزایش معنادار میزان mRNA این ژن در مقایسه با سلول های تیمار نشده(کنترل) می‌شود، ولی برعکس در سلول‌هایی که تنها با ATO تیمار شده‌اند در مقایسه با کنترل، میزان mRNA این پروتئین سرکوب می‌شود. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت که ممکن است p21 در سلول‌های تیمار شده با ترکیب AZT/ATO ، مسؤول کاهش نسبی سلول‌های موجود در مرحله G2/M و در نتیجه کاهش نسبی آپوپتوز ناشی از توقف میتوزی القا شده توسط ATO و همین طور افزایش نسبی سلول‌های موجود در مرحله G1 در مقایسه با سلول‌های تیمار شده با ATO تنها، باشد. در مطالعه‌های بسیاری مطابق با نتایج ما نشان داده شده که p21 با توانایی که در مهار چرخه سلولی در نقطه کنترلی واقع در انتهای G1 دارد، به ویژه در هنگام روبه رویی با آزارهای ژنوتوکسیکی یا عوامل ناپایدارکننده میکروتوبول، می‌تواند سلول‌ها را از آپوپتوز محافظت کند زیرا یک چرخه سلولی فعال برای حس کردن این عوامل و آغاز آپوپتوز نیاز است(35-33، 28). سطوح افزایش یافته پروتئین p21 در سرطان‌های انسانی مختلفی از جمله پروستات، رحم، پستان، کارسینومای سلول‌های سنگفرشی(SCC)، مولتیپل میلوما(MM) و لوسمی میلوئیدی حاد(AML) مشاهده می‌شود و این افزایش بیان با درجه تومور و میزان تهاجم رابطه مثبت داشته و نشان‌دهنده یک پیش آگهی بد می‌باشد و میزان پاسخ‌دهی به شیمی درمانی و رادیوتراپی را متاثر می‌سازد(36). ATO ممکن است درمان مفیدی برای سرطان‌های دیگر نیز باشد. در in vitro نشان داده شده که ATO در رده‌های لوسمی مثل AML و مولتیپل میلوما نیز آپوپتوز را القا میکند. ATO در رده‌های مشتق از تومورهای توپر (solid tumor) مانند نوروبلاستوما، هپاتو سلولار کارسینوما و هم‌چنین در سلول‌های سرطانی کولون، معده، پانکراس، پروستات و تخمدان نیز در محیط خارج از بدن، آپوپتوز را القا میکند. اما این سلول‌ها نسبت به دوزهای شیمی درمانی حساسیت کمتری نشان می‌دهند و به دوزهای بیشتری از ATO برای القای آپوپتوز در آن‌ها
نیاز است. دوزهای بالای ATO به دلیل اثرات سمی بر روی بدن، استفاده از آن را در این بیماران محدود میکند(4). با توجه به نتایج مطالعه حاضر و همین طور مطالعه تیلور و همکارانش در سال 2006 ، یکی از مکانیسم‌های مقاومت سلول‌های سرطانی در برابر ATO ، می‌تواند افزایش بیان p21 باشد. p21 می‌تواند با ایجاد تغییر در اثر ATO بر روی چرخه سلولی و در نتیجه مهار آپوپتوز ناشی از توقف میتوزی، و هم چنین احتمالاً از طریق مکانیسم‌های آنتی‌آپوپتوزی دیگری همانند مهار پروتئین‌های مؤثر در آپوپتوز و افزایش بیان ژن‌های دارای فعالیت آنتی‌آپوپتوزی، از القای مرگ سلولی توسط ATO بکاهد(28). بنابراین می‌توان از یک مهارکننده اختصاصی پروتئین p21 به همراه ATO در درمان بدخیمی‌هایی که دارای بیان بالایی از p21 و هم چنین حساسیت پایینی به آپوپتوز در اثر دوزهای شیمی درمانی این دارو هستند، استفاده کرد و اثر آن‌ها را در القای آپوپتوز مورد ارزیابی قرار داد.
نتیجه‌گیری نتایج این مطالعه نشان داد که AZT اثر آپوپتوزی ATO رااحتمالا از طریق القای بیان p21 و گریز سلول از توقف در مرحله G2/M و افزایش توقف در مرحله G1 مهار میکند.
تشکر و قدردانی ازمدیریتو کارکنانمحترممرکزتحقیقاتخون،آنکولوژیوپیوند سلول‌های بنیادیبیمارستانشریعتیکهدرانجاماین پژوهشمارایاریدادندواجازهکاردراینمرکزرادادند،سپاسگزاریبهعملمیآید.
Hasani S, Zaker F, Zekri A, Zaghal A, Alimoghaddam K, Ghavamzadeh A et al . Apoptotic effect of arsenic trioxide plus Azidothymidine on APL cell line (NB4) through P21 expression and cell cycle distribution changes . Sci J Iran Blood Transfus Organ 2013; 10 (2) :129-139 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-769-fa.html
حسنی سعید، ذاکر فرهاد، ذکری علی، زغل اعظم، علی مقدم کامران، قوام زاده اردشیر و همکاران.. اثر آپوپتوزی ترکیب آرسنیک تری اکسید و آزیدوتیمیدین در سلول‌های رده لوسمی پرومیلوسیتی حاد(NB4) از طریق تغییرات بیان P21 و توزیع سیکل سلولی. فصلنامه پژوهشی خون. 1392; 10 (2) :129-139
