جلد 23، شماره 1 - ( بهار 1405 )
جلد 23 شماره 1 صفحات 44-34 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Ethics code: IR.SBMU.ENDOCRINE.REC.1400.140
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Khabareh M, Salehi M, Sadeghi S. A Practical Protocol for the Isolation and Characterization of Small Extracellular Vesicles Derived from Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells. bloodj 2026; 23 (1) :34-44
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1613-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1613-fa.html
خباره میلاد، صالحی مهسا، صادقی سمیه. دستورالعمل کاربردی جداسازی و مشخصه یابی وزیکولهای خارج سلولی کوچک از سلولهای بنیادی مزانشیمی ژل وارتون بند ناف انسانی. فصلنامه پژوهشی خون. 1405; 23 (1) :34-44
استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 979 kb]
(105 دریافت)
| چکیده (HTML) (149 مشاهده)
مقدمه
امروزه درمان مبتنی بر سلولهای بنیادی مزانشیمی (MSCs : Mesenchymal stem cells) و ترشحـات آنها، بـه ویژه وزیکولهای خارج سلولی(EVs : Extracellular Vesicles)، به عنوان یـک استراتژی نوظهور در پزشکی بازساختی شناخته میشوند. بر اساس بیانیه استاندارد انجمن بینالمللی وزیکولهای خارج سلولی (MISEV : Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)، این وزیکولها بر حسب اندازه به دو دسته کلی EVs بزرگ و EVs کوچک (sEVs یا smal EVs) تقسیم میشونـد. ذرات sEV، وزیکولهایی با منشأ اندوزومی و محدوده اندازه ۴۰ تا ۱۵۰ نانومتر هستند که نقش حیاتی در ارتباطات بین سلولی و انتقال پیامهای بیولوژیـک ایفا میکنند (3-1).
سلولهای بنیادی مزانشیمی یکی از مهمترین منابع جهت استخراج ذرات sEV محسوب میشوند. بر طبق تعریـف انجمن بینالمللی سلول درمانی (ISCT : International Society for Cellular Therapy)، سلولهای MSC، به عنوان سلولهای استرومایی چند توان با ویژگیهای خود تجدید شوندگی، توانایی اتصال به پلاستیک در شرایط کشت استاندارد، ظرفیت تمایز به دودمانهای سلولی متعدد و بیان نشانگرهای سطحی مانند CD105، CD73 و CD90 و عدم بیان مارکرهایی همچون CD34 و CD45 درنظر گرفته میشوند (4). اگر چه این سلولها از بافتهای متنوعی نظیر مغز استخوان، چربی و خون قاعدگی قابل استخراج هستند، اما در سالهای اخیر، بافت بند ناف انسان به دلیل ویژگیهای منحصر به فرد، مورد توجه ویژهای قرار گرفته است (7-5). بند ناف شامل عروق خونی و غلاف آمنیوتیک است که توسط ماده ژلاتینی محافظی به نام ژل وارتون (Wharton’s Jelly) احاطه شدهاند (8). سلولهای بنیادی مشتق از ژل وارتون، به دلیل دسترسی آسان، روش جداسازی غیر تهاجمی، عدم وجود چالشهای اخلاقی، خاصیت هتروژنیسیته محدودتر و توان تکثیر بالا، منبعی ایدهآل برای استخراج ذرات sEV در مقیاس صنعتی و بالینی به شمار میروند (10، 9).
کاربرد درمانی sEVs به دلیل توانایی آنها در انتقال اطلاعات بیولوژیـک سلولهای والد، پایداری بالا در برابر تخریب دارویی، سمیت ناچیز و قابلیت فرار از سیستم رتیکولوآنـدوتلیال، افقهای جدیدی را در درمان بیماریهای مختــلف گشوده است (10، 9). با این حـال، دستیابـی بـه
دستورالعملهـای دقیـق جهـت جداسـازی بـا کیفیــت بالا
همچنان یـک چالش کلیدی است. لذا در این مطالعه، با هدف ارتقای دقت در فرآیندهای آزمایشگاهی، دستورالعمل کاربردی، ساده و مقرون به صرفه برای استخراج سلولهای WJ-MSC به روش مهاجرت سلول از قطعه بافتی (Explant) و متعاقب آن، جداسازی sEVs از سوپ رویی این سلولها با استفاده از کیتهای تجاری بر پایه سانتریفیوژ شیب چگالی پیادهسازی گردید. این روش برخلاف روشهای آنزیمی، آسیب کمتری به سلولها وارد کرده و منجر به تولید جمعیتهای سلولی با خلوص و توان تمایزی بالا میشود. در نهایت، ویژگیهای فیزیکوشیمیایی، غلظت پروتئینی و ساختار مورفولوژیک وزیکولهای حاصله جهت ارزیابی کارآمدی روش، مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
فاز اول: استخراج sEVs
نمونههای بند ناف از نوزادان تازه متولد شده، از پژوهشگاه رویان تهران، تهیه و تحت شرایط استریل درون نرمال سالین به آزمایشگاه منتقل شدند و تمام آزمایشهای شرح داده شده در ادامه، در شرایط استریل و زیر هود لامینار انجـام شد. در این مطالعه از 2 نمونه بافت ژل وارتون بند ناف انسانی مجزا با روش Explant (قطعات بـافتی به طول تقریبی 5 میلیلیتر) جهت استخراج سلولهای MSC استفاده گردید. بدین صورت که، نمونه بند ناف با PBS حاوی پنیسیلین و استرپتومایسین به منظور از بین بردن آلودگیهای باکتریایی شستشو داده شد. سپس رگهای خونی، شامل یک سیاهرگ بزرگ و دو سرخرگ کوچک، جـداسازی شده و ﺑﺎﻓﺖ ژل وارﺗﻮن با قیچی به قطعات کوچکتر (5 میلیمتر) تقسیم گردید. سپس بـا شستن مکرر با PBS ، باقیماندههای خون پـاک و قطعات کوچک بافتی (تعداد 5 الی6 قطعه) به ﻓﻼسک 25 سانتیمتری انتقال داده شد و ﺑﻪ ﻣﺪت 5 دﻗﯿﻘﻪ در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید تا ﺑﯿﺸﺘﺮیﻦ ﻣﯿﺰان چسبندگی ﺑﯿﻦ ﻗﻄﻌﺎت بافتی و کف ﻓﻼسک ﻓﺮاﻫﻢ شود. جهت دستیابی به میزان حداکثر سلول آزاد شده از قطعات بافتـی، عدم جابهجایی تکههای بافتی در پلیت یا فلاسک کشت نقش مهمی در خروج سلولها از قطعات بافتی دارد، لذا توصیه میشود قبل از اضافه کردن محیط کشت به فلاسک کشت سلولی، ابتدا قطعات بافتی ﺑﻪ ﻣﺪت 3 الی 5 دﻗﯿﻘﻪ در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردد تـا ﺑﯿﺸﺘﺮیﻦ ﻣﯿﺰان چسبندگی ﺑﯿﻦ ﻗﻄﻌﺎت بافتی و کف ﻓﻼسک
ایجاد شود (11).
سپس، ﺑﻪ ﻫﺮ ﻓﻼسک محیط کشت DMEM-F12 به همراه 10 درصد FBS ، اﺿﺎﻓﻪ گردید. ﻓﻼسکﻫﺎ ﺑﻪ ﻣﺪت 72 ﺳﺎﻋﺖ در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد، 5% CO2 انکوبه ﺷﺪ و سپس ﻣﺤﯿﻂ کشت آنﻫﺎ ﺑﺎ دﻗﺖ و ﺑﻪ آرامی ﺗﻌﻮیﺾ ﺷد. در طول زمان انکوباسیون، به تدریج سلولهای بنیادی مزانشیمی شروع بـه خروج از قطعههای بافتی و انتشار در کف پلیت میکنند و معمولاً 5 الی 7 روز ﺑﻌﺪ از انکوباسیون، ﺳﻠﻮلﻫﺎی کوچک در اﻃﺮاف ﻗﻄﻌﺎت بافت ﻗﺎﺑﻞ رؤیﺖ اﺳﺖ. پس از این که جمعیت سلولهای آزاد شده به تراکم مناسب رسید، ﻗﻄﻌﺎت بافتی از فلاسک کشت برداشته شد و ﺑﻪ ﺳﻠﻮلﻫﺎی آزاد ﺷﺪه اﺟﺎزه رﺷﺪ داده شد ﺗﺎ ﺑﻪ ﺗﺮاکم ﻣﻨﺎﺳﺐ ﺑﺮﺳﻨﺪ. پس از آن که تراکم آنها در محیط کشت به طور تقریبی به 80 درصد رسید، سلولها با استفاده از تریپسین- EDTA استخراج شدند (12).
پتانسیل تمایز سلولهای WJ-MSC :
به منظور رسیدن سلولها به تراکم مناسب (80%) و اطمینان از خلوص و حفظ ویژگیهـای مورفولوژیک (دوکی شکل بودن) سلولهای مزانشیمی، در طی پاساژهای اولیه از سلولهای پاساژ 2 استفاده و پس از رسیدن به تراکم 80 درصد، پتانسیل تمایز سلولهای WJ-MSC به استئوبلاستها و سلولهای چربی مورد بررسی قرار گرفت (4).
بدین صورت که، با توجه به مدت زمان نسبتاً طولانی انکوباسیون سلولها (21 روز) جهت آزمایشهای تمایزی و جهت جلوگیری از ریزش سلولها در اثر تراکم بیش از اندازه سلولی، 10 هزار سلول WJ-MSC در پاساژ 2، به پلیت چهارخـانه منتقل و پس از گذشت 48 ساعت انکوباسیون در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد، 5% CO2 ، محیط کشت موجود در چاهـکها با 1 میلیلیتر محیط تمایز استئوژنیک ]شامل دگزامتازون (100 میلیمولار)، گلیسرول فسفات (10 میلیمولار)، و اسید اسکوربیک (50 میکرومولار) به همراه 10 درصد FBS [ و یـا محیط تمایز آدیپوژنیک ]شامل ایندومتاسین (100 میلیمولار)، 3-ایزوبوتیل- متیل گزانتین (5/0 میلیمولار)، دگزامتازون (250 میلیمولار)، و انسولین (5 میلیمولار) بـه همراه 10 درصد FBS [ جایگزین شد. به مدت 21 روز محیط تمایزی هر 3 روز یک بار تعـویض گردید و پس از 21 روز، تمایز سلولها به بافت استخوان و چربی به ترتیب با رنگآمیزی Alizarin Red و Oil Red O مورد سنجش قرار گرفت (4). رنگآمیزی Alizarin Red برای مشاهده تجمعات ترکیبات معدنی خارج سلولی و تایید تمایز به استخوان، و Oil Red O برای تایید تجمع قطرات لیپیدی (چربی) در داخل سلولهای تمایز یافته انجام شد.
تجزیـه و تحلیل فنوتیپ سلولهای WJ-MSC به کمک فلوسیتومتری:
برای تجزیه و تحلیل نشانگرهای سطحی، سلولهای WJ-MSC در پاساژ دوم (حدود 106×1 سلول) به صورت سوسپانسیون تک سلولی با آنتیبادیهای مونوکلونال علیه CD73، CD45، CD34، CD105 رنـگآمیزی شدند. دادهها با نرمافزار Flowjo 7.6.1 تجزیه و تحلیل شد (4).
تهیه سوپ سلولی WJ-MSC جهت جداسازی ذرات sEV :
ذرات sEV از محیط کشت سلولهای WJ-MSC به دست آمد (13). به طور خلاصه، جهت استخراج sEVs از سوپ سلولی حاصل از سلولهای WJ-MSC در پاساژ دوم با تراکم 80 درصد استفاده شد. هر 2 الی 3 روز، محیط کشت سلولها با FBS کمتری جایگزین شد. بدین صورت که FBS محیط از 15 درصد به صورت تدریجی به 7 ، 5 ، 2 و صفر کاهش یافت تا سلولها با محیط کشت بدون سرم سازگار شوند. در نهایت پس از این که میزان FBS محیط به صفر رسید، مایع رویی حاصل از چند فلاسک کشت سلولی که تحت شرایط یکسان کشت داده شده بودند، جمعآوری و با استفاده از فیلترهای 22/0 میکرومتری فیلتر شد تا بقایای سلولی حذف شود و در نهایت در منفی 70 درجه سانتیگراد ذخیره گردید.
استخراج ذرات sEV مشتق از سلولهای WJ-MSC :
جداسازی MSC-sEV از مایع رویی تهیه شده با استفاده از دستورالعمل کیت Exocib (Cib Biotech Co.) انجـام شد. اساس عملکرد این کیت بر مبنای سانتریفیوژ شیب چگالی است. اساس این کیت ایجاد لایههایی از محلول با چگالی متفاوت است که در آن ذرات sEV بر اساس وزن مخصوص خود در لایه مناسب قرار میگیرند. ابتدا 15 میلیلیتر از مایع رویی فیلتر شده دفریز شد و با 3 میلیلیتر معرف A موجود در کیت مخلوط شد. پس از گذشت یک شب انکوباسیون در دمای 4 درجه سانتیگراد، لولهها به مدت 40 دقیقه با سرعت g 1000 سانتریفیوژ شدند. در نهایت، بسته به اندازه رسوب، ۱۰۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر PBS به رسوب اضافه شد و مخلوط دوباره به حالـت تعلیق درآمد.
عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی SEM :
برای مشاهده مورفولوژی ذرات sEV از میکروسکوپ الکترونی روبشی SEM (Scaning electron microscopy) استفاده شد. بدین منظور، سوسپانسیون sEVs ابتدا باPBS رقیق گردید (به نسبت 1 به 10). سپس مقدار 10 میکرولیتر از نمونه روی لامل شیشهای تمیز قرار داده شد و اجازه داده شد تا در دمای اتاق در شرایط خلأ خشک شود. پس از آمادهسازی نمونه طبق دستورالعمل استاندارد دستگاه، (2100 AIS- ، SEM-SDBON) در دانشگاه امیرکبیر تصویربرداری انجام گرفت.
تعیین غلظت پروتئین sEV با استفاده از روش برادفود:
تعیین غلظت پروتئین sEVs مطابق با دستورالعمل کیت پروتوسیب انجام شد، بدین صورت که نمونـه sEVs و یا رقتهای متوالی پروتئین BSA بـه عنوان استانـدارد ( 125 میکرولیتر) با محلــول کوماسـی (125 میکرولیتـر) مخلـوط
گردیـد و بـه مدت 10 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. پس از گذشت مدت زمان انکوباسیون، جذب نمونهها در طول موج 595 نانومتر خوانش گردید و مقدار غلظت sEVs به کمک رسم نمودار از نمونههای استاندارد محاسبه شد.
یافتهها
ﺟﺪاﺳﺎزی سلولهای WJ-MSC ﺑﺎ روش Explant :
جداسازی سلولهای MSC با استفاده از قطعات بافت ژل وارتون بند ناف انسان صورت گرفت (شکل 1). بعد از قرار دادن قطعات بـافتی در فلاسکهای کشت، در روزهای 5 الی 7، اولین مهاجرت سلولی در اطراف بـافت قابل مشاهده بود. در ابتدا مورفولوژی سلولها گرد و سپس تغییر شکل داده و تبدیل به سلولهای دوکی شدند. پس از حصول تراکم سلولی در اطراف هر قطعه بافتی (روزهای 10 الی 14)، قطعات بافت ژل وارتون از فلاسکها خارج گردید تا سلولهای آزاد شده تکثیر و گسترش یابند (شکل 1).
تجزیه و تحلیل تمایز سلولهای WJ-MSC به سلولهای استخوانی و چربی:
سلولهای جدا شده از قطعات بافت ژل وارتون انسانی، با ویژگی چسبندگی به کف فلاسک کشت رشد کرده و در هفته دوم کشت به 80% تراکم رسیدنـد. در این مرحله سلولها پاساژ داده شدند و به فلاسک جدید انتقال داده شدند. این سلولها موفولوژی دوکی شکل را نشان دادند و ویژگیهای مورفولوژیکی این سلولها در طی پاساژهای متوالی حفظ شد (شکل A2). سلولهای WJ-MSC در پـاساژ دوم، از نظر توانایی تمایز به رده سلولی تأیید شدند. بدین صورت که توانایی تمایز این سلولها پس از 21 روز از انکوباسیون سلولها در محیط تمایزی القای استئوسیت و آدیپوسیت بررسی شد. تجمع قطرات لیپیدی در سلولهای تمایز یافته بـا استفـاده از روش رنگآمیـزی Oil Red O تأیید شد (شکل B2). همچنین، تجمعات ترکیبات معدنی خارج سلولی با رنگآمیزی Alizarin Red S مشاهده گردید (شکل C2).
بررسی مارکرهای سطحی سلولهای WJ-MSC با روش فلوسیتومتری:
فنوتیپ سلولهای WJ-MSC به کمک فلوسیتومتری بررسی گردید. نتایج حاصل از فلوسیتومتری نشان داد که سلولها به لحاظ بیان مارکرهای (8/98%) CD73 و (8/93%) CD105 مثبت بودند (شکل 3). در حالی که بیان مارکرهـای (83/1%) CD34 و (28/1%) CD45 منفـی بـود (شکل 3).
بررسی ذرات sEV های جـداسازی شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM :
نتایج حاصل از میکروگرافهای میکروسکوپ الکترونی نشان داد که بیشترین وزیکولهای استخراج شده با ظاهری کروی و محدوده انـدازه بین 60-40 نانومتر تأیید گردید (شکل 4).
تعیین غلظت sEV به کمک برادفورد:
به منظور انجام آزمایش برادفورد، همان طور که در بخش مواد و روشها توضیح داده شد، پس از مشخصهیابی سلولها، جهت استخراج ذرات sEV، در هر نوبـت 15 میلیلیتر از سوپرناتانت سلولی جمعآوری و با استفاده از کیت Exocib فرآوری شد. بسته به اندازه رسوب، 100 تا 200 میکرولیتر PBS به رسوب اضافه و سوسپانسیون مجدداً بـه حالت تعلیق درآمد. برای آزمایش برادفورد و به منظور تعیین غلظت پروتئینی ذرات sEV، رسوبهای حاصل از چندین نوبت استخراج (که هر کدام در ۱۰۰ تا 200 میکرولیتر PBS تعلیق شده بودند) جهت یکنواختسازی میانگین غلظت، تجمیع (Pool) گردیدنـد. سپس، جهت انجام آزمایش برادفورد، مقدار مورد نیاز مطابق با کیت (125 میکرولیتر) از سوسپانسیون نهایی sEVs برداشته شد. غلظت پروتئین sEVs با ترسیم منحنی استاندارد کیت و در سه تکرار مستقل (3 n=) تعیین شد (شکل 5). میانگین غلظت پروتئین sEVs بـه دسـت آمـده حدود 500 میکروگرم در میلیلیتر بود.
لازم بـه ذکر اسـت کـه ایـن آزمایش میزان پروتئیـن در
نمونـه را نشان میدهد و جهت بررسی اختصاصی پروتئینهای sEVs توصیه میشود از روشهای اختصاصیتر هم چون روش وسترن بلات استفاده کرد.
بحث
ذرات sEV مشتق از سلول به دلیل ویژگیهای کلیدی خود مـانند ایمنیزایی کم، پایداری فیزیکوشیمیایی بالا و امکان نگهداری طولانی مدت، ظرفیت نفوذ بـه بافتها و ظرفیت ذاتی برای برقراری ارتبـاط طولانی مدت با سایر سلولها، عدم خطرات و محدودیتهای مرتبط با درمان بر پایـه سلول، کاندیدای درمانی امیدوارکنندهای در زمینه پزشکی مدرن محسوب میشود (14).
با این وجود، عملکرد و خلوص و خواص فیزیکوشیمیایی ذرات sEV تحت تأثیر منشاء سلولی مناسب و انتخاب روشهای جداسازی اگزوزم قرار میگیرد. لذا، امکان تولید sEVs در مقیاس بـالا و ضرورت وجود یک منبع سلولی مناسب مورد توجه محققان و دانشمندان است (15، 4). سلولهای بنیادی مزانشیمی یکی از بهترین منابع sEVs محسوب میشوند. به طور عمده، سلولهای MSC به راحتی از تمام بافتهای انسانی به دست میآیند و به واسطه گسترش آسان در مقادیر زیاد بدون از دست دادن خواص بازسازی خود، به عنوان یک منبع مقیاس پذیر و درازمدت از sEVs در نظر گرفته میشوند (15، 4).
در میان منابع مختلف جهت جداسازی سلولهای MSC، بند ناف یک منبع سلولی مناسب، در دسترس و فاقد مشکلات اخلاقی است (16). مطالعهها نشان دادهاند که در مقایسه با سلولهای MSC استخراج شده از سایر بافتها، سلولهای WT-MSC دارای پتانسیل تعدیلکنندگی سیستم ایمنی قویتر و تکثیر بالاتری هستند (18، 17). شایان ذکر است که سلولهای MSCمستخرج از خون بند ناف ویژگیهای مشابهی با سلولهای WJ-MSCدارند، با این حـال، به دلیل فراوانی کم، نرخ تکثیـر ضعیف و محدودیتهای کشت، برای کاربردهـای بالینی جذابیت کمتری دارند. همچنین استفاده از روشهای غیر تهاجمی و بـدون درد در استخراج سلولهای WJ-MSC، آنها را به عنوان جـایگزین بهتری برای کاربردهای بالینی تبدیل کرده است (19). از آن جایی که خون بند ناف منبع غنی از سلولهای بنیادی/پیشساز خونساز است و میزان سلولهای MSC پـایینی دارد، در مقایسه با ژل وارتون، استخراج سلولهای MSC از خون بند ناف دشوار و با راندمان پایین است در حالی کـه ژل وارتون منبع غنی از این سلولها است. علاوه بر این، تنوع زیـاد در مورفولوژی سلولهای استخراج شده از خون بند ناف، سبب کارآیی پایین این منبع سلولی میشود (22-20).
در مقایسه با سلولهای مزانشیمی مشتق از جفت (P-MSCs = Placental mesenchymal stem cells)، علیرغم شباهت در مورفـولوژی، ایمونوفنوتیپ و پتانسیل تمایز به استئوبلاستها و آدیپوسیتها، سلولهای WJ-MSC زمان دو برابر شدن سلولی کوتاهتر، نرخ تکثیر بالاتر و نرخ تشکیل کلونی بیشتری دارند، که نشاندهنده چشمانداز کاربردی بهتر برای این سلولها است (24، 23). از طرفی، جداسازی سلولهای بنیادی مزانشیمی از جفت، پیچیده بوده و احتمال آلودگی بـا سلولهای مادری زیاد است، که این موضوع نشاندهنده مزیت سلولهای WJ-MSC از نظر سهولت جداسازی و خلوص در مقایسه با منابع جفتی است (25). همچنین درمطالعهای در مقایسه بین سلولهای BM-MSC، WJ-MSC و AT-MSC، گزارش شده است که سلولهای WT-MSC و BM-MSC دارای قدرت تکثیر بالاتری در مقایسه با سلولهای AT-MSC بوده و الگوی بیان ژن در سلولهای WT-MSC مشابه با سلولهای AT-MSC میباشد (26).
امروزه با توجه به اهمیت روشهای نوین درمان و توسعه مبتنی بر سلول، شناسایی و دستیابی به روشهای مناسب جهت استخراج و تکثیر این سلولها در مقیاس بالا بسیار حائز اهمیت است. در حال حاضر، روشهای مختلفی جهت استخراج سلولهای MSC در مطالعههای مختلف گزارش و مقایسه شدهاند از جمله روشهای آنزیمی و Explant (29-27). روشهای آنزیمی متعدد بر پایه استفاده از آنزیمهای پروتئولیتیک مانند کلاژناز، تریپسین و آنزیمهای دیگر نظیر هیالورونیداز در جهت حذف ماتریکس خارج سلولی و آزادسازی سلولها استواراست (30). در روش Explant قطعات کوچک بافتی در محیط کشت قرار داده میشود تا سلولها به تدریج از بافت خارج شوند. در مقایسه با روش آنزیمی، روش Explant آسانتر، و مقرون به صرفهتر بوده و سلولها با آسیبدیدگی کمتر مواجه میشوند و درصد زندهمانی بالاتری دارند و همچنین این سلولها میزان رشد بیشتری را در مدت زمان کوتاه پس از استخراج نشان میدهند (29). در مطالعههای بسیاری این دو روش بـه منظور استخراج سلولهای MSC مورد بررسی و مقایسه قرار گرفتهاند. در مطالعه پریا و همکاران نشان داده شده است که سلولهای به دست آمده از این دو روش از نظر بیان مارکرهای سطحی (CD34، CD44، CD73، CD90، CD105 و HLA-DR) و فعالیتهای ایمنی تفاوت کمی دارند، به طوری که هر دو روش تکثیر سلولهای تک هستهای خون محیطی (PBMC : Peripheral blood mononuclear cell) را تحریک نکرده و تکثیر لنفوسیتها را سرکوب میکنند. بـا این وجود، درصد بسیار پایین سلولهای HLA-DR+ خونی در پاساژ اول از سلولهای MSC استخراج شده با روش Explant نشاندهنده جمعیت یکنواختتر سلولهای MSC است (31). روش Explant منجر به برداشت سلولهای خالصتر و کمهتروژنتر با نرخ تکثیر بالاتر نسبت به روش آنزیمی میشود، در حالی که هضم آنزیمی علاوه بر جداسازی سلولهای استم سل شبه فیبروبـلاست (Fibroblast-like stem cells)، موجب آزادسازی سلولهای اندوتلیال و پریسیتها نیز میگردد (32). لذا تجمع سلولی یکنواختتر و آسیب کمتر ناشی از آنزیمها، دلیل افزایش نرخ تکثیر سلولهای MSCبه دست آمده از روش Explant است (32، 31).
یون و همکاران نیز در مطالعه خود گزارش کردند کـه تعداد اولیه سلولها در روش Explant بیشتر بوده است (تا 8/2 برابر بیشتر در پاساژ P0) (33). جینگ و همکاران نشان دادند که تعداد سلولها در دو روز اول پس از استخراج بـه کمک روش Explant کم است، اما به سرعت در روزهای بعد افزایش مییـابد و در نهایت سلولهای اولیه به دست آمده با دو روش تقریباً همزمان به کانفلوئنسی80% رسیـدند. آنها نشان دادند که روش Explant بازده بیشتری از سلولهای استرومال نسبت به روش هضم آنزیمی ارائه میدهد، که احتمالاً به دلیل کاهش قابلیت چسبندگی سلولهای قرار گرفته در معرض آنزیم و از دست رفتن سلولها در طول فرآیندهای فیلتراسیون و شستشو در روش هضم آنزیمی است (34). لذا استفاده از روشهای غیر آنزیمی در جهت جداسازی سلولهای MSC توصیه میشود. در این مطالعه نیز از روش Explant در جهت استخراج سلولهای WT-MSC استفاده گردید و معیارهای اصلی در جهت تائید و خلوص سلولهای MSC بر اساس انجمن بینالمللی سلول درمانی (ISCT)، همچون بررسی مورفولوژی و توانایی چسبندگی این سلولها به سطح، میزان تکثیر و قدرت تمایز آنها به بافت چربی و استخوان و حضور مارکرهای مختص سلولهای MSC (CD73 و CD105) و عدم حضور مارکرهای غیراختصاصی (CD34 و CD45) مورد تائید قــرار
گرفت.
علاوه بر انتخـاب منبع مناسب، تولید مقیاسپذیر و جداسازی sEVs ها با بازده و خلوص بالا و همچنین حفظ ساختار آنها چالش اصلی مرتبط با درمانهای مبتنی بر sEVs است. علاوه بر این، روش جداسازی باید مقرون به صرفه باشد و با فرآیند تولید با توان بالا سازگار باشد (14). امروزه روشهای مختلفی بر مبنای توانایی مؤثر در جهت جداسازی ذرات sEV و حذف پارتیکلهای اضافی در جهت جـداسازی sEVs وجود دارد (35). در اغلب مطالعهها، دو روش اولترا سانتریفیوژ و روش سانتریفیوژ شیب چگالی مورد مقایسه قرار گرفتهاند. نتایج نشان میدهد که استفاده از اولترا سانتریفیوژ دارای مزایایی همچون ظرفیت بـالای استخراج، خلوص بالا و آلودگی کمتر است. از طرفی، نیاز به تجهیزات گران قیمت و امکان آسیب به ذرات sEV در نتیجه سرعت بالای سانتریفیوژ از معایب استخراج sEV به کمک اولتراسانتریفیوژ محسوب میشود (36). سهولت بالا و عدم نیاز به تجهیزات ویژه از مزایای روشهای سانتریفیوژ شیب چگالی محسوب میشود که البته رسوب پروتئین و آلودگی sEVs به همراه پروتئین از جمله معایب این روش در نظر گرفته میشود (37).
در این مطالعه از کیت اگزوسیب در جهت جداسازی ذرات sEV موجود درسوپ سلولی سلولهای WT-MSC استفاده شد، که اساس روش این کیت بر مبنای سانتریفیوژ شیب چگالی است. پس از جداسازی، خصوصیات مورفولوژی ذرات sEV به کمک میکروسکوپ الکترونی تایید شد و عدم آسیب بـه ساختـار وزیکولها و یکپارچگی غشا آنها قابل رؤیت بود.
محدودیتهای مطالعه:
علیرغم دستاوردهای مطلوب در استخراج ذرات sEV از سلولهای WJ-MSC، این مطالعه با محدودیتهایی مواجه بود که بـاید در تفسیر نتایج و مطالعههای آتی مد نظر قرار گیرند: در این مطالعه، سنجش کمی پروتئین صرفاً بر اساس روش برادفورد (سنجش پروتئین کل) انجام شد. اگرچه این روش برای تعیین دوز اولیه و اثبات بازدهی استخراج کافی است، اما عدم استفاده از روشهایی نظیر وسترن بلات یا فلوسیتومتری برای شناسایی مارکرهای غشایی اختصاصی sEVs و همچنین روش NTA برای تعیین دقیق توزیع اندازه ذرات، از محدودیتهای فنی این پژوهش محسوب میشود.
نتیجهگیری
پژوهش حاضر تائید میکند که سلولهای WJ-MSC، به دلیل دسترسی غیر تهاجمی و توان تکثیری بالا، منبعی ایـدهآل و مقرون به صرفه برای استخراج ذرات sEV در مقیاس آزمایشگاهی هستند. همچنین نتایج نشان داد که استفاده از دستورالعمل جداسازی معرفی شده در این پژوهش، منجر به استحصال ذرات sEV با ساختار مورفولوژیک سالم و غلظت پروتئینی مناسب میگردد با این حـال، باید به محدودیتهایی در این مطالعه نظیر اکتفا به سنجش پروتئین کل به جای شناسایی مارکرهای اختصاصی (مانند وسترن بلات) اشاره نمود که پیشنهاد میشود در مطالعههای آینده، بـا استفاده از حجمهای بالاتری از بافت اولیه، مشخصهیـابی پروتئینی دقیقتر و بررسیهای عملکردی بر روی این ذرات sEV صورت پذیرد.
حمایت مالی
این پروژه توسط مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و معاونت علمی، فناوری و اقتصاد دانش بنیان ریاست جمهوری تأمین مالی شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه در کمیته اخلاق در پژوهش پژوهشکده علوم غدد درونریز و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکــی شهیـــد
بهشتی کد اخلاق دریافت کرده است (IR.SBMU.ENDOCRINE.REC.1400.140).
عدم تعارض منافع
هیچگونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود ندارد.
نقش نویسندگان
میلاد خباره: انجام مراحل پژوهش، جمعآوری دادهها، تحلیل دادهها، تهیه گزارش، نگارش مقاله
دکتر مهسا صالحی: نگارش و ویرایش مقاله
دکتر سمیه صادقی: طراحی مطالعه، انجام مراحل پژوهش، تحلیل دادهها، هدایـــــت و راهنمایی پژوهش، نگارش و ویرایش مقاله
تشکر و قدردانی
مقاله حاضر، حاصل بخشی از نتایج پایاننامه کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون (شماره 1414) میباشد. هزینه اجرای طرح توسط مؤسسه عالی طب انتقال خون و حمایت مالی معاونت علمی، فناوری و اقتصاد دانش بنیان ریاست جمهوری تحت شماره گرنت (CT1402080876) در تهران، ایران، انجام شده است. بدین وسیله، از کلیه حمایتهای بیدریغ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و معاونت علمی، فناوری و اقتصاد دانش بنیان ریاست جمهوری کمال تشکر را داریم.
متن کامل: (9 مشاهده)
دستورالعمل کاربردی جداسازی و مشخصه یابی وزیکولهای خارج سلولی کوچک از سلولهای بنیادی مزانشیمی ژل وارتون بند ناف انسانی
میلاد خباره1، مهسا صالحی 2 ، سمیه صادقی3
1- دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی پزشکی ـ مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- دکترای تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- دکترای تخصصی ایمونولوژی پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
1- دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی پزشکی ـ مرکز تحقیقات فرآوردههای بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- دکترای تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- دکترای تخصصی ایمونولوژی پزشکی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
http://dx.doi.org/10.61186/bloodj.22.1.19 Citation: Khabareh M, Salehi M, Sadeghi S. A Practical Protocol for the Isolation and Characterization of Small Extracellular Vesicles Derived from Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells. J Iran Blood Transfus. 2026: 23 (1): 34-44 نویسنده مسئول: دکتر سمیه صادقی. استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران صندوق پستی: 1157-14665 صندوق پستی: 1157-14665 E-mail:
کد اخلاق: IR.SBMU.ENDOCRINE.REC.1400.140 |
 چکیدهسابقه و هدف امروزه درمانهای مبتنی بر سلولهای بنیادی مزانشیمی (MSCs) و وزیکولهای خارج سلولی کوچک (sEVs) مشتق از آنها به عنوان یک رویکرد درمانی نوین، توجه گستردهای را در مطالعههای پیش بالینی و کارآزماییهای بالینی به خود جلب کردهاند. ذرات sEV ضمن دارا بودن اثرات درمانی مشابه با سلولهای مادر از ایمنی بالایی برخوردارند. از اینرو جایگزین مناسبی برای سلول درمانی مستقیم محسوب میشوند. شناسایی منبع سلولی مناسب و توسعه روشهای کارآمد جهت استخراج این وزیکولها از اهمیت ویژهای برخوردار است. سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از ژل وارتون بند ناف انسانی به دلیل دسترسی آسان، قدرت تکثیر بالا و خواص ایمنی تنظیمی مطلوب، به عنوان یکی از منابع ارزشمند در این زمینه مطرح هستند. هدف از این مطالعه، ارائه دستورالعمل کاربردی، آسان و مقرون به صرفه برای استخراج و مشخصهیابی اگزوزومهای مشتق از سلولهای مزانشیمی ژل وارتون بند ناف انسانی است تا دقت و تکرارپذیری فرآیندهای آزمایشگاهی ارتقا یابد. مواد و روشها در این مطالعه تجربی، سلولهای بنیادی مزانشیمی از دو نمونه مجزای بافت ژل وارتون بند ناف انسانی با روش Explant استخراج شدند. پس از تأیید فنوتیپ سلولها از نظر بیان مارکرهای CD73، CD45، CD34، CD105 و پتانسیل تمایزی آنها به سلولهای چربی و استئوبلاستها، جهت استخراج sEVs، در هر نوبت 15 میلیلیتر از سوپرناتانت سلولی حاصل از چند فلاسک کشت تحت شرایط یکسان جمعآوری و با استفاده از کیت تجاری استخراج sEVs فرآوری شد. خصوصیات مورفولوژیک sEV ها با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و غلظت پروتئینی آنها با آزمون برادفورد مورد ارزیابی قرار گرفت. یافتهها نتایج فلوسیتومتری نشان داد که سلولهای مشتق از سلولهای مزانشیمی ژل وارتون بند ناف انسانی، بیان بالایی از مارکرهای (8/98%) CD73 و (8/93%( CD73 داشته در حالی که بیان مارکرهای خونساز CD34 و CD45 کمتر از 2% بود. همچنین، توان تمایز سلولها به ردههای استخوانی و چربی تأیید شد. تصاویرSEM ، حفظ تمامیت غشایی و مورفولوژی کروی ذرات sEV را در محدوده ابعادی مورد انتظار (60-40 نانومتر) نشان داد. غلظت پروتئینی وزیکولهای خارج سلولی کوچک استخراج شده بر اساس آزمون برادفورد برابر با 500 میکروگرم بر میلیلیتر (3 n=) محاسبه گردید. نتیجه گیری نتایج این مطالعه نشان داد که روش Explant به همراه استفاده از کیتهای مبتنی بر سانتریفیوژ شیب چگالی، روشی ساده، مقرون به صرفه و کارآمد برای استخراج سلولهای بنیادی مزانشیمی ژل وارتون و تولید ذرات وزیکولهای خارج سلولی کوچک با کیفیت مناسب است و میتواند به عنوان یک راهکار عملی جهت تولید ذرات وزیکولهای خارج سلولی کوچک مورد استفاده قرار گیرد. کلمات کلیدی: بند ناف، ژل وارتون ، سلولهای بنیادی مزانشیمی، وزیکولهای خارج سلولی |
مقدمه
امروزه درمان مبتنی بر سلولهای بنیادی مزانشیمی (MSCs : Mesenchymal stem cells) و ترشحـات آنها، بـه ویژه وزیکولهای خارج سلولی(EVs : Extracellular Vesicles)، به عنوان یـک استراتژی نوظهور در پزشکی بازساختی شناخته میشوند. بر اساس بیانیه استاندارد انجمن بینالمللی وزیکولهای خارج سلولی (MISEV : Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)، این وزیکولها بر حسب اندازه به دو دسته کلی EVs بزرگ و EVs کوچک (sEVs یا smal EVs) تقسیم میشونـد. ذرات sEV، وزیکولهایی با منشأ اندوزومی و محدوده اندازه ۴۰ تا ۱۵۰ نانومتر هستند که نقش حیاتی در ارتباطات بین سلولی و انتقال پیامهای بیولوژیـک ایفا میکنند (3-1).
سلولهای بنیادی مزانشیمی یکی از مهمترین منابع جهت استخراج ذرات sEV محسوب میشوند. بر طبق تعریـف انجمن بینالمللی سلول درمانی (ISCT : International Society for Cellular Therapy)، سلولهای MSC، به عنوان سلولهای استرومایی چند توان با ویژگیهای خود تجدید شوندگی، توانایی اتصال به پلاستیک در شرایط کشت استاندارد، ظرفیت تمایز به دودمانهای سلولی متعدد و بیان نشانگرهای سطحی مانند CD105، CD73 و CD90 و عدم بیان مارکرهایی همچون CD34 و CD45 درنظر گرفته میشوند (4). اگر چه این سلولها از بافتهای متنوعی نظیر مغز استخوان، چربی و خون قاعدگی قابل استخراج هستند، اما در سالهای اخیر، بافت بند ناف انسان به دلیل ویژگیهای منحصر به فرد، مورد توجه ویژهای قرار گرفته است (7-5). بند ناف شامل عروق خونی و غلاف آمنیوتیک است که توسط ماده ژلاتینی محافظی به نام ژل وارتون (Wharton’s Jelly) احاطه شدهاند (8). سلولهای بنیادی مشتق از ژل وارتون، به دلیل دسترسی آسان، روش جداسازی غیر تهاجمی، عدم وجود چالشهای اخلاقی، خاصیت هتروژنیسیته محدودتر و توان تکثیر بالا، منبعی ایدهآل برای استخراج ذرات sEV در مقیاس صنعتی و بالینی به شمار میروند (10، 9).
کاربرد درمانی sEVs به دلیل توانایی آنها در انتقال اطلاعات بیولوژیـک سلولهای والد، پایداری بالا در برابر تخریب دارویی، سمیت ناچیز و قابلیت فرار از سیستم رتیکولوآنـدوتلیال، افقهای جدیدی را در درمان بیماریهای مختــلف گشوده است (10، 9). با این حـال، دستیابـی بـه
دستورالعملهـای دقیـق جهـت جداسـازی بـا کیفیــت بالا
همچنان یـک چالش کلیدی است. لذا در این مطالعه، با هدف ارتقای دقت در فرآیندهای آزمایشگاهی، دستورالعمل کاربردی، ساده و مقرون به صرفه برای استخراج سلولهای WJ-MSC به روش مهاجرت سلول از قطعه بافتی (Explant) و متعاقب آن، جداسازی sEVs از سوپ رویی این سلولها با استفاده از کیتهای تجاری بر پایه سانتریفیوژ شیب چگالی پیادهسازی گردید. این روش برخلاف روشهای آنزیمی، آسیب کمتری به سلولها وارد کرده و منجر به تولید جمعیتهای سلولی با خلوص و توان تمایزی بالا میشود. در نهایت، ویژگیهای فیزیکوشیمیایی، غلظت پروتئینی و ساختار مورفولوژیک وزیکولهای حاصله جهت ارزیابی کارآمدی روش، مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
فاز اول: استخراج sEVs
نمونههای بند ناف از نوزادان تازه متولد شده، از پژوهشگاه رویان تهران، تهیه و تحت شرایط استریل درون نرمال سالین به آزمایشگاه منتقل شدند و تمام آزمایشهای شرح داده شده در ادامه، در شرایط استریل و زیر هود لامینار انجـام شد. در این مطالعه از 2 نمونه بافت ژل وارتون بند ناف انسانی مجزا با روش Explant (قطعات بـافتی به طول تقریبی 5 میلیلیتر) جهت استخراج سلولهای MSC استفاده گردید. بدین صورت که، نمونه بند ناف با PBS حاوی پنیسیلین و استرپتومایسین به منظور از بین بردن آلودگیهای باکتریایی شستشو داده شد. سپس رگهای خونی، شامل یک سیاهرگ بزرگ و دو سرخرگ کوچک، جـداسازی شده و ﺑﺎﻓﺖ ژل وارﺗﻮن با قیچی به قطعات کوچکتر (5 میلیمتر) تقسیم گردید. سپس بـا شستن مکرر با PBS ، باقیماندههای خون پـاک و قطعات کوچک بافتی (تعداد 5 الی6 قطعه) به ﻓﻼسک 25 سانتیمتری انتقال داده شد و ﺑﻪ ﻣﺪت 5 دﻗﯿﻘﻪ در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید تا ﺑﯿﺸﺘﺮیﻦ ﻣﯿﺰان چسبندگی ﺑﯿﻦ ﻗﻄﻌﺎت بافتی و کف ﻓﻼسک ﻓﺮاﻫﻢ شود. جهت دستیابی به میزان حداکثر سلول آزاد شده از قطعات بافتـی، عدم جابهجایی تکههای بافتی در پلیت یا فلاسک کشت نقش مهمی در خروج سلولها از قطعات بافتی دارد، لذا توصیه میشود قبل از اضافه کردن محیط کشت به فلاسک کشت سلولی، ابتدا قطعات بافتی ﺑﻪ ﻣﺪت 3 الی 5 دﻗﯿﻘﻪ در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردد تـا ﺑﯿﺸﺘﺮیﻦ ﻣﯿﺰان چسبندگی ﺑﯿﻦ ﻗﻄﻌﺎت بافتی و کف ﻓﻼسک
ایجاد شود (11).
سپس، ﺑﻪ ﻫﺮ ﻓﻼسک محیط کشت DMEM-F12 به همراه 10 درصد FBS ، اﺿﺎﻓﻪ گردید. ﻓﻼسکﻫﺎ ﺑﻪ ﻣﺪت 72 ﺳﺎﻋﺖ در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد، 5% CO2 انکوبه ﺷﺪ و سپس ﻣﺤﯿﻂ کشت آنﻫﺎ ﺑﺎ دﻗﺖ و ﺑﻪ آرامی ﺗﻌﻮیﺾ ﺷد. در طول زمان انکوباسیون، به تدریج سلولهای بنیادی مزانشیمی شروع بـه خروج از قطعههای بافتی و انتشار در کف پلیت میکنند و معمولاً 5 الی 7 روز ﺑﻌﺪ از انکوباسیون، ﺳﻠﻮلﻫﺎی کوچک در اﻃﺮاف ﻗﻄﻌﺎت بافت ﻗﺎﺑﻞ رؤیﺖ اﺳﺖ. پس از این که جمعیت سلولهای آزاد شده به تراکم مناسب رسید، ﻗﻄﻌﺎت بافتی از فلاسک کشت برداشته شد و ﺑﻪ ﺳﻠﻮلﻫﺎی آزاد ﺷﺪه اﺟﺎزه رﺷﺪ داده شد ﺗﺎ ﺑﻪ ﺗﺮاکم ﻣﻨﺎﺳﺐ ﺑﺮﺳﻨﺪ. پس از آن که تراکم آنها در محیط کشت به طور تقریبی به 80 درصد رسید، سلولها با استفاده از تریپسین- EDTA استخراج شدند (12).
پتانسیل تمایز سلولهای WJ-MSC :
به منظور رسیدن سلولها به تراکم مناسب (80%) و اطمینان از خلوص و حفظ ویژگیهـای مورفولوژیک (دوکی شکل بودن) سلولهای مزانشیمی، در طی پاساژهای اولیه از سلولهای پاساژ 2 استفاده و پس از رسیدن به تراکم 80 درصد، پتانسیل تمایز سلولهای WJ-MSC به استئوبلاستها و سلولهای چربی مورد بررسی قرار گرفت (4).
بدین صورت که، با توجه به مدت زمان نسبتاً طولانی انکوباسیون سلولها (21 روز) جهت آزمایشهای تمایزی و جهت جلوگیری از ریزش سلولها در اثر تراکم بیش از اندازه سلولی، 10 هزار سلول WJ-MSC در پاساژ 2، به پلیت چهارخـانه منتقل و پس از گذشت 48 ساعت انکوباسیون در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد، 5% CO2 ، محیط کشت موجود در چاهـکها با 1 میلیلیتر محیط تمایز استئوژنیک ]شامل دگزامتازون (100 میلیمولار)، گلیسرول فسفات (10 میلیمولار)، و اسید اسکوربیک (50 میکرومولار) به همراه 10 درصد FBS [ و یـا محیط تمایز آدیپوژنیک ]شامل ایندومتاسین (100 میلیمولار)، 3-ایزوبوتیل- متیل گزانتین (5/0 میلیمولار)، دگزامتازون (250 میلیمولار)، و انسولین (5 میلیمولار) بـه همراه 10 درصد FBS [ جایگزین شد. به مدت 21 روز محیط تمایزی هر 3 روز یک بار تعـویض گردید و پس از 21 روز، تمایز سلولها به بافت استخوان و چربی به ترتیب با رنگآمیزی Alizarin Red و Oil Red O مورد سنجش قرار گرفت (4). رنگآمیزی Alizarin Red برای مشاهده تجمعات ترکیبات معدنی خارج سلولی و تایید تمایز به استخوان، و Oil Red O برای تایید تجمع قطرات لیپیدی (چربی) در داخل سلولهای تمایز یافته انجام شد.
تجزیـه و تحلیل فنوتیپ سلولهای WJ-MSC به کمک فلوسیتومتری:
برای تجزیه و تحلیل نشانگرهای سطحی، سلولهای WJ-MSC در پاساژ دوم (حدود 106×1 سلول) به صورت سوسپانسیون تک سلولی با آنتیبادیهای مونوکلونال علیه CD73، CD45، CD34، CD105 رنـگآمیزی شدند. دادهها با نرمافزار Flowjo 7.6.1 تجزیه و تحلیل شد (4).
تهیه سوپ سلولی WJ-MSC جهت جداسازی ذرات sEV :
ذرات sEV از محیط کشت سلولهای WJ-MSC به دست آمد (13). به طور خلاصه، جهت استخراج sEVs از سوپ سلولی حاصل از سلولهای WJ-MSC در پاساژ دوم با تراکم 80 درصد استفاده شد. هر 2 الی 3 روز، محیط کشت سلولها با FBS کمتری جایگزین شد. بدین صورت که FBS محیط از 15 درصد به صورت تدریجی به 7 ، 5 ، 2 و صفر کاهش یافت تا سلولها با محیط کشت بدون سرم سازگار شوند. در نهایت پس از این که میزان FBS محیط به صفر رسید، مایع رویی حاصل از چند فلاسک کشت سلولی که تحت شرایط یکسان کشت داده شده بودند، جمعآوری و با استفاده از فیلترهای 22/0 میکرومتری فیلتر شد تا بقایای سلولی حذف شود و در نهایت در منفی 70 درجه سانتیگراد ذخیره گردید.
استخراج ذرات sEV مشتق از سلولهای WJ-MSC :
جداسازی MSC-sEV از مایع رویی تهیه شده با استفاده از دستورالعمل کیت Exocib (Cib Biotech Co.) انجـام شد. اساس عملکرد این کیت بر مبنای سانتریفیوژ شیب چگالی است. اساس این کیت ایجاد لایههایی از محلول با چگالی متفاوت است که در آن ذرات sEV بر اساس وزن مخصوص خود در لایه مناسب قرار میگیرند. ابتدا 15 میلیلیتر از مایع رویی فیلتر شده دفریز شد و با 3 میلیلیتر معرف A موجود در کیت مخلوط شد. پس از گذشت یک شب انکوباسیون در دمای 4 درجه سانتیگراد، لولهها به مدت 40 دقیقه با سرعت g 1000 سانتریفیوژ شدند. در نهایت، بسته به اندازه رسوب، ۱۰۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر PBS به رسوب اضافه شد و مخلوط دوباره به حالـت تعلیق درآمد.
عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی SEM :
برای مشاهده مورفولوژی ذرات sEV از میکروسکوپ الکترونی روبشی SEM (Scaning electron microscopy) استفاده شد. بدین منظور، سوسپانسیون sEVs ابتدا باPBS رقیق گردید (به نسبت 1 به 10). سپس مقدار 10 میکرولیتر از نمونه روی لامل شیشهای تمیز قرار داده شد و اجازه داده شد تا در دمای اتاق در شرایط خلأ خشک شود. پس از آمادهسازی نمونه طبق دستورالعمل استاندارد دستگاه، (2100 AIS- ، SEM-SDBON) در دانشگاه امیرکبیر تصویربرداری انجام گرفت.
تعیین غلظت پروتئین sEV با استفاده از روش برادفود:
تعیین غلظت پروتئین sEVs مطابق با دستورالعمل کیت پروتوسیب انجام شد، بدین صورت که نمونـه sEVs و یا رقتهای متوالی پروتئین BSA بـه عنوان استانـدارد ( 125 میکرولیتر) با محلــول کوماسـی (125 میکرولیتـر) مخلـوط
گردیـد و بـه مدت 10 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. پس از گذشت مدت زمان انکوباسیون، جذب نمونهها در طول موج 595 نانومتر خوانش گردید و مقدار غلظت sEVs به کمک رسم نمودار از نمونههای استاندارد محاسبه شد.
یافتهها
ﺟﺪاﺳﺎزی سلولهای WJ-MSC ﺑﺎ روش Explant :
جداسازی سلولهای MSC با استفاده از قطعات بافت ژل وارتون بند ناف انسان صورت گرفت (شکل 1). بعد از قرار دادن قطعات بـافتی در فلاسکهای کشت، در روزهای 5 الی 7، اولین مهاجرت سلولی در اطراف بـافت قابل مشاهده بود. در ابتدا مورفولوژی سلولها گرد و سپس تغییر شکل داده و تبدیل به سلولهای دوکی شدند. پس از حصول تراکم سلولی در اطراف هر قطعه بافتی (روزهای 10 الی 14)، قطعات بافت ژل وارتون از فلاسکها خارج گردید تا سلولهای آزاد شده تکثیر و گسترش یابند (شکل 1).
تجزیه و تحلیل تمایز سلولهای WJ-MSC به سلولهای استخوانی و چربی:
سلولهای جدا شده از قطعات بافت ژل وارتون انسانی، با ویژگی چسبندگی به کف فلاسک کشت رشد کرده و در هفته دوم کشت به 80% تراکم رسیدنـد. در این مرحله سلولها پاساژ داده شدند و به فلاسک جدید انتقال داده شدند. این سلولها موفولوژی دوکی شکل را نشان دادند و ویژگیهای مورفولوژیکی این سلولها در طی پاساژهای متوالی حفظ شد (شکل A2). سلولهای WJ-MSC در پـاساژ دوم، از نظر توانایی تمایز به رده سلولی تأیید شدند. بدین صورت که توانایی تمایز این سلولها پس از 21 روز از انکوباسیون سلولها در محیط تمایزی القای استئوسیت و آدیپوسیت بررسی شد. تجمع قطرات لیپیدی در سلولهای تمایز یافته بـا استفـاده از روش رنگآمیـزی Oil Red O تأیید شد (شکل B2). همچنین، تجمعات ترکیبات معدنی خارج سلولی با رنگآمیزی Alizarin Red S مشاهده گردید (شکل C2).
بررسی مارکرهای سطحی سلولهای WJ-MSC با روش فلوسیتومتری:
فنوتیپ سلولهای WJ-MSC به کمک فلوسیتومتری بررسی گردید. نتایج حاصل از فلوسیتومتری نشان داد که سلولها به لحاظ بیان مارکرهای (8/98%) CD73 و (8/93%) CD105 مثبت بودند (شکل 3). در حالی که بیان مارکرهـای (83/1%) CD34 و (28/1%) CD45 منفـی بـود (شکل 3).
بررسی ذرات sEV های جـداسازی شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM :
نتایج حاصل از میکروگرافهای میکروسکوپ الکترونی نشان داد که بیشترین وزیکولهای استخراج شده با ظاهری کروی و محدوده انـدازه بین 60-40 نانومتر تأیید گردید (شکل 4).
تعیین غلظت sEV به کمک برادفورد:
به منظور انجام آزمایش برادفورد، همان طور که در بخش مواد و روشها توضیح داده شد، پس از مشخصهیابی سلولها، جهت استخراج ذرات sEV، در هر نوبـت 15 میلیلیتر از سوپرناتانت سلولی جمعآوری و با استفاده از کیت Exocib فرآوری شد. بسته به اندازه رسوب، 100 تا 200 میکرولیتر PBS به رسوب اضافه و سوسپانسیون مجدداً بـه حالت تعلیق درآمد. برای آزمایش برادفورد و به منظور تعیین غلظت پروتئینی ذرات sEV، رسوبهای حاصل از چندین نوبت استخراج (که هر کدام در ۱۰۰ تا 200 میکرولیتر PBS تعلیق شده بودند) جهت یکنواختسازی میانگین غلظت، تجمیع (Pool) گردیدنـد. سپس، جهت انجام آزمایش برادفورد، مقدار مورد نیاز مطابق با کیت (125 میکرولیتر) از سوسپانسیون نهایی sEVs برداشته شد. غلظت پروتئین sEVs با ترسیم منحنی استاندارد کیت و در سه تکرار مستقل (3 n=) تعیین شد (شکل 5). میانگین غلظت پروتئین sEVs بـه دسـت آمـده حدود 500 میکروگرم در میلیلیتر بود.
لازم بـه ذکر اسـت کـه ایـن آزمایش میزان پروتئیـن در
نمونـه را نشان میدهد و جهت بررسی اختصاصی پروتئینهای sEVs توصیه میشود از روشهای اختصاصیتر هم چون روش وسترن بلات استفاده کرد.
بحث
ذرات sEV مشتق از سلول به دلیل ویژگیهای کلیدی خود مـانند ایمنیزایی کم، پایداری فیزیکوشیمیایی بالا و امکان نگهداری طولانی مدت، ظرفیت نفوذ بـه بافتها و ظرفیت ذاتی برای برقراری ارتبـاط طولانی مدت با سایر سلولها، عدم خطرات و محدودیتهای مرتبط با درمان بر پایـه سلول، کاندیدای درمانی امیدوارکنندهای در زمینه پزشکی مدرن محسوب میشود (14).
با این وجود، عملکرد و خلوص و خواص فیزیکوشیمیایی ذرات sEV تحت تأثیر منشاء سلولی مناسب و انتخاب روشهای جداسازی اگزوزم قرار میگیرد. لذا، امکان تولید sEVs در مقیاس بـالا و ضرورت وجود یک منبع سلولی مناسب مورد توجه محققان و دانشمندان است (15، 4). سلولهای بنیادی مزانشیمی یکی از بهترین منابع sEVs محسوب میشوند. به طور عمده، سلولهای MSC به راحتی از تمام بافتهای انسانی به دست میآیند و به واسطه گسترش آسان در مقادیر زیاد بدون از دست دادن خواص بازسازی خود، به عنوان یک منبع مقیاس پذیر و درازمدت از sEVs در نظر گرفته میشوند (15، 4).
در میان منابع مختلف جهت جداسازی سلولهای MSC، بند ناف یک منبع سلولی مناسب، در دسترس و فاقد مشکلات اخلاقی است (16). مطالعهها نشان دادهاند که در مقایسه با سلولهای MSC استخراج شده از سایر بافتها، سلولهای WT-MSC دارای پتانسیل تعدیلکنندگی سیستم ایمنی قویتر و تکثیر بالاتری هستند (18، 17). شایان ذکر است که سلولهای MSCمستخرج از خون بند ناف ویژگیهای مشابهی با سلولهای WJ-MSCدارند، با این حـال، به دلیل فراوانی کم، نرخ تکثیـر ضعیف و محدودیتهای کشت، برای کاربردهـای بالینی جذابیت کمتری دارند. همچنین استفاده از روشهای غیر تهاجمی و بـدون درد در استخراج سلولهای WJ-MSC، آنها را به عنوان جـایگزین بهتری برای کاربردهای بالینی تبدیل کرده است (19). از آن جایی که خون بند ناف منبع غنی از سلولهای بنیادی/پیشساز خونساز است و میزان سلولهای MSC پـایینی دارد، در مقایسه با ژل وارتون، استخراج سلولهای MSC از خون بند ناف دشوار و با راندمان پایین است در حالی کـه ژل وارتون منبع غنی از این سلولها است. علاوه بر این، تنوع زیـاد در مورفولوژی سلولهای استخراج شده از خون بند ناف، سبب کارآیی پایین این منبع سلولی میشود (22-20).
در مقایسه با سلولهای مزانشیمی مشتق از جفت (P-MSCs = Placental mesenchymal stem cells)، علیرغم شباهت در مورفـولوژی، ایمونوفنوتیپ و پتانسیل تمایز به استئوبلاستها و آدیپوسیتها، سلولهای WJ-MSC زمان دو برابر شدن سلولی کوتاهتر، نرخ تکثیر بالاتر و نرخ تشکیل کلونی بیشتری دارند، که نشاندهنده چشمانداز کاربردی بهتر برای این سلولها است (24، 23). از طرفی، جداسازی سلولهای بنیادی مزانشیمی از جفت، پیچیده بوده و احتمال آلودگی بـا سلولهای مادری زیاد است، که این موضوع نشاندهنده مزیت سلولهای WJ-MSC از نظر سهولت جداسازی و خلوص در مقایسه با منابع جفتی است (25). همچنین درمطالعهای در مقایسه بین سلولهای BM-MSC، WJ-MSC و AT-MSC، گزارش شده است که سلولهای WT-MSC و BM-MSC دارای قدرت تکثیر بالاتری در مقایسه با سلولهای AT-MSC بوده و الگوی بیان ژن در سلولهای WT-MSC مشابه با سلولهای AT-MSC میباشد (26).
امروزه با توجه به اهمیت روشهای نوین درمان و توسعه مبتنی بر سلول، شناسایی و دستیابی به روشهای مناسب جهت استخراج و تکثیر این سلولها در مقیاس بالا بسیار حائز اهمیت است. در حال حاضر، روشهای مختلفی جهت استخراج سلولهای MSC در مطالعههای مختلف گزارش و مقایسه شدهاند از جمله روشهای آنزیمی و Explant (29-27). روشهای آنزیمی متعدد بر پایه استفاده از آنزیمهای پروتئولیتیک مانند کلاژناز، تریپسین و آنزیمهای دیگر نظیر هیالورونیداز در جهت حذف ماتریکس خارج سلولی و آزادسازی سلولها استواراست (30). در روش Explant قطعات کوچک بافتی در محیط کشت قرار داده میشود تا سلولها به تدریج از بافت خارج شوند. در مقایسه با روش آنزیمی، روش Explant آسانتر، و مقرون به صرفهتر بوده و سلولها با آسیبدیدگی کمتر مواجه میشوند و درصد زندهمانی بالاتری دارند و همچنین این سلولها میزان رشد بیشتری را در مدت زمان کوتاه پس از استخراج نشان میدهند (29). در مطالعههای بسیاری این دو روش بـه منظور استخراج سلولهای MSC مورد بررسی و مقایسه قرار گرفتهاند. در مطالعه پریا و همکاران نشان داده شده است که سلولهای به دست آمده از این دو روش از نظر بیان مارکرهای سطحی (CD34، CD44، CD73، CD90، CD105 و HLA-DR) و فعالیتهای ایمنی تفاوت کمی دارند، به طوری که هر دو روش تکثیر سلولهای تک هستهای خون محیطی (PBMC : Peripheral blood mononuclear cell) را تحریک نکرده و تکثیر لنفوسیتها را سرکوب میکنند. بـا این وجود، درصد بسیار پایین سلولهای HLA-DR+ خونی در پاساژ اول از سلولهای MSC استخراج شده با روش Explant نشاندهنده جمعیت یکنواختتر سلولهای MSC است (31). روش Explant منجر به برداشت سلولهای خالصتر و کمهتروژنتر با نرخ تکثیر بالاتر نسبت به روش آنزیمی میشود، در حالی که هضم آنزیمی علاوه بر جداسازی سلولهای استم سل شبه فیبروبـلاست (Fibroblast-like stem cells)، موجب آزادسازی سلولهای اندوتلیال و پریسیتها نیز میگردد (32). لذا تجمع سلولی یکنواختتر و آسیب کمتر ناشی از آنزیمها، دلیل افزایش نرخ تکثیر سلولهای MSCبه دست آمده از روش Explant است (32، 31).
یون و همکاران نیز در مطالعه خود گزارش کردند کـه تعداد اولیه سلولها در روش Explant بیشتر بوده است (تا 8/2 برابر بیشتر در پاساژ P0) (33). جینگ و همکاران نشان دادند که تعداد سلولها در دو روز اول پس از استخراج بـه کمک روش Explant کم است، اما به سرعت در روزهای بعد افزایش مییـابد و در نهایت سلولهای اولیه به دست آمده با دو روش تقریباً همزمان به کانفلوئنسی80% رسیـدند. آنها نشان دادند که روش Explant بازده بیشتری از سلولهای استرومال نسبت به روش هضم آنزیمی ارائه میدهد، که احتمالاً به دلیل کاهش قابلیت چسبندگی سلولهای قرار گرفته در معرض آنزیم و از دست رفتن سلولها در طول فرآیندهای فیلتراسیون و شستشو در روش هضم آنزیمی است (34). لذا استفاده از روشهای غیر آنزیمی در جهت جداسازی سلولهای MSC توصیه میشود. در این مطالعه نیز از روش Explant در جهت استخراج سلولهای WT-MSC استفاده گردید و معیارهای اصلی در جهت تائید و خلوص سلولهای MSC بر اساس انجمن بینالمللی سلول درمانی (ISCT)، همچون بررسی مورفولوژی و توانایی چسبندگی این سلولها به سطح، میزان تکثیر و قدرت تمایز آنها به بافت چربی و استخوان و حضور مارکرهای مختص سلولهای MSC (CD73 و CD105) و عدم حضور مارکرهای غیراختصاصی (CD34 و CD45) مورد تائید قــرار
گرفت.
علاوه بر انتخـاب منبع مناسب، تولید مقیاسپذیر و جداسازی sEVs ها با بازده و خلوص بالا و همچنین حفظ ساختار آنها چالش اصلی مرتبط با درمانهای مبتنی بر sEVs است. علاوه بر این، روش جداسازی باید مقرون به صرفه باشد و با فرآیند تولید با توان بالا سازگار باشد (14). امروزه روشهای مختلفی بر مبنای توانایی مؤثر در جهت جداسازی ذرات sEV و حذف پارتیکلهای اضافی در جهت جـداسازی sEVs وجود دارد (35). در اغلب مطالعهها، دو روش اولترا سانتریفیوژ و روش سانتریفیوژ شیب چگالی مورد مقایسه قرار گرفتهاند. نتایج نشان میدهد که استفاده از اولترا سانتریفیوژ دارای مزایایی همچون ظرفیت بـالای استخراج، خلوص بالا و آلودگی کمتر است. از طرفی، نیاز به تجهیزات گران قیمت و امکان آسیب به ذرات sEV در نتیجه سرعت بالای سانتریفیوژ از معایب استخراج sEV به کمک اولتراسانتریفیوژ محسوب میشود (36). سهولت بالا و عدم نیاز به تجهیزات ویژه از مزایای روشهای سانتریفیوژ شیب چگالی محسوب میشود که البته رسوب پروتئین و آلودگی sEVs به همراه پروتئین از جمله معایب این روش در نظر گرفته میشود (37).
در این مطالعه از کیت اگزوسیب در جهت جداسازی ذرات sEV موجود درسوپ سلولی سلولهای WT-MSC استفاده شد، که اساس روش این کیت بر مبنای سانتریفیوژ شیب چگالی است. پس از جداسازی، خصوصیات مورفولوژی ذرات sEV به کمک میکروسکوپ الکترونی تایید شد و عدم آسیب بـه ساختـار وزیکولها و یکپارچگی غشا آنها قابل رؤیت بود.
محدودیتهای مطالعه:
علیرغم دستاوردهای مطلوب در استخراج ذرات sEV از سلولهای WJ-MSC، این مطالعه با محدودیتهایی مواجه بود که بـاید در تفسیر نتایج و مطالعههای آتی مد نظر قرار گیرند: در این مطالعه، سنجش کمی پروتئین صرفاً بر اساس روش برادفورد (سنجش پروتئین کل) انجام شد. اگرچه این روش برای تعیین دوز اولیه و اثبات بازدهی استخراج کافی است، اما عدم استفاده از روشهایی نظیر وسترن بلات یا فلوسیتومتری برای شناسایی مارکرهای غشایی اختصاصی sEVs و همچنین روش NTA برای تعیین دقیق توزیع اندازه ذرات، از محدودیتهای فنی این پژوهش محسوب میشود.
نتیجهگیری
پژوهش حاضر تائید میکند که سلولهای WJ-MSC، به دلیل دسترسی غیر تهاجمی و توان تکثیری بالا، منبعی ایـدهآل و مقرون به صرفه برای استخراج ذرات sEV در مقیاس آزمایشگاهی هستند. همچنین نتایج نشان داد که استفاده از دستورالعمل جداسازی معرفی شده در این پژوهش، منجر به استحصال ذرات sEV با ساختار مورفولوژیک سالم و غلظت پروتئینی مناسب میگردد با این حـال، باید به محدودیتهایی در این مطالعه نظیر اکتفا به سنجش پروتئین کل به جای شناسایی مارکرهای اختصاصی (مانند وسترن بلات) اشاره نمود که پیشنهاد میشود در مطالعههای آینده، بـا استفاده از حجمهای بالاتری از بافت اولیه، مشخصهیـابی پروتئینی دقیقتر و بررسیهای عملکردی بر روی این ذرات sEV صورت پذیرد.
حمایت مالی
این پروژه توسط مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و معاونت علمی، فناوری و اقتصاد دانش بنیان ریاست جمهوری تأمین مالی شده است.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه در کمیته اخلاق در پژوهش پژوهشکده علوم غدد درونریز و متابولیسم ـ دانشگاه علوم پزشکــی شهیـــد
بهشتی کد اخلاق دریافت کرده است (IR.SBMU.ENDOCRINE.REC.1400.140).
عدم تعارض منافع
هیچگونه تعارض منافعی در مطالعه حاضر وجود ندارد.
نقش نویسندگان
میلاد خباره: انجام مراحل پژوهش، جمعآوری دادهها، تحلیل دادهها، تهیه گزارش، نگارش مقاله
دکتر مهسا صالحی: نگارش و ویرایش مقاله
دکتر سمیه صادقی: طراحی مطالعه، انجام مراحل پژوهش، تحلیل دادهها، هدایـــــت و راهنمایی پژوهش، نگارش و ویرایش مقاله
تشکر و قدردانی
مقاله حاضر، حاصل بخشی از نتایج پایاننامه کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون (شماره 1414) میباشد. هزینه اجرای طرح توسط مؤسسه عالی طب انتقال خون و حمایت مالی معاونت علمی، فناوری و اقتصاد دانش بنیان ریاست جمهوری تحت شماره گرنت (CT1402080876) در تهران، ایران، انجام شده است. بدین وسیله، از کلیه حمایتهای بیدریغ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و معاونت علمی، فناوری و اقتصاد دانش بنیان ریاست جمهوری کمال تشکر را داریم.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
سلولهاي بنيادي
فهرست منابع
1. de Abreu RC, Fernandes H, da Costa Martins PA, Sahoo S, Emanueli C, Ferreira L. Native and bioengineered extracellular vesicles for cardiovascular therapeutics. Nat Rev Cardiol . 2020; 17(11): 685-97. [DOI:10.1038/s41569-020-0389-5] [PMID] []
2. Trubiani O, Marconi GD, Pierdomenico SD, Piattelli A, Diomede F, Pizzicannella J. Human oral stem cells, biomaterials and extracellular vesicles: a promising tool in bone tissue repair. Int J Mol Sci. 2019; 20(20): 4987. [DOI:10.3390/ijms20204987] [PMID] []
3. Zhang Y, Liu Y, Liu H, Tang WH. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell Biosci. 2019; 9:1-18. [DOI:10.1186/s13578-019-0282-2] [PMID] []
4. Sadeghi S, Mosaffa N, Hashemi SM, Naghizadeh MM, Ghazanfari T. The immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells on long term pulmonary complications in an animal model exposed to a sulfur mustard analog. Int Immunopharmacol. 2020; 80: 105879. [DOI:10.1016/j.intimp.2019.105879] [PMID]
5. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(25): 13625-30. [DOI:10.1073/pnas.240309797] [PMID] []
6. Erices A, Conget P, Minguell JJ. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 2000; 109(1) :235-42. [DOI:10.1046/j.1365-2141.2000.01986.x] [PMID]
7. Baksh D, Yao R, Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007; 25(6): 1384- 92. [DOI:10.1634/stemcells.2006-0709] [PMID]
8. Meyer FA Laver-Rudich Z, Tanenbaum R. Evidence for a mechanical coupling of glycoprotein microfibrils with collagen fibrils in Wharton's jelly. Biochim Biophys Acta. 1983; 755(3): 376-87. [DOI:10.1016/0304-4165(83)90241-6] [PMID]
9. Shafiee A, Moradi L, Lim M, Brown J. Coronavirus disease 2019: a tissue engineering and regenerative medicine perspective. Stem Cell Transl Med. 2021; 10(1):27-38. [DOI:10.1002/sctm.20-0197] [PMID] []
10. Zhang S, Zhu D, Mei X, Li Z, Li J, Xie M, et al. Advances in biomaterials and regenerative medicine for primary ovarian insufficiency therapy. Bioact Mater. 2021; 6(7): 1957-72. [DOI:10.1016/j.bioactmat.2020.12.008] [PMID] []
11. Ahangari F , Mirsanei Z, Soudi S, Ghaffari Khaligh S, Soufi S , Seyed Mahmoud Hashemi SM. Isolation of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) from Wharton's Jelly (WJ) Tissue of Human Umbilical Cord (hUC); a Protocol. School of Medicine Students' Journal. 2022; 5: e42169.
12. Zolfaghar M, Mirzaeian L, Beiki B, Naji T, Moini A, Eftekhari-Yazdi P, et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 2020; 6(10):e04992. [DOI:10.1016/j.heliyon.2020.e04992] [PMID] []
13. Ding C, Zhu L, Shen H, Lu J, Zou Q, Huang C, et al. Exosomal miRNA-17-5p derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells improves ovarian function in premature ovarian insufficiency by regulating SIRT7. Stem Cells. 2020; 38(9): 1137-48. [DOI:10.1002/stem.3204] [PMID]
14. Sadeghi S Soudi S, Shafiee A, Hashemi SM. Mesenchymal stem cell therapies for COVID-19: Current status and mechanism of action. Life Sci. 2020:262: 118493. [DOI:10.1016/j.lfs.2020.118493] [PMID] []
15. Sadeghi S, Ramezani Tehrani F, Tahmasebi S, Shafiee A, Hashemi SM. Exosome engineering in cell therapy and drug delivery. Inflammopharmacology 2023 ;169:31 :145-169. [DOI:10.1007/s10787-022-01115-7] [PMID] []
16. Zhou T, Yuan Z, Weng J, Pei D, Du X, He C, et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. J Hematol oncol. 2021; 14: 1-24. [DOI:10.1186/s13045-021-01037-x] [PMID] []
17. Varaa N, Azandeh S, Khodabandeh Z, Gharravi AM .Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cell: Various Protocols for Isolation and Differentiation of Hepatocyte-Like Cells; Narrative Review.Iran J Med Sci. 2019; 44(6): 437-48.
18. Deuse T, Stubbendorff M, Tang-Quan K, Phillips N, Kay MA, Eiermann T, et al. Immunogenicity and Immunomodulatory Properties of Umbilical Cord Lining Mesenchymal Stem Cells . Cell Transplant. 2011; 20(5):655-67. [DOI:10.3727/096368910X536473] [PMID]
19. Drobiova H, Sindhu S, Ahmad R, Haddad D, Al-Mulla F, Al Madhoun A. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: a concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 2023; 11 :1211217. [DOI:10.3389/fcell.2023.1211217] [PMID] []
20. Rao MS, Mattson MP. Stem cells and aging: expanding the possibilities. Mech Ageing Dev. 2001; 122(7): 713-34. [DOI:10.1016/S0047-6374(01)00224-X] [PMID]
21. Manca M, Zwart I, Beo J, Palasingham R, Jen L, Navarrete R, et al. Characterization of mesenchymal stromal cells derived from full-term umbilical cord blood. Cytotherapy. 2008; 10(1): 54-68. [DOI:10.1080/14653240701732763] [PMID]
22. Varaa N, Azandeh S, Khodabandeh Z, Gharravi AM. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 2019; 44(6): 437-448.
23. Guan Y-T, Xie Y, Li D-S, Zhu Y-Y, Zhang X-L, Feng Y-L, et al. Comparison of biological characteristics of mesenchymal stem cells derived from the human umbilical cord and decidua parietalis. Mol Med Rep. 2019; 20(1): 633-9. [DOI:10.3892/mmr.2019.10286]
24. Beeravolu N, McKee C, Alamri A, Mikhael S, Brown C, Perez-Cruet M, et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. 2017 (122): 55224. [DOI:10.3791/55224-v] [PMID] []
25. Kim MJ, Shin KS, Jeon JH, Lee DR, Shim SH, Kim JK, et al. Human chorionic-plate-derived mesenchymal stem cells and Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: a comparative analysis of their potential as placenta-derived stem cells. Cell Tissue Res. 2011; 346(1): 53-64. [DOI:10.1007/s00441-011-1249-8] [PMID]
26. Wang Q ,Yang Q, Wang Z, Tong H, Ma L, Zhang Y, et al. Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from fetal-bone marrow, adipose tissue, and Warton's jelly as sources of cell immunomodulatory therapy.Hum Vaccin Immunother. 2016; 12(1): 85-96. [DOI:10.1080/21645515.2015.1030549] [PMID] []
27. Can A, Balci D. Isolation culture, and characterization of human umbilical cord stroma-derived mesenchymal,stem cells. Methods Mol Biol. 2011; 698: 51-62. [DOI:10.1007/978-1-60761-999-4_5] [PMID]
28. Tong CK, Vellasamy Sh, Tan BC, Abdullah M, Vidyadaran Sh, Seow HF, et al. Generation of mesenchymal stem, method. Cell Biol Int, 2011; 35(3): 221-6. [DOI:10.1042/CBI20100326] [PMID]
29. De Bruyn C, Najar M, Raicevic G, Meuleman N, Pieters K, Stamatopoulos B, et al. A rapid, simple, and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton's jelly without enzymatic treatment. Stem Cells Dev. 2011; 20(3): 547-57. [DOI:10.1089/scd.2010.0260] [PMID]
30. Seshareddy K, Troyer D, Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 2008; 86: 101-19 . [DOI:10.1016/S0091-679X(08)00006-X] [PMID]
31. Priya N, Sarcar S, Majumdar AS, SundarRaj S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. J Tissue Eng Regen Med. 2014; 8(9): 706-16. [DOI:10.1002/term.1569] [PMID]
32. Hilkens P, Gervois P, Fanton Y, Vanormelingen J, Martens W, Struys T, et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Res. 2013; 353(1): 65-78. [DOI:10.1007/s00441-013-1630-x] [PMID]
33. Yoon JH, Roh EY, Shin S, Jung NH, Song EY, Chang JY, et al. Comparison of Explant‐Derived and Enzymatic Digestion‐Derived MSCs and the Growth Factors from Wharton's Jelly. BioMed res Int. 2013; 2013(1): 428726. [DOI:10.1155/2013/428726] [PMID] []
34. Jing W, Xiao J, Xiong Z, Yang X, Huang Y, Zhou M, et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose‐derived stromal cells for tissue engineering. Artif Organs. 2011; 35(2): 105-12. [DOI:10.1111/j.1525-1594.2010.01054.x] [PMID]
35. Zhang Z, Wang C, Li T, Liu Z, Li L. Comparison of ultracentrifugation and density gradient separation methods for isolating Tca8113 human tongue cancer cell line ‑ derived exosomes. Oncol Lett. 2014; 8(4): 1701-06. [DOI:10.3892/ol.2014.2373] [PMID] []
36. Skottvoll FS, Berg H, Bjorseth K, Lund K, Roos N, Bekhradnia S, et al. Comparison of ultracentrifugation and a commercial kit for isolationof exosomes derived from glioblastoma and breast cancer cells. bioRxiv. 2018; 274910. [DOI:10.1101/274910] [PMID] []
37. Weng Y, Sui Z, Shan Y, Hu Y, Chen Y, Zhang L, et al. Effective isolation of exosomes with polyethyleneglycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. Analyst. 2016; 141(15): 4640-6. [DOI:10.1039/C6AN00892E] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
