fa بررسی ترانسفکت وکتورهای نوترکیب آدنوویروسی فاقد ژن گزارشگر و تیتراسیون آن با روش‌های مولکولی: راهنمای عملی ويروس شناسي Virology پژوهشي Research <p>  </p><p align="right">  چکید ه </p><p align="right"> <strong><i> سابقه و هدف </i></strong></p><p align="right"> <strong> خصوصیات بیولوژی آدنوویروس، آن را به وکتوری مناسب در تحقیقات پایه به عنوان ابزار انتقال ژن و هم چنین در درمان بالینی بسیاری از بیماری‌ها و واکسیناسیون مبدل کرده است. در این مطالعه، ترانسفکشن آدنوویروس فاقد ژن گزارشگر و هم چنین تیتراسیون آن به وسیله روش‌های مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفت. </strong></p><p align="right"> <strong><i> مواد و روش‌ها </i></strong></p><p align="right"> <strong> در یک مطالعه تجربی، پس از ساخت آدنوویروس نوترکیب، وجود ترانس ژن در سازه ژنی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی آن با روش </strong><strong>PCR </strong><strong>و هم چنین تعیین توالی ارزیابی شد. به منظور پایش ترانسفکشن، </strong><strong>DNA </strong><strong>استخراج شده از سلول‌های ترانسفکت شده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ترانس ژن با روش </strong><strong>PCR </strong><strong>مورد بررسی قرار گرفت. تیتر ویروس به روش </strong><strong>Real-time PCR </strong><strong>و با استفاده از آغازگرهای تشخیصی بر روی </strong><strong>DNA </strong><strong>استخراج شده از لیزات ویروس تعیین شد. </strong></p><p align="right"> <strong><i> یافته‌ها </i></strong></p><p align="right"> <strong> وجود ترانس ژن در سازه ژنی نوترکیب با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ترانس ژن و هم چنین تعیین توالی تایید شد. بررسی </strong><strong>DNA </strong><strong>استخراج شده از سلول‌های </strong><strong>HEK 293A </strong><strong>ترانسفکت شده، موفقیت کیفی ترانسفکشن را مورد تایید قرار داد و هم چنین تعداد ذرات ویروس با استفاده از </strong><strong>Real-time PCR </strong><strong>حدود 10⁷ × </strong><strong>5 </strong><strong></strong><strong>در واحد حجم(میلی‌لیتر) برآورد شد. </strong><strong></strong></p><p align="right"> <strong><i> نتیجه گیری </i></strong></p><p align="right" style="DIRECTION: rtl"> <strong> با طراحی و مهندسی هدفمند آغازگر، می‌توان موفقیت یا عدم موفقیت ترانسفکشن را به صورت کیفی در کار با وکتورهای آدنوویروسی فاقد ژن گزارشگر، ارزیابی نمود. هم چنین با استفاده از روش </strong><strong>Real-time PCR </strong><strong>و به کارگیری روش‌های مناسب جداسازی ژنوم کامل ویروس از لیزات آن، از محدودیت‌های تیتراسیون کیفی آدنوویروس اجتناب ورزید. </strong></p><p align="right">  </p><p align="right">  </p><p></p> <p>  <strong></strong></p><p> <i> </i></p><p>  <strong>Abstract</strong> </p><p> <i><strong>Background and Objectives</strong></i></p><p> Biologival features of adenoviruses have made them vectors of choice for gene transfer in basic research as well as in clinical treatment and vaccination. The key steps in the trasnsfer of adenovirus vector gene are transfection monitoring and viral titer determination. We investigated the transfection of non-reporter adenoviruses as well as viral titration using molecular methods.</p><p>  </p><p> <i><strong>Materials and Methods</strong></i></p><p> In this experimental study, after the recombinant adenovirus vector construction, the presence of transgenes in gene construct was evaluated by PCR with transgene specific primers and sequencing. After calcium-phosphate transfection of the packaging cell line (HEK 293A), transfection was monitored by PCR using transgene specific primers (diagnostic and compound primers) to analyze DNA extracted from the transfected packaging cell line. The viral titer was determined by Real Time PCR (RT-PCR) using diagnostic primer to analyze DNA extracted from viral lysates.</p><p>  </p><p> <i><strong>Results</strong></i></p><p> The presence of transgene in gene construct was confirmed by transgene specific primers and sequencing. Evaluation of DNA extracted from transfected packaging cells confirmed the efficiency of monitoring of transfection. The viral titer was estimated to be about 4 × 10⁷ viral particles/ml by RT-PCR. </p><p>  </p><p> <i><strong>Conclusions</strong></i></p><p> Careful primer design is the key to the efficient monitoring of non-reporter adenovirus vector transfection. The appropriate genomic purification and the use of RT-PCR technique would also avoid the disadvantages of functional titration of adenoviruses. </p><p> </p> کلمات کلیدی : آدنوویروس‌ها, ترانسفکشن, PCR Key words: Adenoviruses, Transfection, PCR 380 390 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-110-1&slc_lang=fa&sid=1 K. Atarodi کامران عطاردی 910031947532846009707 910031947532846009707 No دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس و مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون AA. Pourfatholah علی‌اکبر پورفتح‌اله pourfa@modares.ac.ir 910031947532846009708 910031947532846009708 Yes استاد دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس H. Abolghasemi حسن ابوالقاسمی 910031947532846009709 910031947532846009709 No استاد دانشکده پزشکی دانشگاه بقیه‌اله و مرکز تحقیقات بیماری‌های خونی مادرزادی کودکان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی N. Amirizadeh ناصر امیری زاده 910031947532846009710 910031947532846009710 No استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون M. Habibi Roudkenar مهریار حبیبی رودکنار 910031947532846009711 910031947532846009711 No دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی‌آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Gh. Khamisipour غلامرضا خمیسی‌پور 910031947532846009712 910031947532846009712 No استادیار دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی بوشهر