جلد 20، شماره 1 - ( بهار 1402 )
جلد 20 شماره 1 صفحات 52-44 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Farjadi A, Masoomizadeh S, Andashti B. Association study of RBC indices with Beta globin gene mutations in beta thalassemia carriers in Khuzestan province. bloodj 2023; 20 (1) :44-52
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1469-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1469-fa.html
فرجادی عاطفه، معصومی زاده سیده زهرا، اندشتی بهناز. بررسی ارتباط اندازه شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون با نوع جهش‌های ژن بتاگلوبین در ناقلین بتا تالاسمی استان خوزستان. فصلنامه پژوهشی خون. 1402; 20 (1) :44-52
دانشکده علوم دانشگاه شهید چمران
متن کامل [PDF 608 kb]
(698 دریافت)
| چکیده (HTML) (1049 مشاهده)
مقدمه
تالاسـمی شایع‌ترین بیماری ارثی در دنیاست کـه وراثــت آن از نوع اتوزومی مغلـوب می‌باشد. این اختلال در حوزه دریای مدیترانه، استوا و نزدیک آن در آسیا و آفریقا بسیار شایع است(1). هم‌چنین این بیمـاری دارای شیــوع زیـادی در کشور ماسـت ولی عمـدتاً در نـواحی ســواحل دریـای خزر و خلیج فارس دارای گسـترد‌گـی بیـشتـری می‌باشد(2). به طور متوسط 5/4 درصد از جمعیت ایران ناقل بتاتالاسمی هستند و طیف بیماری از ۱ تا ۱۰ درصد در استان‌های مختلف متفاوت است. فرد مبتلا در طول زندگی وابسته به تزریق مـداوم و ماهانه خون و تزریق روزانه دسفرال می باشد. علاوه بر این، عوارض مختلف جسمانی، غددی، کبدی، قلبی، اسـتخوانی وغیره نیز در طول درمان بـروز مـی‌کنـد. این بیمـاری دراثـر ازدواج دو فـرد ناقل بتا تالاسمی و با احتمال 25 درصد در هـر حـاملگی بـه وجود می‌آید(5-3). یکی از علایـم اصلی ناقلان بتاتالاسـمی کاهـش شاخـص‌های خونی گلبـول‌های قرمز و بعضـاً الگوی همـوگلوبین آنهاست. شاخـص‌های خـونی گلبول‌های قرمز ناقـلان نسـبت به افـراد سـالم به صـورت زیـر مـی‌باشد: میکروسیتوز یا کوچک شدن حجم گلبول‌های قرمز و پایین بودن MCV و هیپوکرومیا یا کم رنگ شدن گلبول‌های قـرمز و پایین بودن MCH هم‌چنین پایین بودن نامحسوس تا کم غلظت هموگلوبین یا MCHC ، پایین بودن غلظت هموگلوبین(Hb) و افزایش تعداد سلول‌های قرمز خونی(RBC ) و تغییراتی در میزان الگوی همـوگلـوبین از جملـه پایین بودن هموگلوبینA (HbA) و بالا بودن هموگلوبین A2 (HbA2) و هموگلوبین جنینی F (HbF) (1).
در افراد بالغ سالم حدود 95% هموگلوبین خون از نوع A (a2b2) می‌باشد به همراه مقادیر کمی(5/3%<) هموگلوبین A2 (a2d2) و هموگلوبین F (a2γ2) که هموگلوبین جنینی است(6). تنظیم این که در هر مرحله از تکامل کدام ژن از خانواده‌های آلفا و بتا بیان شود به عهده عوامل تنظیم‌کننده ژنـی در ناحیـهLCR (Locus Control Region) مـی‌بــاشد.
LCR خانواده بتا در فاصله 20 کیلوبازی سمت ¢5 آخرین ژن قرار دارد(7)(شکل 1).
اساس مولکولی این بیماری، جهش و نقص در ساختمان ژن بتاگلوبین است و بیش از 400 نوع جهش در دنیا گزارش شده است. البته هر جمعیت طیف خاصی از جهش‌های ژن بتاگلوبین را نشان می‌دهد(8). مطالعه‌های جمعیتی نشان داده که حدود 40 جهش بیش از 90% از جهش‌های بتا تالاسمی را در دنیا تشکیل می‌دهند و در مناطقی که بتا تالاسمی شایع است، فقط انواع کمی از جهش‌ها(8-4 جهش) شایع هستند و تعداد متنوعی از جهش‌های نادر نیز وجود دارد که البته شیوع کمتری دارند(9). با توجه به شیوع بالای این بیماری در کشور، یافتن روش‌های تشخیصی سریع و کم هزینه می‌تواند برای جامعه و به ویژه مراکز غربالگری حائز اهمیت باشد.
هدف از این مطالعه یافتن رابطه‌ای بین شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون و نوع جهش‌های ژنی منجر به بیماری در ناقلین بتا تالاسمی بود. نتایج این تحقیق می‌تواند به ویژه در تشخیص‌های پیش از تولد به کار گرفته شود. بدین صورت که با اندازه‌گیری شاخص‌های گلبول قرمز فرد ناقل و جنین او که با یک آزمایش CBC ساده و ارزان قابل انجام است، و با بررسی این مقادیر احتمالاً می‌توان نوع جهش را چنانچه جزء جهش‌های شایع منطقه باشد با استفاده از روش‌هایی نظیر ARMS-PCR ، سریع‌تر تشخیص داد و دیگر نیازی به انجام آزمایش‌های پرهزینه توالی‌یابی برای فرد نباشد. بررسی‌های تکمیلی در تشخیص نهایی توصیه می‌شود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه توصیفی ـ تحلیلی، جمع‌آوری نمونه‌ها با دسترسی به پرونده پزشکی بیماران مبتلا به بتا تالاسمی ماژور مراجعه‌کننده به مرکز تحقیقات تالاسمی واقع در بیمارستان شفای اهواز انجام گرفت. بیماران تالاسمی ماژور احتمالاْ دارای والدین ناقل بوده‌اند، اما با این حال تنها نمونه والدینی که از نظر علایم بالینی، آزمایش‌های خونشناسی و الکتروفورز هموگلوبین مینور بودن آن‌ها تایید شده بود، به عنوان جمعیت مورد مطالعه انتخاب شدند. پس 200 نمونه به صورت غیرتصادفی آسان و در بازه زمانی سال 1395 تا 1400 که همگی والدین بیماران تالاسمی ماژور در استان خوزستان بودند، انتخاب شدند. نکته مهم در انتخاب نمونه این بود که بیماران حتماً در ژن بتاگلوبین خود جهش نشان داده باشند. این بررسی از نوع مطالعه توصیفی-تحلیلی بوده و به بررسی ارتباط انواع جهش‌ها با اندازه شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون ناقلان بتا تالاسمی پرداخته است. به منظور رعایت کلیه موازین اخلاقی در این تحقیق، صرفاً از نتایج آزمایش‌های خونی مندرج در فرم‌های افراد استفاده شده و محرمانه بودن نام آن‌ها در تمام مراحل تحقیق رعایت گردید. ضمناْ شناسه پژوهشی اخلاق نیز برای این تحقیق با شماره IR.IAU.AHVAZ.REC.1401.110 به ثبت رسید.
اطلاعاتی که از آزمایش‌های خونی(CBC) ناقلان استخراج شد شامل شمارش گلبول‌های قرمز، میزان هموگلوبین، MCV و MCH بود. هم‌چنین به دلیلMCV و MCH پایین در ناقلان طبق برنامه کشوری پیشگیری از تالاسمـی، الکتروفـورز همـوگلوبین نیز برای این افراد انجام
شده بود پس مقادیر هموگلوبین A ، A2 و F نمونه‌ها نیز از فرم‌ها استخراج و نوشته شد. به منظور تعیین جهش نیز از نمونه خون هر یک از افراد که در آرشیو مرکز نگهداری می‌شدند، به میزان 5/0 میلی‌لیتر برداشته و استخراج DNA به روش نمکی(Salting out) بر روی آن‌ها انجام شد(10). سپس با طراحی آغازگرهای ویژه ژن، توالی ژن بتاگلوبین(Hbβ) در یک قطعه به طول حدود 1800 جفت باز به کمک روش PCR تحت شرایط دمایی ۳ دقیقه در 94 درجه سانتی‌گراد (1 چرخه)، 30 ثانیه 94 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه 61 درجه سانتی‌گراد و 35 ثانیه 72 درجه سانتی‌گراد(35 چرخه) و در نهایت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد(1 چرخه) در دستگاه ترموسایکلر بیوراد تکثیر شد. پس از تکثیر ژن به روش سانجر و در دستگاه ABI-PRISM 3700 تعیین توالی شد. نتایج تعیین توالی ابتدا در برنامه کروماس بررسی شده و سپس در برنامه نوکلئوتید بلاست با توالی مرجع مقایسه و جهش‌ها شناسایی شدند. جهت طراحی آغازگرها از نرم‌افزار اولیگو 7 استفاده شد و توالی الگوی ژن بتاگلوبین(ID: 3043) به عنوان توالی مرجع از بانک ژن NCBI گرفته شد. لازم به ذکر است که به منظور تعیین توالی کل ژن بتاگلوبین از سه آغازگر کمکی دیگر نیز استفاده شد(جدول 1). در مجموع داده‌های 200 نمونه با 26 نوع جهش متفاوت وارد نرم‌افزار SPSS ( نسخه 26) شد و روش آماری آنالیز واریانس(Anova) به منظور بررسی ارتباط جهش‌های ژن بتاگلوبین با هر یک از شاخص‌های خونی مورد استفاده قرار گرفت. سطح معناداری در این مطالعه 05/0 p< در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
در این تحقیق به طور کلی 200 نمونه مورد بررسی قرار گرفت که از این تعداد 110 زن و 90 مرد بودند. پس از دسته‌بندی آماری مقادیر عددی هریک از شاخص‌های گلبول قرمز مورد بررسی و نتایج زیر به دست آمد(جدول2).
همان‌طور که در جدول 2 مشاهده می‌شود مقدار RBC
کمتر از 5 میلیون در مترمکعب در 20 نفر(10%) دیده شده و RBC بالاتر از 7 میلیون در مترمکعب در 12 نفر(6%) بودند.
در مورد شاخص MCV هم مقادیر fL 60 > MCV با 40%
و مقادیر70 ≥MCV ≥60 با 53% بیشترین فراوانی را در بین افراد مورد مطالعه نشان دادند. در مورد فاکتور MCH نیز مقادیرPg
20 > MCH با 51% و مقادیر 26 ≥MCH ≥20 
با حدود 45% بیشترین فراوانی را داشتنــد. در آزمایش‌هــای الکتروفورز هموگلوبین افراد مورد مطالعه انواع هموگلوبین‌های A ، A2 و F اندازه‌گیری شد و نتایج نشان داد که اولاً مقادیر10< Hb در 80% افراد دیده شد و مقادیر 2 ≥ HbA2 نیز در بیش از 99% افراد گزارش شد و در نهایت هموگلوبین F بالاتر از یک نیز در 86% موارد گزارش شد(جدول 3).
در مورد بررسی نوع جهش ژن بتاگلوبین در افراد مورد مطالعه به طور کلی در 200 مورد 26 نوع جهش بتا تالاسمی
تشخیص داده شد. البته فراوانی بیش از 60% موارد تنها مربوط به چهار جهش شایع IVSII-1(G>A) ، IVSI-110(G>A) ، CD36/37(-T) و IVSI-5(G>C) بودند و بقیه جهش‌ها مربوط به حدود 40% باقی‌مانده افراد بود. به طوری که 10 نوع از جهش‌ها تنها در یک یا دو فرد دیده شدند (نمودار 1).
به منظور بررسی آماری داده‌ها تنها چهار جهش شایع اول که با فراوانی بالاتر از 10 نفر بودند وارد برنامه آماری SPSS شده و بدین ترتیب تعداد 120 نفر بررسی و 80 نفر که دارای جهش‌های دیگر بودند کنار گذاشته شدند(جدول ۴).
در این مطالعه سطح معناداری
05/0 P< در نظر گرفته شد و پس از بررسی مشخص شد که به لحاظ آماری ارتباط معناداری بین تغییرات میانگین شاخص خونی MCV و نوع جهش در افراد ناقل مورد مطالعه وجود دارد. اما سایر متغیرها نظیر HbA2 ، Hb و MCH با نوع جهش ارتباط معناداری نداشتند. در بین چهار جهش شایع بیشترین فراوانی مربوط به جهش 
IVSII-1(G>A) با فراوانی 5/22 درصد و کمترین فراوانی مربوط به جهش شایع 
IVSI-5(G>C) با فراوانی 7 درصد بود. هم‌چنین میانگین متغیرهای شاخص‌های خونی ناقلان بتا تالاسمی برحسب نوع جهش مورد بررسی قرار گرفت که بیشترین مقدار میانگین MCV با
عدد 4/65 در مبتلایان با جهش
IVSI-110(G>A) و کمترین مقدار میانگین مربوط به جهش IVSII-1(G>A) 
با عدد 61
بود (جدول 4).
بحث
در مطالعه‌های انجام شده در دنیا ارتباط بین جهش‌های ناقلان بتا تالاسمی و شاخص‌های خونی به صورت پراکنده و اندک صورت گرفته است و نشان می‌دهد که شدت و نوع جهش می‌تواند در تغییر میزان شاخص‌های خونی تأثیر داشته باشد.
در تحقیق حاضر رابطه بین چهار جهش شایع در ناقلان بتا تالاسمی استان خوزستان و شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون شامل MCV ، MCH ، Hb و HbA2 بررسی شد و مشخص گردید که شاخص MCV با نوع جهش در جمعیت مورد مطالعه از ارتباط معناداری برخوردار است.
دقیق‌تریـن روش‌هـا بـرای تشخیـص تـالاسمی مینـور
اندازه‌گیری کمی هموگلوبین A2 و F و تعیین نسبت ساخت زنجیره گلوبین و تعیین جهش در مولکول DNA می‌باشد. به دلیل هزینه بالا، این آزمایش‌ها در غربالگری استفاده نمی‌شوند. از آن جا که در همه موارد تالاسمی به صورت ثابت هیپوکرومیا (Pg 30 MCH <) و میکروسیتوز(fL 80 MCV<) دیده می‌شود، لذا از این شاخص‌های گلبول‌های قرمز به عنوان راه‌های تشخیص اولیه بسیار استفاده می‌شود(12، 11).
در کشور ما نیز Pg 27 MCH < و fL 80 MCV < به عنوان شاخص غربالگری به‌کار می‌روند. همان طور که در جدول 2 نشان داده شد، موارد 30 MCH > تنها 2 مورد (1%) بوده و در مورد شاخص MCV نیز موارد 80 MCV > تنها 4 مورد (2%) از نمونه‌های مورد مطالعه را به خود اختصاص داده‌اند در حالی که در مورد تعداد RBCها 20 مورد (10%) موارد کمتر از 5 میلیون در میلی‌متر مکعب و در مورد هموگلوبین نیز موارد بالاتر از
g/dL 11 در بیش از 60% موارد دیده شده است(جدول 3). بنابراین با توجه به یافته‌های فوق مشخص می‌شود که مقدار هموگلوبین و RBC از حساسیت کمتری در غربالگری برخوردار هستند و بر عکس MCV و به ویژه Pg 27 MCH < اهمیت شایانی دارند.
در نتایج الکتروفورز هموگلوبین نیز که از شاخص‌های تشخیص بتا تالاسمی مینور هستند، مطابق داده‌های جدول 3، هموگلوبین A2 بالاتر از 5/3 در بیش از 90% موارد و هموگلوبین F بالاتر از 1 در بیش از 85% موارد از جمعیت مورد مطالعه دیده شد. پس این دو شاخص نیز نمی‌توانند به عنوان شاخص‌های حساس در غربالگری استفاده شوند.
همان طور که اشاره شد به منظور تشخیص اولیه بیماران مبتلا به تالاسمی از متغیرهای خونی نظیر MCV ، MCH و Hb و جهت تأیید تشخیص اولیه از شناسایی نوع جهش استفاده می‌شود. در حال حاضر بیش از 400 نوع جهش در ژن گلوبین در جمعیت‌های مختلف جهان گزارش شده است(7). در مطالعه حاضر شایع‌ترین جهش در ژن بتاگلوبین IVSII-1 با فراوانی 5/22 درصد بود. این نتیجه با سایر مطالعه‌های انجام شده در جمعیت‌های ایران هم خوانی دارد(13، 3).
در تحقیق بهفر و همکاران، ارتباط بین انواع جهش با 8 نوع شاخص خونی MCV ، MCH ، HG ، HbF ، HbA و HbA2 مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که همه شـاخص‌هـا بـه صورت کـم و بیـش بـا جهش‌های متفاوت
بتاگلوبین در تغییر بودند. هم چنین مشخص گردید که میانگین دو شاخص MCV و MCH از نظر آماری ارتباط معناداری با نوع جهش اعم از شدید(β˚) یا ضعیف(β+) دارد. در حالی‌که ارتباط بین شدت جهش و میانگین شاخص‌های خونی دیگر معنا‌دار نبود.
هم‌چنین شایع‌ترین جهش در مطالعه فوق IVSII-(G>A) بـا فراوانی40% گزارش شد که از این نظر نیز مطالعه حاضر با آن هم‌خوانی دارد(14).
در مطالعه راند و همکاران که رابطه بین شاخص MCV و شدت جهش‌های بتا تالاسمی در 113 بیمار را بررسی نمودند، به طور کلی 18 نوع جهش گزارش شده که شایع‌ترین آن‌ها جهش IVSII-1(G>A) می‌باشد و در راستای مطالعه حاضر بوده، هم‌چنین ارتباط مستقیم و معناداری بین میزان کاهش MCV و شدت جهش بتا تالاسمی گزارش شده و نشان داده که MCV به عنوان پارامتر مهمی برای شناسایی سریع جهش به ویژه در زمینه تشخیص‌های پیش از تولد می‌تواند باشد و نتایج پژوهش حاضر نیز در راستای این مطالعه می‌باشد(15).
در تحقیق ابراهیم‌زاده و همکاران نیز که بر روی بررسی ارتباط شاخص‌های خونی در ناقلان آلفاتالاسمی انجام شده، مشخص گردید که ارتباط مستقیم بین شاخص‌های MCV و MCH و شدت جهش در ناقلان آلفاتالاسمی هم وجود دارد که می‌تواند به عنوان یک الگوی با ارزش، جهت تشخیص
سریع نوع جهش‌ها در جمعیت ایران به کار رود(16).
نتیجه‌گیری
در ایـن مطالعـه مقادیـر شاخـص‌های خونی مختلف در
ناقلان بتاتالاسمی مورد بررسی قرار گرفته و ارتباط آن‌ها با نوع جهش‌های ژن بتاگلوبین در این افراد سنجیده شد و ارتباط معناداری از نظر آماری بین مقدار میانگین MCV افراد با جهش‌های آن‌ها مشاهده شد. در حالی که نوع جهش با متغیرهای دیگر ارتباط معناداری نشان نداد. جهش IVSII-1(G>A) شایع‌ترین جهش در جمعیت ناقلان مورد مطالعه در استان خوزستان بود. هم‌چنین نتایج تحقیق حاضر در راستای بسیاری از مطالعه‌های انجام گرفته در این زمینه بوده و می‌تواند به عنوان یک راهنما جهت امکان دسترسی سریع به نوع جهش باشد. با جایگزینی روش‌های تشخیصی سریع و ارزان به جای روش‌های تعیین توالی که هزینه و زمان زیادی را صرف می‌کنند، می‌توان به تشخیص جهش ژن در زوجین ناقل مراجعه کننده به مراکز مشاوره ژنتیکی یا مراکز تشخیص پیش از تولد کمک شایانی نمود.
تشکر و قدردانی
از استاد گرامی آقای دکتر حمید گله‌داری و پرسنل محترم آزمایشگاه ژنتیک بیمارستان شفا که ما را در جمع‌آوری اطلاعات بیماران و تهیه نمونه یاری نمودند، کمال تشکر و قدردانی می‌گردد.
متن کامل: (850 مشاهده)
بررسی ارتباط اندازه شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون با نوع جهش‌های ژن
بتاگلوبین در ناقلین بتا تالاسمی استان خوزستان
عاطفه فرجادی1، سیده زهرا معصومی‌زاده2، بهناز اندشتی3
چکیده
سابقه و هدف
بتاتالاسـمی شایع‌ترین بیماری ارثی تک ژنی در سراسر دنیاست کـه با الگوی اتوزومی مغلـوب به ارث می‌رسد و در اثر جهش در ژن بتاگلوبین ایجاد می‌شود. از علایـم ناقلین بتا تالاسـمی، کاهـش شاخـص‌های خونی گلبـول‌های قرمز و تغییراتی در میزان همـوگلـوبین از جمله پایین بودن هموگلوبین A1 و بالا بودن هموگلوبین A2 را می‌توان نام برد. هدف این تحقیق، یافتن رابطه‌ای بین مقادیر این شاخص‌ها و نوع جهش‌های ژنی منجر به بیماری می‌باشد که می‌تواند به عنوان روش تشخیص سریع نوع جهش در غربالگری اولیه ناقلین و تشخیص‌های پیش از تولد به کار رود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی ـ تحلیلی پس از تکثیر و تعیین توالی ژن بتاگلوبین به روش سانجر از جمعیت 200 نفری ناقلین بتا تالاسمی استان خوزستان، ارتباط جهش‌های ژن با اندازه شاخص‌های گلبول‌های قرمز افراد به روش آماری تجزیه و تحلیل واریانس(Anova) و به کمک نرم‌افزار 26SPSS مورد بررسی آماری قرار گرفت.
یافته‌ها
نتایج نشان داد که جهش IVSII-1(G>A)با 5/22% فراوانی شایع‌ترین جهش در این جمعیت بوده و هم‌چنین از نظر آماری ارتباط معناداری بین تغییرات میانگین شاخص MCV افراد نسبت به نوع جهش‌آن‌ها وجود دارد. به طوری که بیشترین میانگین این شاخص با مقدار 7/3 ± 4/65 در جهش IVSI-110(G>A) مشاهده شد.
نتیجه گیری
یافته‌های تحقیق حاضر در راستای بسیاری از مطالعه‌های انجام گرفته در این زمینه بوده و می‌تواند به عنوان یک راهنما جهت امکان تشخیص سریع نوع جهش در مراکز تشخیصی و درمانی به کار رود.
کلمات کلیدی: بتا تالاسمی، شاخص‌های اریتروسیتی، گلبول‌های قرمز
تاریخ دریافت: 19/07/1401
تاریخ پذیرش: 27/10/1401
1- کارشناس ارشد ژنتیک ـ دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز ـ اهواز ـ ایران
2- PhD زیست دریا ـ استادیار دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز ـ اهواز ـ ایران
3- PhD بیوشیمی ـ دانشکده علوم دانشگاه شهید چمران ـ اهواز ـ ایران ـ صندوق پستی: 44337-61357
بتاگلوبین در ناقلین بتا تالاسمی استان خوزستان
عاطفه فرجادی1، سیده زهرا معصومی‌زاده2، بهناز اندشتی3
چکیده
سابقه و هدف
بتاتالاسـمی شایع‌ترین بیماری ارثی تک ژنی در سراسر دنیاست کـه با الگوی اتوزومی مغلـوب به ارث می‌رسد و در اثر جهش در ژن بتاگلوبین ایجاد می‌شود. از علایـم ناقلین بتا تالاسـمی، کاهـش شاخـص‌های خونی گلبـول‌های قرمز و تغییراتی در میزان همـوگلـوبین از جمله پایین بودن هموگلوبین A1 و بالا بودن هموگلوبین A2 را می‌توان نام برد. هدف این تحقیق، یافتن رابطه‌ای بین مقادیر این شاخص‌ها و نوع جهش‌های ژنی منجر به بیماری می‌باشد که می‌تواند به عنوان روش تشخیص سریع نوع جهش در غربالگری اولیه ناقلین و تشخیص‌های پیش از تولد به کار رود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی ـ تحلیلی پس از تکثیر و تعیین توالی ژن بتاگلوبین به روش سانجر از جمعیت 200 نفری ناقلین بتا تالاسمی استان خوزستان، ارتباط جهش‌های ژن با اندازه شاخص‌های گلبول‌های قرمز افراد به روش آماری تجزیه و تحلیل واریانس(Anova) و به کمک نرم‌افزار 26SPSS مورد بررسی آماری قرار گرفت.
یافته‌ها
نتایج نشان داد که جهش IVSII-1(G>A)با 5/22% فراوانی شایع‌ترین جهش در این جمعیت بوده و هم‌چنین از نظر آماری ارتباط معناداری بین تغییرات میانگین شاخص MCV افراد نسبت به نوع جهش‌آن‌ها وجود دارد. به طوری که بیشترین میانگین این شاخص با مقدار 7/3 ± 4/65 در جهش IVSI-110(G>A) مشاهده شد.
نتیجه گیری
یافته‌های تحقیق حاضر در راستای بسیاری از مطالعه‌های انجام گرفته در این زمینه بوده و می‌تواند به عنوان یک راهنما جهت امکان تشخیص سریع نوع جهش در مراکز تشخیصی و درمانی به کار رود.
کلمات کلیدی: بتا تالاسمی، شاخص‌های اریتروسیتی، گلبول‌های قرمز
تاریخ دریافت: 19/07/1401
تاریخ پذیرش: 27/10/1401
1- کارشناس ارشد ژنتیک ـ دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز ـ اهواز ـ ایران
2- PhD زیست دریا ـ استادیار دانشکده علوم پایه دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز ـ اهواز ـ ایران
3- PhD بیوشیمی ـ دانشکده علوم دانشگاه شهید چمران ـ اهواز ـ ایران ـ صندوق پستی: 44337-61357
مقدمه
تالاسـمی شایع‌ترین بیماری ارثی در دنیاست کـه وراثــت آن از نوع اتوزومی مغلـوب می‌باشد. این اختلال در حوزه دریای مدیترانه، استوا و نزدیک آن در آسیا و آفریقا بسیار شایع است(1). هم‌چنین این بیمـاری دارای شیــوع زیـادی در کشور ماسـت ولی عمـدتاً در نـواحی ســواحل دریـای خزر و خلیج فارس دارای گسـترد‌گـی بیـشتـری می‌باشد(2). به طور متوسط 5/4 درصد از جمعیت ایران ناقل بتاتالاسمی هستند و طیف بیماری از ۱ تا ۱۰ درصد در استان‌های مختلف متفاوت است. فرد مبتلا در طول زندگی وابسته به تزریق مـداوم و ماهانه خون و تزریق روزانه دسفرال می باشد. علاوه بر این، عوارض مختلف جسمانی، غددی، کبدی، قلبی، اسـتخوانی وغیره نیز در طول درمان بـروز مـی‌کنـد. این بیمـاری دراثـر ازدواج دو فـرد ناقل بتا تالاسمی و با احتمال 25 درصد در هـر حـاملگی بـه وجود می‌آید(5-3). یکی از علایـم اصلی ناقلان بتاتالاسـمی کاهـش شاخـص‌های خونی گلبـول‌های قرمز و بعضـاً الگوی همـوگلوبین آنهاست. شاخـص‌های خـونی گلبول‌های قرمز ناقـلان نسـبت به افـراد سـالم به صـورت زیـر مـی‌باشد: میکروسیتوز یا کوچک شدن حجم گلبول‌های قرمز و پایین بودن MCV و هیپوکرومیا یا کم رنگ شدن گلبول‌های قـرمز و پایین بودن MCH هم‌چنین پایین بودن نامحسوس تا کم غلظت هموگلوبین یا MCHC ، پایین بودن غلظت هموگلوبین(Hb) و افزایش تعداد سلول‌های قرمز خونی(
در افراد بالغ سالم حدود 95% هموگلوبین خون از نوع A (a2b2) می‌باشد به همراه مقادیر کمی(5/3%<) هموگلوبین A2 (a2d2) و هموگلوبین F (a2γ2) که هموگلوبین جنینی است(6). تنظیم این که در هر مرحله از تکامل کدام ژن از خانواده‌های آلفا و بتا بیان شود به عهده عوامل تنظیم‌کننده ژنـی در ناحیـهLCR (Locus Control Region) مـی‌بــاشد.
LCR خانواده بتا در فاصله 20 کیلوبازی سمت ¢5 آخرین ژن قرار دارد(7)(شکل 1).
اساس مولکولی این بیماری، جهش و نقص در ساختمان ژن بتاگلوبین است و بیش از 400 نوع جهش در دنیا گزارش شده است. البته هر جمعیت طیف خاصی از جهش‌های ژن بتاگلوبین را نشان می‌دهد(8). مطالعه‌های جمعیتی نشان داده که حدود 40 جهش بیش از 90% از جهش‌های بتا تالاسمی را در دنیا تشکیل می‌دهند و در مناطقی که بتا تالاسمی شایع است، فقط انواع کمی از جهش‌ها(8-4 جهش) شایع هستند و تعداد متنوعی از جهش‌های نادر نیز وجود دارد که البته شیوع کمتری دارند(9). با توجه به شیوع بالای این بیماری در کشور، یافتن روش‌های تشخیصی سریع و کم هزینه می‌تواند برای جامعه و به ویژه مراکز غربالگری حائز اهمیت باشد.
هدف از این مطالعه یافتن رابطه‌ای بین شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون و نوع جهش‌های ژنی منجر به بیماری در ناقلین بتا تالاسمی بود. نتایج این تحقیق می‌تواند به ویژه در تشخیص‌های پیش از تولد به کار گرفته شود. بدین صورت که با اندازه‌گیری شاخص‌های گلبول قرمز فرد ناقل و جنین او که با یک آزمایش CBC ساده و ارزان قابل انجام است، و با بررسی این مقادیر احتمالاً می‌توان نوع جهش را چنانچه جزء جهش‌های شایع منطقه باشد با استفاده از روش‌هایی نظیر ARMS-PCR ، سریع‌تر تشخیص داد و دیگر نیازی به انجام آزمایش‌های پرهزینه توالی‌یابی برای فرد نباشد. بررسی‌های تکمیلی در تشخیص نهایی توصیه می‌شود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه توصیفی ـ تحلیلی، جمع‌آوری نمونه‌ها با دسترسی به پرونده پزشکی بیماران مبتلا به بتا تالاسمی ماژور مراجعه‌کننده به مرکز تحقیقات تالاسمی واقع در بیمارستان شفای اهواز انجام گرفت. بیماران تالاسمی ماژور احتمالاْ دارای والدین ناقل بوده‌اند، اما با این حال تنها نمونه والدینی که از نظر علایم بالینی، آزمایش‌های خونشناسی و الکتروفورز هموگلوبین مینور بودن آن‌ها تایید شده بود، به عنوان جمعیت مورد مطالعه انتخاب شدند. پس 200 نمونه به صورت غیرتصادفی آسان و در بازه زمانی سال 1395 تا 1400 که همگی والدین بیماران تالاسمی ماژور در استان خوزستان بودند، انتخاب شدند. نکته مهم در انتخاب نمونه این بود که بیماران حتماً در ژن بتاگلوبین خود جهش نشان داده باشند. این بررسی از نوع مطالعه توصیفی-تحلیلی بوده و به بررسی ارتباط انواع جهش‌ها با اندازه شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون ناقلان بتا تالاسمی پرداخته است. به منظور رعایت کلیه موازین اخلاقی در این تحقیق، صرفاً از نتایج آزمایش‌های خونی مندرج در فرم‌های افراد استفاده شده و محرمانه بودن نام آن‌ها در تمام مراحل تحقیق رعایت گردید. ضمناْ شناسه پژوهشی اخلاق نیز برای این تحقیق با شماره IR.IAU.AHVAZ.REC.1401.110 به ثبت رسید.
اطلاعاتی که از آزمایش‌های خونی(CBC) ناقلان استخراج شد شامل شمارش گلبول‌های قرمز، میزان هموگلوبین، MCV و MCH بود. هم‌چنین به دلیلMCV و MCH پایین در ناقلان طبق برنامه کشوری پیشگیری از تالاسمـی، الکتروفـورز همـوگلوبین نیز برای این افراد انجام
شده بود پس مقادیر هموگلوبین A ، A2 و F نمونه‌ها نیز از فرم‌ها استخراج و نوشته شد. به منظور تعیین جهش نیز از نمونه خون هر یک از افراد که در آرشیو مرکز نگهداری می‌شدند، به میزان 5/0 میلی‌لیتر برداشته و استخراج DNA به روش نمکی(Salting out) بر روی آن‌ها انجام شد(10). سپس با طراحی آغازگرهای ویژه ژن، توالی ژن بتاگلوبین(Hbβ) در یک قطعه به طول حدود 1800 جفت باز به کمک روش PCR تحت شرایط دمایی ۳ دقیقه در 94 درجه سانتی‌گراد (1 چرخه)، 30 ثانیه 94 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه 61 درجه سانتی‌گراد و 35 ثانیه 72 درجه سانتی‌گراد(35 چرخه) و در نهایت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد(1 چرخه) در دستگاه ترموسایکلر بیوراد تکثیر شد. پس از تکثیر ژن به روش سانجر و در دستگاه ABI-PRISM 3700 تعیین توالی شد. نتایج تعیین توالی ابتدا در برنامه کروماس بررسی شده و سپس در برنامه نوکلئوتید بلاست با توالی مرجع مقایسه و جهش‌ها شناسایی شدند. جهت طراحی آغازگرها از نرم‌افزار اولیگو 7 استفاده شد و توالی الگوی ژن بتاگلوبین(ID: 3043) به عنوان توالی مرجع از بانک ژن NCBI گرفته شد. لازم به ذکر است که به منظور تعیین توالی کل ژن بتاگلوبین از سه آغازگر کمکی دیگر نیز استفاده شد(جدول 1). در مجموع داده‌های 200 نمونه با 26 نوع جهش متفاوت وارد نرم‌افزار SPSS ( نسخه 26) شد و روش آماری آنالیز واریانس(Anova) به منظور بررسی ارتباط جهش‌های ژن بتاگلوبین با هر یک از شاخص‌های خونی مورد استفاده قرار گرفت. سطح معناداری در این مطالعه 05/0 p< در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
در این تحقیق به طور کلی 200 نمونه مورد بررسی قرار گرفت که از این تعداد 110 زن و 90 مرد بودند. پس از دسته‌بندی آماری مقادیر عددی هریک از شاخص‌های گلبول قرمز مورد بررسی و نتایج زیر به دست آمد(جدول2).
همان‌طور که در جدول 2 مشاهده می‌شود مقدار RBC
کمتر از 5 میلیون در مترمکعب در 20 نفر(10%) دیده شده و RBC بالاتر از 7 میلیون در مترمکعب در 12 نفر(6%) بودند.
در مورد شاخص MCV هم مقادیر fL 60 > MCV با 40%
و مقادیر70 ≥MCV ≥60 با 53% بیشترین فراوانی را در بین افراد مورد مطالعه نشان دادند. در مورد فاکتور MCH نیز مقادیرPg
20 > MCH با 51% و مقادیر 26 ≥MCH ≥20 با حدود 45% بیشترین فراوانی را داشتنــد. در آزمایش‌هــای الکتروفورز هموگلوبین افراد مورد مطالعه انواع هموگلوبین‌های A ، A2 و F اندازه‌گیری شد و نتایج نشان داد که اولاً مقادیر10< Hb در 80% افراد دیده شد و مقادیر 2 ≥ HbA2 نیز در بیش از 99% افراد گزارش شد و در نهایت هموگلوبین F بالاتر از یک نیز در 86% موارد گزارش شد(جدول 3). در مورد بررسی نوع جهش ژن بتاگلوبین در افراد مورد مطالعه به طور کلی در 200 مورد 26 نوع جهش بتا تالاسمی
تشخیص داده شد. البته فراوانی بیش از 60% موارد تنها مربوط به چهار جهش شایع IVSII-1(G>A) ، IVSI-110(G>A) ، CD36/37(-T) و IVSI-5(G>C) بودند و بقیه جهش‌ها مربوط به حدود 40% باقی‌مانده افراد بود. به طوری که 10 نوع از جهش‌ها تنها در یک یا دو فرد دیده شدند (نمودار 1).
به منظور بررسی آماری داده‌ها تنها چهار جهش شایع اول که با فراوانی بالاتر از 10 نفر بودند وارد برنامه آماری SPSS شده و بدین ترتیب تعداد 120 نفر بررسی و 80 نفر که دارای جهش‌های دیگر بودند کنار گذاشته شدند(جدول ۴).
در این مطالعه سطح معناداری
05/0 P< در نظر گرفته شد و پس از بررسی مشخص شد که به لحاظ آماری ارتباط معناداری بین تغییرات میانگین شاخص خونی MCV و نوع جهش در افراد ناقل مورد مطالعه وجود دارد. اما سایر متغیرها نظیر HbA2 ، Hb و MCH با نوع جهش ارتباط معناداری نداشتند. در بین چهار جهش شایع بیشترین فراوانی مربوط به جهش IVSII-1(G>A) با فراوانی 5/22 درصد و کمترین فراوانی مربوط به جهش شایع IVSI-5(G>C) با فراوانی 7 درصد بود. هم‌چنین میانگین متغیرهای شاخص‌های خونی ناقلان بتا تالاسمی برحسب نوع جهش مورد بررسی قرار گرفت که بیشترین مقدار میانگین MCV با عدد 4/65 در مبتلایان با جهش
IVSI-110(G>A) و کمترین مقدار میانگین مربوط به جهش IVSII-1(G>A) با عدد 61بود (جدول 4).
در مطالعه‌های انجام شده در دنیا ارتباط بین جهش‌های ناقلان بتا تالاسمی و شاخص‌های خونی به صورت پراکنده و اندک صورت گرفته است و نشان می‌دهد که شدت و نوع جهش می‌تواند در تغییر میزان شاخص‌های خونی تأثیر داشته باشد.
در تحقیق حاضر رابطه بین چهار جهش شایع در ناقلان بتا تالاسمی استان خوزستان و شاخص‌های گلبول‌های قرمز خون شامل MCV ، MCH ، Hb و HbA2 بررسی شد و مشخص گردید که شاخص MCV با نوع جهش در جمعیت مورد مطالعه از ارتباط معناداری برخوردار است.
دقیق‌تریـن روش‌هـا بـرای تشخیـص تـالاسمی مینـور
اندازه‌گیری کمی هموگلوبین A2 و F و تعیین نسبت ساخت زنجیره گلوبین و تعیین جهش در مولکول DNA می‌باشد. به دلیل هزینه بالا، این آزمایش‌ها در غربالگری استفاده نمی‌شوند. از آن جا که در همه موارد تالاسمی به صورت ثابت هیپوکرومیا (Pg 30 MCH <) و میکروسیتوز(fL 80 MCV<) دیده می‌شود، لذا از این شاخص‌های گلبول‌های قرمز به عنوان راه‌های تشخیص اولیه بسیار استفاده می‌شود(12، 11).
در کشور ما نیز Pg 27 MCH < و fL 80 MCV < به عنوان شاخص غربالگری به‌کار می‌روند. همان طور که در جدول 2 نشان داده شد، موارد 30 MCH > تنها 2 مورد (1%) بوده و در مورد شاخص MCV نیز موارد 80 MCV > تنها 4 مورد (2%) از نمونه‌های مورد مطالعه را به خود اختصاص داده‌اند در حالی که در مورد تعداد RBCها 20 مورد (10%) موارد کمتر از 5 میلیون در میلی‌متر مکعب و در مورد هموگلوبین نیز موارد بالاتر از
g/dL 11 در بیش از 60% موارد دیده شده است(جدول 3). بنابراین با توجه به یافته‌های فوق مشخص می‌شود که مقدار هموگلوبین و RBC از حساسیت کمتری در غربالگری برخوردار هستند و بر عکس MCV و به ویژه Pg 27 MCH < اهمیت شایانی دارند. در نتایج الکتروفورز هموگلوبین نیز که از شاخص‌های تشخیص بتا تالاسمی مینور هستند، مطابق داده‌های جدول 3، هموگلوبین A2 بالاتر از 5/3 در بیش از 90% موارد و هموگلوبین F بالاتر از 1 در بیش از 85% موارد از جمعیت مورد مطالعه دیده شد. پس این دو شاخص نیز نمی‌توانند به عنوان شاخص‌های حساس در غربالگری استفاده شوند.
همان طور که اشاره شد به منظور تشخیص اولیه بیماران مبتلا به تالاسمی از متغیرهای خونی نظیر MCV ، MCH و Hb و جهت تأیید تشخیص اولیه از شناسایی نوع جهش استفاده می‌شود. در حال حاضر بیش از 400 نوع جهش در ژن گلوبین در جمعیت‌های مختلف جهان گزارش شده است(7). در مطالعه حاضر شایع‌ترین جهش در ژن بتاگلوبین IVSII-1 با فراوانی 5/22 درصد بود. این نتیجه با سایر مطالعه‌های انجام شده در جمعیت‌های ایران هم خوانی دارد(13، 3).
در تحقیق بهفر و همکاران، ارتباط بین انواع جهش با 8 نوع شاخص خونی MCV ، MCH ، HG ، HbF ، HbA و HbA2 مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که همه شـاخص‌هـا بـه صورت کـم و بیـش بـا جهش‌های متفاوت
بتاگلوبین در تغییر بودند. هم چنین مشخص گردید که میانگین دو شاخص MCV و MCH از نظر آماری ارتباط معناداری با نوع جهش اعم از شدید(β˚) یا ضعیف(β+) دارد. در حالی‌که ارتباط بین شدت جهش و میانگین شاخص‌های خونی دیگر معنا‌دار نبود.
هم‌چنین شایع‌ترین جهش در مطالعه فوق IVSII-(G>A) بـا فراوانی40% گزارش شد که از این نظر نیز مطالعه حاضر با آن هم‌خوانی دارد(14).
در مطالعه راند و همکاران که رابطه بین شاخص MCV و شدت جهش‌های بتا تالاسمی در 113 بیمار را بررسی نمودند، به طور کلی 18 نوع جهش گزارش شده که شایع‌ترین آن‌ها جهش IVSII-1(G>A) می‌باشد و در راستای مطالعه حاضر بوده، هم‌چنین ارتباط مستقیم و معناداری بین میزان کاهش MCV و شدت جهش بتا تالاسمی گزارش شده و نشان داده که MCV به عنوان پارامتر مهمی برای شناسایی سریع جهش به ویژه در زمینه تشخیص‌های پیش از تولد می‌تواند باشد و نتایج پژوهش حاضر نیز در راستای این مطالعه می‌باشد(15).
در تحقیق ابراهیم‌زاده و همکاران نیز که بر روی بررسی ارتباط شاخص‌های خونی در ناقلان آلفاتالاسمی انجام شده، مشخص گردید که ارتباط مستقیم بین شاخص‌های MCV و MCH و شدت جهش در ناقلان آلفاتالاسمی هم وجود دارد که می‌تواند به عنوان یک الگوی با ارزش، جهت تشخیص
سریع نوع جهش‌ها در جمعیت ایران به کار رود(16).
نتیجه‌گیری
در ایـن مطالعـه مقادیـر شاخـص‌های خونی مختلف در
ناقلان بتاتالاسمی مورد بررسی قرار گرفته و ارتباط آن‌ها با نوع جهش‌های ژن بتاگلوبین در این افراد سنجیده شد و ارتباط معناداری از نظر آماری بین مقدار میانگین MCV افراد با جهش‌های آن‌ها مشاهده شد. در حالی که نوع جهش با متغیرهای دیگر ارتباط معناداری نشان نداد. جهش IVSII-1(G>A) شایع‌ترین جهش در جمعیت ناقلان مورد مطالعه در استان خوزستان بود. هم‌چنین نتایج تحقیق حاضر در راستای بسیاری از مطالعه‌های انجام گرفته در این زمینه بوده و می‌تواند به عنوان یک راهنما جهت امکان دسترسی سریع به نوع جهش باشد. با جایگزینی روش‌های تشخیصی سریع و ارزان به جای روش‌های تعیین توالی که هزینه و زمان زیادی را صرف می‌کنند، می‌توان به تشخیص جهش ژن در زوجین ناقل مراجعه کننده به مراکز مشاوره ژنتیکی یا مراکز تشخیص پیش از تولد کمک شایانی نمود.
تشکر و قدردانی
از استاد گرامی آقای دکتر حمید گله‌داری و پرسنل محترم آزمایشگاه ژنتیک بیمارستان شفا که ما را در جمع‌آوری اطلاعات بیماران و تهیه نمونه یاری نمودند، کمال تشکر و قدردانی می‌گردد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
