Journal of Iranian Blood Transfusion

fa کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی موش صحرایی: استفاده از پلاسمای تهیه شده از خون محیطی به عنوان مکمل محیط کشت Culture of rat mesenchymal stem cell using peripheral blood-derived plasma as the culture medium supplement سلولهاي بنيادي Stem cells پژوهشي Research چکیده سابقه و هدف در دستورالعمل‌های رایج جداسازی و تکثیر سلول بنیادی مزانشیمی، استفاده از سرم جنینی گاو(FBS) به عنوان مکمل محیط کشت، اجتناب ناپذیر است. این در حالی است که سرم جنینی گاو در انسان ایمونوژنیک بوده و به هنگام پیوند خطر انتقال عفونت را با خود به همراه دارد. لذا به دنبال یک جانشین مناسب برای سرم جنینی گاو، در مطالعه حاضر، تاثیر پلاسمای تهیه شده از خون محیطی بر رشد سلول‌های بنیادی مزانشیمی بررسی شده است. مواد وروش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. سلول‌های مغز استخوان تهیه شده از استخوان‌های دراز موش صحرایی، از کشت اولیه تا پاساژ سوم با استفاده از محیط کشت حاوی FBS و پلاسمای تهیه شده از خون محیطی موش صحرایی کشت شدند و حاصل هر مرحله از کشت که در اصل به ترتیب سلول‌های پاساژ اول تا چهارم محسوب می‌شوند، از لحاظ میزان دو برابر شدگی جمعیت سلولی، توان زیستی و تکثیر سلولی به ترتیب با روش‌های شمارش سلولی، آزمایش MTT و رسم منحنی رشد اندازه‌گیری شد. سلول‌های حاصل از کشت اولیه از لحاظ کلون‌زایی نیز بررسی شدند. هر مطالعه 10 بار تکرار شد و میانگین نتایج، مقایسه‌ آماری شد. در پایان سلول‌های پاساژ سوم از لحاظ پتانسیل تمایز به استخوان و چربی با روش رنگ‌آمیزی اختصاصی RT-PCR بررسی شدند.   یافته‌ها سلول‌های کشت شده در پلاسما از لحاظ مورفولوژی، تقریباًَ یک دست دوکی شکل بودند در حالی که در کشت سلول‌های گروه FBS ، تعدادی سلول غیر دوکی شفاف نیز مشاهده شد. در مجموع، از لحاظ دو برابر شدگی جمعیت سلولی و آزمایش MTT ،‌سلول‌های گروه FBS به طور معنی‌داری وضعیت بهتری داشتند ولی تفاوت‌ها در سلول‌های حاصل از پاساژ سوم از لحاظ آماری معنی‌دار نبود. در منحنی رشد، در طول دوره کشت، طول و شیب فازهای نمودار در دو گروه مشابه بود ولی گروه FBS ، رشد بیشتری از خود نشان داد. سلول‌های گروه پلاسما تعداد بیشتری کلون تولید کردند ولی اندازه این کلون‌ها در مقایسه با سلول‌های گروه FBS کمتر بود. سلول‌های هر دو گروه به راحتی به دودمان‌های آدیپوژنیک و استئوژنیک تمایز یافتند. زیرا سلول‌ها به ترتیب با اویل‌رد و آلیزارین رد رنگ‌ شدند و ژن‌های PPAR-gama ، PPAR-alpha و C/EBP-alpha برای چربی و استئوکلسین و استئوپونتین برای استخوان بیان شد.  نتیجه گیری روی هم رفته می‌توان گفت که پلاسما به عنوان جایگزین سرم گاو قادر است از تکثیر سلول بنیادی مزانشیمی حمایت کرده و توان زیستی آن را حفظ نماید، اگر چه این حمایت، در مقایسه با FBS تا حدودی کمتر است ولی در عوض جایگزین سالمی محسوب می‌شود. کلمات کلیدی: سلول‌های بنیادی مزانشیمی موش، پلاسما، تکثیر سلولی   Abstract Background and Objectives In current protocol for isolation and expansion of mesenchymal stem cells (MSCs), the use of fetal calf serum (FBS) as a medium supplement is inevitable. FBS is immunogenic for human subjects and may transfer infection in the case of transplantation. In the search for an appropriate substitute for FBS, in the present study the effect of plasma prepared from peripheral blood on the growth of MSCs has been examined.   Materials and Methods Marrow cells obtained from rat long bones were cultivated both in the mediums containing FBS and in those with plasma prepared from rat peripheral blood for the primary culture and the three consequent passages. The cells present in all four passages were evaluated at each culture stage for population doubling number, viability, and the rate of proliferation by cell count, MTT assay, and plotting growth curve, respectively. The cells from primary culture were also examined with respect to their clonogenic activity. All experiments were replicated 10 times and the average values for each group were statistically compared. Furthermore, passage 3 cells from each group were examined in terms of bone and adipogenic differentiation by specific staining as well as RT-PCR.   Results The cultures from plasma group appeared morphologically more homogenous than those from FBS group. In general, the cells from FBS groups had a better status in terms of total population doubling number and MTT test but these differences were not significant in passage 3. Moreover, growth curve plotted for each group indicated that the proliferation of cells in the plasma group is somewhat slower than those in FBS groups. The culture of plasma groups showed more colon cells compared to FBS groups but the colons in the latter appeared larger than the former. The cells from both groups were readily differentiated into osteoblastic and adipogenic cells lineages; this was confirmed by alizarin red and oil red staining, the bone expression of osteopontin and osteocalcin, and the expression of PPAR-alfa, PPAR-gamma, and C/EBP-alpha for adipose cells.   Conclusions Taken together, plasma as a substitute for FBS can support proliferation of MSCs and maintains their viability in vitro. Although this support was somehow less strong than FBS, plasma could still be considered a safe substitute for FBS.   سلول‌های بنیادی مزانشیمی موش, پلاسما, تکثیر سلولی Mesenchymal stem cells, Plasma, Cell proliferation, Fetal bovine serum, Differentiation 25 37 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1-167&slc_lang=fa&sid=1 M.R. Eslaminejad محمدرضا باغبان اسلامی نژاد bagesla@yahoo.com 9100319475328460019312 9100319475328460019312 Yes L. Rouhi لیلا روحی 9100319475328460019313 9100319475328460019313 No S.M. Arab Najafi سید محمود عرب نجفی 9100319475328460019314 9100319475328460019314 No H. Baharvand حسین بهاروند 9100319475328460019315 9100319475328460019315 No