fa جداسازی، کلونینگ و بیان ژن فاکتور VII انعقادی نوترکیب انسانی در رده سلولی CHO هماتولوژي Hematology پژوهشي Research جداسازی، کلونینگ و بیان ژن فاکتور VII انعقادی نوترکیب انسانی در رده سلولی CHO راحله حلبیان1، ناصر شاگردی اسماعیلی2، آرزو اوودی2، ناصر مسروری3، دکتر ناصر امیری‌زاده4، دکتر کامران موسوی حسینی5، دکتر احمد قره‌باغیان6، دکتر حوری رضوان7، دکتر محمد علی جلیلی8، دکتر مهریار حبیبی رودکنار9 چکیده سابقه و هدف فاکتور VII ، یک گلیکوپروتئین پلاسمایی است که در آبشار انعقادی تشکیل فیبرین، شرکت دارد. فاکتور VII در مسیر انعقادی نقش مهمی داشته و آغازگر مسیر خارجی انعقاد است. هدف اساسی این مطالعه جداسازی و کلونینگ فاکتور VII نوترکیب انسانی و بیان آن در رده سلولی یوکاریوتی CHO جهت بیان فاکتور VII نوترکیب(FVII) بود. مواد وروش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. ابتدا cDNA ژن فاکتور VII از رده سلولی کبد انسان(HepG2) جدا شده و در وکتور(+) 1/3 pcDNA کلون شده سپس وکتور نوترکیب به داخل سلول‌های CHO ترانسفکت شد. در نهایت، یک کلون سلولی که به طور پیوسته فاکتور VII را بیان می‌کند تثبیت شد. بیان فاکتور VII نوترکیب توسط روش‌های RT-PCR ، الایزا، SDS-PAGE و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. هم چنین تایید فعالیت بیولوژیکی فاکتور VII نوترکیب توسط آزمایش PT و ایجاد لخته در پلاسمای فاقد فاکتور VII صورت گرفت. یافته‌ها نتایج به دست آمده نشان‌دهنده کلونینگ و بیان موفقیت‌آمیز ژن فاکتور VII بود. پس از 3 هفته کشت سلول‌های CHO در حضور جنتیسین، کلون سلول‌های پایدار به دست آمد. نتایج آزمایش‌های RT-PCR ، الایزا، SDS-PAGE و وسترن بلات حاصل از کلون‌ها، نشان‌دهنده بیان این پروتئین در رده سلولی CHO بود. کاهش 3 الی 4 برابری در زمان انعقاد نشان‌دهنده وجود فعالیت بیولوژیکی فاکتور VII نوترکیب بیان شده بود. نتیجه گیری سالانه حدود 4000 الی 6000 ویال(33600 تا 50400 میلی گرم) از این فرآورده وارد کشور می‌شود که دولت را متحمل هزینه بسیار بالایی می‌کند. بنابراین تولید فاکتور VII نوترکیب با استفاده از فناوری DNA نوترکیب در سطح آزمایشگاهی، می‌تواند اولین گام در راه فایق آمدن بر مشکلات فوق باشد. Isolation, cloning and expression of recombinant human factor VII in CHO cell line Halabian R.1( MS ), Shagerdi Esmaili N.1( MS ), Oodi A.1( MS ), Masroori N.1(MS), Amirizadeh N.1(PhD), Mousavi Hosseini K.1(PhD), Gharehbaghian A.1(PhD), Rezvan H.1(PhD), Jalili M.A.1(PhD), Habibi Rudkenar M.1(PhD) 1Iranian Blood Transfusion Organization, Research Center, Tehran, Iran Abstract Background and Objectives Factor VII is a plasma glycoprotein that participates in the coagulation process leading to the generation of fibrin. Factor VII plays an important role in the cascade of coagulation. The aim of this study was to clone and express human recombinant factor VII in CHO cell line as an eukaryotic host cell. Materials and Methods In this descriptive study, FVII cDNA was isolated from HepG2 cell line and cloned to pcDNA 30.1(+) vector. The constructs were transfected to CHO cell line. A cell line that permanently expressed recombinant factor VII was established. The expression of recombinant FVII was determined by RT-PCR, ELISA, SDS-PAGE and western blot analysis. Biological activity of recombinant factor VII was determined by prothrombin time assay in factor FVII-depleted plasma. Results The results showed that FVII was successfully cloned and expressed. After 3 weeks stable cell lines were generated in the culture of the CHO cell line in the presence of geneticin. RT-PCR, ELISA, SDS-PAGE and western blot analysis results indicate the expression of FVII in the stable clones. A three- to four-fold decrease of the specific coagulant activity of rFVII was observed that indicates of rFVII being biologically active. Conclusions Four thousands to Six thousands vials of rFVII were imported to our country having high cost for the government. Therefore, production of rFVII through recombinant DNA technology within lab scale is the first step to overcome the problems. Key words: Hemophilia, rFVIIa, CHO, Transfection SJIBTO 2009 6(1): 1-11 Received: 21 Oct 2008 Accepted:21 May 2009 Correspondence: Habibi Roudkenar M., PhD of Biotechnology. Assistant professor of Iranian Blood Transfusion Organization-Research Center. P.O.Box: 14665-1157, Tehran, Iran. Tel: (+9821)88601599 Fax: (+9821)88601599 E-mail: roudkenar@ibto.ir هموفیلی, فاکتور VII نوترکیب, CHO , ترانسفکشن Hemophilia, rFVIIa, CHO, Transfection 1 11 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-164-1&slc_lang=fa&sid=1 Mehryar Habibi Roudkenar مهریار حبیبی رودکنار roudkenar@ibto.ir 9100319475328460010158 9100319475328460010158 Yes R Halabian راحله حلبیان 9100319475328460010159 9100319475328460010159 No N Shagerdi Esmaili ناصر شاگردی اسماعیلی 9100319475328460010160 9100319475328460010160 No A Oodi آرزو اودی 9100319475328460010161 9100319475328460010161 No N Masroori ناصر مسروری 9100319475328460010162 9100319475328460010162 No N Amirizadeh ناصر امیری زاده 9100319475328460010163 9100319475328460010163 No K Mousavi Hosseini کامران موسوی حسینی 9100319475328460010164 9100319475328460010164 No A Gharehbaghian احمد قره باغیان 9100319475328460010165 9100319475328460010165 No H Rezvan حوری رضوان 9100319475328460010166 9100319475328460010166 No M.A Jalili محمدعلی جلیلی 9100319475328460010167 9100319475328460010167 No