نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله: هماتولوژي انتشار: 1395/10/5
متن کامل: (3048 مشاهده)
موتاسیون ژن ASXL1 در لوسمی میلوژنوس مزمن
امیر ولیخانی1، میترا سادات رضایی2، مستانه علائی3، بهزاد پوپک4، ناصر امیری‌زاده5، محمد حسین احمدی6
چکیده سابقه و هدف ژن ASXL1به تازگی به عنوان ژن جهش یافته در لوسمی‌های میلوئیدی مطرح شده است. جهش در این ژن با حالت تهاجمی بیماری و پیامد بد بالینی همراه است و بررسی آن نتایج ارزشمندی در تعیین پیش‌آگهی بیماری در اختیار ما خواهد گذاشت. با توجه به این که فاکتورهای پیشگوییکننده محدودی برای تعیین پیش آگهی بیماران CML وجود داردو از سویی مطالعه این ژن در بیماران ایرانی تاکنون صورت نگرفته، در این مطالعه وجود این جهش در بیماران CMLبررسی شد. مواد و روش‌ها در یک مطالعه تجربی، تعداد 66 بیمار CML (لوسمی میلوئیدی مزمن) بعد از تشخیص بیماری از نظر وجود این جهش بررسی شدند. بدین منظور قسمتی از اگزون 12 از ژن ASXL1 که اکثر جهش‌ها در آن روی می‌دهد تکثیر داده شد و با تعیین سکانس، توالی نوکلئوتیدی از نظر جهش مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها موتاسیون‌های ژن ASXL1 در 4 بیمار(2 مرد و 2 زن) با میانگین سنی 44 سال و با انحراف معیار 85/17 مبتلا به CML (6%) وجود داشتند. موتاسیون‌ها دو نوع و شامل موتاسیون نوع تغییر غالب(c.1934dupG, p.Gly646TrpfsX12) و نوع حذفی(c.1900-1922del, p.Glu635ArgfsX15) بودند و در مطالعه‌های گذشته بیان شده بودند. هیچ تفاوت معناداری در بیماران دارای موتاسیون و بدون موتاسیون از نظر سن، جنس تعداد گلبول سفید، تعداد پلاکت و میزان هموگلوبین مشاهده نشد. نتیجه گیری موتاسیون ژن ASXL1 به عنوان یک ناهنجاری ژنی در CML قلمداد می‌شود. با توجه به یافته ما که موتاسیون در بیماران از ابتدای تشخیص وجود داشت، می‌توان آن را یکی از آسیب‌های اولیه ژنی در این لوسمی دانست. کلمات کلیدی: پروتئین ASXL1 ، انسان، موتاسیون، لوسمی
تاریخ دریافت: 5 /5 /94 تاریخ پذیرش : 24/5/95
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ استادیار مرکز تحقیقات ویروس‌شناسی ـ مؤسسه ملی تحقیقات سل و بیماری‌های ریوی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران 3- مؤلف مسئول: متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665 4- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ استادیار دانشگاه آزاد اسلامی تهران ـ واحد پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 5- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 6- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه ژن ASXL1 (additional sex combs like 1) در محل 20q11 کروموزوم واقع شده است و جزو خانواده ژنی درگیر در تنظیمات اپی‌ژنتیک می‌باشد. این ژن دارای 12 اگزون بوده و در اکثر سلول‌های هماتوپوئتیک بیان می‌شود(1). ژن ASXL1 در واقع هومولوگ انسانی (Additional sex comb) ASX در دروزوفیلا(Drosophila) بوده و تقویت کننده دو گروه ژنی به نام(poly comb group) PcG و (tri thorax group) trxG می‌باشد که به ترتیب در خاموشی و بیان ژن‌های مؤثر در هماتوپوئز و لوکوموژنز نقش دارند(2). ژن ASXL1 تنظیمات اپی‌ژنتیک و رونویسی را از طریق مهار کننده‌ها و فعال‌کننده‌های رونویسی و polycomb complex protein انجام می‌دهد. تحقیقات اخیر حاکی از ارتباط بین ASXL1 با اجزایی از کمپلکس Polycomb به نام(polycom Repressive complex) PRC2 شامل SUZ12,EZH2 می‌باشد(4، 3). این کمپلکس سرکوب‌گر رونویسی از طریق trimetilation در هیستون 3H روی لیزین 27(H3K27me3) مانع از رونویسی و بیان ژن می‌شوند(6، 5). عدم فعالیت ASXL1 بر اثر جهش می‌تواند مانع عملکرد کمپلکس PRC2 و در نتیجه بیان بیش از حد برخی ژن‌ها شود و این عمل نقش مؤثری در پیدایش سلول‌های سرطانی دارد(7). موتاسیون در این ژن اولین بار در سال 2009 در سندرم‌های میلودیسپلاستیک (MDS) گزارش شد. موتاسیون‌ها معمولاً از نوع frame shift و nonsense بوده و گمان می‌رود که باعث نقص قسمتی از دومن پروتئینی ASXL1 به نام دومن PHD شود. اکثر موتاسیون‌های ASXL1 در بدخیمی‌های میلوئیدی در اگزون 12یافت شده‌اند(8). شایع‌ترین موتاسیون این ژن(بیش از 50% موارد) دو برابر شدن نوکلئوتید گوانین(c.1934dupG) است و باعث یک موتاسیون frame shift می‌شود.نتیجه آن جابه‌جایی اسید آمینه تریپتوفان با گلایسین (P.Gly646Trpfx12) است(9). موتاسیون‌های ژن ASXL1 معمولاً هتروزیگوت‌اند و گفته می‌شود که پدیده haplo insufficiency فاکتور پاتولوژیـک کلیـدی آن می‌باشـد. در واقـع تحقیقـات اخیر حاکی از آن است که از بین رفتن پروتئین ASXL1 در نمونه‌های لوسمی واجد این موتاسیون،نشان‌دهنده نوع loss of function آلل بیمار می‌باشد(7). مجموعه مطالعه‌های انجام گرفته نشان می‌دهد که فراوانی این جهش از درصدهای کم تا بیش از 50% در بدخیمی‌های میلوئیدی، متفاوت بوده و در لوسمی CMML بیشترین فراوانی(45%) را دارد(9). درمان نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو(MPN)، در میلوفیبروز اولیه(PMF) حدود 5/34% و در موارد محدودی در پلی‌سایتمی اولیه(PV) و ترومبوسایتمی اساسی(ET) دیده شده است. در AML ثانویه(SAML)، بیشتر از نوع اولیه (denovo AML) وجود دارد (30% در برابر 5/6%) و در MDS دومین جهش شایع بعد از جهش TET2 می‌باشد(10). در این سندرم‌ها میزان جهش ASXL1 در آنمی مقاوم همراه با افزایش بلاست(RAEB) بیشتر از انواع دیگر مانند آنمی مقاوم همراه با سیدروبلاست حلقوی(RARS) است(11). تعداد زیادی از مطالعه‌های انجام شده در مورد ASXL1 ، به ارتباط جهش این ژن و سرانجام بیماری مرتبط است. در مطالعه‌ای روی MPN ها که بر اساس DIPSS-plus score (Dynamic International Prognostic Scoring System for primary myelofibrosis)انجام گرفته، جهش در ژن ASXL1 با حالت تهاجمی و کاهش OS (shorter overall survival) همراه بوده است(12). در CMML وجود این جهش می‌تواند پیش‌بینی بر تغییر شکل بیماری به سمت وضیعت حاد AML باشد(13). در MDS نیز با کاهش زمان پیشرفت به سمت AML و فاکتور پیشگوییکننده، غیر وابسته قلمداد شده است(14). در AML به خصوص AML ثانویه جهش ASXL1 دیده می‌شود که به طور مشخص با سرانجام بیماری و کاهش OS همراه بوده و به عنوان یک فاکتور پیشگوییکننده محسوب می‌شود(15). در CML نیز در حدود 15% موارد این جهش مشاهده شده و به عنوان یک ناهنجاری جدید در این لوسمی در نظر گرفته می‌شود(16). CMLجزو بیماری‌های MPN است و تقریباً 15% لوسمی‌های تازه تشخیص داده شده در بزرگسالان را تشکیل می‌دهد. پاتوژنز اصلی، فیوژن ژن BL (Abelson murine leukemia) بر روی کروموزوم 9 با ژن BCR (breakpoint cluster region) روی کروموزوم 22 است که باعث ایجاد انکوژنی به نام BCR-ABL می‌شود(17). با توجه به این که مطالعه‌های محدودی در مورد بررسی موتاسیون‌های این ژن در بیماران CML صورت گرفته و از طرفی فاکتورهای پیشگوییکننده در این بیماران محدود به شمارش بلاست و شمارش تعداد سلول‌ها از جمله گلبول سفید و پلاکت‌ها است، لذا هدف از مطالعه حاضر، بررسی موتاسیون‌های ژن ASXL1 در گروهی از بیماران تازه تشخیص CML به منظور شناسایی دیگر ناهنجاری‌های ژنی به غیر از فیوژن BCR-ABL است. در واقع بررسی این ژن می‌تواند اطلاعات کاملتری از پیش‌آگهی بیماری در زمان تشخیص به ما دهد. لازم به ذکر است مطالعه مذکور نخستین مطالعه انجام گرفته در یک جمعیت ایرانی است.
مواد و روش‌ها نوع مطالعه به صورت تجربی بود. نمونه خون محیطی از 66 بیمار تهیه و مراحل تشخیص CML از طریق لام خون محیطی و جستجوی ژن فیوژن BCR-ABL با روش RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) و آغازگرهای استاندارد طبق دستورالعمل ELN (European leukemia network) در مرکز آزمایشگاهی پیوند انجام شد )جدول 1). در مرحله بعد جستجوی موتاسیون در ژن ASXL1 با انجام PCR بر روی DNA استخراج شده از بافی کوت بیماران صورت گرفت. آغازگر مورد استفاده Fw-ASXL1-Exl2 5'- 5'CCA CCC TGG GTG GTT AAA G-3- و Rev-ASXL1-Ex12 5'TCG CTG TAG ATC TGA CGT AC-3' طوری انتخاب شد که بتواند اکثر موتاسیون‌های ژن که در اگزون 12 روی می‌دهد را شناسایی کند(2). این آغازگر محدوده اسید آمینه 575 تا 687 را پوشش داده که طول محصول bp 339 را می‌دهد.
واکنش PCR : واکنـش PCR در حضـور mM dNTP 25 ، pmol 10 primer ،mM Mgcl2 2 ، Taq polymerase 1 x buffer (ژنت‌بیو) انجام شد. همه واکنش‌ها با دمای اتصال 57 درجه سانتی‌گراد و چرخه‌های دمایی به این شکل تنظیم شد: 95 درجه سانتی‌گراد 5 دقیقه؛ 94 درجه سانتی‌گراد 1 دقیقه، 57 درجه سانتی‌گراد 30 ثانیه، 72 درجه سانتی‌گراد 1 دقیقه برای 40 چرخه واکنش؛ 72 درجه سانتی‌گراد 5 دقیقه.
سکانس DNA : سکانس مستقیم محصول PCRبا آغازگرهای رفت و برگشت (Forward and Reverse) انجام شد(ماکروژن کره). سکانس‌ها به منظور جستجوی موتاسیون با نرم‌افزار 6/1 Sequence Analysis (انفورماژن، آمریکا) و 25/3 Mutation Surveyor (ساخت ژنتیک، آمریکا) بررسی و موتاسیون‌ها تایید شدند. ضمناً از نظر SNP در سایت‌های NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) و پروژه 1000 ژن (www. 1000genomes.org) نیز بررسی شدند.
بررسی آماری: رابطه بین موتاسیون با تعداد گلبول سفید(WBC) و تعداد پلاکت(PLT) و میزان هموگلوبین(Hb) و سن با استفاده از آزمون‌های آماری t independent test و اسپیرمن انجام شد که نتایج یکسانی داشتند. اختلاف فراوانی از نظر جنس نیز با آزمون کای‌دو(Chi square) بررسی شد. آزمون‌ها توسط نرم‌افزار 19 SPSS آنالیز شدند.اختلاف معنادار به صورت 05/0 p< تعیین شد. کلیه موازین اخلاقی و حذف اسرار بیماران در این مطالعه رعایت شده است.
جدول 1: آغازگرهای ژن‌های bcr-abl
نام ژن
توالی
اندازه محصول
ABL-a3-B
GTTTGGGCTTCACACCATTCC
417 bp یا 342
BCR-b1-A
GAAGTGTTTCAGAAGCTTCTCC
یافته‌ها در این طرح 66 بیمار مبتلا به CML شامل 23 زن و 43 مرد(با میانگین سنی 44 سال) بررسی شدند. بررسی فیوژن ژنbcr-abl و نتیجه PCR و الکتروفورز ژن ASXL1 انجام شد(شکل‌های 1 و 2). موتاسیون‌های ژن ASXL1 در 4 بیمار(6%) وجود داشتند. موتاسیون‌های این بیماران در سه نفر از نوع تغییر غالب (frame shift) (c.1934dupG, p.Gly646TrpfsX12) و در یک نفر از نوع حذف
(p.Glu635ArgfsX15 ، c.1900-1922del) بود(جدول 2)(شکل 3). هیچ تفاوت معناداری در بیماران دارای موتاسیـون و بـدون مـوتاسیون از نظـر سن، جنس و تعداد گلبول سفید(L/ 109 * 280/78 در برابر L/ 109 * 613/110) با انحراف معیار 02/73، تعداد پلاکت (L/ 109 * 6/430 در برابر L/ 109 * 337) و میزان هموگلوبین (9/10 در برابر g/dL 12) وجود نداشت(جداول 3، 4 و 5).
شکل 1: اتیدیوم بروماید ژل الکتروفورز واریانت‌های BCR-ABL باند M مارکر bp 100. باند bp 417 مربوط به b3a2 در شماره 6 و 7.باند bp 342 مربوط به b2a2 در شماره 4 و 5.شماره 2 کنترل منفی و شماره 3 کنترل منفی واکنش PCR
شکل 2 : قطعه bp 339 در محدوده(اسید آمینه 575 تا 687) از اگزون12ژن ASXL1 باند M مارکر bp 100. شماره 1 تا 8 مربوط به بیماران. شماره 9 مربوط به کنترل ژن بتاگلوبین و شماره 10 کنترل منفی واکنش PCR
شکل 3 : کروماتوگرام سکانس DNA ژن ASXL1 الف: سکانس DNA شایع‌ترین موتاسیون ژنASXL1را در مطالعه حاضر نشان می‌دهدc.1934dupG (p.G646TrpfsX12) یک اضافه شدن باز گوانین در موقعیت 1394 است که نتیجه آن موتاسیون تغییر غالب و به دنبال آن کدون پایان و پروتئین ناقص است. ب: سکانس DNA دومین موتاسیون ژن ASXL1 یعنیc.1900_1922del (p.Glu635ArgfsX15) که باعث حذف 23 نوکلئوتید و به دنبال آن رسیدن به کدون پایان و پروتئین ناقص می‌شود. جدول 2: خلاصه اطلاعات مربوط به بیماران دارای موتاسیون
شماره
سن/جنس
موتاسیون
/L109 * WBC
/L109 * PLT
Hb (g/dL)
تغییر نوکلئوتید
تغییر اسید آمینه
1C
70/F
c.1934dupG
p.Gly646TrpfsX12
8/59
668
10
8C
47/M
c.1900_1922del
p.Glu635ArgfsX15
3/193
249
3/9
22C
69/F
c.1934dupG
p.Gly646TrpfsX12
2/24
134
3/10
33C
24/M
c.1934dupG
p.Gly646TrpfsX12
7/12
725
1/13
جدول 3: میانگین تعداد گلبول سفید به تفکیک در افراد دارای آلل موتانت و طبیعی
نوع متغیر
میانگین
حداقل
حداکثر
SD
نوع موتانت
(L) 109 * 280/78
(L) 109 * 71/12
(L) 109 * 3/193
022/73
نوع وحشی
(L) 109 * 613/110
(L) 109 * 65/4
(L) 109 * 766
646/139
جدول 4: میانگین میزان هموگلوبین در افراد موتانت و طبیعی
نوع متغیر
میانگین
حداقل
حداکثر
SD
نوع موتانت
9/10
3/9
1/13
5/1
نوع وحشی
1/12
7/7
4/19
2
جدول 5: میانگین تعداد پلاکت به تفکیک در افراد دارای آلل موتانت و طبیعی
تعداد پلاکت
میانگین
حداقل
حداکثر
SD
نوع موتانت
(L) 109 * 430
(L) 109 * 134
(L) 109 * 725
249/258
نوع وحشی
(L) 109 * 337
(L) 109 * 22
(L) 109 * 1171
501/249
بحث در این مطالعه تعداد 66 بیمار CML در جمعیت ایرانی جهت وجود موتاسیون ژن ASXL1 بررسی شدند. نتایج این مطالعه حاکی از آن بود که در 6% بیماران CML موتاسیون ژن ASXL1 وجوددارد. قابل توجه است که تا به حال مطالعه‌های کمی در مورد موتاسیون ASXL1 در لوسمی CML صورت گرفته است(19، 18، 16). در مطالعه‌ای که توسط بولتوود و همکارانش در انگلیس صورت گرفت، نشان داده شد که حدود 6 بیمار از 41 بیمار مبتلا به CML یعنی 6/14% بیماران این جهش را دارند(17). 5 نفر موتاسیون از نوع تغییر غالب(frame shift) و بقیه از نوع بی‌معنی(nonsense) بود. در مطالعه ماکیشیما و همکارانش روی 54 بیمار CML ، فقط 2 نفر دارای موتاسیون بودند(18). در مطالعه دیگر توسط کراس‌من و همکاران، موتاسیون در 8 نفر از 39 نفر مبتلا به CML در فاز بلاستیکوجود داشت(19). در مطالعه بولتوود و همکارانش، بررسی موتاسیون ASXL1 با SNP array نشان داد که این موتاسیون هم در مرحله مزمن و هم بلاستیک وجود دارد که می‌توان از آن نتیجه گرفت که موتاسیون در این ژن به عنوان اتفاق اولیه و زمینه‌ساز دیگر جهش‌ها و پیشرفت به سوی فاز بلاستیک باشد(16). در این مطالعه نیز در بیماران فاز مزمن موتاسیون دیده شد. روش‌های بررسی این موتاسیون در تقریباً همه مطالعه‌های تکثیر قسمتی از اگزون 12 که جهش‌ها در آن رخ مـی‌دهـد(HOT spot) و سپـس انجـام سکانــس توالی نوکلئوتیدی برای جستجوی موتاسیون است. در این بین از روش‌های دیگر مانند روش‌های Array نیز استفاده شده است از جمله در مطالعه بولتوود و جلسی بویر که از روش‌های مبتنی بر Array هم استفاده شد اما همگی از آنالیز سکانس DNA به عنوان Gold standard نیز استفاده کردند(16، 1). در این مطالعه، 2 نوع موتاسیون مختلف در CML گزارش شد. یکی از آن‌ها که بیشترین فراوانی را داشت، Insersion G یا همان دو برابر شدن G (dupG 1394) است که باعث یک موتاسیون از نوع Frame shift می‌شود. در تقریباً همه مطالعه‌های گذشته در طیف‌های مختلف لوسمی‌های میلوئیدی، این موتاسیون به عنوان فراوان‌ترین نوع گزارش شده است(بیش از 50%)(9).یک مورد از بیماران دراین بررسی دارای حذف یا Deletion 23 نوکلئوتیدی در موقعیت 1922-1900 و جابه‌جایی در اسید آمینه 635 گلوتامیک اسید با آرژنین p.Glu635ArgfsX15 بود. در مقاله مروری جلسی بویر و یا دربررسی بیماران AML توسط مارتا پراتکورونا و همکاران، این حذف 23 نوکلئوتیدی به عنوان دومین نوع شایع موتاسیون مطرح شده است(9، 2). در این مطالعه ارتباط بین موتاسیون با برخی از متغیرها از جمله جنسیت، سن، تعداد گلبول سفید، تعداد پلاکت و میزان هموگلوبین بررسی شد. نتایج حاصل نشان داد که در هیچ یک از موارد، متغیرهای مستقل رابطه‌ای با وجود موتاسیون ندارد. در مطالعه‌ای توسط چوو و همکاران بر روی 501 بیمـار Denovo AML کـه تعداد 54 نفر از آن‌ها موتاسیون داشتند، مشخص شد که موتاسیون این ژن رابطه نزدیکی با سن بالاتر و جنس مرد دارد. در ضمن هیچ ارتباطی با Hb ، WBC و تعداد پلاکت در بیماران دارای موتاسیون وجود نداشت(20). در بررسی دیگر روی بیماران MRC-AML(Myelodysplastic relate change) مشخص شد موتاسیون با افزایش سن از شیوع بالاتری برخوردار است(21). در مطالعه دیگر روی 882 بیمار AML که از بین آن‌ها 46 بیمار دچار موتاسیون بودند، افراد دارایموتاسیون ژن ASXL1 سن بالاتر و تعداد WBC کمتری در مقایسه با افراد بدون موتاسیون داشتند(2).
نتیجه‌گیری مطالعه این ژن به تعداد محدودی در مورد CML صورت گرفته است و میزان دقیق این جهش و هم چنین
ارتباط این موتاسیون با مشخصات بیمار در این لوسمی هنوز نامشخص می‌باشد. اما با توجه به فراوانی آن در این مطالعه و مطالعه‌های قبل، می‌توان آن را به عنوان یک ناهنجاری ژنی در CML قلمداد کرد که می‌تواند همراه با تغییرات ژنی دیگر باعث به وجود آمدن یا تغییر شکل و یا پیشرفت آن شود.
تشکر و قدردانی این مقاله حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد مصوب مرکز تحقیقات انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون وابسته به سازمان انتقال خون ایران می‌باشد. بدین‌وسیله از کلیه همکاران مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون که در انجام این پایان‌نامه ما را یاری نمودند تشکر و قدردانی می‌نماییم.
Valikhani A, Rezaei M, Alaei M, Popak B, Amirizade N, Ahmadi M. Study of ASXL1 gene mutation in Chronic Myelogenous Leukemia. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2016; 13 (4) :324-332 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-977-fa.html
