جلد 18، شماره 3 - ( پاییز 1400 )
جلد 18 شماره 3 صفحات 170-161 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Nemati A, Yari F, Mohammadipour M, Rezaei N. The effect of sCD40L derived from platelet concentrate on cell survival and activation of Daudi cells. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2021; 18 (3) :161-170
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1378-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1378-fa.html
نعمتی آتوسا، یاری فاطمه، محمدی پور مهشید، رضایی نگار. تأثیر CD40L محلول به دست آمده از کنسانتره پلاکتی بر بقا و فعال‌سازی سلول‌های Daudi. فصلنامه پژوهشی خون. 1400; 18 (3) :161-170
استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 503 kb]
(736 دریافت)
| چکیده (HTML) (1725 مشاهده)
مقدمه
CD40L (CD154)، عضو خانواده بزرگ فاکتور نکروز تومور، یک مولکول محرک است که برای اولین بار در سلول‌های T فعال کشف شد(1). این مولکول از محل متیونین 113 دومین خارج سلولی شکسته و به فرم محلول ترشح می‌شود(3، 2). لنفوسیت‌های B ، آنتی‌ژن‌های سطح سلول و آنتی‌ژن‌های محلول داخل سلولی را شناسایی می‌کنند و به پلاسما سل‌های تولیدکننده آنتی‌بادی تمایز می‌یابند. علاوه بر سلول‌های T، پلاکت‌ها نیز با فعال‌شدن، سطوح بالایی از CD40L را بیان می‌کنند(4). اصلی‌ترین رسپتور آن مولکول CD40 است که توسط سلول‌های ایمنی و غیر ایمنی بیان می‌شود(7-5). فعال شدن CD40 سیگنال‌های حیاتی برای فعالیت، تمایز و ترشح ایمنوگلوبولین‌ها از لنفوسیت B را فراهم می‌کند(8).
طبق مطالعه‌های گذشته، تخمین زده شده است که بیش از 95 درصد از CD40L محلول(sCD40L) در گردش خون، مشتق از پلاکت‌هاست(10، 9). این مولکول نقشی محوری در تنظیم پاسخ‌های ایمنی ذاتی و اکتسابی از طریق میان‌کنش CD40L-CD40 دارد(12، 11). راتلیف و همکارانش نشان دادند که در پاسخ ایمنی اولیه، زمانی که تعداد لنفوسیت‌های T CD4+ کم است،CD40L محلول حاصل از پلاکت‌ها، سیگنال‌های اولیه برای تکثیر لنفوسیت‌های B را فراهم می‌کند(13).
رده سلولی Daudi یک رده سلولی لنفوبلاستوئید B مشتق از لنفوم بورکیت است(14). تفاوت عمده بین لنفوسیت‌های اولیه B و سلول‌های Daudi ، عدم وجود کلاس HLA I در سطح این سلول‌ها است(15). مطالعه‌ها نشان داده‌اند که یکی از مارکرهای فعال‌سازی لنفوسیت B، CD27 می‌باشد(16). بدین منظور جهت بررسی فعال‌سازی سلول Daudi ، از بررسی بیان این مارکر استفاده شد. با توجه به میزان فراوان CD40L در کنسانتره پلاکتی(PC) و نقش مطرح شده این مولکول در بقا و تکثیر لنفوسیت B، ما را بر آن داشت تا به تاثیر فرم محلول CD40L به صورت خالص شده با استفاده از سلول Daudi (رده سلولی مشتق از لنفوسیت B) بپردازیم تا نقش آن بر بقا و فعال‌سازی لنفوسیت‌های B بیشتر مشخص شود.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود.
تخلیص پروتئین به وسیله کروماتوگرافی تمایلی:
5 میلی‌لیتر از محلول رویی فرآورده پلاکتی(پلاسمای فاقد میکروپارتیکل‌های پلاکتی)، با 5 میلی‌لیتر از PBS رقیق شد و سپس شیر ستون بسته شد و نمونه به آرامی وارد ستون گردید.
به منظور خروج پروتئین‌های متصل نشده یا پروتئین‌های متصل غیراختصاصی و یا سست، ستون چندین مرتبه با بافر PBS شستوشو داده شد. با استفاده از بافر گلیسین 1/0 مولار(pH برابر با 8/2) شستشو صورت گرفت و محلول خروجی جمع‌آوری گردید. از قبل در لوله‌های جمع‌آوری نمونه، 100 میکرولیتر از بافر تریس 2 مولار(pH برابر با 8) اضافه شد تا pH بافر گلیسین را خنثی کند و از دناتوره شدن پروتئین هنگام خروج جلوگیری شود. محلول حاصل جمع‌آوری و در انتها OD نمونه جمع‌آوری شده در 280 نانومتر به عنوان جذب نوری پروتئین ثبت گردید.
مواجهه CD40L محلول پلاکتی و رده سلولی Daudi در شرایط کشت:
پس از تخلیص CD40L به روش کروماتوگرافی تمایلی، سلول‌های Daudi با CD40L پلاکتی در محیط کشت و در شرایط کاملاً استریل مواجه شدند. برای کشت از فلاسک‌های کشت(چین، Jet Biofil) و محیط کشت RPMI (آمریکا، جیبکو) واجد 10درصد FBS (آمریکا، جیبکو)، 1 درصد L-گلوتامین(آلمان، مرک) و 1درصد آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین- استرپتومایسین(آمریکا، جیبکو)
استفاده گردید. برای مواجهه، سه ردیف اول هر پلیت کشت سلولی به عنوان چاهک‌های آزمایش در نظر گرفته شد و تعداد سلول‌های سوش Daudi (105×1 در میلی‌لیتر)، غلظت CD40L محلول(500، 1000 نانوگرم بر میلی‌لیتر)(با توجه به مطالعه اولیه در چند غلظت، دو غلظت 500 و 1000 نانوگرم بر میلی‌لیتر انتخاب گردید) و محیط کشت RPMI به آن افزوده شد و سایر مواد افزودنی به نحوی انتخاب گردید که حجم هر چاهک پلیت 1 میلی‌لیتر باشد. چاهک‌های ردیف آخر به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد، به عنوان کنترل از سلول Daudi بدون افزودن CD40L محلول استفاده شد. پس در این مطالعه گروه مداخله، سلول‌های Daudi همراه با CD40L محلول و گروه کنترل، سلول‌های Daudi بدون افزودن CD40L محلـول بودند. در پایان این مرحله ، پلیت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد CO2 دار بـرای مـدت 48 و 72 ساعـت انکوبـه گردیـد.
نمونه‌برداری از محیط کشت:
پس از گذشت 48 و 72 ساعت از مواجهه CD40L محلول و سلول Daudi نمونه‌برداری انجام شد، بدین منظور در روز دوم کشت در شرایط کاملاً استریل، تعدادی از چاهک‌های پلیت مورد نظر(از هر غلظت یکی از چاهک‌ها و دو تا از چاهک‌های کنترل) به طور کامل داخل میکروتیوبها منتقل شدند.
شمارش سلولی با تریپان‌بلو صورت گرفت و از حیات سلول‌ها اطمینان حاصل شد. میکروتیوبها در دور rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. تکمه سلولی میکروتیوبها به حالت سوسپانسیون در آمد و بعد از یکبار شستوشو با PBS استریل، حدود 200 میکرولیتر از PBS جهت رسیدن سلول‌ها به یک میلیون به هر میکروتیوب اضافه شد. سلول‌ها با لام نئوبار شمارش شدند. از کیت MTT (UK ، رُوش) جهت بررسی بقای سلول‌ها استفاده شد. بدین منظور از هر میکروتیوب 50 میکرولیتر سلول در هر چاهک پلیت 96 خانه‌ای ریخته شد و سپس 5 میکرولیتر محلول MTT اضافه گردید و سپس به مدت 4 ساعت در انکوباتور CO2 گرماگذاری شد. پس از آن به هر چاهک، 40 میکرولیتر از محلول حل‌کننده رسوب کیت MTT اضافه گردید و به مدت 24 ساعت در انکوباتور CO2 قرار داده شد.
بعد از این مدت، در 570 نانومتر جذب آن خوانده شد. 100 میکرولیتر از سلول باقی مانده جهت بررسی بیان CD27 بـا استفاده از فلوسیتومتری مورد استفاده قرار گرفت.
بررسی شاخص فعالیت سلول‌های B با انجام فلوسیتومتری
برای بیان CD27:
جهت انجام فلوسیتومتری از دستگاه سیس‌مکس (آلمان، Norderstedt) استفاده شد. در ابتدا سلول‌ها در دور rpm 1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی تهیه شده، استفاده شد. تعداد 105×1 سلول در 100 میکرولیتر برداشته شد و به داخل میکروتیوب منتقل گردید. 2 میکرولیتر از آنتی‌بادی ضد CD27 (آبکام، کمبریج انگلیس Clone mumber LT27) به نمونه‌ها اضافه شد. به مدت 40 دقیقه در تاریکی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. در مرحله بعد دو بار شستشو با PBS و سانتریفیوژ در دورrpm 1500 انجام گردید. سپس محلول رویی تخلیه شده و به رسوب باقی مانده از مرحله قبل 2 میکرولیتر از IgG موشی کونژوگه با FITC، F(ab)΄2 (داکو ـ آلمان) اضافه و با PBS به حجم 100 میکرولیتر رسانده شد. نمونه برای 40 دقیقه در یخچال و در تاریکی انکوبه گردید.
بعد از گذشت زمان انکوباسیون، نمونه‌ها به داخل لوله‌های فلوسیتومتری منتقل شد و با دستگاه فلوسیتومتری از نظر بیان CD27 مورد آنالیز قرار گرفتند. جهت اطمینان از اختصاصی بودن واکنش‌ها از کنترل ایزوتیپ کونژوگه با FITC استفاده شد.
آنالیز داده‌ها:
آنالیزهای آماری با استفاده از نرم‌افزار SPSS (26 version) انجام شد. در این مطالعه از آزمون‌های من‌ویتنی و Independent two Sample Test جهت مقایسه گروه کنترل و مداخله استفاده شد. معنا‌داری آماری در 05/0 p< تنظیم شد.
یافته‌ها
بررسی میزان بقای سلول‌های Daudi با استفاده از روش MTT :
پس از گذشت 48 و 72 ساعت از مواجهه سلول‌های Daudi با دو غلظت متفاوت از CD40L تخلیص شده از فرآورده پلاکتی، داده‌های حاصل مورد تجزیه و تحلیل قرار
گرفت. نتایج حاصل از بقا و تکثیر سلول‌ها در نمودار نمایش داده شده است(نمودارهای 1 و 2).
با توجه به نمودار 1، بعد از 48 ساعت از مواجهه سلول‌های Daudi با غلظت ng/mL 500 CD40L محلول نسبت به حالت کنترل، افزایش بقای سلول‌ها مشاهده شد، اما این اختلاف با توجه به 052/0 p=و میانگین (35/0 ± 58/0) نسبت به گروه کنترل با میانگین(16/0 ± 30/0) معنادار نبود. در 72 ساعت پس از مواجهه نیز با توجه به 5/0=p و میانگین(28/0 ± 60/0) نسبت به گروه کنترل با میانگین (36/0 ± 52/0) افزایش معنا‌داری مشاهده نشد.
با توجه به نمودار 2، بعد از 48 ساعت از مواجهه سلول Daudi با غلظت ng/mL 1000 CD40L محلول نسبت به حالت کنترل، افزایش بقای سلول‌ها مشاهده شد، در 48 ساعت پس از مواجهه با توجه به 041/0=p و میانگین 41/0 ± 61/0 نسبت به گروه کنترل با میانگین 16/0 ± 30/0 معنادار بود. در 72 ساعت پس از مواجهه با توجه به 6/0=p و میانگین 55/0 ± 60/0 نسبت به گروه کنترل با میانگین 35/0 ± 55/0 این افزایش معنادار نبود.
بررسی CD27 بر روی لنفوسیت B با استفاده از فلوسیتومتری:
نتایج حاصل از بررسی بیان CD27 و میزان فعالیت سلول Daudi پس از مواجهه با CD40L محلول در نمودار نمایش داده شده است(نمودارهای 3 و 4).
با توجه به نمودار 3، پس از گذشت 48 ساعت از مواجهه سلول Daudi و sCD40L با غلظت ng/mL 500 نسبت به حالت کنترل، افزایش بیان CD27 مشاهده شد، اما این افزایش در هر دو زمان مورد بررسی با توجه به 4/0=p و میانگین(83/3 ± 49/22) نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان (83/3 ± 86/20) در 48 ساعت و 18/0=p و میانگین بیان (72/6± 06/24) در 72 ساعت پس از مواجهه نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان (65/6 ± 02/21)، معنادار نبود.
با توجه به نمودار 4، پس از گذشت 48 ساعت از مواجهه سلول Daudi و sCD40L با غلظت ng/mL 1000 نسبت به حالت کنترل، افزایش بیان CD27 مشاهده شد، ایـن افـزایش در هـر دو زمـان مـورد بـررسی با توجه بـه
2/0=p و میانگین 08/6 ± 32/24 نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان 43/4 ± 69/19 در 48 ساعت و 57/0=p و میانگین بیان 83/6 ± 21/23 در 72 ساعت پس از مواجهه نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان 65/6 ± 02/21 معنادار نبود.
در نمودار 5، بیان CD27 در مقایسه با ایزوتیپ کنترل بر سطح سلول Daudi پس از مواجهه با CD40L محلول نمایش داده شده است. Mean Fluorescence Index (MFI) مشخص شده در نمودار بیانگر میانگین شدت فلورسانس می‌باشد. در واقع، تغییر در شدت فلورسانس جمعیت سلول‌ها است.
بحث
با توجه به اهمیت بالای مولکول CD40L در فعال‌سازی لنفوسیت‌های B و بقای این سلول‌ها، این مطالعه جهت بررسی اثر این مولکول بر رده سلولی Daudi (رده سلولی مشتق از لنفوسیت B) طراحی شد. نتایج به‌دست آمده از این مطالعه نشان‌دهنده افزایش بقای سلول‌های Daudi در مواجهه با sCD40L در غلظت بالاتر به صورت معنادار بود، اما افزایش فعالیت این سلول‌ها و بیان CD27 در هیچ یک از غلظت‌های مورد بررسی، معنادار مشاهده نشد.
مولکول CD40L به میزان بالایی بر سطح لنفوسیت T و پلاکت‌ها بیان می‌شود و در این حالت می‌تواند به فرم محلول(sCD40L) شکسته شود. پلاکت‌ها از طریق CD40L با انواع مختلفی از سلول‌ها از جمله لنفوسیت‌ها و سلول‌های اندوتلیال و گرانولوسیت‌ها در ارتباطند. نتایج و عملکرد دقیق این ارتباطات همیشه مشخص نبوده است اما این موضوع واضح است که در نتیجه این ارتباط‌ها، آزادسازی مدیاتورهایی اتفاق می‌افتد که واکنش آن‌ها را تقویت می‌کند(17). از آن‌جایی که تخمین زده شده است، بیش از 95 درصد CD40L محلول در گردش خون، مشتق از پلاکت‌هاست (18)، مطالعه این مولکول در فرآورده پلاکتی بر فعال‌سازی و بقای لنفوسیت B نقش بسیار مهمی دارد.
در این مطالعه سعی شده است تا تاثیر CD40L محلول بـر فعـال شـدن رده سلولـی Daudi و هم‌چنین بقـای این
سلول‌ها مورد بررسی قرار گیرد. از این جهت CD40L پلاکتی از کیسه‌های پلاکت در 3 روز پس از ذخیره‌سازی تخلیص گردید و با رده سلولی Daudi در شرایط کشت (in vitro) مواجه شد. در روزهای مختلف مواجهه ( 48 و 72 ساعت) نمونه‌برداری از چاهک‌های کشت انجام شد و با نمونه‌های آزمایش از نظر بیان شاخص CD27 با استفاده از روش فلوسیتومتری و از نظر بقا و تکثیر با استفاده از روش MTT مورد ارزیابی قرار گرفت.
اولین مطالعه انجام شده مرتبط با تاثیر CD40L بر لنفوسیت‌هایB ، گزارش بانچرا و همکارانش در سال 1991 در مورد سیستم CD40 بود. نتایج حاصل از این مطالعه بیان کرد که سیستم CD40 برای تحریک لنفوسیت‌های B با طول عمر بالا در آزمایشگاه ضروری می‌باشند. در این مطالعه از راه‌کارهای متفاوتی جهت تحریک CD40، از قبیل آنتی‌بادی‌های منوکلونال آگونیست CD40 و استفاده از پروتئین‌های نوترکیب استفاده شد(19).
بیشتر مطالعه‌های انجام شده در حوزه تاثیر CD40L بر فعال‌سازی لنفوسیت B، به فرم غشایی آن پرداخته‌اند. در مطالعه انجام شده در سال 1992، اسپریگز و همکارانش در رده سلولی CV1/EBNA، ژن CD40L را کلون کرده و اثر آن را بر فعال‌سازی سلول B و تولید آنتی‌بادی IgE از آن مورد مطالعه قرار دادند. نتایج آن‌ها بیانگر افزایش فعال‌سازی و تولید IgE در کشت هم‌زمان CD40L غشایی و لنفوسیت B خون محیطی بود(20).
در مطالعه‌ای که توسط فابریک کوگناس و همکارانش در سال 2007 در فرانسه انجام شد، نشان داده شد که در کشت هم‌زمان پلاکت همراه با لنفوسیت B در محیط آزمایشگاه، هر دو سلول فعال می‌شوند. در این حالت، شاخص‌های فعال‌سازی CD62P در سطح پلاکت‌ها و CD86 و CD27 در سطح سلول‌های B افزایش، اما شاخص IgD کاهش می‌یابد. هم‌چنین بیان کرد که واکنش پلاکت‌ها و لنفوسیت‌های B از طریق ارتباط متقابل CD40-CD40L صورت می‌پذیرد(21).
در مطالعه انجام شده در سال 2018 توسط دکتر یاری و همکارانش، تاثیر میکروپارتیکل‌های پلاکتی بر بیان مارکرهای CD27 و CD86 بر سطح سلول‌های Daudi مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل از آن مطالعه، میکروپارتیکل‌های پلاکتی از طریق مارکرهای سطحی خود که همان مارکرهای پلاکتی هستند، قادر به فعال کردن و تمایز سلول‌های نامیرا Daudi می‌باشند. در مطالعه حاضر به بررسی تاثیر CD40L محلول پلاکتی بر بقا و بیان مارکر فعالیت یک رده سلولی از لنفوسیت B پرداختیم و نتایج حاصل، بیان کننده توانایی CD40L محلول تا حدودی در افزایش فعالیت و تمایز سلول Daudi بود(22).
پیش از این به تاثیر پلاکت‌ها بر سلول‌های B خون محیطی اشاره شده است(21-17)، اما مطالعه‌هایی که با این موضوع سر و کار دارند، بیشتر بر فرم غشایی CD40L و تاثیر آن بر لنفوسیت‌های خون محیطی تمرکز داشته‌اند. در این جا قصد داشتیم توانایی CD40L محلول مشتق از کنسانتره پلاکتی را بر فعال کردن و بقای سلول‌های Daudi به عنوان یک رده سلولی برای لنفوسیت‌های B خون محیطی ارزیابی کنیم. به دلیل جهش به طور طبیعی یا القا شده، یک رده سلولی جاودانه می‌تواند برای زمان‌های طولانی در شرایط in vitro رشد کند. هم‌چنین به دست آوردن تعداد کافی از این سلول‌ها از طریق کشت سلولی آسان‌تر از جداسازی لنفوسیت‌های B خون محیطی از خون کامل انسان است. از آن‌جایی که تأثیر مولکول CD40L بر فعال‌سازی و تحریک لنفوسیت‌های B از اهمیت بالایی برخوردار است و بیشترین میزان CD40L گردش خون از
پلاکت‌ها حاصل می‌شود، بررسی تاثیر این مولکول بر فعال‌سازی و بقای لنفوسیت‌های B اولین گام در تولید آنتی‌بادی از این سلول‌ها می‌باشد.
نتیجه‌گیری
حاصل این مطالعه، بررسی فعالیت و بقای سلول‌های Daudi در مواجهه با مولکول با اهمیت CD40L بوده است که در غلظت‌های بالاتر sCD40L تا حدودی بر بقای سلول Daudi تاثیرگذار بوده و افزایش غیر معنادار بیان CD27 نیاز به فراهم کردن مولکول‌های تاثیرگذار دیگر هم‌چون سیتوکاین‌ها در محیط کشت سلول را بیان می‌کند. در ارتباط با اثر‌گذاری این مولکول در مطالعه‌های آتی نیاز به طراحی جدید و وجود مولکول‌های تاثیرگذار دیگر جهت ارسال سیگنال‌های لازم به سلول ضروری باشد.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایان نامـه دانشـجویی دوره کارشناسـی ارشد رشته هماتولوژی و طب انتقال خون مرکـز تحقیقـات مؤسسـه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون بـا کـد اخلاق IR.TMI.REC.1397.037 می‌باشد. بودجه این مطالعه توسـط مؤسسه آموزشی و پژوهشـی طـب انتقـال خـون تأمین گردیده و همـه مراحل عملـی پـروژه در مرکـز تحقیقـات سازمان انتقال خون انجام شده است.
متن کامل: (1224 مشاهده)
تأثیر CD40L محلول به دست آمده از کنسانتره پلاکتی بر بقا و فعال‌سازی
سلول‌های Daudi
آتوسا نعمتی1، فاطمه یاری2، مهشید محمدی‌پور3، نگار رضایی4
چکیده
سابقه و هدف
مطالعه‌های پیشین به ارتباط مهم CD40L با لنفوسیت B اشاره کرده‌اند. CD40L پلاکتی نقش مهمی در فعال‌سازی لنفوسیت B و ایمنی هومورال ایفا می‌کند. هدف از مطالعه حاضر، بررسی اثر CD40L تخلیص شده از فرآورده پلاکتی بر بقا و فعال‌سازی سلول‌های Daudi به عنوان یک رده سلولی در دسترس برای لنفوسیت‌های B خون محیطی بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، CD40L تخلیص شده از فرآورده پلاکتی در دو غلظت 500 و 1000 ng/mL با رده سلولی Daudi مواجه شد. پس از گذشت 48 و 72 ساعت از مواجهه، بقا و تکثیر سلول با استفاده از روش MTT و میزان بیان CD27 با استفاده از فلوسیتومتری مورد مطالعه قرار گرفت. جهت تجزیه و تحلیل آماری از نرم‌افزار 26 SPSS و آزمون‌های آماری Independent two Sample Test و Mann-Whitney استفاده شد.
یافته‌ها
نتایج به دست آمده نشان‌دهنده افزایش بقای سلول‌ها در 48 ساعت پس از مواجهه با غلظت ng/mL 1000 با 04/0=p و میانگین 41/0 ± 61/0 نسبت به گروه کنترل با میانگین 15/0 ± 30/0 معنادار و در غلظت ng/mL 500 و میانگین 35/0 ± 58/0 غیر معنادار بود. میانگین بیان CD27 در تمامی غلظت‌ها افزایش معنا‌داری نشان نداد.
نتیجه گیری
CD40L محلول در بقای سلول‌های Daudi در غلظت‌های بالاتر تاثیرگذار بوده است و افزایش غیر معنادار بیان CD27 به عنوان یکی از مارکرهای فعال‌سازی لنفوسیت B ، نیاز به فراهم کردن شرایط مناسب‌تر هم‌چون استفاده از سیتوکاین‌ها در محیط کشت سلول را بیان می‌کند.
کلمات کلیدی: پلاکت‌ها، بقا، لنفوسیت‌های B
تاریخ دریافت: 07/08/1399
تاریخ پذیرش: 03/10/1399
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و طب انتقال خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD ایمونولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- PhD ژنتیک مولکولی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4-PhD اپیدمیولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات غدد درون‌ریز و متابولیسم ـ پژوهشکده علوم بالینی غدد ـ پژوهشگاه علوم غدد و متابولیسم دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
سلول‌های Daudi
آتوسا نعمتی1، فاطمه یاری2، مهشید محمدی‌پور3، نگار رضایی4
چکیده
سابقه و هدف
مطالعه‌های پیشین به ارتباط مهم CD40L با لنفوسیت B اشاره کرده‌اند. CD40L پلاکتی نقش مهمی در فعال‌سازی لنفوسیت B و ایمنی هومورال ایفا می‌کند. هدف از مطالعه حاضر، بررسی اثر CD40L تخلیص شده از فرآورده پلاکتی بر بقا و فعال‌سازی سلول‌های Daudi به عنوان یک رده سلولی در دسترس برای لنفوسیت‌های B خون محیطی بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، CD40L تخلیص شده از فرآورده پلاکتی در دو غلظت 500 و 1000 ng/mL با رده سلولی Daudi مواجه شد. پس از گذشت 48 و 72 ساعت از مواجهه، بقا و تکثیر سلول با استفاده از روش MTT و میزان بیان CD27 با استفاده از فلوسیتومتری مورد مطالعه قرار گرفت. جهت تجزیه و تحلیل آماری از نرم‌افزار 26 SPSS و آزمون‌های آماری Independent two Sample Test و Mann-Whitney استفاده شد.
یافته‌ها
نتایج به دست آمده نشان‌دهنده افزایش بقای سلول‌ها در 48 ساعت پس از مواجهه با غلظت ng/mL 1000 با 04/0=p و میانگین 41/0 ± 61/0 نسبت به گروه کنترل با میانگین 15/0 ± 30/0 معنادار و در غلظت ng/mL 500 و میانگین 35/0 ± 58/0 غیر معنادار بود. میانگین بیان CD27 در تمامی غلظت‌ها افزایش معنا‌داری نشان نداد.
نتیجه گیری
CD40L محلول در بقای سلول‌های Daudi در غلظت‌های بالاتر تاثیرگذار بوده است و افزایش غیر معنادار بیان CD27 به عنوان یکی از مارکرهای فعال‌سازی لنفوسیت B ، نیاز به فراهم کردن شرایط مناسب‌تر هم‌چون استفاده از سیتوکاین‌ها در محیط کشت سلول را بیان می‌کند.
کلمات کلیدی: پلاکت‌ها، بقا، لنفوسیت‌های B
تاریخ دریافت: 07/08/1399
تاریخ پذیرش: 03/10/1399
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و طب انتقال خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD ایمونولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- PhD ژنتیک مولکولی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4-PhD اپیدمیولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات غدد درون‌ریز و متابولیسم ـ پژوهشکده علوم بالینی غدد ـ پژوهشگاه علوم غدد و متابولیسم دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
مقدمه
CD40L (CD154)، عضو خانواده بزرگ فاکتور نکروز تومور، یک مولکول محرک است که برای اولین بار در سلول‌های T فعال کشف شد(1). این مولکول از محل متیونین 113 دومین خارج سلولی شکسته و به فرم محلول ترشح می‌شود(3، 2). لنفوسیت‌های B ، آنتی‌ژن‌های سطح سلول و آنتی‌ژن‌های محلول داخل سلولی را شناسایی می‌کنند و به پلاسما سل‌های تولیدکننده آنتی‌بادی تمایز می‌یابند. علاوه بر سلول‌های T، پلاکت‌ها نیز با فعال‌شدن، سطوح بالایی از CD40L را بیان می‌کنند(4). اصلی‌ترین رسپتور آن مولکول CD40 است که توسط سلول‌های ایمنی و غیر ایمنی بیان می‌شود(7-5). فعال شدن CD40 سیگنال‌های حیاتی برای فعالیت، تمایز و ترشح ایمنوگلوبولین‌ها از لنفوسیت B را فراهم می‌کند(8).
طبق مطالعه‌های گذشته، تخمین زده شده است که بیش از 95 درصد از CD40L محلول(sCD40L) در گردش خون، مشتق از پلاکت‌هاست(10، 9). این مولکول نقشی محوری در تنظیم پاسخ‌های ایمنی ذاتی و اکتسابی از طریق میان‌کنش CD40L-CD40 دارد(12، 11). راتلیف و همکارانش نشان دادند که در پاسخ ایمنی اولیه، زمانی که تعداد لنفوسیت‌های T CD4+ کم است،CD40L محلول حاصل از پلاکت‌ها، سیگنال‌های اولیه برای تکثیر لنفوسیت‌های B را فراهم می‌کند(13).
رده سلولی Daudi یک رده سلولی لنفوبلاستوئید B مشتق از لنفوم بورکیت است(14). تفاوت عمده بین لنفوسیت‌های اولیه B و سلول‌های Daudi ، عدم وجود کلاس HLA I در سطح این سلول‌ها است(15). مطالعه‌ها نشان داده‌اند که یکی از مارکرهای فعال‌سازی لنفوسیت B، CD27 می‌باشد(16). بدین منظور جهت بررسی فعال‌سازی سلول Daudi ، از بررسی بیان این مارکر استفاده شد. با توجه به میزان فراوان CD40L در کنسانتره پلاکتی(PC) و نقش مطرح شده این مولکول در بقا و تکثیر لنفوسیت B، ما را بر آن داشت تا به تاثیر فرم محلول CD40L به صورت خالص شده با استفاده از سلول Daudi (رده سلولی مشتق از لنفوسیت B) بپردازیم تا نقش آن بر بقا و فعال‌سازی لنفوسیت‌های B بیشتر مشخص شود.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود.
تخلیص پروتئین به وسیله کروماتوگرافی تمایلی:
5 میلی‌لیتر از محلول رویی فرآورده پلاکتی(پلاسمای فاقد میکروپارتیکل‌های پلاکتی)، با 5 میلی‌لیتر از PBS رقیق شد و سپس شیر ستون بسته شد و نمونه به آرامی وارد ستون گردید.
به منظور خروج پروتئین‌های متصل نشده یا پروتئین‌های متصل غیراختصاصی و یا سست، ستون چندین مرتبه با بافر PBS شستوشو داده شد. با استفاده از بافر گلیسین 1/0 مولار(pH برابر با 8/2) شستشو صورت گرفت و محلول خروجی جمع‌آوری گردید. از قبل در لوله‌های جمع‌آوری نمونه، 100 میکرولیتر از بافر تریس 2 مولار(pH برابر با 8) اضافه شد تا pH بافر گلیسین را خنثی کند و از دناتوره شدن پروتئین هنگام خروج جلوگیری شود. محلول حاصل جمع‌آوری و در انتها OD نمونه جمع‌آوری شده در 280 نانومتر به عنوان جذب نوری پروتئین ثبت گردید.
مواجهه CD40L محلول پلاکتی و رده سلولی Daudi در شرایط کشت:
پس از تخلیص CD40L به روش کروماتوگرافی تمایلی، سلول‌های Daudi با CD40L پلاکتی در محیط کشت و در شرایط کاملاً استریل مواجه شدند. برای کشت از فلاسک‌های کشت(چین، Jet Biofil) و محیط کشت RPMI (آمریکا، جیبکو) واجد 10درصد FBS (آمریکا، جیبکو)، 1 درصد L-گلوتامین(آلمان، مرک) و 1درصد آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین- استرپتومایسین(آمریکا، جیبکو)
استفاده گردید. برای مواجهه، سه ردیف اول هر پلیت کشت سلولی به عنوان چاهک‌های آزمایش در نظر گرفته شد و تعداد سلول‌های سوش Daudi (105×1 در میلی‌لیتر)، غلظت CD40L محلول(500، 1000 نانوگرم بر میلی‌لیتر)(با توجه به مطالعه اولیه در چند غلظت، دو غلظت 500 و 1000 نانوگرم بر میلی‌لیتر انتخاب گردید) و محیط کشت RPMI به آن افزوده شد و سایر مواد افزودنی به نحوی انتخاب گردید که حجم هر چاهک پلیت 1 میلی‌لیتر باشد. چاهک‌های ردیف آخر به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد، به عنوان کنترل از سلول Daudi بدون افزودن CD40L محلول استفاده شد. پس در این مطالعه گروه مداخله، سلول‌های Daudi همراه با CD40L محلول و گروه کنترل، سلول‌های Daudi بدون افزودن CD40L محلـول بودند. در پایان این مرحله ، پلیت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد CO2 دار بـرای مـدت 48 و 72 ساعـت انکوبـه گردیـد.
نمونه‌برداری از محیط کشت:
پس از گذشت 48 و 72 ساعت از مواجهه CD40L محلول و سلول Daudi نمونه‌برداری انجام شد، بدین منظور در روز دوم کشت در شرایط کاملاً استریل، تعدادی از چاهک‌های پلیت مورد نظر(از هر غلظت یکی از چاهک‌ها و دو تا از چاهک‌های کنترل) به طور کامل داخل میکروتیوبها منتقل شدند.
شمارش سلولی با تریپان‌بلو صورت گرفت و از حیات سلول‌ها اطمینان حاصل شد. میکروتیوبها در دور rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. تکمه سلولی میکروتیوبها به حالت سوسپانسیون در آمد و بعد از یکبار شستوشو با PBS استریل، حدود 200 میکرولیتر از PBS جهت رسیدن سلول‌ها به یک میلیون به هر میکروتیوب اضافه شد. سلول‌ها با لام نئوبار شمارش شدند. از کیت MTT (UK ، رُوش) جهت بررسی بقای سلول‌ها استفاده شد. بدین منظور از هر میکروتیوب 50 میکرولیتر سلول در هر چاهک پلیت 96 خانه‌ای ریخته شد و سپس 5 میکرولیتر محلول MTT اضافه گردید و سپس به مدت 4 ساعت در انکوباتور CO2 گرماگذاری شد. پس از آن به هر چاهک، 40 میکرولیتر از محلول حل‌کننده رسوب کیت MTT اضافه گردید و به مدت 24 ساعت در انکوباتور CO2 قرار داده شد.
بعد از این مدت، در 570 نانومتر جذب آن خوانده شد. 100 میکرولیتر از سلول باقی مانده جهت بررسی بیان CD27 بـا استفاده از فلوسیتومتری مورد استفاده قرار گرفت.
بررسی شاخص فعالیت سلول‌های B با انجام فلوسیتومتری
برای بیان CD27:
جهت انجام فلوسیتومتری از دستگاه سیس‌مکس (آلمان، Norderstedt) استفاده شد. در ابتدا سلول‌ها در دور rpm 1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی تهیه شده، استفاده شد. تعداد 105×1 سلول در 100 میکرولیتر برداشته شد و به داخل میکروتیوب منتقل گردید. 2 میکرولیتر از آنتی‌بادی ضد CD27 (آبکام، کمبریج انگلیس Clone mumber LT27) به نمونه‌ها اضافه شد. به مدت 40 دقیقه در تاریکی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. در مرحله بعد دو بار شستشو با PBS و سانتریفیوژ در دورrpm 1500 انجام گردید. سپس محلول رویی تخلیه شده و به رسوب باقی مانده از مرحله قبل 2 میکرولیتر از IgG موشی کونژوگه با FITC، F(ab)΄2 (داکو ـ آلمان) اضافه و با PBS به حجم 100 میکرولیتر رسانده شد. نمونه برای 40 دقیقه در یخچال و در تاریکی انکوبه گردید.
بعد از گذشت زمان انکوباسیون، نمونه‌ها به داخل لوله‌های فلوسیتومتری منتقل شد و با دستگاه فلوسیتومتری از نظر بیان CD27 مورد آنالیز قرار گرفتند. جهت اطمینان از اختصاصی بودن واکنش‌ها از کنترل ایزوتیپ کونژوگه با FITC استفاده شد.
آنالیز داده‌ها:
آنالیزهای آماری با استفاده از نرم‌افزار SPSS (26 version) انجام شد. در این مطالعه از آزمون‌های من‌ویتنی و Independent two Sample Test جهت مقایسه گروه کنترل و مداخله استفاده شد. معنا‌داری آماری در 05/0 p< تنظیم شد.
یافته‌ها
بررسی میزان بقای سلول‌های Daudi با استفاده از روش MTT :
پس از گذشت 48 و 72 ساعت از مواجهه سلول‌های Daudi با دو غلظت متفاوت از CD40L تخلیص شده از فرآورده پلاکتی، داده‌های حاصل مورد تجزیه و تحلیل قرار
گرفت. نتایج حاصل از بقا و تکثیر سلول‌ها در نمودار نمایش داده شده است(نمودارهای 1 و 2).
با توجه به نمودار 1، بعد از 48 ساعت از مواجهه سلول‌های Daudi با غلظت ng/mL 500 CD40L محلول نسبت به حالت کنترل، افزایش بقای سلول‌ها مشاهده شد، اما این اختلاف با توجه به 052/0 p=و میانگین (35/0 ± 58/0) نسبت به گروه کنترل با میانگین(16/0 ± 30/0) معنادار نبود. در 72 ساعت پس از مواجهه نیز با توجه به 5/0=p و میانگین(28/0 ± 60/0) نسبت به گروه کنترل با میانگین (36/0 ± 52/0) افزایش معنا‌داری مشاهده نشد.
با توجه به نمودار 2، بعد از 48 ساعت از مواجهه سلول Daudi با غلظت ng/mL 1000 CD40L محلول نسبت به حالت کنترل، افزایش بقای سلول‌ها مشاهده شد، در 48 ساعت پس از مواجهه با توجه به 041/0=p و میانگین 41/0 ± 61/0 نسبت به گروه کنترل با میانگین 16/0 ± 30/0 معنادار بود. در 72 ساعت پس از مواجهه با توجه به 6/0=p و میانگین 55/0 ± 60/0 نسبت به گروه کنترل با میانگین 35/0 ± 55/0 این افزایش معنادار نبود.
بررسی CD27 بر روی لنفوسیت B با استفاده از فلوسیتومتری:
نتایج حاصل از بررسی بیان CD27 و میزان فعالیت سلول Daudi پس از مواجهه با CD40L محلول در نمودار نمایش داده شده است(نمودارهای 3 و 4).
با توجه به نمودار 3، پس از گذشت 48 ساعت از مواجهه سلول Daudi و sCD40L با غلظت ng/mL 500 نسبت به حالت کنترل، افزایش بیان CD27 مشاهده شد، اما این افزایش در هر دو زمان مورد بررسی با توجه به 4/0=p و میانگین(83/3 ± 49/22) نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان (83/3 ± 86/20) در 48 ساعت و 18/0=p و میانگین بیان (72/6± 06/24) در 72 ساعت پس از مواجهه نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان (65/6 ± 02/21)، معنادار نبود.
با توجه به نمودار 4، پس از گذشت 48 ساعت از مواجهه سلول Daudi و sCD40L با غلظت ng/mL 1000 نسبت به حالت کنترل، افزایش بیان CD27 مشاهده شد، ایـن افـزایش در هـر دو زمـان مـورد بـررسی با توجه بـه
2/0=p و میانگین 08/6 ± 32/24 نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان 43/4 ± 69/19 در 48 ساعت و 57/0=p و میانگین بیان 83/6 ± 21/23 در 72 ساعت پس از مواجهه نسبت به گروه کنترل با میانگین بیان 65/6 ± 02/21 معنادار نبود.
در نمودار 5، بیان CD27 در مقایسه با ایزوتیپ کنترل بر سطح سلول Daudi پس از مواجهه با CD40L محلول نمایش داده شده است. Mean Fluorescence Index (MFI) مشخص شده در نمودار بیانگر میانگین شدت فلورسانس می‌باشد. در واقع، تغییر در شدت فلورسانس جمعیت سلول‌ها است.
بحث
با توجه به اهمیت بالای مولکول CD40L در فعال‌سازی لنفوسیت‌های B و بقای این سلول‌ها، این مطالعه جهت بررسی اثر این مولکول بر رده سلولی Daudi (رده سلولی مشتق از لنفوسیت B) طراحی شد. نتایج به‌دست آمده از این مطالعه نشان‌دهنده افزایش بقای سلول‌های Daudi در مواجهه با sCD40L در غلظت بالاتر به صورت معنادار بود، اما افزایش فعالیت این سلول‌ها و بیان CD27 در هیچ یک از غلظت‌های مورد بررسی، معنادار مشاهده نشد.
مولکول CD40L به میزان بالایی بر سطح لنفوسیت T و پلاکت‌ها بیان می‌شود و در این حالت می‌تواند به فرم محلول(sCD40L) شکسته شود. پلاکت‌ها از طریق CD40L با انواع مختلفی از سلول‌ها از جمله لنفوسیت‌ها و سلول‌های اندوتلیال و گرانولوسیت‌ها در ارتباطند. نتایج و عملکرد دقیق این ارتباطات همیشه مشخص نبوده است اما این موضوع واضح است که در نتیجه این ارتباط‌ها، آزادسازی مدیاتورهایی اتفاق می‌افتد که واکنش آن‌ها را تقویت می‌کند(17). از آن‌جایی که تخمین زده شده است، بیش از 95 درصد CD40L محلول در گردش خون، مشتق از پلاکت‌هاست (18)، مطالعه این مولکول در فرآورده پلاکتی بر فعال‌سازی و بقای لنفوسیت B نقش بسیار مهمی دارد.
در این مطالعه سعی شده است تا تاثیر CD40L محلول بـر فعـال شـدن رده سلولـی Daudi و هم‌چنین بقـای این
سلول‌ها مورد بررسی قرار گیرد. از این جهت CD40L پلاکتی از کیسه‌های پلاکت در 3 روز پس از ذخیره‌سازی تخلیص گردید و با رده سلولی Daudi در شرایط کشت (in vitro) مواجه شد. در روزهای مختلف مواجهه ( 48 و 72 ساعت) نمونه‌برداری از چاهک‌های کشت انجام شد و با نمونه‌های آزمایش از نظر بیان شاخص CD27 با استفاده از روش فلوسیتومتری و از نظر بقا و تکثیر با استفاده از روش MTT مورد ارزیابی قرار گرفت.
اولین مطالعه انجام شده مرتبط با تاثیر CD40L بر لنفوسیت‌هایB ، گزارش بانچرا و همکارانش در سال 1991 در مورد سیستم CD40 بود. نتایج حاصل از این مطالعه بیان کرد که سیستم CD40 برای تحریک لنفوسیت‌های B با طول عمر بالا در آزمایشگاه ضروری می‌باشند. در این مطالعه از راه‌کارهای متفاوتی جهت تحریک CD40، از قبیل آنتی‌بادی‌های منوکلونال آگونیست CD40 و استفاده از پروتئین‌های نوترکیب استفاده شد(19).
بیشتر مطالعه‌های انجام شده در حوزه تاثیر CD40L بر فعال‌سازی لنفوسیت B، به فرم غشایی آن پرداخته‌اند. در مطالعه انجام شده در سال 1992، اسپریگز و همکارانش در رده سلولی CV1/EBNA، ژن CD40L را کلون کرده و اثر آن را بر فعال‌سازی سلول B و تولید آنتی‌بادی IgE از آن مورد مطالعه قرار دادند. نتایج آن‌ها بیانگر افزایش فعال‌سازی و تولید IgE در کشت هم‌زمان CD40L غشایی و لنفوسیت B خون محیطی بود(20).
در مطالعه‌ای که توسط فابریک کوگناس و همکارانش در سال 2007 در فرانسه انجام شد، نشان داده شد که در کشت هم‌زمان پلاکت همراه با لنفوسیت B در محیط آزمایشگاه، هر دو سلول فعال می‌شوند. در این حالت، شاخص‌های فعال‌سازی CD62P در سطح پلاکت‌ها و CD86 و CD27 در سطح سلول‌های B افزایش، اما شاخص IgD کاهش می‌یابد. هم‌چنین بیان کرد که واکنش پلاکت‌ها و لنفوسیت‌های B از طریق ارتباط متقابل CD40-CD40L صورت می‌پذیرد(21).
در مطالعه انجام شده در سال 2018 توسط دکتر یاری و همکارانش، تاثیر میکروپارتیکل‌های پلاکتی بر بیان مارکرهای CD27 و CD86 بر سطح سلول‌های Daudi مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل از آن مطالعه، میکروپارتیکل‌های پلاکتی از طریق مارکرهای سطحی خود که همان مارکرهای پلاکتی هستند، قادر به فعال کردن و تمایز سلول‌های نامیرا Daudi می‌باشند. در مطالعه حاضر به بررسی تاثیر CD40L محلول پلاکتی بر بقا و بیان مارکر فعالیت یک رده سلولی از لنفوسیت B پرداختیم و نتایج حاصل، بیان کننده توانایی CD40L محلول تا حدودی در افزایش فعالیت و تمایز سلول Daudi بود(22).
پیش از این به تاثیر پلاکت‌ها بر سلول‌های B خون محیطی اشاره شده است(21-17)، اما مطالعه‌هایی که با این موضوع سر و کار دارند، بیشتر بر فرم غشایی CD40L و تاثیر آن بر لنفوسیت‌های خون محیطی تمرکز داشته‌اند. در این جا قصد داشتیم توانایی CD40L محلول مشتق از کنسانتره پلاکتی را بر فعال کردن و بقای سلول‌های Daudi به عنوان یک رده سلولی برای لنفوسیت‌های B خون محیطی ارزیابی کنیم. به دلیل جهش به طور طبیعی یا القا شده، یک رده سلولی جاودانه می‌تواند برای زمان‌های طولانی در شرایط in vitro رشد کند. هم‌چنین به دست آوردن تعداد کافی از این سلول‌ها از طریق کشت سلولی آسان‌تر از جداسازی لنفوسیت‌های B خون محیطی از خون کامل انسان است. از آن‌جایی که تأثیر مولکول CD40L بر فعال‌سازی و تحریک لنفوسیت‌های B از اهمیت بالایی برخوردار است و بیشترین میزان CD40L گردش خون از
پلاکت‌ها حاصل می‌شود، بررسی تاثیر این مولکول بر فعال‌سازی و بقای لنفوسیت‌های B اولین گام در تولید آنتی‌بادی از این سلول‌ها می‌باشد.
نتیجه‌گیری
حاصل این مطالعه، بررسی فعالیت و بقای سلول‌های Daudi در مواجهه با مولکول با اهمیت CD40L بوده است که در غلظت‌های بالاتر sCD40L تا حدودی بر بقای سلول Daudi تاثیرگذار بوده و افزایش غیر معنادار بیان CD27 نیاز به فراهم کردن مولکول‌های تاثیرگذار دیگر هم‌چون سیتوکاین‌ها در محیط کشت سلول را بیان می‌کند. در ارتباط با اثر‌گذاری این مولکول در مطالعه‌های آتی نیاز به طراحی جدید و وجود مولکول‌های تاثیرگذار دیگر جهت ارسال سیگنال‌های لازم به سلول ضروری باشد.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایان نامـه دانشـجویی دوره کارشناسـی ارشد رشته هماتولوژی و طب انتقال خون مرکـز تحقیقـات مؤسسـه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون بـا کـد اخلاق IR.TMI.REC.1397.037 می‌باشد. بودجه این مطالعه توسـط مؤسسه آموزشی و پژوهشـی طـب انتقـال خـون تأمین گردیده و همـه مراحل عملـی پـروژه در مرکـز تحقیقـات سازمان انتقال خون انجام شده است.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
