چکیده سابقه و هدف کورکومین، ماده‌ای است که اثراتضد سرطانیآندربسیاریازسرطانها اثباتشدهاست. سورافنیب به عنوان مهارکننده رگزایی مانع افزایش حیات در سلولها میشود.یکی از مسیرهای مؤثر و کلیدی در بقای سلولهای سرطانی، فعالیت ژن AKT است. هدف این مطالعه، بررسی اثر ترکیبی کورکومین و سورافنیب بر بیان ژن AKT بود. مواد و روش‌ها در مطالعه تجربی حاضر، از آزمایشMTT جهت بررسی تکثیر دو رده سلولی U937 و KG-1 با کورکومین و سورافنیببه صورت تک و ترکیبی در دوزها و بازه‌های زمانی مختلف استفاده گردید. میزان آپوپتوز با آزمایش فلوسایتومتری ارزیابی شد. در نهایت میزان بیان ژن AKT توسط Real Time PCR سنجیده شد. از آزمون آماری Mann–Whitney U testوGraphpad Prism5 برای تجزیه و تحلیل اطلاعات استفاده شد. یافته‌ها IC50 برای داروی سورافنیب در رده سلولی KG-1 برابر با µM 7 و در رده سلولی U937، Mµ 5و برای کورکومین در هر دو رده µM 40 در بازه زمانی 24 ساعته به دست آمد. ترکیب داروها اثرکشندگی بیشتری در هر دو رده سلولی نشان داد. بیان ژن AKT به دنبال تیمار با ترکیب کورکومین و سورافنیب در رده KG1به مقدار30% و در رده U937 به میزان 50% کاهش معناداری داشت(001/0 *** p<). نتیجه گیری این مطالعه نشان داد که ترکیب دو داروی مذکور، منجر به افزایش آپوپتوز و هم‌چنین کاهش تکثیر سلولی در ردههای سلولی 1 KG-وU937 شده است و این کاهش تکثیر ممکن است با کاهش بیان AKT در ارتباط باشد. برای تایید این نتایج، بررسی بیشتر در سطح پروتئین لازم است. کلمات کلیدی: لوسمی میلوئیدی حاد، کورکومین، سورافنیب
تاریخ دریافت: 22/5 /98 تاریخ پذیرش: 11/10/98
1- کارشناس ارشد ژنتیک- مرکز تحقیقات هماتولوژی، انکولوژی و پیوند سلولهای بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 2- کارشناس ارشد ژنتیک پزشکی- مرکز تحقیقات هماتولوژی، انکولوژی و پیوند سلولهای بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران - تهران- ایران 3- دکترای تخصصی زیست‌شناسی - استادیار دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شرق- تهران- ایران 4- دکترایتخصصیهماتولوژی - استادیارمرکزتحقیقاتهماتولوژی،انکولوژی و پیوندسلولهایبنیادیدانشگاهعلومپزشکیتهران- تهران-ایران 5- دکترایتخصصیهماتولوژی - دانشیارمرکزتحقیقات هماتولوژی،انکولوژیوپیوندسلولهایبنیادیدانشگاهعلومپزشکیتهران- تهران-ایران 6- فوق تخصص خون و انکولوژی- استادیارمرکزتحقیقاتهماتولوژی، انکولوژی و پیوندسلولهایبنیادیدانشگاهعلومپزشکیتهران- تهران-ایران 7- مؤلف مسئول: دکترای تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی- دانشیار مرکز تحقیقات هماتولوژی، انکولوژی و پیوند سلولهای بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران – تهران - خیابان کارگر شمالی - بیمارستان شریعتی- ایران – کدپستی: 1411713131
مقدمه AML (لوسمی میلوئیدی حاد)، یک اختلال کلونال بدخیم سلولهای نابالغ در سیستم خونساز است. این لوسمی در سلولهای تمایز نیافته که فاقد عملکرد طبیعی هستند رخ میدهد(1). این بیماری، دومینسرطانخونشایعبا میزان 5/18% وسومینسرطانخونکشندهدرایرانبهشمار می‌آید(2). علی‌رغم شیمی درمانی با دوز بالا، عود پس از درمان رایج، شایع است. مطالعه‌های اخیر نشان میدهد که جمعیت مبتلا به لوسمی بسیار ناهمگون است و بیماری به دنبال افزایش زیر جمعیتی از سلولهای لوکمیک به نام Leukemic Stem Cell(LSC) روی میدهد(3). در این راستا طراحی درمان‌های هدفمند علیه مسیرهای اختصاصی حفظ و بقای LSC ، میتوانند مفید واقع شوند(5، 4).از جمله مسیرها و مکانیسمهایی که به بقای LSC ها کمک میکنند میتوان به فعالیت یا مهار پروتئینهای مرتبط با مسیر فسفواینوزایتید-3 کیناز (PI3K) مانند AKT اشاره کرد(7، 6). مسیر سیگنالی PI3K/AKT ، کلید تنظیمی بقا در طی استرس سلولی است(8). فعالسازی مسیر AKT منجر به افزایش رشد و بقای سلولی درسلولهایسالمو بدخیمو در نهایت منجر به تکثیر در سلولهای سرطانی، آنژیوژنز و مقاومت به درمان و آپوپتوز میشود. بنابراین، این مسیر پیچیده به عنوان یکی از جذاب‌ترین اهداف برای توسعه عوامل دارویی مورد توجه قرار گرفته است(10، 9). سورافنیب از جمله داروهای جدیدی است که اخیراً وارد بازار دارویی جهان شده است. این ترکیب به دلیل داشتن مکانیسم عمل چند آنزیمی، پیشرفتهای بسیاری را در درمان سرطان به همراه داشته است. سورافنیب به عنوان یک داروی هدفمند عمل میکند به طوری که از مهمترین مهار کنندههای اصلی تیروزین کینازی ضد رگزایی است که گرایش بالایی به اتصال به کینازهای رگزایی داشته و اخیراً برای درمان بیماران مبتلا به سرطانهای پیشرفته استفاده میشود. این دارو از طریق القای آپوپتوز در سلولهای سرطانی و پیشگیری از آنژیوژنز عمل میکند(11). اخیراً در این بیماری، سورافنیب بازدارنده مولتی کیناز موضعی، قادر به القای بهبود قابل توجهی در افزایش طول عمر و بقای بیماران است(12). برای کاهش دوز داروی سورافنیب و به منظور دستیابی به ارتقای اثرات شیمی درمانی، باید روش‌های درمانی جدید با به کارگیری ترکیبی داروها با روند تاثیرگذاری مشابه مثل ممانعت از تکثیر سلولهای سرطانی و یا القای مرگ در آنها، طراحی شود تا هم باعث افزایش روند بهبودی و هم باعث کاهش اثرات مضر شیمی درمانی گردند(14، 13). کورکومینیک ماده طبیعی است که در گیاه Curcuma longa که عضوی از خانواده زنجبیل است وجود داشته و به طور شایع تحت عنوان زردچوبه شناخته میشود. با توجهبهاین کهعوارضجانبیوسمیخاصیازاین فرآوردهطبیعیگزارشنشدهاست،مصرفاین فرآوردهبه عنوان یک عامل ترکیبی مشهور و مکملداروییدررژیمهایدرمانیدربیمارانسرطانیموردتوجهاست. این فرآورده که با مکانیسم‌های ناشناخته موجب سرکوب تکثیر سلولی و القای آپوپتوز در طیف وسیعی از سلولهای تومورال میشود، فعالیت ضد سرطانی و دارویی خود را تا حد زیادی با مهار مسیرهای سیگنال‌رسانی دفاعی NF-κB ، PPAR-y،Cyclin –D1 وPI3/AKT انجام میدهد. البته مسیرهای دیگری هم در این روند دخالت دارند(15).دو رده سلولی KG-1 و U937 به عنوان دو مدل مقاوم و حساس به درمان در مطالعه‌های تحقیقاتی به عنوان مدل LSCs ( Leukemia Stem Cell) مشتق شده از AML استفاده شدند(16). هدف از مطالعه حاضر، بررسی اثر ترکیبیسورافنیب و کورکومینبه عنوان یکاستراتژی جدید با خواص ضد سرطانی منحصر به فرد در بیان ژنAKTو القای آپوپتوز در محیط آزمایشگاهی بر روی ردههای سلولی سرطانی KG-1 وU937 در بیماران مبتلا به AML نسبت به داروهای شیمی درمانی متداول و ناکارآمد میباشد.
مواد و روش‌ها کشت سلولی: در مطالعه تجربیحاضر، ردههای سلولی انسانی U937 وKG-1)لوسمی میلوئیدی حاد) از بانک سلولی ایران(انستیتو پاستور) تهیه شدند. این ردههای سلولی در محیط RPMI-1640 همراه با 10% و 20% سرم گاوی (FBS) غیر فعال شده با گرما به ترتیب برای رده سلولی U937 وKG-1 همراه با U/mL100 پنی‌سیلین و μg/mL 100 استرپتومایسین نگهداری شد. تمام سلولها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و فشار Co2 5% کشت داده شدند.
اندازه‌گیری تکثیر سلولی با آزمون MTT (3- (4,5- dimethylthiazol- 2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide): برای بررسی اثر مهاری سورافنیب(سانتاکروز، آمریکا) و کورکومین(سیگما، آمریکا) برروی فعالیت متابولیکی سلولهای KG-1 وU937 به روش MTT در 24 ، 48 و 72 ساعت، از پودر MTT (مشتق شده از نمک تیازول)(سیگما، آمریکا) و محلول DMSO (دی متیل سولفواکساید) استفاده و جذب نوری با دستگاه الایزا ریدر در طول موج nm 578 خوانده شد. سلولهایی که در فاز لگاریتمی رشد بودند، در پلیتهای 96 خانه به مقدار 5000 سلول در μL /well 100 کشت داده شدند. بعد از انکوباسیون و ریختن سلولها در هر خانه، 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت در محیط کشت سرم‌دار ساخته شده و انکوبه شده تا سلولها به کف هر خانه متصل شوند، سپس سلولها با غلظتهای سورافنیب(µmoL 12-2) و کورکومین(µM 100-0) به مدت 24 ، 48 و 72 ساعت تیمار شدند. محلول MTT (mg/mL 5/0) به مقدار 10 میکرولیتر به سلولها اضافه شد و سلولها به مدت چهار ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند تا این محلول را متابولیزه کنند. رسوب فرمازان تشکیل شده با 100 میکرولیتر DMSO حل شده و محلول بنفش رنگی ایجاد و جذب پلیت در طول موج 570 نانومتر خوانده شد.
آزمایش تعیین درصد سلولهای زنده با روش تریپان‌بلو: در این روش، برای شمارش سلولی از لام نئوبار و رنگ تریپان‌بلو استفاده شد. اساس رنگ‌آمیزی به این صورت است که سلولهای زنده که غشای ناتراوا نسبت به رنگ تریپان‌بلو دارند، بی‌رنگ و سلولهای مرده که هیچ انتخابی برای ورود رنگ ندارند و رنگ وارد سیتوپلاسم آنها میشود به رنگ آبی مایل به بنفش دیده میشوند. برای شمارش سلولهای زنده، میزان µL 15-10 سلول را با مقدار مشابه تریپان‌بلو حل کرده و µL 10 از این محلول برداشته شده و زیر لامل ریخته میشود.
100 × تعداد کل سلولها/تعداد سلولهای زنده = درصد زنده
آزمایش ارزیابی آپوپتوز با روش فلوسیتومتری با رنگ‌آمیزی دوگانه Annexin/PI : به منظور ارزیابی اثر القایی داروها به تنهایی یا در ترکیب با هم بر فعالیت کشندگی و مشخص شدن این که این اثر با واسطه آپوپتوز و یا با واسطه نکروز سلولی است، رنگ‌آمیزی Annexin/PI (رُوش، آلمان) انجام شد و درصد سلولهای آپوپتوتیک تعیین گردید. بعد از گذشت 24 و 48 ساعت پس از تیمار نمودن ردههای سلولی KG-1 و U937توسط کورکومین و نیز ترکیب کورکومین با سورافنیب در پلیتهای 24 خانه کشت داده شده، ابتدا سلولهایی که با دارو تیمار شده بودند جمعآوری شده و با دور g 600 به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ شدند. سپس سلولها یک بار توسط PBS 1X شسته شدند. به هر کدام از لوله‌هایی که از قبل، µL 1 از رنگ Annexin با غلظت استوک mg/mL 5/0 و µL1 از PI با غلظت استوک mg/mL 1/0 ریخته شده بود، µL 100 از Binding buffer 1X اضافه و لولهها به آرامی مخلوط شدند. سپس لولهها به مدت 15-10 دقیقه دور از تابش نور خورشید و در دمای اتاق گذاشته و سپس جهت تجزیه و تحلیل و بررسی به دستگاه فلوسیتومتری داده شدند. نتایج فلوسیتومتری توسط نرم‌افزار FlowJO با ورژن(7.6.1) مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
استخراج RNA، ساخت cDNA و ارزیابی میزان تغییرات بیان ژن با روش کمی :Real-Time PCR RNA سلـول بـا استفـاده از محلول TriPure (رُوش، آلمان) طبق دستورالعمل کیت استخراج شد. غلظت RNA
جدول 1: توالی آغازگرهای به کار گرفته شده در روش Real-Time quantitative PCR
نمونه‌ها با استفاده از دستگاه نانودراپ(آلمان) اندازه‌گیری شد. ساخت cDNA با استفاده از کیت cDNA سنتتاز (تاکارا ، ژاپن) انجام شد و میزان بیان ژن در سطح mRNA با دستگاه light cycler (رٌوش، آلمان) و با روش Real-Time PCR مورد بررسی قرار گرفت.مواد لازم برای انجام Real-time PCR در حجم 20 میکرولیتر شامل µL 10 از رنگ SYBR Green master mix (تاکارا ، ژاپن) و µL 2 از cDNA واز آغازگر(ژن فن‌آوران، ایران) µL 1 (pmol10) و µL 6 آب استریل با هم مخلوط گردید. برنامه دمایی و زمانی دستگاه Real-time PCR برای فعال کردن اولیه شامل30 ثانیه زمان در دمای 95 درجه سانتی‌گراد بود. در ادامه40 چرخه برای مرحله واسرشتگی که در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 ثانیه و برای مرحله آنیلینگ/اکستنشن که در دمای 60 درجه سانتی‌گراد20 ثانیه خواهد بود، میباشد. برای تکثیر ژن مورد نظر، دو عدد آغازگر اختصاصی برای ژن انتخاب گردید که شامل آغازگر پیش برنده و معکوس بود. اختصاصیت تمامی آغازگرها با نرم‌افزار آنلاین Primer-BLAST (وب سایتNCBI ) بررسی و تائید شد. هم چنین برای بررسی اختصاصی بودن محصول PCR شده، از منحنی ذوب استفاده شد. میزان تغییرات بیان ژن در شرایط سلولهای تیمار شده با داروها با توجه به ژن داخلی HPRT ، بر طبق روش 2-∆∆Ct محاسبه شد و نتایج به دست آمده در قالب نمودار ستونی با یکدیگر مقایسه شدند(جدول 1).
روش تجزیه و تحلیل اطلاعات و آزمون آماری: تمـام آزمایش‌ها بـه شکل سه آزمون مستقل انجام و مقادیر گزارش شده به شکل Mean SE ±قیدشدهاند. هم چنین برای محاسبات آماری از روش Mann–Whitney U test و Graphpad Prism 5 استفاده شد. تفاوت آماری معناداری در مقایسه با گروه کنترل به صورت 05/0 *P<، 01/0P<** و001/0P< *** ارزیابی گردید(نمودارهای 1 و 2).
یافته‌ها بررسی تکثیر سلولی با استفاده از آزمون MTT: مهار تکثیر سلولیدرردههایKG-1 و U937 با غلظتهای مختلف(µM 100-20) کورکومین و(µM 12-2) سورافنیب، هم چنین اثر ترکیبیداروها با استفاده از روشMTTدر بازه‌های زمانی24، 48 و 72 ساعت بررسی شد و بین 48 و 72 ساعت تفاوت معناداری مشاهده نشد(نمودارهای 1 و 2). نتایج نشان داد که در رده سلولی KG1 ، اثر کورکومین در دوزهای 40 تا 100 میکرومولار و سورافنیب در دوزهای 7 تا 12 میکرو مولار و در رده سلولی U937 اثر کورکومین در دوزهای 40 تا 100 میکرومولار و اثر سورافنیب در دوزهای 12-5 میکرو مولار قابل توجه بوده است(3)(نمودارهای 1 و 2). IC50 برای داروی کورکومین با دوز µM 40 برای هر دو رده سلولی و IC50 برای داروی سورافنیب 5 و 7 میکرومول به ترتیب برای رده سلولی KG1 وU937 انتخاب شد. هم‌چنین با تیمارسازی ترکیبی در دوز µM40 ، کورکومین برای رده سلولی KG1و دوز 5 و 7 میکرومول سورافنیب برای U937، کشندگی سلولی و کاهش تکثیر سلولی بیشتری را نشان میدهد و با ترکیب کورکومین و سورافنیب،درصد بقای سلولهای تیمار شده نسبت به گروه کنترل به طور چشمگیر کاهش مییابد(001/0 *** P<)(نمودار 1 و 2). طبق نمودارهای فوق، درصدبقای سلولهای تیمار شده با سورافنیب و کورکومین در یک روند وابسته به دوز و زمان نسبت به گروه کنترل کاهش مییابد.
نمودار 1: الف (نمودارستونی اثر مهاری کورکومین با غلظتهای مختلف(µM 100-20) بر رشد و بقا ب) نمودار ستونی اثر مهاری سورافنیب در غلظتهای مختلف(µM 12-2) بر رشد و بقا ج) نمودار ستونی اثر مهاری ترکیب کورکومین و سورافنیب در رده سلولی KG1 با استفاده از آزمون MTT در بازه‌های زمانی 24 ، 48 و 72 ساعت. نتایج در نمودار با سه بار تکرار به صورت SE±mean نمایش داده شده و نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل به صورت 05/0 *P<، 01/0P<** و001/0P< ***، معنادار میباشد.
نمودار2: الف) نمودار ستونی اثر مهاری کورکومین با غلظتهای مختلف(µM 100-20) بر رشد و بقا ب) نمودار ستونی اثر مهاری سورافنیب در غلظتهای مختلف(µM 12-2) بر رشد و بقا ج) نمودار ستونی اثر مهاری ترکیب کورکومین و سورافنیب در رده سلولی U937با استفاده از آزمونMTT در بازه‌های زمانی 24 و 48 و 72 ساعته. نتایجدر نمودار با سه بار تکرار به صورت SE±mean نمایش داده شده و نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل به صورت 05/0 *p<، 01/0p<** و001/0p< ***، معنادار میباشد.
بررسی آپوپتوز به روش فلوسیتومتری با استفاده از روش رنگ‌آمیزی Annexin/PI : در ادامه کار برای تایید نتایج به دست آمده از روش MTT و به منظور بررسی اثر القائی داروی کورکومین به تنهایی یا در ترکیب با سورافنیب روی مرگ سلولها، مهار تکثیر سلولی و تعیین این که این مرگ از طریق آپوپتوز انجام گرفته و یا با نکروز، رنگ‌آمیزی Annexin/PI انجام پذیرفت و با استفاده از روش فلوسیتومتری، درصد سلولهای آپوپتوز شده مشخص گردید. در آزمایش به عمل آمده تنها جمعیتهایی که Annexin آنها مثبت و یا Annexin و PI آنها مثبت باشند دارای اهمیت بوده و جمعیت‌های PI مثبت به تنهایی نشان از نکروز سلولی بوده که روندی پاتولوژیک و ناخوشایند و فاقد اهمیت میباشد. نتایج تجزیه و تحلیل از رنگ‌آمیزی Annexin/PI با دستگاه فلوسیتومتری، اثرات القای آپوپتوزی با داروها را نشان میدهد. طبق نمودارها، سلولهای KG1 وU937 تیمار شده با دوزهای ترکیبی کورکومین و سورافنیب نسبت به گروه کنترل، یک افزایش آپوپتوتیک قابل توجهی را نسبت به دوزهای کورکومین و سورافنیب به
تنهایی، نشان میدهد(نمودارهای 3 و 4). هم‌چنین ترکیب داروهای کورکومین و سورافنیب با یکدیگر در سلولهای KG1 وU937 در مقایسه با گروه کنترل، بیشترین میزان آپوپتوز القا شده تا مرحله Late یا آپوپتوز کامل و حداقل میزان نکروز را در هر دو رده U937 و KG-1 در مقایسه با نمونه کنترل باعث میشوند(شکل‌های 1 و 2).
نمودار 3: نتایج بررسی تیمارسازی با داروی کورکومین، سورافنیب و ترکیب آن دو با یکدیگر در القای آپوپتوز سلولی با رنگ‌آمیزی Annexin/PI در رده سلولیKG-1 در بازه زمانی24 ساعته.
شکل1: بررسی پراکنش فلوسایتومتری حاصل از آزمایشAnnexin/PI برای بررسی آپوپتوز در سلولهای KG1 پس از تیمار با غلظتهای
µM 40 کورکومین و غلظت µM 7 سورافنیب و مقادیر ترکیبی آنها دربازه زمانی 24 ساعته
طبق نمودار ترکیب داروهای کورکومین و سورافنیب با یکدیگر در سلولهای KG1 در مقایسه با گروه کنترل به میزان 9/61% بیشترین میزان آپوپتوز القا شده تا مرحله تأخیری(Late) یا آپوپتوز کامل(بخش Q2) را باعث
میشوند. دوز تک کورکومین(µM 40) به میزان 1/29% تا مرحله اولیه(early) و دوز تک سورافنیبµM) 7( به میزان 4/11% تا مرحله early از آپوپتوزرا نشان میدهد.
نمودار 4: نتایج بررسی آپوپتوزسلولی حاصل از رنگ‌آمیزی Annexin/PIدررده سلولیU937 در بازه زمانی 24 ساعته بدنبال تیمار سازی با غلظت های µM 40 کورکومین وµM 5 سورافنیب و ترکیب آن دوبا یکدیگر
شکل 2: نمودار پراکنش فلوسایتومتری حاصل از تست Annexin/PI برای بررسی آپوپتوز در سلولهای U937 پس از تیمار با غلظت های µM40 کورکومین و غلظت µM 5 سورافنیب و مقادیر ترکیبی آنها در بازه زمانی 24 ساعته
طبق نمودار ترکیب داروهای کورکومین و سورافنیب با یکدیگر در سلولهایU937 در مقایسه با گروه کنترل به میزان9/69% بیشترین میزان آپوپتوز القا شده را باعث می شوند.
نتایج ارزیابی اثر کورکومین و سورافنیب بر بیانژن AKT در سطح mRNA در رده سلولیKG1 : طبق نمودار فوق نتایج نشان میدهد بیان ژن AKT در سلولKG1 تیمار شده در غلظت µM 40 کورکومین به صورت 05/0 p<* و µM 7 سورافنیب به صورت 01/0p<** و با ترکیب این دو دارو به صورت 05/0 p<* در مقایسه با گروه کنترل کاهش مییابد. در ترکیب دو دارو نتایج به صورت جزئی، چشمگیر بوده و این احتمالاً به دلیل مکانیسم‌های مقاومتی در رده سلولی KG1 میباشد(نمودار 5).
نمودار 5 : نتایج بررسی تیمار سلول KG1باداروی کورکومین و سورافنیب و ترکیب آن دو با یکدیگر بر بیان ژنAKT به روش Real time PCR در بازه زمانی24 ساعته. نتایج با سه بار آزمایش مستقل و به صورت SE±meanنشان داده شده‌اند و نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل به صورت 05/0 *p< ، 01/0p<** و001/0p< ***، معنادار میباشد.
نتایج ارزیابی اثر کورکومین و سورافنیب بر بیانژن AKT در سطح mRNA در رده سلولیU937 : طبق نمودار نتایج نشان میدهد بیان ژن AKT در سلول U937 تیمار شده با غلظت تک µM 40 کورکومین به صورت01/0 **p< و µM 5 سورافنیب به صورت 05/0*P< و درترکیب دو دارو به صورت001/0***p< در مقایسه با گروه کنترل کاهش مییابد. در دوز ترکیبی دو دارو، کاهش چشمگیر و قابل قبولی در بیان ژن AKT دیده میشود(نمودار 6).
نمودار 6: نتایج بررسی تیمار سلولU937 با داروی کورکومین و سورافنیب و ترکیب آن دو با یکدیگر بر روی بیان ژنAKTبه روش Real time PCR در بازه زمانی24 ساعته. نتایج با سه بار آزمایش مستقل و به صورت SE ± meanنشان داده شده‌اند و نتایج از نظر آماری در مقایسه با نمونه کنترل به صورت 05/0 *p<، 01/0p<** و001/0p< ***، معنادار میباشد.
بحث لوسمی میلوئیدی حاد یک اختلال شایع هماتولوژیکی بوده که در آن اکثر بیماران به دلیل ناکارآمد بودن داروهای رایج امروزی، شانس زندگی طولانی مدت در آنها پایین میباشد. مطالعهها در سالهای اخیر نشان میدهد که جمعیت‌های لوکمیک بسیار هتروژن می‌باشند و ایجاد بیماری، به دنبال افزایش زیر جمعیتی از سلولهای لوکمیک به نام LSC روی میدهد. به عنوان یکی از مسیرهای مؤثر در بقای LSC ها، میتوان به فعالیت یا مهار پروتئینهای مرتبط مانند AKT اشاره کرد. از یک سو آبشارهای Ras / Raf / MEK / ERK وPI3K / PTEN / AKT / mTOR اغلب با تغییرات ژنتیکی در مولکولهای سیگنالینگ بالادست مانند گیرندههای تیروزین کیناز(RTK) فعال میشوند(19). ترکیباتی که توانایی از بین بردن LSC ها را دارند و به طور خاص مسیر VEGF و Ras/ Raf/ MEK/ ERK, PI3K/AKT/mTOR را هدف قرار میدهند شامل کورکومین و سورافنیب هستند. در این مطالعه، ارزیابی اولیه توسط آزمایش MTT نشان میدهد که کورکومین و سورافنیب در هر دو رده سلولی، اثرات معناداری بر مهار رشد سلولها داشته‌اند و این در حالی است که ترکیب داروها دارای کشندگی سلولی بیشتر در مقایسه کورکومین و سورافنیب به تنهایی میباشد و هم‌چنین نتایج آزمایش آپوپتوز نیز نشان میدهد که میزان چشمگیری از درصد کشندگی سلولی که در آزمایش MTT مشاهده شد، آپوپتوز یا مرگ برنامه‌ریزی سلولی بوده و این میزان چشمگیر نیز پس از ترکیب داروها باعث میزان بالاتری از آپوپتوز در مقایسه با هر یک از داروها به تنهایی بوده است. بنابراین این مطالعه علاوه بر نشان دادن تاثیر چشمگیرکورکومین و سورافنیب در از بین بردن بقا و رشد سلولهای سرطان خون AML ، نشان میدهد که احتمالاً به واسطه ترکیب این دو دارو میتوان به نتایج بهتری برای درمان دست یافت. هم‌چنین تیمار رده سلولی U937 وKG-1 لوکمیAML ، توسط کورکومین و سورافنیب و ترکیب آنها باعث مرگ سلولی چشمگیر و القاء آپوپتوز میشود. سپس به جهت یافتن علت آپوپتوز به سراغ بررسی میزان بیان ژن AKT رفتیم زیرا در مطالعهها و تحقیقات، کاهش بیان AKTرا علت القاء آپوپتوز می‌دانند. بنابراین برای اولین بار اثر دوزهای انتخابی داروها و ترکیب آنها را بر میزان بیان ژن AKT به وسیله آزمایش Real time PCRاندازه‌گیری کردیم، نتایج نشان میدهد در سلولهای KG1 و U937در تمامی دوزها نسبت به نمونه کنترل، شاهد کاهش بیان ژن AKTبوده‌ایم، احتمالاً میتوان مسئول آپوپتوز را در این ردههای سلولی، کاهش بیان ژن AKT دانست زیرا آبشار به راه افتاده پس از فعالسازی این ژن، باعث بقای بیشتر سلولها میشود. در رده سلولیKG-1 در دوز ترکیبی دو دارو، شاهد کاهش بیان ژن AKT بوده‌ایم ولی اثرش خیلی چشمگیر نمی‌باشد که احتمالاً به دلیل مکانیسم‌های مقاومتی سلولی میباشد. در رده سلولی U937 دوز ترکیبی دو دارو نسبت به دوز تک سورافنیب(µM 5) باعث کاهش بیان بیشتر ژن AKT شده است. در مطالعه‌های گذشته بر روی بیماران AML نشان داده شده که بلوکه کردن مسیر پیامرسانیAKT ، منجر به افزایش فعالیت P53 میشود. این مسأله نشان میدهد که در مبتلایان به بیماری AML ، ژن P53 از طریق این مسیر پیامرسانی تنظیم میشود و این مسیر با افزایش فسفریلاسیون Mdm2 ، کاهش بیان ژن P53 و القای فعالیت ضد آپوپتوزی، میتواند باعث افزایش مقاومت دارویی باشد. هم چنین در مطالعهها نشان دادند که فعالیت محور MEK1/MEK2/ERK مرتبط با فعالیت AKT در سلولهای KG1وU937 بوده و نقش مهمی در بقای سلولهای بنیادین AMLدر مقابل کورکومین و یا ترکیب با سورافنیب بازی میکنند و همبستگی قابل توجهی بین بیان ژن‌های RAF/MEK با ژن‌هایAKT/mTOR/PTEN/ β-Cateninدر این سلولها بعد از درمان دیده شد. در سایر مطالعهها اثر کورکومین بر روی AKT در سطح پروتئین اندازه‌گیری شده است و این مطالعهها نشان‌دهنده افزایش آپوپتوز سلولی، توقف چرخه سلولی و یا کاهش میزان بیان ژن AKT به دنبال درمان با کورکومین در سلولهای U937 لوکمی بوده است. مطالعه حاضر نشان میدهد کورکومین باعث مهار تزاید سلولی و هم‌چنین القای آپوپتوز در سلولهای لوکمیک AML میشود و نیز باعث کاهش بیان ژن AKT (که به عنوان یک عامل پیش‌برنده سرطان شناخته میشود) در این سلولها می‌گردد. هم‌چنین بر اساس مطالعه‌های گذشته، داروی سورافنیب که در ابتدا به عنوان مهار کننده C-Raf و B-Raf شناخته شد، میتواند بر روی تیروزین کینازهای دیگر که در پیشرفت سرطان بسیار حائز اهمیت هستند نیز نقش داشته باشد(21، 20). از آن جایی که کورکومین یک ترکیب گیاهی میباشد، در مقایسه با شکل تک داروهای رایج، به صورت ترکیبی احتمالاً میتواند با اثرگذاری بهتر و کارآمدتر و عوارض جانبی و سمیت کمتری در بیماران مبتلا به AML مورد استفاده قرار گیرد. ژانگ و همکارانش در سال 2015 نشان دادند که ترکیب دو داروی سورافنیب و کورکومین دارای اثرات ضد سرطانی در بیماران مبتلا به سرطان تیروئید میباشد. هم چنین آنها بیان داشتند که ترکیب دو دارو به طور قابل توجهی باعث القای آپوپتوز و کاهش سطح پروتئینهای AKT و ERK در رده سلولهای سرطانی FTC133 در مقایسه با درمان تک دارویی میشود(22). کائو و همکارانش در سال 2015 نشان دادند که انتقال هم‌زمان دو داروی سورافنیب و کورکومین به وسیله هدفمند کردن ذرات نانو، اثرات درمانی را در کارسینومای کبدی افزایش میدهد(23). رُوآ و همکاران در سال 2011 در بخشی از مطالعه خود نشان دادند که کورکومین باعث مهار تزاید سلولی و القای آپوپتوز در سلولهای U937و KG-1 لوکمی میلوئیدی حادAML میشود(24). هابِر و همکارانش در سال 2011 نشان دادند که سورافنیب میتواند منجر به توقف چرخه سلولی، کاهش مقاومت دارویی و هم‌چنین افزایش آپوپتوز در بیماران با سرطان خون مزمن هم از طریق مهار مسیر VEGF و هم از مسیرهای دیگر شود(25). چِن و همکارانش در سال 2011 نشان دادند که فعالسازی مسیر پیامرسانی PI3K/AKT در کارسینومای کبدی به واسطه مقاومت به سورافنیب به دست آمده است(26). صفائیان و همکارانش در مطالعهای بالینی، در سال 2009 نشان دادند که سورافنیب بر بیماران AML داری جهش FLT-3 ، خاصیت ضد سرطانی بالقوهای را
نشان داده است. در تحقیق حاضر نیز دوز سورافنیب موجب کاهش قابل قبول بیان ژن AKT در رده سلولی KG1 شد که با تحقیق صفائیان مطابقت دارد(27). با توجه به محدودیت‌های این تحقیق که مهار دارویی بر روی یک مسیر پیامرسانی و درسطح in vitro انجام شد، به نظر می‌رسد در صورت طراحی مهارکننده‌های انتخابی و اختصاصی مسیر AKT و با ساختارهای نانو که در سطح in vivo باشد، میتوان به نتایج مؤثرتری برای درمان سرطان خون دست یافت.
نتیجه‌گیری با توجه به یافته‌های این تحقیق و نقش اثر ترکیبی کورکومین و سورافنیب که دارای اثر سینرژیک در مهار تکثیر سلولی، القای آپوپتوز و کاهش بیان ژن AKT میباشد، ترکیب دو داروی فوق با در نظر گرفتن نتایج موجود و نتایج سایر مطالعهها، میتواند در درمان سرطان خون مؤثر باشد.
تشکر و قدردانی بدین‌وسیله از مرکز تحقیقات هماتولوژی، انکولوژی و پیوند سلولهای بنیادی بیمارستان شریعتی به جهت تأمین بودجه طرح، تشکر و قدردانی می‌گردد.
Pazahr R, Mohammadikian M, Ali Asgari E, Mohammadi S, Rostami S, Chahardolii B, et al . Effect of curcumin and sorafenib on AKT gene expression in KG1 and U937 cell lines. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2020; 17 (2) :113-125 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1297-fa.html
پازهر راضیه، محمدی کیان مهناز، علی عسگری الهه، محمدی سعید، رستمی شهربانو، چهاردولی بهرام، و همکاران.. اثر کورکومین و سورافنیب بر بیان ژن AKT در ردههای سلولی KG1 و U937. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (2) :113-125
