fa طراحی و ساخت وکتور بیانی اختصاصی کراتینوسیت های اپیدرمو بررسی بیان فاکتورIX انسانی به عنوان مدل عمومى General پژوهشي Research <p> <strong> چکیده </strong></p><p> <strong><i> سابقه و هدف </i></strong></p><p> <strong> کراتینوسیت یک مدل مناسب برای بیان ژن به صورت<i> </i></strong><strong><i /></strong><strong><i>ex vivo </i></strong><strong>برای رهاسازی سیستمیک پروتئین است. با توجه به این نکته عناصر کنترلی اختصاصی کراتینوسیت‌ها، گزینه‌های مناسبی برای بیان ژن با واسطه کراتینوسیت‌ها هستند. در پژوهش حاضر </strong><strong>یک وکتور برای بیان اختصاصی پروتئین‌های نوترکیب در کراتینوسیت‌های اپیدرم </strong><strong>با استفاده از پروموتر ژن کراتین‌ـ‌ 14 انسانی طراحی گردید. توانایی پلاسمید ساخته‌شده به‌وسیله بیان </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور انعقادی </strong><strong>IX </strong><strong>انسان </strong><strong>ی در کراتینوسیت‌های اولیه انسانی نشان داده‌شد. </strong></p><p> <strong><i> مواد وروش ها </i></strong></p><p> <strong> مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. با قرار گرفتن یک قطعه حاوی پروموتر ژن کراتین ـ 14 انسانی به جای پروموتر سیتومگالوویروس </strong><strong>( </strong><strong>CMV </strong><strong>) </strong><strong>در پلاسمید </strong><strong>pcDNA3 </strong><strong>، پلاسمید بیانی </strong><strong>phPK14H </strong><strong>ساخته شد. در مرحله بعد </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور </strong><strong></strong><strong>IX </strong><strong></strong><strong>انسانی که از کتابخانه </strong><strong>cDNA </strong><strong>کبدی جدا شده بود، وارد پلاسمید بیانی شد و پلاسمید </strong><strong>pK14hFIX </strong><strong>ساخته شد و برای ترانسفکشن کراتینوسیت‌ها مورد استفاده قرار گرفت. کراتینوسیت‌های انسانی از پوست ختنه نوزادان جدا و با استفاده از محیط کشت عاری از سرم مخصوص کراتینوسیت‌ها کشت داده شدند. سلول‌های مزبور با پلاسمید نوترکیب جدید ساخته شده </strong><strong>( </strong><strong>pK14hFIX </strong><strong>) </strong><strong>با استفاده از فیوجین-6 ترانسفکت شدند. حدود 72 ساعت پس از ترانسفکشن، محیط کشت به‌دست آمده از سلول‌های ترانسفکت شده برای بررسی بیان فاکتور </strong><strong>IX </strong><strong></strong><strong>جمع آوری و سلول‌ها به محیط کشت انتخابی حاوی جنیتیسین منتقل شدند. ادامه کشت سلول‌های مزبور در محیط انتخابی منجر به پدیدار شدن 9 کلنی شد که در ادامه هر یک به صورت جداگانه کشت داده شده و مورد مطالعه قرار گرفتند. بیان </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور </strong><strong>IX </strong><strong>با استفاده از آزمون انعقادی یک مرحله‌ای بر روی محیط‌های کشت و هم‌چنین انجام </strong><strong>RT-PCR </strong><strong>بر روی سلول‌های کراتینوسیت ترانسفکت مورد مطالعه قرار گرفت. </strong></p><p> <strong><i> یافته‌ها </i></strong></p><p> <strong> زمان‌های انعقاد به دست آمده از محیط‌های کشت سری‌های مختلف ترانسفکشن با کنترل‌های منفی مقایسه شد. فعالیت انعقادی فاکتور </strong><strong>IX </strong><strong>نوترکیب در محیط کشت کراتینوسیت‌های ترانسفکت شده قبل از تیمار جنیتیسین وپس از انتخاب کلنی‌ها با جنیتیسین نشان داده شد. بیان </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور </strong><strong>IX </strong><strong>در سلول‌های ترانسفکت شده هم‌چنین با انجام </strong><strong>RT-PCR </strong><strong>تایید شد. </strong></p><p>  <strong><i>نتیجه‌گیری </i></strong></p><p> <strong> نتایج اولیه ما نظریه‌ای که کراتینوسیت‌های انسانی قادر به تولید فاکتور </strong><strong>IX </strong><strong>فعال تحت کنترل پروموتر کراتین‌ـ14هستند را تایید می‌کند. علاوه بر این پلاسمید ساخته شده حاصل از این تحقیق ابزار مناسبی برای بررسی بیان پروتئین‌هایی که از اهمیت درمانی برخوردارند را در کراتینوسیت‌ها برای مطالعات مختلف بیوشیمیایی و سلولی فراهم ساخته است. </strong></p><i><strong>کلمات کلیدی: </strong></i><strong>فاکتور IX ، کراتینوسیت، کراتین ـ 14، ژن درمانی سوماتیک </strong> <p> <strong> Abstract </strong></p><p> <strong><i> </i></strong></p><p> <strong><i> Background and Objectives </i></strong></p><p>  Keratinocyte is a suitable model for <i>ex vivo</i> gene expression strategies for systemic release of a protein. In this regard, keratincyte-specific regulatory elements are especially attractive candidates for keratinocyte–mediated gene expression. <strong></strong>In the present study, a vector was designed for specific expression of recombinant protein in human epidermal keratinocytes using human keratin 14 gene promoter. The potential of the constructed plasmid was shown by the expression of human FIX-cDNA in human primary keratinocytes. </p><p>  </p><p> <strong><i> Materials and Methods </i></strong></p><p>  A fragment containing human keratin14 gene promoter was inserted in the pcDNA3 plasmid. The human FIX cDNA isolated from a human liver cDNA library was inserted into the recombinant plasmid (phPK 14 H). Human epidermal keratinocytes isolated from neonatal foreskin were cultivated in keratinocyte serum-free medium and transfected with the newly made recombinant plasmid (pK14hFIX) using fugene-6. About 72 hours after transfection, cultured media were collected for expression analysis, and the cells were transferred into selective media containing geneticin. Incubation continued until the appearance of 9 colonies. The expression of human FIX-cDNA was examined by performing one-stage clotting assay as well as RT-PCR. </p><p>  </p><p> <strong><i> Results </i></strong></p><p>  The clotting times obtained from the cultured media of different transfection lines were compared to of the negative controls. Indeed the coagulation activity of the expressed rhFIX in the cultured media was detectable both before and after geniticin selection of the transfected keratinocytes. The expression of hFIX-cDNA in the transfected cells was also confirmed by performing RT-PCR. </p><p>  </p><p> <strong><i> Conclusion </i></strong></p><p>  Our preliminary results support the idea that human keratinocyte has potential for the production and secretion of biologically active FIX. The expression plasmid constructed in this study, has provided useful means for the expression of different proteins of medical importance in keratinocyte for further biochemical and cellular studies. </p><p> <strong><i> </i></strong></p><p> <strong><i> Key words: </i></strong>Factor IX ، Keratinocyte, Keratin-14, Somatic gene therapy <strong><i /></strong></p> ,فاکتور IX,کراتینوسیت,کراتین ـ 14,ژن درمانی سوماتیک Factor IX , Keratinocyte, Keratin-14, Somatic gene therapy 17 27 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1-62&slc_lang=fa&sid=1 S.J Hosseini سید جواد حسینی 9100319475328460010757 9100319475328460010757 No A.R Zomorodipour دکتر علیرضا زمردی‌پور zomorodi@nrcgeb.ac.ir 9100319475328460010758 9100319475328460010758 Yes R Jalal دکتر راضیه جلال 9100319475328460010759 9100319475328460010759 No F Sabooni دکتر فرزانه صابونی 9100319475328460010760 9100319475328460010760 No