جلد ۱۶، شماره ۲ - ( تابستان ۱۳۹۸ )
جلد ۱۶ شماره ۲ صفحات ۱۱۵-۱۰۳ |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mohammadipour M, Amirizadeh N, Mortazavi P, Jahandideh A. Evaluation of human platelet gel effect on production process and expression level of VEGF in experimental skin wounds in rat. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2019; 16 (2) :103-115
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1251-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-1251-fa.html
محمدی پور ماهان، امیری زاده ناصر، مرتضوی پژمان، جهاندیده علیرضا. اثر ژل پلاکتی بر روند ترمیم و میزان بیان فاکتور VEGF در زخمهای تجربی پوست در موش صحرایی. فصلنامه پژوهشی خون. ۱۳۹۸; ۱۶ (۲) :۱۰۳-۱۱۵
دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون
متن کامل [PDF 1148 kb]
(۱۵۰۰ دریافت)
| چکیده (HTML) (3910 مشاهده)
مقدمه
زخمهای پوستی و کاهش زمان بهبود آنها یکی از جنبههای مهم پزشکی محسوب میشود. به هرگونه گسستگی در انسجام لایههای پوست یا بافتهای زیرپوستی زخم گفته میشود که میتواند در اثر عوامل فیزیکی یا شیمیایی ایجاد شود. با وجود پیشرفتهای چشمگیر در درمان زخم، همچنان تلاش در جهت توسعه روشهای موثر در درمان زخم طی کوتاهترین زمان و با ایجاد کمترین عارضه ادامه دارد (1). بهبود و ترمیم زخم در انسان و حیوانات تکاملیافته، با یک مکانیسم کاملاً پیچیده صورت میپذیرد. سرعت بهبود زخم، به عوامل بسیاری بستگی دارد از جمله: اندازه زخم، ذخیره خونی در محل زخم، وجود اجسام خارجی و میکروارگانیسمها، سن، وضعیت سلامت و تغذیه بیمار (2).
یکی از پیشرفتها در زمینه مدیریت و مراقبت برای تسریع بهبود زخمهای پوستی، استفاده از فرآوردههای خونی و ترکیبات مشتق از آنها مانند فاکتور رشد پلاکتی ((PDGF، درمان با سلولهای بنیادی حاصل از مغز استخوان و یا خون بندناف میباشد(3).
امروزه استفاده از پلاکتها به صورت ژل پلاکتی، در ترمیم هر چه سریعتر زخمها، رو به افزایش است. مزایای استفاده از ژل پلاکتی، افزایش فاکتورهای رشد مورد نیاز برای ترمیم در موضع زخم، ایجاد بستر مناسب برای ترمیم زخم، تقویت سلولهای پیش‌ساز و بنیادی شرکت‌کننده در ترمیم زخم، بهبود روند جلوگیری از از دست دادن خون و آب بدن، خواص ضد التهابی، خواص ضد میکروبی، روش تهیه و استفاده نسبتاً ساده میباشد(4). پلاکتها علاوه بر نقش ضد میکروبی که دارند، باعث فعال شدن سلولهای ایمنی دیگر میشوند که همین امر باعث تقویت مکانیسم دفاعی و تسریع روند بهبودی می‌گردد(5).
استفاده از فاکتورهای رشد موجود در پلاکت(PDGF: AA, AB, BB)، (TFG:b1,b2)، (bFGF)، (EGF)، (VEGF) در ترمیم هر چه سریعتر زخمها خصوصا زخمهای مزمن ایجاد شده در افراد دیابتیک که نیاز به ترمیم سریعتر برای جلوگیـری از ایجاد عفونـت دارنـد و هم‌چنیــن برشهای
حاصـل از جراحیهـا و یـا شکستگیهـای استخوانــی، به
صورت ژل پلاکتی که از پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) تهیه میشود رو به افزایش است. ژل پلاکتی را میتوان از طریق مخلوط کردن PRP با ترومبین و کلسیم تهیه نمود که در آن غلظت پلاکتها 3 تا 5 برابر غلظت پلاکتهای اولیه در خون است(8-6). ترومبین به کار رفته در تهیه ژل پلاکتی به عنوان فعال‌کننده، سبب تحریک تجمع پلاکتها و آزادسازی فاکتورهای رشد ذخیره شده در پلاکتها میشود. کلسیم باعث خنثی شدن اثر ماده ضد انعقاد خون و تسهیل در آزادسازی گرانولهای پلاکتی میشود. بعد از افزودن ترومبین و کلسیم، ژل چسبنده و ضخیمی شکل میگیرد(4). در سال 2014 تامبلا و همکارانش استفاده از ژل پلاکتی اتولوگ را در درمان زخم بستر در سگ مورد مطالعه قرار دادند. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی اتولوگ میتواند اثر مثبتی در بهبود زخمهای مقاوم به درمان و مزمن داشته باشد(9).
ادیلبلوت و همکارانش در سال 2015 میزان اثر بخشی ژل پلاکتی را بر میکروارگانیسمهای فرصت طلب (شامل استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و آسینوباکتر بومانی) در زخمهای پوستی بررسی کردند. نتایج نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی در درمان زخمهای پوستی علاوه بر این که باعث تسریع در روند بهبودی زخم میشود، میتواند اثر ضد میکروبی موثری در زخمهای عفونی داشته باشد(10).
در سال 2009 امانی و همکارانش تاثیر ژل پلاکتی را بر تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیمی در محیط کشت(In vitro) مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج به دست آمده از مطالعه آنها نشان داد که عوامل رشد پلاکتی را میتوان جایگزین سرم در محیط کشت سه بعدی نمود. زیرا این عوامل، محیط مناسبی را برای رشد سلول های مزانشیمی فراهم می‌سازند(11).
هدف کلی ما از این مطالعه، بررسی تاثیر ژل پلاکتی بر شاخصهای التیامی زخم پوستی القا شده در موش صحرایی و اهداف اختصاصی بررسی اثر ژل پلاکتی دارای فاکتورهای رشد بر میزان بیان فاکتور VEGF در ترمیم زخم و افزایش سرعت ترمیم زخم پوستی در بیماران در مدل حیوانی بود.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود و این مطالعه مطابق با مصوبه اخلاق در پژوهش به شناسه IR.IAU.SRB.REC.1397.071 در تاریخ 9/8/1397 در دانشگاه آزاد اسلامی- واحد علوم و تحقیقات تهران، مورد تصویب کمیته اخلاق قرار گرفت.
تهیه ترومبین از پلاسمای انسان:
10 میلی‌لیتر نمونه خون سیتراته از یک فرد اهداکننده خون تهیه شد. به منظور جداسازی پلاسما، نمونه با دور g ×3000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ(اپندورف، آلمان) شد. محلول رویی(پلاسمای شفاف) در لوله فالکون mL 15 (Nunc، دانمارک) جداگانه جمع‌آوری شد. در نهایت، به ازای هر 2 میلی‌لیتر پلاسما، 5/1 میلی‌لیتر کلسیم گلوکونات 10% (مینو، ایران) اضافه شد و منتظر ماندیم تا در بن ماری (اپتیما، ژاپن) در دمای 37 درجه سانتیگراد لخته ایجاد شود و سپس با سانتریفیوژ کردن لخته از محلول روئی که حاوی ترومبین بود، جدا شد.
طرز تهیه ژل پلاکتی:
کیسه پلاکتی از خون کامل اهداکنندگان با روش استاندارد در بانک خون تهیه گردید. کیسه پلاکتی تهیه شده در دستگاه آژیتاتور پلاکت خون(اپتیما ، ژاپن) نگهداری شد. مطابق با روشهای ذکر شده در بالا، PRP و ترومبین به دست آمد. به منظور تهیه ژل پلاکتی، محتویات کیسه پلاکتی به 4 لوله فالکون mL 15 (Nunc، دانمارک) منتقل شد. تعداد پلاکتهای موجود در این PRP توسط دستگاه شمارش سلولهای خونی (سیس‌مکس) شمارش شد. لوله‌های فالکون حاوی PRPبا دور g3000× به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ(اپندورف، آلمان) گردید. به منظور تغلیظ بیشتر پلاکتها، نیمی از محلول روئی خالی شد. دوباره تعداد پلاکتها توسط دستگاه شمارش سلولهای خونی (سیس‌مکس) شمارش شد که در نهایت با سمپلر (اپندورف، آلمان)، 2 میلی‌لیتر PRP تغلیظ شده با 5/0 میلی‌لیتر ترومبین در درون یک پتری دیش ریخته شد و به آرامی مخلوط گردید تا لخته ایجاد شد و ژل پلاکتی تشکیل گردید. تمام مراحل تهیه ژل پلاکتی در زیر هود و در شرایط استریل انجام شد.
آمادهسازی موشها و ایجاد زخم تجربی و درمان:
24 سر موش صحرایی(رت) نر بالغ نژاد ویستار با محدوده سنی 14- 15 هفته و محدوده وزنی 10 ± 200 گرم از آزمایشگاه حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) تهیه شد. این حیوانات به محل در نظر گرفته شده جهت انجام آزمایش منتقل و در قفسهای استاندارد نگهداری موش تحت شرایط نوردهی کنترل شده 12 ساعت روشنایی و12 ساعت تاریکی و دمای ثابت 2 ± 22 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
حیوانات قبل از انجام مطالعه‌ها به مدت یک هفته دوره تطابق را گذراندند تا تاثیر منفی استرس ناشی از محیط ناآشنا بر روی نتایج مطالعه مورد نظر به حداقل برسد. موشها با پلت تغذیه شدند و به آب و غذا (پلت) دسترسی آزاد داشتند. القای بیهوشی با ترکیب زایلازین هیدروکلراید(2%) mg/kg/IP5 وکتامین هیدروکلراید(10%)
mg/kg/IP50 بهصورت داخل صفاقی انجام گردید. موشها به صورت شکمی بر روی میز جراحی قرار داده شدند، سپس سطح پشتی موشها ازناحیه کتف تا ایلئوم آمادهسازی و اسکراب شد و یک زخم مربع شکل با ابعاد 5/1 در 5/1 سانتیمتری در محل بین دو کتف با پانچ پوستی ایجاد شد به طوری کـه لایــههای اپیدرم و درم به
طور کامل برداشته شد.
ابتدا موشها به طور تصادفی به دوگروه 12تایی(شاهد و درمان شده با ژل پلاکتی) تقسیم شده، سپس هر کدام از اینها خود به 4 زیر گروه 3 تایی(گروههای نمونهبرداری در روزهای مختلف( تقسیم شدند. در گروه درمان شده ژل پلاکتی به صورت موضعی در محل زخم مورد استفاده قرار گرفـت و در گـروه شاهد هیچ درمانی انجام نشد(شکل 1).
درمان زخمهای پوستی در گروه درمان شده با ژل پلاکتی به صورت زیر انجام شد:
نمونههای درمانی که روز 3 نمونهبرداری شدند یک بار ژل پلاکتی دریافت کردند (فقط در روز 0)
نمونههای درمانی که روز 5 نمونهبرداری شدند دو
بار ژل پلاکتی دریافت کردند (روزهای 0، 3)
نمونههای درمانی که در روز 7 نمونهبرداری شدند
سه بار ژل پلاکتی دریافت کردند(روزهای 0، 3، 5)
نمونههای درمانی که در روز 14 نمونهبرداری شدند
چهار بـار ژل پلاکتی دریافت کردنـد(روزهای 0، 3، 5، 12)
شکل 1: زخم پوستی 5/1 در 5/1 سانتیمتری. زخم پوستی در محل بین دو کتف رت با پانچ پوستی ایجاد شد.
روش نمونهبرداری از پوست:
در پایان روزهای 3، 5، 7 و 14 در هر گروه شاهد و درمان از 3 موش صحرایی به منظور بررسیهای هیستوپاتولوژی و ایمنوهیستوشیمی توسط اسکالپل و پنس، نمونه‌ای جهت انجام آزمایش‌های مربوطه اخذ شد. بعد از نمونهبرداری، نمونه پوست به منظور جلوگیری از چروکیده شدن بافت بر روی تکه‌ای مقوا چسبانده شد و سپس درون یک لوله فالکون mL 50 که حاوی 45 میلی‌لیتر فرمالین 10% بود قرار داده شد.
در پایان روزهای نمونهبرداری پوست موشهای صحرایی بخیه گردید و نمونههای پوست به آزمایشگاه پاتولوژی منتقل شد و پس از آمادهسازی به روش معمول، اسلاید هیستوپاتولوژی تهیه گردید.
نمونههای زخم پوستی با رنگآمیزی H&E و ماسون تریکروم برای ارزیابی هیستوپاتولوژی و فلورسنت ایمنوهیستوشیمی به روش غیر مستقیم جهت ارزیابی فاکتور VEGF طبق دستورالعمل استاندارد انجام شد(13، 12).
روش کار ایمنوهیستوشیمی:
روش تهیه پارافرمالدهید 4% :
مقدار 20 گرم پارا فرمالدهید(آلمان، مرک) به500 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد. رویHot Plate قرار گرفت تا دمای آن به 60 درجه سانتیگراد برسد. بعد از آن به محلول مورد نظر، سود(NaoH) اضافه گردید تا pH محلول به 2/7 تا 4/7 برسد. در مرحله آخر یک قرص PBS (Phosphate Buffer Salin) درون محلول قرار داده شد.
روش تهیه اسید کلریدریک 2 طبیعی:
مقدار 2 میلی‌لیتر اسید کلریدریک 5/37% به 11 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه گردید.
روش تهیه سرم بز 10 درصد و تریتون (Triton) 3/0%:
مقدار 100 لاندا سرم بز به 900 لاندا PBS اضافه گردید و سرم بز 10% به دست آمد.
مقدار 3 لاندا تریتون x100 به 997 لاندا PBS اضافه شد و تریتون 3/0% به دست آمد.
روش انجام کار:
نمونه با PBS در 4 مرحله و به فاصله 5 دقیقه شسته شد. به منظور بازیابی آنتی‌ژنی بر روی نمونهها، اسیدکلریدریک 2 طبیعی به مدت 30 دقیقه ریخته شد. بافر بورات به منظور خنثی‌سازی اسید به مدت 5 دقیقه اضافه شد و سلولها با PBS شسته شدند. تریتون 3/0% به مدت 30 دقیقه به منظور نفوذ پذیر کردن غشاء سلولها استفاده گردید. با PBS شستشو داده شدند. سرم بز 10% برای مدت 30 دقیقه به منظور بلوک کردن واکنش آنتیبادی ثانویه به صورت رنگ اضافی زمینه اضافه شد. آنتیبادی اولیه رقیق شده(1 به 100) با PBS به نمونه اضافه گردید و بعد از ایجاد یک محیط مرطوب برای جلوگیری از خشک شدن بافت، به مدت یک شب درون یخچال با دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد قرار داده شد. روز بعد ظرف حاوی بافت از یخچال خارج شد و سپس 4 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه با PBS شستشو داده شد. به نمونه آنتیبادی ثانویه با رقت 1 به 150 اضافه گردید و سپس در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و30 دقیقه در تاریکی انکوبه شد. بعد از آن نمونه از انکوباتور به اتاق تاریک منتقل گردید و بعد از 4 بار شستشو، به آنها DAPI اضافه گردید، بلافاصله برداشته و روی نمونه PBS ریخته شد. در مرحله آخر نمونه توسط میکروسکوپ فلوروسنت مدل Olympus و با لنز 400 برای تایید مارکرها مشاهده شد. سپس شاخصهای التیامی مانند میزان تشکیل بافت پوششی، میزان تشکیل کلاژن، میزان نفوذ سلولهای التهابی و میزان بیان فاکتور VEGF مورد بررسی قرار گرفت.
میزان بیان VEGF به این صورت ارزیابی گردید:
1: 0% (بدون واکنش ایمنی) = 0 یا منفی
2: 1% تا 10% = 1+ یا مثبت ضعیف
3: 10% تا 50% = 2+ یا مثبت متوسط
4: بیشتر از 50% = 3+ یا مثبت شدید
تحلیل آماری:
برای تحلیل دادههای هیستوپاتولوژی از بسته نرم‌افزاری
SPSS ورژن 22 استفاده شد و توسط آزمون کای‌اسکوئر (Chisquare) مورد بررسی قرار گرفت. مقادیر 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شدند. برای مقایسه میانگین از تحلیل واریانس(ANOVA) استفاده شد.
یافته‌ها
شمارش تعداد پلاکتها:
تعداد پلاکتهای موجود در PRP در کیسههای پلاکتی، 103×838 در هر میکرولیتر بود که به منظور تغلیظ بیشتر بعد از سانتریفیوژ و خالی کردن نیمی از محلول رویی، تعداد پلاکتها 103×1548 در هر میکرولیتر شده بود.
ارزیابی شاخصهای ترمیمی بافت پوست:
میزان تشکیل بافت پوششی:
میزان تشکیل بافت پوششی در تمامی نمونهها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 1).
شکل 2 : هیستوپاتولوژی مقطع زخم در گروه درمان (سمت راست) و شاهد (سمت چپ) در روزهای سوم، پنجم و هفتم(به ترتیب الف، ب و ج). در گروه درمان مهاجرت سلولهای اپیدرم (پیکان) در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلولهای التهابی در درم(نوک پیکان) دیده میشود. در گروه شاهد ضخیم شدن اپیدرم (پیکان) بدون هیچ گونه مهاجرتی در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلولهای التهابی در درم(نوک پیکان) دیده میشود(الف)، در شکل ب، مهاجرت اندک سلولهای اپیدرم(پیکان) در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلولهای التهابی در دُم(نوک پیکان) دیده میشود. در شکل ج، مهاجرت زیاد سلولهای اپیدرم(پیکان) در کنار لبه زخم و بافت جوانه گوشتی(نوک پیکان) در گروه درمان نسبت به شاهد به وضوح دیده میشود.
شکل 3 : هیستوپاتولوژی مقطع زخم در گروه درمان (سمت راست) و شاهد (سمت چپ) در روز پنجم(الف) عروق خونی تازه تشکیل(پیکان) و رشتههای کلاژن(نوک پیکان) در بافت جوانه گوشتی دیده میشود. در روز هفتم(ب) رشتههای کلاژن(نوک پیکان) با ضخامت قابل توجه دیده میشود. در گروه شاهد اپیدرم در حال ترمیم نیز(نوک پیکان) دیده میشود. در روز چهاردهم(ج) رشتههای کلاژن با ضخامت مناسب و اپیدرم نوزایش یافته(نوک پیکان) دیده میشود.
جدول 1: نتایج ارزیابی ایمونوهیستوشیمی بافت پوست
شکل 4 : بیان متوسط VEGF در اطراف یک رگ خونی در گروه شاهد(A, C, E) در روزهای پنجم، هفتم و چهاردهم بعد از ایجاد زخم و بیان شدید VEGF در اطراف یک رگ خونی در گروه درمان(B, D, F) در روزهای پنجم، هفتم و چهاردهم بعد از ایجاد زخم
(Indirect immunofluorescence of VEGF)
نتایج ایمنوهیستوشیمی بافت پوست:
در این مطالعه، میزان بیان فاکتور VEGFدر دو گروه درمان و شاهد در روزهای 3، 5، 7 و 14 بعد از ایجاد زخم توسط آنتیبادی فلورسنت اندازه‌گیری شد(جدول 1). همان طور که در جدول مربوطه مشخص است، تفاوت معنادار بین گروههای درمان و شاهد در روزهای 5، 7، 14 دیده میشود به طوری که میزان بیان VEGF در گروههای درمان شدید در حالی که میزان بیان این فاکتور رشد در گروههای شاهد متوسط است(شکل 4).
بحث
روند بهبود زخمهای پوستی شامل یکسری وقایع سلولی و بیوشیمیایی بنام هموستاز و التهاب، تکثیر، بلوغ و
بازسازی میباشد(14). امروزه روشهای درمانی مختلفی برای بهبود زخم وجود دارد اما روش درمانی که بتواند به تسریع این روند بهبودی کمک کند، بسیار ارزشمند است. تجمع پلاکتها در محل زخم و آزادسازی فاکتورهای رشد مختلف از آنها میتواند محرکی برای تسریع مراحل ترمیم زخم باشند(15).
در این مطالعه، هدف از تهیه ژل پلاکتی این بود که بتوان پلاکتها را با آگونیستهای قوی مانند ترومبین در حضور کلسیم فعال کرد تا بدین طریق محتویات گرانولهای پلاکتی به بیرون تراوش کند(11). در ارزیابیهای هیستوپاتولوژی شاخصهای ترمیمی مانند میزان تشکیل بافت پوششی، میزان تشکیل کلاژن و میزان نفوذ سلولهای التهابی بررسی شد که نتایج نشان داد استفاده ار ژل پلاکتی به صورت موضعی باعث تسریع در روند ترمیم زخمهای پوستی میشود. هم چنین در ارزیابی ایمنوهیستوشیمی میزان بیان فاکتور VEGF در دو گروه شاهد و درمان گزارش شد. میزان رگزایی که در ترمیم زخم نقش مهمی ایفا میکند به صورت اختصاصی با آنتیبادی فلورسنت ارزیابی شد. براساس نتایج به دست آمده از روز 5 بعد از ایجاد زخم، میزان بیان VEGF در گروه درمان شدید و در گروه شاهد متوسط مشاهده شد.
در سال 2015 پارازی و همکاران سطوح بالایی از هورمون ها و مولکولهایی با توانایی ترمیم بافت در ژل پلاکتی تهیه شده از خون بندناف کشف نمودند. ژل پلاکتی خون بندناف در مقایسه با خون محیطی غلظتهای بالاتری از چندین فاکتور رگ‌زا را دارد(16). در مطالعه حاضر نیز با ارزیابیهای هیستوپاتولوژی بافت مشاهده شد که استفاده از ژل پلاکتی به صورت موضعی باعث تسریع روند ترمیم زخم در گروه درمان نسبت به گروه شاهد میشود. در ارزیابی ایمنوهیستوشیمی افزایش میزان رگزایی در گروه درمان شده با ژل پلاکتی نسبت به گروه شاهد مشاهده شد.
دمسی و همکارانش در سال 2016 اثر فاکتورهای رشد را بر ترمیم زخمهای پوستی در موش صحرایی مورد مطالعه قرار دادند. در مطالعه آنها، گروهی با تزریق فاکتور رشد EGF و گروهی دیگر با تزریق ترکیبی از چندین فاکتور رشد(VEGF، FGF و IGF) درمان شدند. نتایج حاصل از مطالعه آنها بیانگر این بود که تزریق چندین فاکتور رشد در مرز زخمهای پوستی منجر به بهبودی سریعتر و کاهش بافت گرانوله میشود و به طور کلی با ارزیابیهای هیستوپاتولوژی در گروه درمان، افزایش میزان رگزایی گزارش شده بود(17). در سال 2017 تاتار و همکارانش اثر PRP را بر ترمیم زخمهای پوستی در موش صحرایی مورد بررسی قرار دادند. موشها به گروههای مختلفی تقسیم شدند. گروهی PRP را به صورت موضعی در محل زخم و گروهی دیگر PRPرا به صورت تزریقی داخل زخم دریافت کردند. در نتایج به دست آمده از مطالعه آنها، در روزهـای 7 و 14 بعـد از ایجـاد زخم در گروهی
که PRPرا به صورت موضعی دریافت کردند میزان
رگزایی به طور معناداری بیشتر از گروههای دیگر بود (14). در مطالعه حاضر با ارزیابی ایمنوهیستوشیمی میزان بیان VEGFدر روزهای مختلف بعد از ایجاد زخم بررسی گردید و یافتههای ایمنوهیستوشیمی بیانگر آن بود که میزان بیان فاکتور VEGF در روزهای 5، 7 و 14 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان شده با استفاده موضعی از ژل پلاکتی نسبت به گروه شاهد بیشتر بوده است.
دیوراکس و همکارانش در سال 2018 اثر PRP را بر فیبروبلاستهای پوستی مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد استفاده از PRP باعث افزایش فیبروبلاستهای پوستی میشود که این فیبروبلاستها با مهاجرت و تکثیر در بافت گرانوله اطراف زخم ذخیره شده و باعث کاهش اسکار پوستی میشوند(18). هم چنین در سال 2018 شو ایبی و همکارانش اثر PRP را در تکثیر و مهاجرت فیبروبلاستهای پوستی انسان مورد مطالعه قرار دادند. هدف از این مطالعه، بررسی اثرات PRP بر روی بازسازی ماتریکس خارج سلولی بود که نیاز به فعال‌سازی فیبروبلاستهای پوستی دارد. PRP باعث تحریک تکثیر و مهاجرت فیبروبلاستهای پوستی و هم چنین افزایش بیان پروکلاژن І آلفا 1، الاستین، MMP-1، MMP-2 در فیبروبلاستهای پوستی میشود در نتیجه میتواند به تسریع ترمیم کمک کند(19). در مطالعه حاضر نیز در ارزیابی میکروسکوپی روز 5 بعد از ایجاد زخم، میزان تشکیل کلاژن در گروه درمان نسبت به گروه شاهد بیشتر مشاهده شد که نشاندهنده تاثیر ژل پلاکتی بر تسریع روند ترمیم زخم است.
عبداله و همکارانش در سال 2018 ، اثرات استفاده موضعی ازPRP (همولوگ) در خرگوش را بررسی کردند. در ارزیابیهای میکروسکوپی روز 3 بعد از ایجاد زخم در گروهی که PRP دریافت کردند، تشکیل بافت پوششی در بستر زخم به همراه افزایش میزان رگزایی به طور مشخص دیده شد(20). در نتایج میکروسکوپی ما در این مطالعه در روز 3 بعد از ایجاد زخم، تشکیل بافت پوششی در گروه شاهد مشاهده نشد در حالی که در گروه درمان شده با ژل پلاکتی، تشکیل بافت پوششی دیده شد اما برخلاف نتایج میکروسکوپی روز 3 بعد از ایجاد زخم در مطالعه آنها، میزان رگزایی در گروه شاهد و درمان در مطالعه حاضر مشابه بوده است(نتایج ایمنوهیستوشیمی). نتایج روز 7 در مطالعه آنها نشان داد در گروه درمان شده با PRP ، تشکیل بافت پوششی تکمیل و رشتههای کلاژن ضخیم نسبت به گروه شاهد دیده شد(20). اما در مطالعه حاضر تشکیل بافت پوششی و میزان کلاژن در دو گروه درمان و شاهد در روز 7 اختلاف آماری معناداری نداشت و در هر دو گروه درمان وشاهد بافت پوششی در حال ترمیم و رشتههای کلاژن با ضخامت قابل توجه دیده شد.
در سال 2018 چونچارونی و همکارانش اثر ژل پلاکتی را بر ترمیم زخمهای پوستی در موشهای صحرایی مورد ارزیابی قرار دادند که همانند مطالعه ما از پلاکت انسانی برای ترمیم زخمهای پوستی در موش صحرایی استفاده شد با این تفاوت که آنها از PRP تاریخ گذشته استفاده کردند و آن را در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری کرده و قبل از استفاده، PRP را در داخل یک ژلی که با محلول سدیم کربوکسی متیل سلولز، گلیسیرین، متیل پارابن و پروپیل پارابن تهیه شده قرار دادند(15). اما در مطالعه حاضر طرز تهیه ژل پلاکتی متفاوت بود زیرا ما ژل پلاکتی را با ترکیب PRP تازه و تغلیظ شده به همراه ترومبین تهیه کردیم. در مطالعه آنها ارزیابی میکروسکوپی در روزهای 3، 7 و 12 بعد از ایجاد زخم نشان داد که در روزهای 3 و 7 بعد از ایجاد زخم، در گروه درمان افزایش مهاجرت سلولهای اپیتلیال و تشکیل بافت پوششی در محل زخم به خوبی دیده شد (15). در مطالعه حاضر نیز در مراحل ابتدایی روند ترمیم زخم، تشکیل بافت پوششی و افزایش نفوذ سلولهای التهابی تک هستهای قابل مشاهده بود که این امر نشاندهنده اثر ترمیمی ژل پلاکتی تهیه شده از
پلاکت تازه بر روند بهبود زخمهای پوستی میباشد. به طور کلی پلاکتهای تاریخ گذشته و کهنه با کیفیتی مشابه با پلاکتهای تازه میتوانند در تهیه ژل پلاکتی مورد استفاده قرار گیرند زیرا فاکتورهای رشد موجود در پلاکت‌هاست که باعث تسریع روند ترمیم زخمهای پوستی میشود (4).
نتیجه‌گیری
در این مطالعه ارزیابیهای هیستوپاتولوژی و ایمنوهیستوشیمی انجام شده در روزهای مختلف بعد از ایجاد زخم نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی حاوی فاکتورهای رشد در روند ترمیم زخم بهویژه در مراحل ابتدایی ترمیم مؤثر است به طوری که با افزایش میزان رگزایی، تشکیل بافت پوششی و تشکیل کلاژن و همچنین افزایش نفوذ سلولهای التهابی(تک هستهای) به علت تولید انواع فاکتورهای رشد، سیتوکینها، کموکینها، مدیاتورهای پیش التهابی و اعمال اثرات ضد میکروبی در فرآیند التیام، باعث تسریع روند بهبود زخمهای پوستی میشود. این مطالعه میتواند در تعداد بیشتری از حیوانات آزمایشگاهی و با اندازه‌گیری شاخصهای پاتولوژی بیشتر تکمیل شود. بدیهی است کاربرد این ژل پلاکتی در انسان نیازمند انجام بررسیهای بیشتر از نظر میزان کارایی، ایمنی و اثر بخشی میباشد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از همکاری اساتید و کارکنان آزمایشگاه مرکز
تحقیقات سازمان انتقال خون ایران و اعضای محترم گروه
پاتولوژی و جراحی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران سپاسگزاری می‌نماییم.
متن کامل: (۳۷۲۴ مشاهده)
اثر ژل پلاکتی بر روند ترمیم و میزان بیان فاکتور VEGF در زخمهای
تجربی پوست در موش صحرایی
ماهان محمدی‌پور1، ناصر امیری‌زاده2، پژمان مرتضوی3، علیرضا جهاندیده4
چکیده
سابقه و هدف
ژل پلاکتی تهیه شده از پلاسمای غنی از پلاکت با دارا بودن فاکتورهای رشد، باعث تسریع بازسازی لایههای پوست، تحریک رگزایی و افزایش سنتز کلاژن در روند ترمیم زخمها میشود. در این مطالعه، تاثیر ژل پلاکت انسانی بر میزان بیان فاکتور رشد عروقی در زخمهای تجربی پوست در موش صحرایی بررسی شد.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، ژل پلاکتی با افزودن ترومبین به پلاسمای غنی از پلاکت تهیه شد. در 24 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار، یک زخم 5/1 در 5/1 سانتیمتری در قسمت پشتی بدن بین دو کتف ایجاد شد. موشها به طور تصادفی به دوگروه 12تایی شاهد و درمان(استفاده موضعی از ژل پلاکتی در محل زخم) تقسیم شدند. درمان از ژل پلاکتی جهت پانسمان زخم استفاده گردید. نمونههای زخم پوستی با رنگآمیزی H&E و ماسون تریکروم برای هیستوپاتولوژی و فلورسنت ایمنوهیستوشیمی جهت ارزیابی فاکتور رشد عروقی بررسی شدند.
یافته‌ها
میزان تشکیل بافت پوششی در روز پنجم در گروه درمان شده با ژل پلاکتی 3/0 ± 2 و در گروه شاهد 1/0 ± 1 بود. نتایج هیستوپاتولوژی نشاندهنده افزایش میزان تشکیل کلاژن و افزایش نفوذ سلولهای التهابی در گروه درمان نسبت به گروه شاهد به ویژه در مراحل ابتدایی روند ترمیم زخم بود. هم چنین نتایج ایمنوهیستوشیمی نشان داد که میزان بیان فاکتور رشد عروقی در گروه درمان بیشتر از گروه شاهد بوده است.
نتیجه گیری
استفاده موضعی از ژل پلاکتی بر روی زخمهای پوستی، اثرات مثبتی بر روند بهبود به ویژه در مراحل ابتدایی ترمیم دارد.
کلمات کلیدی: پلاسمای غنی از پلاکت، موش صحرایی(رت)، VEGF
تاریخ دریافت: 5/12/97
تاریخ پذیرش: 9/2 /98
1- دکترای عمومی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- متخصص آسیب‌شناسی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
4- متخصص جراحی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
تجربی پوست در موش صحرایی
ماهان محمدی‌پور1، ناصر امیری‌زاده2، پژمان مرتضوی3، علیرضا جهاندیده4
چکیده
سابقه و هدف
ژل پلاکتی تهیه شده از پلاسمای غنی از پلاکت با دارا بودن فاکتورهای رشد، باعث تسریع بازسازی لایههای پوست، تحریک رگزایی و افزایش سنتز کلاژن در روند ترمیم زخمها میشود. در این مطالعه، تاثیر ژل پلاکت انسانی بر میزان بیان فاکتور رشد عروقی در زخمهای تجربی پوست در موش صحرایی بررسی شد.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، ژل پلاکتی با افزودن ترومبین به پلاسمای غنی از پلاکت تهیه شد. در 24 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار، یک زخم 5/1 در 5/1 سانتیمتری در قسمت پشتی بدن بین دو کتف ایجاد شد. موشها به طور تصادفی به دوگروه 12تایی شاهد و درمان(استفاده موضعی از ژل پلاکتی در محل زخم) تقسیم شدند. درمان از ژل پلاکتی جهت پانسمان زخم استفاده گردید. نمونههای زخم پوستی با رنگآمیزی H&E و ماسون تریکروم برای هیستوپاتولوژی و فلورسنت ایمنوهیستوشیمی جهت ارزیابی فاکتور رشد عروقی بررسی شدند.
یافته‌ها
میزان تشکیل بافت پوششی در روز پنجم در گروه درمان شده با ژل پلاکتی 3/0 ± 2 و در گروه شاهد 1/0 ± 1 بود. نتایج هیستوپاتولوژی نشاندهنده افزایش میزان تشکیل کلاژن و افزایش نفوذ سلولهای التهابی در گروه درمان نسبت به گروه شاهد به ویژه در مراحل ابتدایی روند ترمیم زخم بود. هم چنین نتایج ایمنوهیستوشیمی نشان داد که میزان بیان فاکتور رشد عروقی در گروه درمان بیشتر از گروه شاهد بوده است.
نتیجه گیری
استفاده موضعی از ژل پلاکتی بر روی زخمهای پوستی، اثرات مثبتی بر روند بهبود به ویژه در مراحل ابتدایی ترمیم دارد.
کلمات کلیدی: پلاسمای غنی از پلاکت، موش صحرایی(رت)، VEGF
تاریخ دریافت: 5/12/97
تاریخ پذیرش: 9/2 /98
1- دکترای عمومی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
3- متخصص آسیب‌شناسی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
4- متخصص جراحی دامپزشکی ـ واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی ـ تهران ـ ایران
مقدمه
زخمهای پوستی و کاهش زمان بهبود آنها یکی از جنبههای مهم پزشکی محسوب میشود. به هرگونه گسستگی در انسجام لایههای پوست یا بافتهای زیرپوستی زخم گفته میشود که میتواند در اثر عوامل فیزیکی یا شیمیایی ایجاد شود. با وجود پیشرفتهای چشمگیر در درمان زخم، همچنان تلاش در جهت توسعه روشهای موثر در درمان زخم طی کوتاهترین زمان و با ایجاد کمترین عارضه ادامه دارد (1). بهبود و ترمیم زخم در انسان و حیوانات تکاملیافته، با یک مکانیسم کاملاً پیچیده صورت میپذیرد. سرعت بهبود زخم، به عوامل بسیاری بستگی دارد از جمله: اندازه زخم، ذخیره خونی در محل زخم، وجود اجسام خارجی و میکروارگانیسمها، سن، وضعیت سلامت و تغذیه بیمار (2).
یکی از پیشرفتها در زمینه مدیریت و مراقبت برای تسریع بهبود زخمهای پوستی، استفاده از فرآوردههای خونی و ترکیبات مشتق از آنها مانند فاکتور رشد پلاکتی ((PDGF، درمان با سلولهای بنیادی حاصل از مغز استخوان و یا خون بندناف میباشد(3).
امروزه استفاده از پلاکتها به صورت ژل پلاکتی، در ترمیم هر چه سریعتر زخمها، رو به افزایش است. مزایای استفاده از ژل پلاکتی، افزایش فاکتورهای رشد مورد نیاز برای ترمیم در موضع زخم، ایجاد بستر مناسب برای ترمیم زخم، تقویت سلولهای پیش‌ساز و بنیادی شرکت‌کننده در ترمیم زخم، بهبود روند جلوگیری از از دست دادن خون و آب بدن، خواص ضد التهابی، خواص ضد میکروبی، روش تهیه و استفاده نسبتاً ساده میباشد(4). پلاکتها علاوه بر نقش ضد میکروبی که دارند، باعث فعال شدن سلولهای ایمنی دیگر میشوند که همین امر باعث تقویت مکانیسم دفاعی و تسریع روند بهبودی می‌گردد(5).
استفاده از فاکتورهای رشد موجود در پلاکت(PDGF: AA, AB, BB)، (TFG:b1,b2)، (bFGF)، (EGF)، (VEGF) در ترمیم هر چه سریعتر زخمها خصوصا زخمهای مزمن ایجاد شده در افراد دیابتیک که نیاز به ترمیم سریعتر برای جلوگیـری از ایجاد عفونـت دارنـد و هم‌چنیــن برشهای
حاصـل از جراحیهـا و یـا شکستگیهـای استخوانــی، به
صورت ژل پلاکتی که از پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) تهیه میشود رو به افزایش است. ژل پلاکتی را میتوان از طریق مخلوط کردن PRP با ترومبین و کلسیم تهیه نمود که در آن غلظت پلاکتها 3 تا 5 برابر غلظت پلاکتهای اولیه در خون است(8-6). ترومبین به کار رفته در تهیه ژل پلاکتی به عنوان فعال‌کننده، سبب تحریک تجمع پلاکتها و آزادسازی فاکتورهای رشد ذخیره شده در پلاکتها میشود. کلسیم باعث خنثی شدن اثر ماده ضد انعقاد خون و تسهیل در آزادسازی گرانولهای پلاکتی میشود. بعد از افزودن ترومبین و کلسیم، ژل چسبنده و ضخیمی شکل میگیرد(4). در سال 2014 تامبلا و همکارانش استفاده از ژل پلاکتی اتولوگ را در درمان زخم بستر در سگ مورد مطالعه قرار دادند. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی اتولوگ میتواند اثر مثبتی در بهبود زخمهای مقاوم به درمان و مزمن داشته باشد(9).
ادیلبلوت و همکارانش در سال 2015 میزان اثر بخشی ژل پلاکتی را بر میکروارگانیسمهای فرصت طلب (شامل استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و آسینوباکتر بومانی) در زخمهای پوستی بررسی کردند. نتایج نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی در درمان زخمهای پوستی علاوه بر این که باعث تسریع در روند بهبودی زخم میشود، میتواند اثر ضد میکروبی موثری در زخمهای عفونی داشته باشد(10).
در سال 2009 امانی و همکارانش تاثیر ژل پلاکتی را بر تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیمی در محیط کشت(In vitro) مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج به دست آمده از مطالعه آنها نشان داد که عوامل رشد پلاکتی را میتوان جایگزین سرم در محیط کشت سه بعدی نمود. زیرا این عوامل، محیط مناسبی را برای رشد سلول های مزانشیمی فراهم می‌سازند(11).
هدف کلی ما از این مطالعه، بررسی تاثیر ژل پلاکتی بر شاخصهای التیامی زخم پوستی القا شده در موش صحرایی و اهداف اختصاصی بررسی اثر ژل پلاکتی دارای فاکتورهای رشد بر میزان بیان فاکتور VEGF در ترمیم زخم و افزایش سرعت ترمیم زخم پوستی در بیماران در مدل حیوانی بود.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود و این مطالعه مطابق با مصوبه اخلاق در پژوهش به شناسه IR.IAU.SRB.REC.1397.071 در تاریخ 9/8/1397 در دانشگاه آزاد اسلامی- واحد علوم و تحقیقات تهران، مورد تصویب کمیته اخلاق قرار گرفت.
تهیه ترومبین از پلاسمای انسان:
10 میلی‌لیتر نمونه خون سیتراته از یک فرد اهداکننده خون تهیه شد. به منظور جداسازی پلاسما، نمونه با دور g ×3000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ(اپندورف، آلمان) شد. محلول رویی(پلاسمای شفاف) در لوله فالکون mL 15 (Nunc، دانمارک) جداگانه جمع‌آوری شد. در نهایت، به ازای هر 2 میلی‌لیتر پلاسما، 5/1 میلی‌لیتر کلسیم گلوکونات 10% (مینو، ایران) اضافه شد و منتظر ماندیم تا در بن ماری (اپتیما، ژاپن) در دمای 37 درجه سانتیگراد لخته ایجاد شود و سپس با سانتریفیوژ کردن لخته از محلول روئی که حاوی ترومبین بود، جدا شد.
طرز تهیه ژل پلاکتی:
کیسه پلاکتی از خون کامل اهداکنندگان با روش استاندارد در بانک خون تهیه گردید. کیسه پلاکتی تهیه شده در دستگاه آژیتاتور پلاکت خون(اپتیما ، ژاپن) نگهداری شد. مطابق با روشهای ذکر شده در بالا، PRP و ترومبین به دست آمد. به منظور تهیه ژل پلاکتی، محتویات کیسه پلاکتی به 4 لوله فالکون mL 15 (Nunc، دانمارک) منتقل شد. تعداد پلاکتهای موجود در این PRP توسط دستگاه شمارش سلولهای خونی (سیس‌مکس) شمارش شد. لوله‌های فالکون حاوی PRPبا دور g3000× به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ(اپندورف، آلمان) گردید. به منظور تغلیظ بیشتر پلاکتها، نیمی از محلول روئی خالی شد. دوباره تعداد پلاکتها توسط دستگاه شمارش سلولهای خونی (سیس‌مکس) شمارش شد که در نهایت با سمپلر (اپندورف، آلمان)، 2 میلی‌لیتر PRP تغلیظ شده با 5/0 میلی‌لیتر ترومبین در درون یک پتری دیش ریخته شد و به آرامی مخلوط گردید تا لخته ایجاد شد و ژل پلاکتی تشکیل گردید. تمام مراحل تهیه ژل پلاکتی در زیر هود و در شرایط استریل انجام شد.
آمادهسازی موشها و ایجاد زخم تجربی و درمان:
24 سر موش صحرایی(رت) نر بالغ نژاد ویستار با محدوده سنی 14- 15 هفته و محدوده وزنی 10 ± 200 گرم از آزمایشگاه حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) تهیه شد. این حیوانات به محل در نظر گرفته شده جهت انجام آزمایش منتقل و در قفسهای استاندارد نگهداری موش تحت شرایط نوردهی کنترل شده 12 ساعت روشنایی و12 ساعت تاریکی و دمای ثابت 2 ± 22 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
حیوانات قبل از انجام مطالعه‌ها به مدت یک هفته دوره تطابق را گذراندند تا تاثیر منفی استرس ناشی از محیط ناآشنا بر روی نتایج مطالعه مورد نظر به حداقل برسد. موشها با پلت تغذیه شدند و به آب و غذا (پلت) دسترسی آزاد داشتند. القای بیهوشی با ترکیب زایلازین هیدروکلراید(2%) mg/kg/IP5 وکتامین هیدروکلراید(10%)
mg/kg/IP50 بهصورت داخل صفاقی انجام گردید. موشها به صورت شکمی بر روی میز جراحی قرار داده شدند، سپس سطح پشتی موشها ازناحیه کتف تا ایلئوم آمادهسازی و اسکراب شد و یک زخم مربع شکل با ابعاد 5/1 در 5/1 سانتیمتری در محل بین دو کتف با پانچ پوستی ایجاد شد به طوری کـه لایــههای اپیدرم و درم به
طور کامل برداشته شد.
ابتدا موشها به طور تصادفی به دوگروه 12تایی(شاهد و درمان شده با ژل پلاکتی) تقسیم شده، سپس هر کدام از اینها خود به 4 زیر گروه 3 تایی(گروههای نمونهبرداری در روزهای مختلف( تقسیم شدند. در گروه درمان شده ژل پلاکتی به صورت موضعی در محل زخم مورد استفاده قرار گرفـت و در گـروه شاهد هیچ درمانی انجام نشد(شکل 1).
درمان زخمهای پوستی در گروه درمان شده با ژل پلاکتی به صورت زیر انجام شد:
نمونههای درمانی که روز 3 نمونهبرداری شدند یک بار ژل پلاکتی دریافت کردند (فقط در روز 0)
نمونههای درمانی که روز 5 نمونهبرداری شدند دو
بار ژل پلاکتی دریافت کردند (روزهای 0، 3)
نمونههای درمانی که در روز 7 نمونهبرداری شدند
سه بار ژل پلاکتی دریافت کردند(روزهای 0، 3، 5)
نمونههای درمانی که در روز 14 نمونهبرداری شدند
چهار بـار ژل پلاکتی دریافت کردنـد(روزهای 0، 3، 5، 12)
شکل 1: زخم پوستی 5/1 در 5/1 سانتیمتری. زخم پوستی در محل بین دو کتف رت با پانچ پوستی ایجاد شد.
روش نمونهبرداری از پوست:
در پایان روزهای 3، 5، 7 و 14 در هر گروه شاهد و درمان از 3 موش صحرایی به منظور بررسیهای هیستوپاتولوژی و ایمنوهیستوشیمی توسط اسکالپل و پنس، نمونه‌ای جهت انجام آزمایش‌های مربوطه اخذ شد. بعد از نمونهبرداری، نمونه پوست به منظور جلوگیری از چروکیده شدن بافت بر روی تکه‌ای مقوا چسبانده شد و سپس درون یک لوله فالکون mL 50 که حاوی 45 میلی‌لیتر فرمالین 10% بود قرار داده شد.
در پایان روزهای نمونهبرداری پوست موشهای صحرایی بخیه گردید و نمونههای پوست به آزمایشگاه پاتولوژی منتقل شد و پس از آمادهسازی به روش معمول، اسلاید هیستوپاتولوژی تهیه گردید.
نمونههای زخم پوستی با رنگآمیزی H&E و ماسون تریکروم برای ارزیابی هیستوپاتولوژی و فلورسنت ایمنوهیستوشیمی به روش غیر مستقیم جهت ارزیابی فاکتور VEGF طبق دستورالعمل استاندارد انجام شد(13، 12).
روش کار ایمنوهیستوشیمی:
روش تهیه پارافرمالدهید 4% :
مقدار 20 گرم پارا فرمالدهید(آلمان، مرک) به500 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد. رویHot Plate قرار گرفت تا دمای آن به 60 درجه سانتیگراد برسد. بعد از آن به محلول مورد نظر، سود(NaoH) اضافه گردید تا pH محلول به 2/7 تا 4/7 برسد. در مرحله آخر یک قرص PBS (Phosphate Buffer Salin) درون محلول قرار داده شد.
روش تهیه اسید کلریدریک 2 طبیعی:
مقدار 2 میلی‌لیتر اسید کلریدریک 5/37% به 11 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه گردید.
روش تهیه سرم بز 10 درصد و تریتون (Triton) 3/0%:
مقدار 100 لاندا سرم بز به 900 لاندا PBS اضافه گردید و سرم بز 10% به دست آمد.
مقدار 3 لاندا تریتون x100 به 997 لاندا PBS اضافه شد و تریتون 3/0% به دست آمد.
روش انجام کار:
نمونه با PBS در 4 مرحله و به فاصله 5 دقیقه شسته شد. به منظور بازیابی آنتی‌ژنی بر روی نمونهها، اسیدکلریدریک 2 طبیعی به مدت 30 دقیقه ریخته شد. بافر بورات به منظور خنثی‌سازی اسید به مدت 5 دقیقه اضافه شد و سلولها با PBS شسته شدند. تریتون 3/0% به مدت 30 دقیقه به منظور نفوذ پذیر کردن غشاء سلولها استفاده گردید. با PBS شستشو داده شدند. سرم بز 10% برای مدت 30 دقیقه به منظور بلوک کردن واکنش آنتیبادی ثانویه به صورت رنگ اضافی زمینه اضافه شد. آنتیبادی اولیه رقیق شده(1 به 100) با PBS به نمونه اضافه گردید و بعد از ایجاد یک محیط مرطوب برای جلوگیری از خشک شدن بافت، به مدت یک شب درون یخچال با دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد قرار داده شد. روز بعد ظرف حاوی بافت از یخچال خارج شد و سپس 4 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه با PBS شستشو داده شد. به نمونه آنتیبادی ثانویه با رقت 1 به 150 اضافه گردید و سپس در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و30 دقیقه در تاریکی انکوبه شد. بعد از آن نمونه از انکوباتور به اتاق تاریک منتقل گردید و بعد از 4 بار شستشو، به آنها DAPI اضافه گردید، بلافاصله برداشته و روی نمونه PBS ریخته شد. در مرحله آخر نمونه توسط میکروسکوپ فلوروسنت مدل Olympus و با لنز 400 برای تایید مارکرها مشاهده شد. سپس شاخصهای التیامی مانند میزان تشکیل بافت پوششی، میزان تشکیل کلاژن، میزان نفوذ سلولهای التهابی و میزان بیان فاکتور VEGF مورد بررسی قرار گرفت.
میزان بیان VEGF به این صورت ارزیابی گردید:
1: 0% (بدون واکنش ایمنی) = 0 یا منفی
2: 1% تا 10% = 1+ یا مثبت ضعیف
3: 10% تا 50% = 2+ یا مثبت متوسط
4: بیشتر از 50% = 3+ یا مثبت شدید
تحلیل آماری:
برای تحلیل دادههای هیستوپاتولوژی از بسته نرم‌افزاری
SPSS ورژن 22 استفاده شد و توسط آزمون کای‌اسکوئر (Chisquare) مورد بررسی قرار گرفت. مقادیر 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شدند. برای مقایسه میانگین از تحلیل واریانس(ANOVA) استفاده شد.
یافته‌ها
شمارش تعداد پلاکتها:
تعداد پلاکتهای موجود در PRP در کیسههای پلاکتی، 103×838 در هر میکرولیتر بود که به منظور تغلیظ بیشتر بعد از سانتریفیوژ و خالی کردن نیمی از محلول رویی، تعداد پلاکتها 103×1548 در هر میکرولیتر شده بود.
ارزیابی شاخصهای ترمیمی بافت پوست:
میزان تشکیل بافت پوششی:
میزان تشکیل بافت پوششی در تمامی نمونهها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 1).
نمودار 1 : میزان تشکیل بافت پوششی در زمانهای مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
(* به معنای 05/0 p< و ** به معنای 01/0 p< و اختلاف معناداری از نظر آماری نشان میدهند)
نمودار 2 : میزان تشکیل کلاژن در زمانهای مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
(* به معنای 05/0 p< و اختلاف معناداری از نظر آماری نشان میدهد).
نمودار3 : میزان سلولهای التهابی در زمانهای مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
(* به معنای 05/0 p< و ** به معنای 01/0 p< و اختلاف معناداری از نظر آماری نشان میدهند)
نمودار 2 : میزان تشکیل کلاژن در زمانهای مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
(* به معنای 05/0 p< و اختلاف معناداری از نظر آماری نشان میدهد).
نمودار3 : میزان سلولهای التهابی در زمانهای مختلف. گروه درمان با حرف T و گروه شاهد با حرف C نشان داده شده است.
(* به معنای 05/0 p< و اختلاف معناداری از نظر آماری نشان میدهد).
همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است، تفاوت معنادار بین گروههای شاهد و درمان در روزهای 3 و 5 بعد از ایجاد زخم دیده میشود به طوری که تشکیل بافت پوششی در روز 3 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان وجود داشته اما در گروه شاهد تشکیل بافت پوششی وجود نداشته است و در روز 5 بعد از ایجاد زخم، در گروه درمان میزان تشکیل بافت پوششی نسبت به گروه شاهد بیشتر بوده است.
میزان تشکیل کلاژن:
میزان تشکیل کلاژن در تمامی نمونهها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 2). همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است میزان تشکیل کلاژن در روز 5 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان با اختلاف معناداری نسبت به گروه شاهد بیشتر است.
میزان نفوذ سلولهای التهابی:
میزان نفوذ سلولهای التهابی در تمامی نمونهها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 3). همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است، میزان نفوذ سلولهای التهابی در گروه درمان نسبت به گروه شاهد در روز 7 بعد از ایجاد زخم بیشتر است.
نتایج هیستوپاتولوژی بافت پوست:
در لامهای هیستوپاتولوژی تهیه شده از بافت پوست، شاخصهایی مانند تشکیل بافت پوششی، نفوذ سلولهای التهابی و میزان تشکیل کلاژن مورد ارزیابی قرار گرفتند (شکل‌های 2 و 3).
میزان تشکیل کلاژن:
میزان تشکیل کلاژن در تمامی نمونهها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 2). همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است میزان تشکیل کلاژن در روز 5 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان با اختلاف معناداری نسبت به گروه شاهد بیشتر است.
میزان نفوذ سلولهای التهابی:
میزان نفوذ سلولهای التهابی در تمامی نمونهها مورد ارزیابی قرار گرفت(نمودار 3). همان طور که در نمودار مربوطه مشخص است، میزان نفوذ سلولهای التهابی در گروه درمان نسبت به گروه شاهد در روز 7 بعد از ایجاد زخم بیشتر است.
نتایج هیستوپاتولوژی بافت پوست:
در لامهای هیستوپاتولوژی تهیه شده از بافت پوست، شاخصهایی مانند تشکیل بافت پوششی، نفوذ سلولهای التهابی و میزان تشکیل کلاژن مورد ارزیابی قرار گرفتند (شکل‌های 2 و 3).
شکل 2 : هیستوپاتولوژی مقطع زخم در گروه درمان (سمت راست) و شاهد (سمت چپ) در روزهای سوم، پنجم و هفتم(به ترتیب الف، ب و ج). در گروه درمان مهاجرت سلولهای اپیدرم (پیکان) در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلولهای التهابی در درم(نوک پیکان) دیده میشود. در گروه شاهد ضخیم شدن اپیدرم (پیکان) بدون هیچ گونه مهاجرتی در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلولهای التهابی در درم(نوک پیکان) دیده میشود(الف)، در شکل ب، مهاجرت اندک سلولهای اپیدرم(پیکان) در کنار لبه زخم و نفوذ شدید سلولهای التهابی در دُم(نوک پیکان) دیده میشود. در شکل ج، مهاجرت زیاد سلولهای اپیدرم(پیکان) در کنار لبه زخم و بافت جوانه گوشتی(نوک پیکان) در گروه درمان نسبت به شاهد به وضوح دیده میشود.
شکل 3 : هیستوپاتولوژی مقطع زخم در گروه درمان (سمت راست) و شاهد (سمت چپ) در روز پنجم(الف) عروق خونی تازه تشکیل(پیکان) و رشتههای کلاژن(نوک پیکان) در بافت جوانه گوشتی دیده میشود. در روز هفتم(ب) رشتههای کلاژن(نوک پیکان) با ضخامت قابل توجه دیده میشود. در گروه شاهد اپیدرم در حال ترمیم نیز(نوک پیکان) دیده میشود. در روز چهاردهم(ج) رشتههای کلاژن با ضخامت مناسب و اپیدرم نوزایش یافته(نوک پیکان) دیده میشود.
جدول 1: نتایج ارزیابی ایمونوهیستوشیمی بافت پوست
| میزان بیان VEGF با استفاده از آنتی بادی فلورسنت | |||||||
| روز 3 | روز 5 | روز7 | روز14 | ||||
| درمان | 2+ | درمان | 3+ | درمان | 3+ | درمان | 3+ |
| شاهد | 2+ | شاهد | 2+ | شاهد | 2+ | شاهد | 2+ |
شکل 4 : بیان متوسط VEGF در اطراف یک رگ خونی در گروه شاهد(A, C, E) در روزهای پنجم، هفتم و چهاردهم بعد از ایجاد زخم و بیان شدید VEGF در اطراف یک رگ خونی در گروه درمان(B, D, F) در روزهای پنجم، هفتم و چهاردهم بعد از ایجاد زخم
(Indirect immunofluorescence of VEGF)
نتایج ایمنوهیستوشیمی بافت پوست:
در این مطالعه، میزان بیان فاکتور VEGFدر دو گروه درمان و شاهد در روزهای 3، 5، 7 و 14 بعد از ایجاد زخم توسط آنتیبادی فلورسنت اندازه‌گیری شد(جدول 1). همان طور که در جدول مربوطه مشخص است، تفاوت معنادار بین گروههای درمان و شاهد در روزهای 5، 7، 14 دیده میشود به طوری که میزان بیان VEGF در گروههای درمان شدید در حالی که میزان بیان این فاکتور رشد در گروههای شاهد متوسط است(شکل 4).
بحث
روند بهبود زخمهای پوستی شامل یکسری وقایع سلولی و بیوشیمیایی بنام هموستاز و التهاب، تکثیر، بلوغ و
بازسازی میباشد(14). امروزه روشهای درمانی مختلفی برای بهبود زخم وجود دارد اما روش درمانی که بتواند به تسریع این روند بهبودی کمک کند، بسیار ارزشمند است. تجمع پلاکتها در محل زخم و آزادسازی فاکتورهای رشد مختلف از آنها میتواند محرکی برای تسریع مراحل ترمیم زخم باشند(15).
در این مطالعه، هدف از تهیه ژل پلاکتی این بود که بتوان پلاکتها را با آگونیستهای قوی مانند ترومبین در حضور کلسیم فعال کرد تا بدین طریق محتویات گرانولهای پلاکتی به بیرون تراوش کند(11). در ارزیابیهای هیستوپاتولوژی شاخصهای ترمیمی مانند میزان تشکیل بافت پوششی، میزان تشکیل کلاژن و میزان نفوذ سلولهای التهابی بررسی شد که نتایج نشان داد استفاده ار ژل پلاکتی به صورت موضعی باعث تسریع در روند ترمیم زخمهای پوستی میشود. هم چنین در ارزیابی ایمنوهیستوشیمی میزان بیان فاکتور VEGF در دو گروه شاهد و درمان گزارش شد. میزان رگزایی که در ترمیم زخم نقش مهمی ایفا میکند به صورت اختصاصی با آنتیبادی فلورسنت ارزیابی شد. براساس نتایج به دست آمده از روز 5 بعد از ایجاد زخم، میزان بیان VEGF در گروه درمان شدید و در گروه شاهد متوسط مشاهده شد.
در سال 2015 پارازی و همکاران سطوح بالایی از هورمون ها و مولکولهایی با توانایی ترمیم بافت در ژل پلاکتی تهیه شده از خون بندناف کشف نمودند. ژل پلاکتی خون بندناف در مقایسه با خون محیطی غلظتهای بالاتری از چندین فاکتور رگ‌زا را دارد(16). در مطالعه حاضر نیز با ارزیابیهای هیستوپاتولوژی بافت مشاهده شد که استفاده از ژل پلاکتی به صورت موضعی باعث تسریع روند ترمیم زخم در گروه درمان نسبت به گروه شاهد میشود. در ارزیابی ایمنوهیستوشیمی افزایش میزان رگزایی در گروه درمان شده با ژل پلاکتی نسبت به گروه شاهد مشاهده شد.
دمسی و همکارانش در سال 2016 اثر فاکتورهای رشد را بر ترمیم زخمهای پوستی در موش صحرایی مورد مطالعه قرار دادند. در مطالعه آنها، گروهی با تزریق فاکتور رشد EGF و گروهی دیگر با تزریق ترکیبی از چندین فاکتور رشد(VEGF، FGF و IGF) درمان شدند. نتایج حاصل از مطالعه آنها بیانگر این بود که تزریق چندین فاکتور رشد در مرز زخمهای پوستی منجر به بهبودی سریعتر و کاهش بافت گرانوله میشود و به طور کلی با ارزیابیهای هیستوپاتولوژی در گروه درمان، افزایش میزان رگزایی گزارش شده بود(17). در سال 2017 تاتار و همکارانش اثر PRP را بر ترمیم زخمهای پوستی در موش صحرایی مورد بررسی قرار دادند. موشها به گروههای مختلفی تقسیم شدند. گروهی PRP را به صورت موضعی در محل زخم و گروهی دیگر PRPرا به صورت تزریقی داخل زخم دریافت کردند. در نتایج به دست آمده از مطالعه آنها، در روزهـای 7 و 14 بعـد از ایجـاد زخم در گروهی
که PRPرا به صورت موضعی دریافت کردند میزان
رگزایی به طور معناداری بیشتر از گروههای دیگر بود (14). در مطالعه حاضر با ارزیابی ایمنوهیستوشیمی میزان بیان VEGFدر روزهای مختلف بعد از ایجاد زخم بررسی گردید و یافتههای ایمنوهیستوشیمی بیانگر آن بود که میزان بیان فاکتور VEGF در روزهای 5، 7 و 14 بعد از ایجاد زخم در گروه درمان شده با استفاده موضعی از ژل پلاکتی نسبت به گروه شاهد بیشتر بوده است.
دیوراکس و همکارانش در سال 2018 اثر PRP را بر فیبروبلاستهای پوستی مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد استفاده از PRP باعث افزایش فیبروبلاستهای پوستی میشود که این فیبروبلاستها با مهاجرت و تکثیر در بافت گرانوله اطراف زخم ذخیره شده و باعث کاهش اسکار پوستی میشوند(18). هم چنین در سال 2018 شو ایبی و همکارانش اثر PRP را در تکثیر و مهاجرت فیبروبلاستهای پوستی انسان مورد مطالعه قرار دادند. هدف از این مطالعه، بررسی اثرات PRP بر روی بازسازی ماتریکس خارج سلولی بود که نیاز به فعال‌سازی فیبروبلاستهای پوستی دارد. PRP باعث تحریک تکثیر و مهاجرت فیبروبلاستهای پوستی و هم چنین افزایش بیان پروکلاژن І آلفا 1، الاستین، MMP-1، MMP-2 در فیبروبلاستهای پوستی میشود در نتیجه میتواند به تسریع ترمیم کمک کند(19). در مطالعه حاضر نیز در ارزیابی میکروسکوپی روز 5 بعد از ایجاد زخم، میزان تشکیل کلاژن در گروه درمان نسبت به گروه شاهد بیشتر مشاهده شد که نشاندهنده تاثیر ژل پلاکتی بر تسریع روند ترمیم زخم است.
عبداله و همکارانش در سال 2018 ، اثرات استفاده موضعی ازPRP (همولوگ) در خرگوش را بررسی کردند. در ارزیابیهای میکروسکوپی روز 3 بعد از ایجاد زخم در گروهی که PRP دریافت کردند، تشکیل بافت پوششی در بستر زخم به همراه افزایش میزان رگزایی به طور مشخص دیده شد(20). در نتایج میکروسکوپی ما در این مطالعه در روز 3 بعد از ایجاد زخم، تشکیل بافت پوششی در گروه شاهد مشاهده نشد در حالی که در گروه درمان شده با ژل پلاکتی، تشکیل بافت پوششی دیده شد اما برخلاف نتایج میکروسکوپی روز 3 بعد از ایجاد زخم در مطالعه آنها، میزان رگزایی در گروه شاهد و درمان در مطالعه حاضر مشابه بوده است(نتایج ایمنوهیستوشیمی). نتایج روز 7 در مطالعه آنها نشان داد در گروه درمان شده با PRP ، تشکیل بافت پوششی تکمیل و رشتههای کلاژن ضخیم نسبت به گروه شاهد دیده شد(20). اما در مطالعه حاضر تشکیل بافت پوششی و میزان کلاژن در دو گروه درمان و شاهد در روز 7 اختلاف آماری معناداری نداشت و در هر دو گروه درمان وشاهد بافت پوششی در حال ترمیم و رشتههای کلاژن با ضخامت قابل توجه دیده شد.
در سال 2018 چونچارونی و همکارانش اثر ژل پلاکتی را بر ترمیم زخمهای پوستی در موشهای صحرایی مورد ارزیابی قرار دادند که همانند مطالعه ما از پلاکت انسانی برای ترمیم زخمهای پوستی در موش صحرایی استفاده شد با این تفاوت که آنها از PRP تاریخ گذشته استفاده کردند و آن را در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری کرده و قبل از استفاده، PRP را در داخل یک ژلی که با محلول سدیم کربوکسی متیل سلولز، گلیسیرین، متیل پارابن و پروپیل پارابن تهیه شده قرار دادند(15). اما در مطالعه حاضر طرز تهیه ژل پلاکتی متفاوت بود زیرا ما ژل پلاکتی را با ترکیب PRP تازه و تغلیظ شده به همراه ترومبین تهیه کردیم. در مطالعه آنها ارزیابی میکروسکوپی در روزهای 3، 7 و 12 بعد از ایجاد زخم نشان داد که در روزهای 3 و 7 بعد از ایجاد زخم، در گروه درمان افزایش مهاجرت سلولهای اپیتلیال و تشکیل بافت پوششی در محل زخم به خوبی دیده شد (15). در مطالعه حاضر نیز در مراحل ابتدایی روند ترمیم زخم، تشکیل بافت پوششی و افزایش نفوذ سلولهای التهابی تک هستهای قابل مشاهده بود که این امر نشاندهنده اثر ترمیمی ژل پلاکتی تهیه شده از
پلاکت تازه بر روند بهبود زخمهای پوستی میباشد. به طور کلی پلاکتهای تاریخ گذشته و کهنه با کیفیتی مشابه با پلاکتهای تازه میتوانند در تهیه ژل پلاکتی مورد استفاده قرار گیرند زیرا فاکتورهای رشد موجود در پلاکت‌هاست که باعث تسریع روند ترمیم زخمهای پوستی میشود (4).
نتیجه‌گیری
در این مطالعه ارزیابیهای هیستوپاتولوژی و ایمنوهیستوشیمی انجام شده در روزهای مختلف بعد از ایجاد زخم نشان داد که استفاده از ژل پلاکتی حاوی فاکتورهای رشد در روند ترمیم زخم بهویژه در مراحل ابتدایی ترمیم مؤثر است به طوری که با افزایش میزان رگزایی، تشکیل بافت پوششی و تشکیل کلاژن و همچنین افزایش نفوذ سلولهای التهابی(تک هستهای) به علت تولید انواع فاکتورهای رشد، سیتوکینها، کموکینها، مدیاتورهای پیش التهابی و اعمال اثرات ضد میکروبی در فرآیند التیام، باعث تسریع روند بهبود زخمهای پوستی میشود. این مطالعه میتواند در تعداد بیشتری از حیوانات آزمایشگاهی و با اندازه‌گیری شاخصهای پاتولوژی بیشتر تکمیل شود. بدیهی است کاربرد این ژل پلاکتی در انسان نیازمند انجام بررسیهای بیشتر از نظر میزان کارایی، ایمنی و اثر بخشی میباشد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از همکاری اساتید و کارکنان آزمایشگاه مرکز
تحقیقات سازمان انتقال خون ایران و اعضای محترم گروه
پاتولوژی و جراحی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران سپاسگزاری می‌نماییم.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
