جلد 17، شماره 1 - ( بهار 1399 )
جلد 17 شماره 1 صفحات 46-36 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Dadkhah tehrani R, Oodi A, Azarkeivan A, Amirizadeh N. Rh blood group genotyping in alloimmunized thalassemic patientsin Tehran Adult Thalassemia Clinic during 2017-18. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2020; 17 (1) :36-46
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1288-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1288-fa.html
دادخواه تهرانی راضیه، اودی آرزو، آذرکیوان آزیتا، امیری زاده ناصر. ژنوتیپ سیستم گروه خونی Rh در بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی درمانگاه تالاسمی بزرگسالان در سال‌های 1397-1396. فصلنامه پژوهشی خون. 1399; 17 (1) :36-46
دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 619 kb]
(1252 دریافت)
| چکیده (HTML) (3221 مشاهده)
مقدمه
از میان گروههای خونی که تاکنون شناخته شده، گروههای خونی Rh ، Kell ، Kidd و Duffy از جمله گروههای خونی هستند که از نظر بالینی مهم می‌باشند. سیستم Rh (ISBT 004) با پیچیده‌ترین اساس ژنتیکی و بیش از 60 آنتی‌ژن، از نظر اهمیت بالینی بعد از ABO قرار می‌گیرد. پروتئین‌های Rh هر کدام از 416 آمینو اسید ساخته شده و پروتئین‌های اصلی آن RhD و RhCE می‌باشد. سیستم Rh دارای آنتی‌ژن‌های فراوان و بسیار ایمونوژن است، اما قابل توجه‌ترین آنتی‌ژن آن ناشی از حضور و یا عدم حضور آنتی‌ژن D روی پلی‌پپتید RhD می‌باشد که معمولاً در انتقال خون برای بررسی سیستم Rh تنها حضور این آنتی‌ژن بر روی گلبول‌های قرمز بررسی میشود که به صورت Rh مثبت و Rh منفی گزارش میشود، اما آنتی‌ژن‌های دیگر Rh از جمله C, c, E, e نیز می‌تواند باعث واکنش‌های همولیتیک شدید در انتقال خون شوند که ایمونوژنسیتی آنتی‌ژن‌ها به صورت c>E>e>C D> می‌باشد(3-1).
دو جایگاه ژنی همولوگوس کد کننده دو پلی‌پپتید (RhD (CD240D و (RhCE (CD240C در کمپلکس رزوس در موقعیت کروموزومی1 (P34-36.1)در کنار یگدیگر قرار می‌گیرند. محتوای ژنوم هر کدام از ژن‌های RhD و RhCE حدود Kbp 75 می‌باشد و هرکدام دارای 10 اگزون هستند. دو ژن RhD و RhCE در توالی نوکلئوتیدی، 92% و در توالی آمینو اسیدی 96% با یکدیگر هومولوژی دارند و دو قطعه دیگر به طول Kbp 9 به نام Rhesus box با 6/98% شباهت در توالی و جهت‌گیری یکسان در دو طرف ژن RhD قرار گرفته است(5-2).
4 آلل محصول ژن RhCE ناشی از پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی می‌باشند که 4 تغییر نوکلئوتیدی باعث تغییر در توالی آمینواسیدی میشود. این جایگزینی‌ها در پلی‌مورفیسم C نسبت به c به ترتیب به صورت C>G nt48 (اگزون 1)، nt178 A>C ، nt203G>A ، nt307 T>C (هرسه در اگزون 2) و در پلی‌مورفیسم E/e به صورت nt676 C>G در اگزون 5 می‌باشد(6، 2).
بیماری تالاسمی یکی از متداول‌ترین بیماری‌های ژنتیکی
در سراسر جهان است و تزریق خون، مهم‌ترین درمان حمایتی برای این افراد می‌باشد. تزریق‌های مکرر خون، بیمار را در معرض عوارض فراوانی قرار می‌دهد که مهم‌ترین آن‌ها، آلوایمیونیزاسیون می‌باشد. طبق مطالعه‌های صورت گرفته، میزان آلوایمیونیزاسیون در بین جمعیت‌های متفاوت در بیماران تالاسمی حدود 37%-3/5% تخمین زده شده است(8، 7). تولید آنتی‌بادی می‌تواند به طور قابل توجهی در درمان اختلال ایجاد کرده و دسترسی به یک تزریق خون سازگار را با مشکل روبرو سازد(10، 9). اما فراهم آوردن یک تزریق خون سازگار در این بیماران، به دلیل طول عمر بیشتر گلبول‌های قرمز اهداکننده در بدن بیمار، باعث کاهش نیاز به تزریق خون و در نتیجه کاهش عوارض میشود (11).
اگر چه روش سرولوژی(هماگلوتیناسیون) هنوز یک روش استاندارد برای تعیین فنوتیپ گروههای خونی می‌باشد اما انجام فنوتیپ در بیماران تالاسمی به دلیل حضور گلبول‌های قرمز اهداکننده در گردش خون بیمار و نیاز به تکرار بررسی‌ها به دلیل عدم شناسایی صحیح آنتی‌ژن‌ها، وقت‌گیر و تفسیر آن مشکل می‌باشد. روشهای مولکولی مختلف با استفاده از آنالیز DNA می‌تواند به این محدودیت‌ها غلبه کند و امکان تعیین دقیق آللهای گروههای خونی و دست‌یابی به یک تزریق خون سازگار و سودمند را فراهم کند(12، 5). بدین جهت در مطالعه حاضر تلاش گردید برای اولین بار در ایران، روشهای مولکولی شامل PCR-SSP وDNA Sequencing را برای تعیین آللهای C، c ،E ، e از سیستم Rh راه‌اندازی کرده و نتایج آن را با روش سرولوژی در بیماران تالاسمی دارای تزریق خون متعدد مقایسه نماییم.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع مقطعی- توصیفی بود و از روش نمونه‌گیری غیر احتمالی آسان استفاده شد. برای بیان نتایج از روشهای آماری توصیفی استفاده گردید.
در این مطالعه از 200 بیمار مراجعه‌کننده به درمانگاه تالاسمی ظفر تهران با سابقه تولید آنتی‌بادی، 5 میلی‌لیتر خون کامل EDTA دار جمع‌آوری گردید.
تعداد 10 اهداکننده سالم مراجعه‌کننده به سازمان انتقال خون به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. فنوتیپ و ژنوتیپ این بیماران تعیین شد و برای تایید نتایج، تعیین توالی انجام شد. از نمونه‌های کنترل جهت بهینه‌سازی راه‌اندازی روشهای مولکولی و به عنوان نمونه کنترل مثبت استفاده شد.
تعیین فنوتیپ:
تعیین فنوتیپ آنتی‌ژن‌های C،c،E،e به صورت سرولوژیک با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال Anti-C،
Anti-c ، Anti-E ، Anti-e (آلمان، GmbH ، ایمونودیا- نوستیکا) و با روش استاندارد لوله‌ای، بر اساس هماگلوتیناسیون استاندارد انجام پذیرفت. برای تعیین هر یک از آنتی‌ژن‌های گروه خونی، یک لوله اختصاص داده سپس به هر لوله یک قطره آنتی‌بادی و یک تا دو قطره از سوسپانسیون 5%-3% گلبول قرمز اضافه گردید. سپس لولهها به مدت 30 ثانیه با دور rpm1500 سانتریفیوژ شد. وجود آگلوتیناسیون در هر لوله در مقابل آینه مقعر همراه با حرکت دادن آهسته لولهها بررسی گردید.غربالگری و تعیین هویت آنتی‌بادی‌ها بر اساس استانداردهای مرجع سازمان انتقال خون ایران و با استفاده از کیت‌های ارسالی از این مرکز انجام شد و نتایج ثبت گردید.
روشهای مولکولی:
استخراج DNA :
استخراج DNAاز خون کامل یا بافی‌کوت، با استفاده از کیت Nucleic Acid purification محصول شرکت یکتا تجهیز آزما انجام گرفت. جهت اطمینان از کیفیت نمونه‌های استخراج شده، جذب نوری DNA استخراج شده توسط دستگاه نانو دراپ مورد بررسی قرار گرفت و نمونه‌ها در فریزر 21- درجه سانتی گراد ذخیره شد.
مطالعه‌های بیوانفورماتیک:
از آن جایـی کـه ژن RHD و ژن RHCE حدود 96% در
توالی نوکلئوتیدی با هم شباهت دارند، بنابراین آغازگرها بایـد به گونه‌ای طراحی می‌شدند که به طور اختصاصی بـه
نواحی مورد نظر در هر یک از ژن‌ها متصل شوند تا از تکثیرهای نابه‌جای ژن‌ها در واکنش PCR ممانعت به عمل آید. برای بررسی این ژن از سه روش PCR-SSP وPCR-RFLP و DNA Sequencing استفاده گردید. از اگزونهای 1،2 به دلیل وجود جایگزینی‌های تک نوکلئوتیدی بین دو آلل C و c و اینترون 2 به دلیل اضافه شدن یک توالی bp 109 در آلل C نسبت به c(و هم چنین آلل D) برای تمایز این دو پلی‌مورفیسم استفاده شد و هم چنین اگزون 5 به دلیل وجود یک جایگزینی تک نوکلئوتیدی در جایگاه 676 برای تعیین پلی‌مورفیسم E/e مورد استفاده قرار گرفت. جزئیات این تغییرات نوکلئوتیدی به تفصیل در مقدمه آورده شده است.
PCR-SSP:
آغازگرهای شروع‌کننده جهت PCR-SSP ، آللهای RhCE*C/c از مقاله اکمن و همکاران در سال 2002 و برای آللهای RHCE*E/e از مقاله فاس و همکاران در سال 1995 گرفته شد(جدول 1)(14، 13). هورمون رشد انسانی به عنوان کنترل داخلی استفاده گردید. حجم کلی واکنش µL 25 و شامل: µL 5/12 از 2x Master Mix PCR (ایران، یکتا تجهیز آزما)، غلظت ng 100-50 DNA و غلظت مخلوط آغازگر مستقیم و معکوس برای هریک از آللهای C و E µM 4/0 و برای آللهای c و e µM 3/0 بوده است. ژنوتیپ تمامی بیماران با استفاده از روش PCR-SSP تعیین شد. برنامه دمایی در دستگاه ترموسایکلر برای این آلل‌ها به صورت زیر می‌باشد:
برای آلل: RHCE*C/c 1 چرخه 3 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 33 چرخه 30 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 63 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد و 1 چرخه 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد.
برای آلل RHCE*E/e : 1 چرخه 5 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 35 چرخه 30 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 52 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد و 1چرخه 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد.
پس از تکثیر DNA ، الکتروفورز محصولات حاصل از PCR روی ژل آگـارز 2% در دستگــاه ژل داکــت مشاهده
جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده جهت بررسی مولکولی به روش PCR-SSP (14، 13)
گردید و نتایج ثبت و بررسی شد.
تعیین توالی DNA (DNA Sequencig):
در این روش جهت مشاهده SNPهای مورد نظر و تایید نتایج PCR-SSP و هم چنین امکان یافتن SNPهای جدید، از این روش استفاده گردید. در این روش از اگزون 1 و اینترون2 جهت شناسایی آللهای RHCE*C/c و از اگزون 5 برای شناسایی آللهای RHCE*E/e استفاده شد و بیمارانی که بین فنوتیپ و ژنوتیپ آن‌ها تفاوت وجود داشت و هم چنین 10 اهداکننده با فنوتیپ‌های متفاوت، جهت کنترل و Set up دو روش مذکور مورد استفاده قرار گرفتند. در ابتدا آغازگرهای مورد استفاده برای تعیین توالی این اگزون‌ها با الگو گرفتن از آغازگرهای معرفی شده توسط دوشر و همکارانش در سال 2005 که برای ژن RHD استفاده کردند، طراحی شدند و پس از تکثیر قطعات، تعیین توالی توسط برنامه کروماس تفسیر شد و SNPها تعیین گردید(15).
حجم کلی واکنش برای اگزون 1، µL 50 و شامل: µL 25 از Master Mix 2x PCR ، غلظت ng 150 DNA و غلظت آغازگر مستقیم و معکوس برای اگزون 1، µM 6/0 بود. حجم کلی واکنش برای اگزون 5 ، µL 50 و شامل: µL 25 از Master Mix 2x PCR، غلظت ng 50 DNA و غلظت آغازگر مستقیم و معکوس برای اگزون 1 µM 4/0 بود. برنامه دمایی برای هر دو واکنش PCR برای این اگزون‌ها در دستگاه ترموسایکلر به صورت زیر می‌باشد:
1 چرخه 2 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 چرخه 30 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 69 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد و 1چرخه 10 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد.
یافته‌ها
در این مطالعه 200 بیمار تالاسمی دارای آلوآنتیبادی شامل 81 (%5/40) بیمار مذکر و 119 (%5/59) بیمار مؤنث و با میانگین سنی 9/10± 30 سال(رنج سنی 65-4 سال) مورد بررسی قرار گرفتند که از این بین 108 (54%) بیمار تالاسمی ماژور، 90 (45%) بیمار اینترمدیا و 2 (1%) بیمار مبتلا به سیکل/بتا تالاسمی بودند.
نتایج تعیین نوع و فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در جمعیت مورد مطالعه:
در مطالعه حاضر بیشترین فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در گروه خونی Rh به صورت 55 بیمار(22%)Anti-E و 24 بیمار(10%) Anti-D بود. هم چنین آنتی‌بادی‌های دیگر گروه خونی Rh به صورت 14 بیمار(7%) Anti-C ، 10 بیمار(5%) Anti-c و Anti-e حدود 2 بیمار(1%) مشخص گردید(جدول 2).
نتایج تعیین فنوتیپ برای آنتی‌ژن‌های C/c و E/e :
فراوانی هر یک از این آلل‌ها با روش سرولوژی در
جمعیت مورد مطالعه به صورت 139 (5/69%) C ، 146 (73%) c ، 33 (5%/16) E ، 192 (96%) e مشاهده شد. هم چنین 31 (5/15%) بیمار دارای نتایج Mixed Field بودند.
جدول 2: فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در گروه خونی Rh
شکل 1: الکتروفورز محصولات تکثیر اگزون 5 ژن RHCE به روشSSP PCR- (آلل (RHe در ژل آگارز 2% . نمونه بیماران در ستون 2 و 3 مثبت(علاوه بر باند هورمون رشد باند اختصاصی مربوط به آلل RHe به طول bp 141 تشکیل شده است) و نمونه بیمار در ستون شماره 4 منفی می‌باشند(تنها باند هورمون رشد دیده میشود). ستون 6: کنترل منفی آغازگرها.
شکل 2: الکتروفورز محصولات PCR-SSP مربوط به اگزون 2 آلل RHc برروی ژل آگارز 2% . نمونه بیماران در ستون‌های 2، 1 و 3 منفی (تنها باند هورمون رشد دیده میشود) و نمونه بیماران در ستون‌های 6، 7 و 8 مثبت(علاوه بر باند مربوط به هورمون رشد باند اختصاصی RHc به طول bp 179مشاهده میشود) می‌باشند، ردیف 5: کنترل منفی آغازگر
شکل 3: الکتروفورز محصولات به دست آمده از تکثیر اگزونهای1 و 5 ژن RHCEروی ژل آگارز 2% . ردیف 1-3: اگزون 1، ردیف 4-6: اگزون 5
بحث
تزریق خون مداوم، یک درمان حمایتی و مهم در بیماران تالاسمی می‌باشد. یکی از مهم‌ترین عوارض تزریق خون، آلوایمیونیزاسیون است که به طور قابل توجهی دسترسـی بـه یـک تزریـق خـون ایمـن را با مشکل روبرو
می‌سازد و باعث واکنش‌های همولیتیک حاد و تاخیری در بیماران میشود که مهم‌ترین این آلوآنتی‌بادی‌ها مربوط به گروه خونی Rh می‌باشد(9). در مطالعه حاضر، بیشترین فراوانی آلوآنتیبادی در گروه خونی Rh از نوع (22%) Anti-E و (10%) Anti-D بود، هم چنین آنتی‌بادی‌های دیگر گروه خونی Rh به صورت(7%)Anti-C ، (5%) Anti-c و Anti-e حدود 1% مشخص گردید. کریمی و همکاران در مطالعه خود در سال 2007 میزان آلوایمیونیزاسیون را در جنوب ایران 3/5% گزارش کردند که بیشترین فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در گروه خونی Rh مربوط به (15%)Anti-D و (10%) Anti-E بود(16). صادقیان و همکاران در مطالعه خود در سال 2009، میزان آلوایمیونیزاسیون در شمال شرق ایران را 87/2% گزارش کردند که بیشترین فراوانی آلوآنتی بادی مربوط به(88%) Anti-D و سپس Anti-C و Anti-E بوده است(17). در مطالعه‌ای که آذرکیوان و همکارانش در سال 2011 در 835 بیمار تالاسمی انجام دادند، Anti-K (34%) بیشترین آلوآنتیبادی و پس از آن (11%) Anti-D و (10%) Anti-E دارای بیشترین فراوانی بودند. هم چنین در این مطالعه درصد فراوانی سایر آلوآنتی‌بادی‌های مربوط به گروه خونی Rh ، 15% گزارش گردید(18). در مطالعه مروری که در سال 2016 توسط پورفتح‌اله و همکارانش انجام شد، میزان آلوایمیونیزاسیون در ایران 10% گزارش شد که در این مطالعه بیشترین آلوآنتی‌بادی‌ها مربوط به (37%) Anti-K، (29%) Anti-D و (20%) Anti-E بودند (19). همان طور که مشاهده میشود، فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در این مطالعه به مطالعه‌های انجام شده در داخل کشور شباهت زیادی دارد.
در مطالعه حاضر با مقایسه نتایج سرولوژی و ژنوتیپ، بیماران در 45 آلل(5/22%) مربوط به گروه خونی Rh دارای تناقض بوده‌اند. این تناقضات 5/7% در آلل C، 6% در آلل c، 5/9% در آلل E و 6/1% در آلل e بوده است. هم چنین در این مطالعه 31 (5/15%) بیمار نیز در آزمایش سرولوژی دارای واکنش میکسد فیلد بوده‌اند که درصد قابل توجهی می‌باشد. در چندین مطالعه مشابه، بین نتایج سرولوژی و ژنوتیپ، اختلافاتی دیده شد که در بیشتر این مطالعه‌ها بیشترین اختلافات مربوط به سیستم Rh بود.
در سال 2009 مطالعه‌ای توسط شایگان و همکارانش روی 44 بیمار با تزریق خون مداوم جهت تعیین آللهای گروههای خونی فرعی Rh ،Kell ،Kidd ، Duffy به دو روش هماگلوتیناسیون و تعیین ژنوتیپ به روش RFLP PCR در ایران صورت گرفت. در این مطالعه در 26 نفر از بیماران، 53 مورد ناسازگاری در آللهای مختلف مشاهده شد که بیشترین ناسازگاری مربوط به گروه خونی Rh (19مورد) بود(20).
در سال 2010 در مطالعه‌ای که توسط گوئلسین و همکارانش در جنوب برزیل انجام شد، 10% بیماران دارای آلوآنتیبادی بودند و بین دو روش فنوتیپ و ژنوتیپ، 16 اختلاف مشخص شد. در این مطالعه بیشترین تناقض در گروه خونی Rhیافت گردید که ازبین 16 تناقض دیده شده در 38 بیمار، 8 تناقض در 5 آلل اصلی D،C ، c،E ،e این گروه خونی دیده شد(21%)(21).
آنجلابلسیتو و همکارانش در سال 2015، در مطالعه‌ای جهت بررسی و مقایسه این دو روش، در 46% عدم تطابق برای گروه RhCE(بیشترین تناقض) مشاهده کردند (22).
ژان و همکارانش در سال 2016، در بیماران با تزریق خون مکرر مطالعه‌ای را به انجام رسانیدند. تعیین فنوتیپ گروههای خونی Rh ، Kell ، Kidd ، Duffy و MNSs را به دوروش سرولوژی و ژنوتیپ انجام دادند. از بین 3 نفر تالاسمی، یک نفر دارای دو اختلاف در گروه RhCE بود که در روش سرولوژی به صورت C/c RH*CEوE/e RH*CE و در ژنوتیپ به صورت C/C RH*CE و RH*CE e/e مشخص گردید. در این مطالعه در افراد بدون تزریق خون قبلی، بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ هیچ گونه تناقضی مشاهده نگردید. نتایج این مطالعه نیز حمایت کننده نتایج ما در راستای وجود اختلال در تعیین فنوتیپ افراد با تزریق خون مداوم می‌باشد(23).
سپس در سال 2017 مطابق مطالعه صورت گرفته توسط روسانا پاتزولا و همکارانش، در صورت تزریق خون مطابق با گروه خون مشخص شده به روش مولکولی، هیچ گونه افزایشی در تولید آلوآنتیبادی آن‌ها مشاهده نگردید. این مطالعه اهمیت تعیین دقیق گروههای خونی مهم و تزریق واحدهای کاملاً سازگار در افراد گیرنده‌ی خون را بیان می‌کند(9). در این مطالعه از 10 اهداکننده مستمر، به عنوان نمونه کنترل استفاده شد. فنوتیپ وژنوتیپ این نمونه‌ها به ترتیب با استفاده از روش استاندارد سرولوژی و روشهای مولکولی تعیین شد. نتایج این روش‌ها کاملاً با یکدیگر تطابق داشته و می‌توان گفت حساسیت و اختصاصیت روش مولکولی نسبت به روش استاندارد هماگلوتیناسیون 100% بوده است. اما در این مطالعه به دلیل این که بیماران تالاسمی مد نظر هستند و این بیماران به طور مکرر خون دریافت می‌کنند، در تعیین صحیح فنوتیپ این بیماران با مشکل روبرو هستیم. همان طور که گفته شد، در این مطالعه 45 مورد ناسازگاری بین فنوتیپ و ژنوتیپ در آللهای مختلف گروه خونی Rh دیده شد. بنابراین برای این بیماران نمی‌توان از روش سرولوژی به عنوان روش استاندارد استفاده کرد. اگر در بین روشهای مولکولی، روش تعییین توالی را به عنوان روش استاندارد در نظر بگیریم، خواهیم دید حساسیت و اختصاصیت سایر روشهای مولکولی، نسبت به این روش 100% بوده است. نتایج متفاوت بین روش سرولوژی و روشهای مولکولی در این مطالعه و سایر مطالعه‌های انجام شده در این راستا، نشان می‌دهد که اگر چه روش سرولوژی به عنوان روش استاندارد برای تعیین فنوتیپ گروههای خونی استفاده میشود اما محدودیت‌های این روش در بعضی مواقع به خصوص در بیماران با تزریق خون مکرر، سبب تولید و گسترش آلوآنتیبادی در این افراد میشود. در مطالعه حاضر برای تعیین ژنوتیپ گروه خونی Rh ، از روشهای مولکولی مختلفی استفاده گردید که همان طور که ذکر شد،
نتایج این روش‌ها یکدیگر را تایید کردند. در نتیجه نتایج این مطالعه و سایر مطالعه‌ها نشان‌دهنده اختصاصیت بالای روشهای مولکولی و امکان استفاده از آن‌ها به عنوان روش مکمل در تعیین گروههای خونی می‌باشد.
نتیجه‌گیری
با توجه به نتایج این مطالعه و سایر مطالعه‌های انجام شده، آنتی‌بادی‌های مربوط به گروه خونی Rh در بیماران تالاسمی با فراوانی بالایی تولید می‌شوند، تعیین دقیق آنتی‌ژن‌های این سیستم خونی قبل و حتی بعد از تزریق خون می‌تواند باعث کاهش قابل توجه آلوایمیونیزاسیون در تزریق‌های بعدی خون در این بیماران شود. بنا بر نتایج این مطالعه، روشهای مولکولی با حل مشکلات روش سرولوژی به عنوان یک روش مکمل، می‌توانند به تعیین دقیق این آنتی‌ژن‌ها کمک کنند.
تشکر و قدردانی
از زحمـات همکـاران بخـــش ایمونوهمـاتولوژی سـتاد مرکـزی سـازمان انتقـال خـون و پرسنل درمانگاه تالاسمی بزرگسالان ظفر که در این پژوهش مـا را یاری کردند، صمیمانه سپاسـگزاریم. این مقاله ماحصل طرح مصوب در مؤسسه ملی توسعه تحقیقات علوم پزشکی ایران با کد طرح 942644 مصوب سال 1395بوده و هزینه‌های آن از محل این سازمان تامین گردیده است.
متن کامل: (5092 مشاهده)
ژنوتیپ سیستم گروه خونی Rh در بیماران تالاسمی دارای آلوآنتیبادی
درمانگاه تالاسمی بزرگسالان در سال‌های 1397-1396
راضیه دادخواه تهرانی1، آرزو اودی2، آزیتا آذرکیوان3، ناصر امیری‌زاده4
چکیده
سابقه و هدف
پس از سیستم ABO ، آنتی‌ژن‌های اصلی سیستم گروه خونی Rh D)، C، c، E، (e، ایمونوژن‌ترین آنتی‌ژن‌ها می‌باشند. روش سرولوژی با توجه به وجود گلبول‌های قرمز اهداکننده در گردش خون بیمار، قادر به تشخیص دقیق آنتی‌ژن‌های گروههای خونی در بیماران با تزریق خون مداوم نیست اما روشهای مولکولی می‌توانند با بررسی DNA با صحت بالایی این آنتی‌ژن‌ها را تعیین کند.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه مقطعی ـ توصیفی، نمونه‌های خون محیطی 200 بیمار مبتلا به تالاسمی دارای آلوآنتیبادی شامل81 (5/40%) بیمار مذکر و 119 (5/59%) بیمار مؤنث با میانگین سنی 9/10 ± 30 سال (رنج سنی 65-4 سال) در درمانگـاه تالاسمـی تهـران در سال‌های 1397-1396 جمع‌آوری گردید و تعیین فنوتیپ آنتی‌ژن‌های C ،c ،E ، e انجام شد. PCR-SSP برای تمامی نمونه‌ها انجام گرفت و در موارد ناهمخوانی بین نتایج ژنوتیپ و سرولوژی، نتایج به روش تعیین توالی DNA تایید شدند.
یافته‌ها
در این مطالعه بیشترین فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در سیستم Rh مربوط به Anti-E (44 بیمار، 22%) و Anti-D (20 بیمار، 10%) و فراوانی آلل‌ها به روش ژنوتیپ به صورت 142 نفر(71%) C، 145 نفر(5/72%) c ، 46 نفر (23%) E و 196 نفر(98%) e بوده است. در این مطالعه، 38 مورد ناسازگاری بین نتایج سرولوژی و ژنوتیپ مشاهده شد. این ناسازگاری‌ها 5/7% (14) در RHC ، 6% (11) در RHc ، 5/9% (17) در RHE و 5/1% (3) در RHe دیده شد.
نتیجه گیری
تعیین ژنوتیپ گروههای خونی می‌تواند به عنوان روش مکمل با رفع مشکلات روش سرولوژی، کمک شایانی به تعیین دقیق آنتی‌ژن‌های گروه خونی بکند.
کلمات کلیدی: تالاسمی، ژنوتیپ، گروههای خونی
تاریخ دریافت: 9 /4/98
تاریخ پذیرش: 30/7/98
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- فوق تخصص هماتولوژی و انکولوژی کودکان ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
درمانگاه تالاسمی بزرگسالان در سال‌های 1397-1396
راضیه دادخواه تهرانی1، آرزو اودی2، آزیتا آذرکیوان3، ناصر امیری‌زاده4
چکیده
سابقه و هدف
پس از سیستم ABO ، آنتی‌ژن‌های اصلی سیستم گروه خونی Rh D)، C، c، E، (e، ایمونوژن‌ترین آنتی‌ژن‌ها می‌باشند. روش سرولوژی با توجه به وجود گلبول‌های قرمز اهداکننده در گردش خون بیمار، قادر به تشخیص دقیق آنتی‌ژن‌های گروههای خونی در بیماران با تزریق خون مداوم نیست اما روشهای مولکولی می‌توانند با بررسی DNA با صحت بالایی این آنتی‌ژن‌ها را تعیین کند.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه مقطعی ـ توصیفی، نمونه‌های خون محیطی 200 بیمار مبتلا به تالاسمی دارای آلوآنتیبادی شامل81 (5/40%) بیمار مذکر و 119 (5/59%) بیمار مؤنث با میانگین سنی 9/10 ± 30 سال (رنج سنی 65-4 سال) در درمانگـاه تالاسمـی تهـران در سال‌های 1397-1396 جمع‌آوری گردید و تعیین فنوتیپ آنتی‌ژن‌های C ،c ،E ، e انجام شد. PCR-SSP برای تمامی نمونه‌ها انجام گرفت و در موارد ناهمخوانی بین نتایج ژنوتیپ و سرولوژی، نتایج به روش تعیین توالی DNA تایید شدند.
یافته‌ها
در این مطالعه بیشترین فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در سیستم Rh مربوط به Anti-E (44 بیمار، 22%) و Anti-D (20 بیمار، 10%) و فراوانی آلل‌ها به روش ژنوتیپ به صورت 142 نفر(71%) C، 145 نفر(5/72%) c ، 46 نفر (23%) E و 196 نفر(98%) e بوده است. در این مطالعه، 38 مورد ناسازگاری بین نتایج سرولوژی و ژنوتیپ مشاهده شد. این ناسازگاری‌ها 5/7% (14) در RHC ، 6% (11) در RHc ، 5/9% (17) در RHE و 5/1% (3) در RHe دیده شد.
نتیجه گیری
تعیین ژنوتیپ گروههای خونی می‌تواند به عنوان روش مکمل با رفع مشکلات روش سرولوژی، کمک شایانی به تعیین دقیق آنتی‌ژن‌های گروه خونی بکند.
کلمات کلیدی: تالاسمی، ژنوتیپ، گروههای خونی
تاریخ دریافت: 9 /4/98
تاریخ پذیرش: 30/7/98
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- فوق تخصص هماتولوژی و انکولوژی کودکان ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه
از میان گروههای خونی که تاکنون شناخته شده، گروههای خونی Rh ، Kell ، Kidd و Duffy از جمله گروههای خونی هستند که از نظر بالینی مهم می‌باشند. سیستم Rh (ISBT 004) با پیچیده‌ترین اساس ژنتیکی و بیش از 60 آنتی‌ژن، از نظر اهمیت بالینی بعد از ABO قرار می‌گیرد. پروتئین‌های Rh هر کدام از 416 آمینو اسید ساخته شده و پروتئین‌های اصلی آن RhD و RhCE می‌باشد. سیستم Rh دارای آنتی‌ژن‌های فراوان و بسیار ایمونوژن است، اما قابل توجه‌ترین آنتی‌ژن آن ناشی از حضور و یا عدم حضور آنتی‌ژن D روی پلی‌پپتید RhD می‌باشد که معمولاً در انتقال خون برای بررسی سیستم Rh تنها حضور این آنتی‌ژن بر روی گلبول‌های قرمز بررسی میشود که به صورت Rh مثبت و Rh منفی گزارش میشود، اما آنتی‌ژن‌های دیگر Rh از جمله C, c, E, e نیز می‌تواند باعث واکنش‌های همولیتیک شدید در انتقال خون شوند که ایمونوژنسیتی آنتی‌ژن‌ها به صورت c>E>e>C D> می‌باشد(3-1).
دو جایگاه ژنی همولوگوس کد کننده دو پلی‌پپتید (RhD (CD240D و (RhCE (CD240C در کمپلکس رزوس در موقعیت کروموزومی1 (P34-36.1)در کنار یگدیگر قرار می‌گیرند. محتوای ژنوم هر کدام از ژن‌های RhD و RhCE حدود Kbp 75 می‌باشد و هرکدام دارای 10 اگزون هستند. دو ژن RhD و RhCE در توالی نوکلئوتیدی، 92% و در توالی آمینو اسیدی 96% با یکدیگر هومولوژی دارند و دو قطعه دیگر به طول Kbp 9 به نام Rhesus box با 6/98% شباهت در توالی و جهت‌گیری یکسان در دو طرف ژن RhD قرار گرفته است(5-2).
4 آلل محصول ژن RhCE ناشی از پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی می‌باشند که 4 تغییر نوکلئوتیدی باعث تغییر در توالی آمینواسیدی میشود. این جایگزینی‌ها در پلی‌مورفیسم C نسبت به c به ترتیب به صورت C>G nt48 (اگزون 1)، nt178 A>C ، nt203G>A ، nt307 T>C (هرسه در اگزون 2) و در پلی‌مورفیسم E/e به صورت nt676 C>G در اگزون 5 می‌باشد(6، 2).
بیماری تالاسمی یکی از متداول‌ترین بیماری‌های ژنتیکی
در سراسر جهان است و تزریق خون، مهم‌ترین درمان حمایتی برای این افراد می‌باشد. تزریق‌های مکرر خون، بیمار را در معرض عوارض فراوانی قرار می‌دهد که مهم‌ترین آن‌ها، آلوایمیونیزاسیون می‌باشد. طبق مطالعه‌های صورت گرفته، میزان آلوایمیونیزاسیون در بین جمعیت‌های متفاوت در بیماران تالاسمی حدود 37%-3/5% تخمین زده شده است(8، 7). تولید آنتی‌بادی می‌تواند به طور قابل توجهی در درمان اختلال ایجاد کرده و دسترسی به یک تزریق خون سازگار را با مشکل روبرو سازد(10، 9). اما فراهم آوردن یک تزریق خون سازگار در این بیماران، به دلیل طول عمر بیشتر گلبول‌های قرمز اهداکننده در بدن بیمار، باعث کاهش نیاز به تزریق خون و در نتیجه کاهش عوارض میشود (11).
اگر چه روش سرولوژی(هماگلوتیناسیون) هنوز یک روش استاندارد برای تعیین فنوتیپ گروههای خونی می‌باشد اما انجام فنوتیپ در بیماران تالاسمی به دلیل حضور گلبول‌های قرمز اهداکننده در گردش خون بیمار و نیاز به تکرار بررسی‌ها به دلیل عدم شناسایی صحیح آنتی‌ژن‌ها، وقت‌گیر و تفسیر آن مشکل می‌باشد. روشهای مولکولی مختلف با استفاده از آنالیز DNA می‌تواند به این محدودیت‌ها غلبه کند و امکان تعیین دقیق آللهای گروههای خونی و دست‌یابی به یک تزریق خون سازگار و سودمند را فراهم کند(12، 5). بدین جهت در مطالعه حاضر تلاش گردید برای اولین بار در ایران، روشهای مولکولی شامل PCR-SSP وDNA Sequencing را برای تعیین آللهای C، c ،E ، e از سیستم Rh راه‌اندازی کرده و نتایج آن را با روش سرولوژی در بیماران تالاسمی دارای تزریق خون متعدد مقایسه نماییم.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع مقطعی- توصیفی بود و از روش نمونه‌گیری غیر احتمالی آسان استفاده شد. برای بیان نتایج از روشهای آماری توصیفی استفاده گردید.
در این مطالعه از 200 بیمار مراجعه‌کننده به درمانگاه تالاسمی ظفر تهران با سابقه تولید آنتی‌بادی، 5 میلی‌لیتر خون کامل EDTA دار جمع‌آوری گردید.
تعداد 10 اهداکننده سالم مراجعه‌کننده به سازمان انتقال خون به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. فنوتیپ و ژنوتیپ این بیماران تعیین شد و برای تایید نتایج، تعیین توالی انجام شد. از نمونه‌های کنترل جهت بهینه‌سازی راه‌اندازی روشهای مولکولی و به عنوان نمونه کنترل مثبت استفاده شد.
تعیین فنوتیپ:
تعیین فنوتیپ آنتی‌ژن‌های C،c،E،e به صورت سرولوژیک با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال Anti-C،
Anti-c ، Anti-E ، Anti-e (آلمان، GmbH ، ایمونودیا- نوستیکا) و با روش استاندارد لوله‌ای، بر اساس هماگلوتیناسیون استاندارد انجام پذیرفت. برای تعیین هر یک از آنتی‌ژن‌های گروه خونی، یک لوله اختصاص داده سپس به هر لوله یک قطره آنتی‌بادی و یک تا دو قطره از سوسپانسیون 5%-3% گلبول قرمز اضافه گردید. سپس لولهها به مدت 30 ثانیه با دور rpm1500 سانتریفیوژ شد. وجود آگلوتیناسیون در هر لوله در مقابل آینه مقعر همراه با حرکت دادن آهسته لولهها بررسی گردید.غربالگری و تعیین هویت آنتی‌بادی‌ها بر اساس استانداردهای مرجع سازمان انتقال خون ایران و با استفاده از کیت‌های ارسالی از این مرکز انجام شد و نتایج ثبت گردید.
روشهای مولکولی:
استخراج DNA :
استخراج DNAاز خون کامل یا بافی‌کوت، با استفاده از کیت Nucleic Acid purification محصول شرکت یکتا تجهیز آزما انجام گرفت. جهت اطمینان از کیفیت نمونه‌های استخراج شده، جذب نوری DNA استخراج شده توسط دستگاه نانو دراپ مورد بررسی قرار گرفت و نمونه‌ها در فریزر 21- درجه سانتی گراد ذخیره شد.
مطالعه‌های بیوانفورماتیک:
از آن جایـی کـه ژن RHD و ژن RHCE حدود 96% در
توالی نوکلئوتیدی با هم شباهت دارند، بنابراین آغازگرها بایـد به گونه‌ای طراحی می‌شدند که به طور اختصاصی بـه
نواحی مورد نظر در هر یک از ژن‌ها متصل شوند تا از تکثیرهای نابه‌جای ژن‌ها در واکنش PCR ممانعت به عمل آید. برای بررسی این ژن از سه روش PCR-SSP وPCR-RFLP و DNA Sequencing استفاده گردید. از اگزونهای 1،2 به دلیل وجود جایگزینی‌های تک نوکلئوتیدی بین دو آلل C و c و اینترون 2 به دلیل اضافه شدن یک توالی bp 109 در آلل C نسبت به c(و هم چنین آلل D) برای تمایز این دو پلی‌مورفیسم استفاده شد و هم چنین اگزون 5 به دلیل وجود یک جایگزینی تک نوکلئوتیدی در جایگاه 676 برای تعیین پلی‌مورفیسم E/e مورد استفاده قرار گرفت. جزئیات این تغییرات نوکلئوتیدی به تفصیل در مقدمه آورده شده است.
PCR-SSP:
آغازگرهای شروع‌کننده جهت PCR-SSP ، آللهای RhCE*C/c از مقاله اکمن و همکاران در سال 2002 و برای آللهای RHCE*E/e از مقاله فاس و همکاران در سال 1995 گرفته شد(جدول 1)(14، 13). هورمون رشد انسانی به عنوان کنترل داخلی استفاده گردید. حجم کلی واکنش µL 25 و شامل: µL 5/12 از 2x Master Mix PCR (ایران، یکتا تجهیز آزما)، غلظت ng 100-50 DNA و غلظت مخلوط آغازگر مستقیم و معکوس برای هریک از آللهای C و E µM 4/0 و برای آللهای c و e µM 3/0 بوده است. ژنوتیپ تمامی بیماران با استفاده از روش PCR-SSP تعیین شد. برنامه دمایی در دستگاه ترموسایکلر برای این آلل‌ها به صورت زیر می‌باشد:
برای آلل: RHCE*C/c 1 چرخه 3 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 33 چرخه 30 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 63 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد و 1 چرخه 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد.
برای آلل RHCE*E/e : 1 چرخه 5 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 35 چرخه 30 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 52 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد و 1چرخه 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد.
پس از تکثیر DNA ، الکتروفورز محصولات حاصل از PCR روی ژل آگـارز 2% در دستگــاه ژل داکــت مشاهده
جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده جهت بررسی مولکولی به روش PCR-SSP (14، 13)
گردید و نتایج ثبت و بررسی شد.
تعیین توالی DNA (DNA Sequencig):
در این روش جهت مشاهده SNPهای مورد نظر و تایید نتایج PCR-SSP و هم چنین امکان یافتن SNPهای جدید، از این روش استفاده گردید. در این روش از اگزون 1 و اینترون2 جهت شناسایی آللهای RHCE*C/c و از اگزون 5 برای شناسایی آللهای RHCE*E/e استفاده شد و بیمارانی که بین فنوتیپ و ژنوتیپ آن‌ها تفاوت وجود داشت و هم چنین 10 اهداکننده با فنوتیپ‌های متفاوت، جهت کنترل و Set up دو روش مذکور مورد استفاده قرار گرفتند. در ابتدا آغازگرهای مورد استفاده برای تعیین توالی این اگزون‌ها با الگو گرفتن از آغازگرهای معرفی شده توسط دوشر و همکارانش در سال 2005 که برای ژن RHD استفاده کردند، طراحی شدند و پس از تکثیر قطعات، تعیین توالی توسط برنامه کروماس تفسیر شد و SNPها تعیین گردید(15).
حجم کلی واکنش برای اگزون 1، µL 50 و شامل: µL 25 از Master Mix 2x PCR ، غلظت ng 150 DNA و غلظت آغازگر مستقیم و معکوس برای اگزون 1، µM 6/0 بود. حجم کلی واکنش برای اگزون 5 ، µL 50 و شامل: µL 25 از Master Mix 2x PCR، غلظت ng 50 DNA و غلظت آغازگر مستقیم و معکوس برای اگزون 1 µM 4/0 بود. برنامه دمایی برای هر دو واکنش PCR برای این اگزون‌ها در دستگاه ترموسایکلر به صورت زیر می‌باشد:
1 چرخه 2 دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 چرخه 30 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 69 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد و 1چرخه 10 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد.
یافته‌ها
در این مطالعه 200 بیمار تالاسمی دارای آلوآنتیبادی شامل 81 (%5/40) بیمار مذکر و 119 (%5/59) بیمار مؤنث و با میانگین سنی 9/10± 30 سال(رنج سنی 65-4 سال) مورد بررسی قرار گرفتند که از این بین 108 (54%) بیمار تالاسمی ماژور، 90 (45%) بیمار اینترمدیا و 2 (1%) بیمار مبتلا به سیکل/بتا تالاسمی بودند.
نتایج تعیین نوع و فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در جمعیت مورد مطالعه:
در مطالعه حاضر بیشترین فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در گروه خونی Rh به صورت 55 بیمار(22%)Anti-E و 24 بیمار(10%) Anti-D بود. هم چنین آنتی‌بادی‌های دیگر گروه خونی Rh به صورت 14 بیمار(7%) Anti-C ، 10 بیمار(5%) Anti-c و Anti-e حدود 2 بیمار(1%) مشخص گردید(جدول 2).
نتایج تعیین فنوتیپ برای آنتی‌ژن‌های C/c و E/e :
فراوانی هر یک از این آلل‌ها با روش سرولوژی در
جمعیت مورد مطالعه به صورت 139 (5/69%) C ، 146 (73%) c ، 33 (5%/16) E ، 192 (96%) e مشاهده شد. هم چنین 31 (5/15%) بیمار دارای نتایج Mixed Field بودند.
جدول 2: فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در گروه خونی Rh
شکل 1: الکتروفورز محصولات تکثیر اگزون 5 ژن RHCE به روشSSP PCR- (آلل (RHe در ژل آگارز 2% . نمونه بیماران در ستون 2 و 3 مثبت(علاوه بر باند هورمون رشد باند اختصاصی مربوط به آلل RHe به طول bp 141 تشکیل شده است) و نمونه بیمار در ستون شماره 4 منفی می‌باشند(تنها باند هورمون رشد دیده میشود). ستون 6: کنترل منفی آغازگرها.
شکل 2: الکتروفورز محصولات PCR-SSP مربوط به اگزون 2 آلل RHc برروی ژل آگارز 2% . نمونه بیماران در ستون‌های 2، 1 و 3 منفی (تنها باند هورمون رشد دیده میشود) و نمونه بیماران در ستون‌های 6، 7 و 8 مثبت(علاوه بر باند مربوط به هورمون رشد باند اختصاصی RHc به طول bp 179مشاهده میشود) می‌باشند، ردیف 5: کنترل منفی آغازگر
شکل 3: الکتروفورز محصولات به دست آمده از تکثیر اگزونهای1 و 5 ژن RHCEروی ژل آگارز 2% . ردیف 1-3: اگزون 1، ردیف 4-6: اگزون 5
نتایج مربوط به آزمایش مولکولی : PCR-SSP
درصد فراوانی ژنوتیپ آللهای گروه خونی Rh بیماران در این مطالعه به صورت 142 نفر(71%) C ، 145 نفر (5/72%) c، 46 نفر(23%)E و 196 نفر(98%) e، بود (شکل‌های 1 و 2).
نتایج مربوط به تعیین توالی اگزون 1 و 5 از لکوس ژنی RHCE :
در این مطالعه بین نتایج تعیین توالی وPCR-SSP هیچ
گونه تناقضی دیده نشد و تعیین توالی نتایج PCR-SSP را کاملاً تایید کرد.
طول قطعه تکثیر شده از اگزون 1، bp 340 و اگزون 5، bp 367 می‌باشد. این قطعات تکثیر شده روی ژل آگارز 2 درصد قابل مشاهده هستند(شکل 3).
سپس نتایج حاصل از تعیین توالی با استفاده از نرم‌افزار (کروماس) مورد بررسی قرار گرفت(شکل‌های 4 و 5).
در ایـن نمونـه در نـوکلئوتیـد 48 بازهای C وG وجود
دارند که سبـب مـیشود ژنوتیـپ ایـن نمونـه بـه صورت
هتروزیگوت RHCE*C/c باشد.
نتایج حاصل از مقایسه آزمایش‌های سرولوژی و روش مولکولی:
در این مطالعه با مقایسه نتایج سرولوژی و ژنوتیپ، از
بین 200 بیمار مورد بررسی، 48 بیمار در آللهای مختلف گروه خونی Rh دارای تناقض بوده اند. این اختلافات به صورت RhC %5/7 (14) ، Rhc 6% (11)، RhE 5/9% (17)، Rhe 5/3% (3) دیده شد.
شکل 4: کروماتوگراف حاصل از تعیین توالی اگزون 1 ژن RHCE با استفاده از نرم‌افزار Chromas. در این نمونه در نوکلئوتید 48 بازهای C و G وجود دارند که سبب میشود ژنوتیپ این نمونه به صورت هتروزیگوت RHCE*C/c شود.
شکل 5: کروماتوگراف حاصل از تعیین توالی اگزون 5 ژن RHCE با استفاده از نرم‌افزار Chromas . در این نمونه در نوکلئوتید 676 ، باز C و G وجود دارد که سبب میشود ژنوتیپ این نمونه به صورت هتروزیگوت RHCE*E/e باشد.
درصد فراوانی ژنوتیپ آللهای گروه خونی Rh بیماران در این مطالعه به صورت 142 نفر(71%) C ، 145 نفر (5/72%) c، 46 نفر(23%)E و 196 نفر(98%) e، بود (شکل‌های 1 و 2).
نتایج مربوط به تعیین توالی اگزون 1 و 5 از لکوس ژنی RHCE :
در این مطالعه بین نتایج تعیین توالی وPCR-SSP هیچ
گونه تناقضی دیده نشد و تعیین توالی نتایج PCR-SSP را کاملاً تایید کرد.
طول قطعه تکثیر شده از اگزون 1، bp 340 و اگزون 5، bp 367 می‌باشد. این قطعات تکثیر شده روی ژل آگارز 2 درصد قابل مشاهده هستند(شکل 3).
سپس نتایج حاصل از تعیین توالی با استفاده از نرم‌افزار (کروماس) مورد بررسی قرار گرفت(شکل‌های 4 و 5).
در ایـن نمونـه در نـوکلئوتیـد 48 بازهای C وG وجود
دارند که سبـب مـیشود ژنوتیـپ ایـن نمونـه بـه صورت
هتروزیگوت RHCE*C/c باشد.
نتایج حاصل از مقایسه آزمایش‌های سرولوژی و روش مولکولی:
در این مطالعه با مقایسه نتایج سرولوژی و ژنوتیپ، از
بین 200 بیمار مورد بررسی، 48 بیمار در آللهای مختلف گروه خونی Rh دارای تناقض بوده اند. این اختلافات به صورت RhC %5/7 (14) ، Rhc 6% (11)، RhE 5/9% (17)، Rhe 5/3% (3) دیده شد.
شکل 4: کروماتوگراف حاصل از تعیین توالی اگزون 1 ژن RHCE با استفاده از نرم‌افزار Chromas. در این نمونه در نوکلئوتید 48 بازهای C و G وجود دارند که سبب میشود ژنوتیپ این نمونه به صورت هتروزیگوت RHCE*C/c شود.
شکل 5: کروماتوگراف حاصل از تعیین توالی اگزون 5 ژن RHCE با استفاده از نرم‌افزار Chromas . در این نمونه در نوکلئوتید 676 ، باز C و G وجود دارد که سبب میشود ژنوتیپ این نمونه به صورت هتروزیگوت RHCE*E/e باشد.
بحث
تزریق خون مداوم، یک درمان حمایتی و مهم در بیماران تالاسمی می‌باشد. یکی از مهم‌ترین عوارض تزریق خون، آلوایمیونیزاسیون است که به طور قابل توجهی دسترسـی بـه یـک تزریـق خـون ایمـن را با مشکل روبرو
می‌سازد و باعث واکنش‌های همولیتیک حاد و تاخیری در بیماران میشود که مهم‌ترین این آلوآنتی‌بادی‌ها مربوط به گروه خونی Rh می‌باشد(9). در مطالعه حاضر، بیشترین فراوانی آلوآنتیبادی در گروه خونی Rh از نوع (22%) Anti-E و (10%) Anti-D بود، هم چنین آنتی‌بادی‌های دیگر گروه خونی Rh به صورت(7%)Anti-C ، (5%) Anti-c و Anti-e حدود 1% مشخص گردید. کریمی و همکاران در مطالعه خود در سال 2007 میزان آلوایمیونیزاسیون را در جنوب ایران 3/5% گزارش کردند که بیشترین فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در گروه خونی Rh مربوط به (15%)Anti-D و (10%) Anti-E بود(16). صادقیان و همکاران در مطالعه خود در سال 2009، میزان آلوایمیونیزاسیون در شمال شرق ایران را 87/2% گزارش کردند که بیشترین فراوانی آلوآنتی بادی مربوط به(88%) Anti-D و سپس Anti-C و Anti-E بوده است(17). در مطالعه‌ای که آذرکیوان و همکارانش در سال 2011 در 835 بیمار تالاسمی انجام دادند، Anti-K (34%) بیشترین آلوآنتیبادی و پس از آن (11%) Anti-D و (10%) Anti-E دارای بیشترین فراوانی بودند. هم چنین در این مطالعه درصد فراوانی سایر آلوآنتی‌بادی‌های مربوط به گروه خونی Rh ، 15% گزارش گردید(18). در مطالعه مروری که در سال 2016 توسط پورفتح‌اله و همکارانش انجام شد، میزان آلوایمیونیزاسیون در ایران 10% گزارش شد که در این مطالعه بیشترین آلوآنتی‌بادی‌ها مربوط به (37%) Anti-K، (29%) Anti-D و (20%) Anti-E بودند (19). همان طور که مشاهده میشود، فراوانی آلوآنتی‌بادی‌ها در این مطالعه به مطالعه‌های انجام شده در داخل کشور شباهت زیادی دارد.
در مطالعه حاضر با مقایسه نتایج سرولوژی و ژنوتیپ، بیماران در 45 آلل(5/22%) مربوط به گروه خونی Rh دارای تناقض بوده‌اند. این تناقضات 5/7% در آلل C، 6% در آلل c، 5/9% در آلل E و 6/1% در آلل e بوده است. هم چنین در این مطالعه 31 (5/15%) بیمار نیز در آزمایش سرولوژی دارای واکنش میکسد فیلد بوده‌اند که درصد قابل توجهی می‌باشد. در چندین مطالعه مشابه، بین نتایج سرولوژی و ژنوتیپ، اختلافاتی دیده شد که در بیشتر این مطالعه‌ها بیشترین اختلافات مربوط به سیستم Rh بود.
در سال 2009 مطالعه‌ای توسط شایگان و همکارانش روی 44 بیمار با تزریق خون مداوم جهت تعیین آللهای گروههای خونی فرعی Rh ،Kell ،Kidd ، Duffy به دو روش هماگلوتیناسیون و تعیین ژنوتیپ به روش RFLP PCR در ایران صورت گرفت. در این مطالعه در 26 نفر از بیماران، 53 مورد ناسازگاری در آللهای مختلف مشاهده شد که بیشترین ناسازگاری مربوط به گروه خونی Rh (19مورد) بود(20).
در سال 2010 در مطالعه‌ای که توسط گوئلسین و همکارانش در جنوب برزیل انجام شد، 10% بیماران دارای آلوآنتیبادی بودند و بین دو روش فنوتیپ و ژنوتیپ، 16 اختلاف مشخص شد. در این مطالعه بیشترین تناقض در گروه خونی Rhیافت گردید که ازبین 16 تناقض دیده شده در 38 بیمار، 8 تناقض در 5 آلل اصلی D،C ، c،E ،e این گروه خونی دیده شد(21%)(21).
آنجلابلسیتو و همکارانش در سال 2015، در مطالعه‌ای جهت بررسی و مقایسه این دو روش، در 46% عدم تطابق برای گروه RhCE(بیشترین تناقض) مشاهده کردند (22).
ژان و همکارانش در سال 2016، در بیماران با تزریق خون مکرر مطالعه‌ای را به انجام رسانیدند. تعیین فنوتیپ گروههای خونی Rh ، Kell ، Kidd ، Duffy و MNSs را به دوروش سرولوژی و ژنوتیپ انجام دادند. از بین 3 نفر تالاسمی، یک نفر دارای دو اختلاف در گروه RhCE بود که در روش سرولوژی به صورت C/c RH*CEوE/e RH*CE و در ژنوتیپ به صورت C/C RH*CE و RH*CE e/e مشخص گردید. در این مطالعه در افراد بدون تزریق خون قبلی، بین نتایج فنوتیپ و ژنوتیپ هیچ گونه تناقضی مشاهده نگردید. نتایج این مطالعه نیز حمایت کننده نتایج ما در راستای وجود اختلال در تعیین فنوتیپ افراد با تزریق خون مداوم می‌باشد(23).
سپس در سال 2017 مطابق مطالعه صورت گرفته توسط روسانا پاتزولا و همکارانش، در صورت تزریق خون مطابق با گروه خون مشخص شده به روش مولکولی، هیچ گونه افزایشی در تولید آلوآنتیبادی آن‌ها مشاهده نگردید. این مطالعه اهمیت تعیین دقیق گروههای خونی مهم و تزریق واحدهای کاملاً سازگار در افراد گیرنده‌ی خون را بیان می‌کند(9). در این مطالعه از 10 اهداکننده مستمر، به عنوان نمونه کنترل استفاده شد. فنوتیپ وژنوتیپ این نمونه‌ها به ترتیب با استفاده از روش استاندارد سرولوژی و روشهای مولکولی تعیین شد. نتایج این روش‌ها کاملاً با یکدیگر تطابق داشته و می‌توان گفت حساسیت و اختصاصیت روش مولکولی نسبت به روش استاندارد هماگلوتیناسیون 100% بوده است. اما در این مطالعه به دلیل این که بیماران تالاسمی مد نظر هستند و این بیماران به طور مکرر خون دریافت می‌کنند، در تعیین صحیح فنوتیپ این بیماران با مشکل روبرو هستیم. همان طور که گفته شد، در این مطالعه 45 مورد ناسازگاری بین فنوتیپ و ژنوتیپ در آللهای مختلف گروه خونی Rh دیده شد. بنابراین برای این بیماران نمی‌توان از روش سرولوژی به عنوان روش استاندارد استفاده کرد. اگر در بین روشهای مولکولی، روش تعییین توالی را به عنوان روش استاندارد در نظر بگیریم، خواهیم دید حساسیت و اختصاصیت سایر روشهای مولکولی، نسبت به این روش 100% بوده است. نتایج متفاوت بین روش سرولوژی و روشهای مولکولی در این مطالعه و سایر مطالعه‌های انجام شده در این راستا، نشان می‌دهد که اگر چه روش سرولوژی به عنوان روش استاندارد برای تعیین فنوتیپ گروههای خونی استفاده میشود اما محدودیت‌های این روش در بعضی مواقع به خصوص در بیماران با تزریق خون مکرر، سبب تولید و گسترش آلوآنتیبادی در این افراد میشود. در مطالعه حاضر برای تعیین ژنوتیپ گروه خونی Rh ، از روشهای مولکولی مختلفی استفاده گردید که همان طور که ذکر شد،
نتایج این روش‌ها یکدیگر را تایید کردند. در نتیجه نتایج این مطالعه و سایر مطالعه‌ها نشان‌دهنده اختصاصیت بالای روشهای مولکولی و امکان استفاده از آن‌ها به عنوان روش مکمل در تعیین گروههای خونی می‌باشد.
نتیجه‌گیری
با توجه به نتایج این مطالعه و سایر مطالعه‌های انجام شده، آنتی‌بادی‌های مربوط به گروه خونی Rh در بیماران تالاسمی با فراوانی بالایی تولید می‌شوند، تعیین دقیق آنتی‌ژن‌های این سیستم خونی قبل و حتی بعد از تزریق خون می‌تواند باعث کاهش قابل توجه آلوایمیونیزاسیون در تزریق‌های بعدی خون در این بیماران شود. بنا بر نتایج این مطالعه، روشهای مولکولی با حل مشکلات روش سرولوژی به عنوان یک روش مکمل، می‌توانند به تعیین دقیق این آنتی‌ژن‌ها کمک کنند.
تشکر و قدردانی
از زحمـات همکـاران بخـــش ایمونوهمـاتولوژی سـتاد مرکـزی سـازمان انتقـال خـون و پرسنل درمانگاه تالاسمی بزرگسالان ظفر که در این پژوهش مـا را یاری کردند، صمیمانه سپاسـگزاریم. این مقاله ماحصل طرح مصوب در مؤسسه ملی توسعه تحقیقات علوم پزشکی ایران با کد طرح 942644 مصوب سال 1395بوده و هزینه‌های آن از محل این سازمان تامین گردیده است.
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
