fa کلون‌سازی و مطالعه بیان فاکتور بافتی نوترکیب در سلول‌های یوکاریوتیک CHO بيوتكنولوژي Biotechnology پژوهشي Research <p align="justify">  چکید ه </p><p> <strong><i> سابقه و هدف </i></strong></p><p> <strong> فاکتور بافتی( </strong><strong>TF </strong><strong>)، اصلی‌ترین آغازکننده آبشار انعقادی است. برای بررسی مسیر خارجی انعقاد، اندازه‌گیری زمان پروترومبین بهترین روش است که در این روش با توجه به </strong><strong>TF </strong><strong>به کار گرفته شده، نوساناتی در نتیجه آزمایش دیده می‌شود. در این مطالعه با هدف دستیابی به نتایجی با تکرارپذیری بیشتر، از </strong><strong>TF </strong><strong>نوترکیب استفاده شده است. </strong></p><p> <strong><i> مواد و روش‌ها </i></strong></p><p> <strong> مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور بافتی در پلاسمید </strong><strong>pcDNA3.1 </strong><strong>کلون و به سلول‌های </strong><strong>CHO </strong><strong>منتقل گردید. پروتئین‌های سلول‌های </strong><strong>CHO </strong><strong>ترانسفکت شده استخراج و پس از جداسازی با روش </strong><strong>SDS-PAGE </strong><strong>با وسترن بلات آنالیز شدند. سلول‌های </strong><strong>CHO </strong><strong>که </strong><strong>TF </strong><strong>را بیان می‌کردند در حضور کلروکلسیم به پلاسمای سیتراته افزوده شدند و زمان لخته شدن پلاسما ثبت گردید. فعال‌سازی فاکتور </strong><strong>VII </strong><strong>در پلاسما با روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت. </strong><strong></strong></p><p> <strong><i> یافته‌ها </i></strong></p><p> <strong> در آنالیز پروتئین‌های جدا شده از سلول های ترانسفکت شده با روش </strong><strong>SDS-PAGE </strong><strong>، باندی حدود 40 کیلودالتون مشاهده شد که با آنتی‌بادی مونوکلونال </strong><strong>TF </strong><strong>در آنالیز وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. زمان انعقاد پلاسما در مقایسه با سلول‌های </strong><strong>CHO </strong><strong>ترانسفکت نشده, از 3 دقیقه به 3 ± 21 ثانیه کاهش یافت. هم چنین اضافه کردن غشای این سلول‌ها به پلاسما در حضور کلرور کلسیم، موجب فعال‌سازی فاکتور </strong><strong>VII </strong><strong></strong><strong></strong><strong>به میزان </strong><strong>ng/ml </strong><strong>35 ±810 شد. </strong></p><p> <strong><i> نتیجه گیری </i></strong></p><p> <strong> TF </strong><strong>نوترکیب بیان شده در سلول‌های </strong><strong>CHO </strong><strong>، قادر به لخته کردن پلاسمای سیتراته و فعال سازی فاکتور </strong><strong>VII </strong><strong>بود. </strong><strong></strong></p><p> </p> <p> <strong> Abstract </strong><strong></strong></p><p> <strong><i>Background and Objectives</i></strong></p><p> Tissue factor (TF), a 45-kDa transmembrane glycoprotein, is the major cellular initiator of the coagulation cascade. Prothrombin Time (PT) is the test that evaluates extrinsic pathway of coagulation. Thromboplastin used in this test is mostly prepared of rabbit brain. Thus it causes variation in the PT results. There is an important advantage of using recombinant TF in PT test to get more reproducible results. </p><p> <strong><i> </i></strong></p><p> <strong><i>Materials and Methods</i></strong></p><p> TF mRNA was isolated from human lung fibroblast cells. After preparation of cDNA it has cloned in pcDNA3 plasmid. CHO cells were transfected with recombinant plasmid. Transfected cells were grown in presence of Geneticin. Total proteins were extracted from CHO cells and separated with SDS/PAGE electrophoresis and analyzed by western blotting technique. CHO cells expressing TF were added to citrated plasma in presence of Cacl₂ and clotting time was measured. In addition, factor VII activation by recombinant TF in the plasma was assessed by ELISA method. </p><p> <strong><i> </i></strong></p><p> <strong><i>Results</i></strong></p><p> Extracted proteins from tarnsfected CHO cells separated on SDS/PAGE showed an approximately 40-kDa band that verified with a monoclonal antibody against TF on western blot analysis. Adding transfected cells (10⁶cell/ml) to the citrated plasma in presence of Cacl₂ could decrease clotting time from 3 minutes to 21 ± 3 seconds compared with untransfected CHO cells. The level of factor VIIa in citrated plasma was 810 ± 35 ng/ml in presence of transfected cells’ membrane.</p><p> <strong><i> </i></strong></p><p> <strong><i>Conclusions</i></strong></p><p>  Recombinant TF expressed in CHO cells was able to clot citrated plasma and to activate factor VII.</p><p> <strong><i> </i></strong></p><p>  </p> سلول‌های CHO, فاکتور VII, زمان پروترومبین CHO cells, Factor VII, Prothrombin Time 96 103 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1-231&slc_lang=fa&sid=1 M. Khorshidfar مونا خورشیدفر 910031947532846009847 910031947532846009847 No N. Amirizadeh ناصر امیری‌زاده n.amirizadeh@ibto.ir 910031947532846009848 910031947532846009848 Yes استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون M. Habibi Roudkenar مهریار حبیبی رودکنار 910031947532846009849 910031947532846009849 No