fa تاثیر اینترون 1 ژن بتاگلوبین انسانی بر روی بیان موقت فاکتور 9 انعقادی فعال انسانی در رده‌ای از سلول‌های پستانداران بيولوژي Biology پژوهشي Research <p>  چکید ه </p><p> <strong><i> سابقه و هدف </i></strong></p><p> <strong> تاثیر حضور اینترون‌ها در افزایش بیان ژن‌ها در سلول‌های پستانداران نشان داده شده است. در این مطالعه کارایی اینترون 1 ژن بتاگلوبین انسانی بر بیان موقت </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 انسانی در رده سلولی تخمدان‌ هامستر چینی( </strong><strong>CHO </strong><strong>) تحت کنترل پروموتر سیتومگالوویروس نشان داده شد. </strong></p><p> <strong><i> مواد وروش‌ها </i></strong></p><p> <strong> مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. در این پژوهش اینترون 1 ژن بتاگلوبین انسانی بین اگزون‌های 1 و 2 </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 انسانی وارد شد. </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 واجد اینترون و </strong><strong>cDNA </strong><strong>طبیعی فاکتور 9 به صورت جداگانه، در پایین دست پروموتر سیتومگالو ویروس در دو پلاسمید بیانی </strong><strong>pcDNA3 </strong><strong>همسانه‌سازی شدند. پس از تایید ساختار مولکولی، سازه‌های نوترکیب ساخته شده برای ترانسفکشن سلول‌های </strong><strong>CHO </strong><strong>مورد استفاده قرار گرفتند. محیط کشت سلول‌های ترانسفکت شده به منظور آشکارسازی بیان پروتئین نوترکیب فاکتور 9 انسانی، جمع‌آوری و مورد آزمون یک مرحله‌ای انعقاد بر روی پلاسمای فاقد فاکتور 9 قرار گرفت. سپس به منظور تایید صحت بیان </strong><strong>cDNA </strong><strong>فاکتور 9 در سلول‌های نوترکیب، حضور آن با آزمون رونوشت‌برداری معکوس تایید شد. </strong></p><p> <strong><i> یافته‌ها </i></strong></p><p> <strong> مقایسه اولیه زمان‌های انعقاد به دست آمده از محیط‌های کشت سلول‌های ترانسفکت شده با هر دو پلاسمید نوترکیب در مقایسه با نمونه‌های کنترل منفی، بیانگر فاکتور 9 به میزان 16 تا 62 درصد توسط هر دو گروه سلول‌های دگرگون شده بود. هم چنین مقایسه نتایج حاصل از فعالیت انعقادی سلول‌های واجد سازه‌های نوترکیب، نشانگر افزایش فعالیت فاکتور 9 بیان شده به میزان 1 تا 28 درصد در محیط کشت سلول‌های دگرگون شده با سازه واجد اینترون نسبت به سلول‌های دگرگون شده با سازه فاقد اینترون بود. هم چنین آزمون رونوشت‌برداری معکوس، صحت فرآیند اسپلایسینگ و بیان فاکتور 9 از سلول‌های نوترکیب را تایید نمود. </strong></p><p> <strong><i> نتیجه گیری </i></strong></p><p> <strong> در این تحقیق تاثیر مثبت حضور اینترون 1 بتا گلوبین بر میزان بیان فاکتور 9 انسانی نشان داده شد. در عین حال با ساخت پلاسمیدهای بیان کننده فاکتور 9 انسانی، ابزار مناسبی برای بررسی پایداری سلول‌های ترانسفکت شده برای تولید فاکتور 9 در محیط انتخابی به صورت سیستماتیک فراهم شد. </strong></p><p> <strong><i> کلمات کلیدی </i>: فاکتور 9 ، بتاگلوبین‌ها، اینترون‌ها، سلول‌های CHO </strong></p> <p> <strong> Abstract </strong><strong></strong></p><p> <strong><i>Background and Objectives</i></strong></p><p> Several studies have shown the positive effects of introns on the expression of heterologous genes in mammalian hosts. In this study, transient expression increment of hFIX in the presence of intron-1 of human beta-glubin was studied.</p><p>  </p><p> <strong><i>Materials and Methods</i></strong></p><p> The intron-1 of human beta-glubin (hBG) was introduced into the human factor IX cDNA in donor/acceptor site between exons 1 and 2. The constructed hFIX mini-gene and a native hFIX were inserted separately in two expression vectors next to the CMV promoter. After verification, the two recombinant plasmids with and without intron were used to transfect Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. The cultured media taken from the tansfected cells were examined for coagulation activity with a single step clotting test performed on FIX-deficient plasma. Then, to confirm the expression of recombinant hFIX by transfected cells, RT-PCR test was conducted.</p><p>  </p><p> <strong><i>Results</i></strong></p><p> The preliminary data obtained from the expression analysis of the two groups of transfected cells in comparison with the cells with parental plasmid (as negative control) indicate of an increase of about 16 to 62% in coagulation activity of both groups of transfected cells. The same data show an enhanced hFIX coagulation activity of about 1 to 28% in the culture media taken from the cells with intron-containing hFIX-cDNA. Furthermore, RT-PCR confirmed correct splicing process and expression of hFIX from both transfected cells.</p><p>  </p><p> <strong><i>Conclusions</i></strong></p><p> The positive function of hBG intron 1 on the expression of hFIX in CHO cells was shown. Besides, the constructed plasmids have provided tools for analysis of the stability of the transfected cells for production of biologically active hFIX in a systematic approach. </p><p> <strong>�</strong></p><p> <strong><i>Key words</i></strong><strong><i> : </i></strong><strong></strong>Factor IX, beta- Globins, Introns, cho cells</p><p>  </p> فاکتور 9 , بتاگلوبین‌ها, اینترون‌ها, سلول‌های CHO Factor IX, beta- Globins, Introns, cho cells 209 223 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-34-2&slc_lang=fa&sid=1 A.A. Mashadrized علی‌اکبر مشهدریزه 9100319475328460010335 9100319475328460010335 No A. Zomorodipour علیرضا زمردی‌پور zomorodi@nigeb.ac.ir 9100319475328460010336 9100319475328460010336 Yes S.J. Hosseini سیدجواد حسینی 9100319475328460010337 9100319475328460010337 No F. Sabouni فرزانه صابونی 9100319475328460010338 9100319475328460010338 No