Journal of Iranian Blood Transfusion

fa دستورالعمل کاربردی جداسازی و مشخصه یابی وزیکول‌های خارج سلولی کوچک از سلول‌های بنیادی مزانشیمی ژل وارتون بند ناف انسانی A Practical Protocol for the Isolation and Characterization of Small Extracellular Vesicles Derived from Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells سلولهاي بنيادي Stem cells پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده سابقه و هدف  امروزه درمان‌های مبتنی بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) و وزیکول‌های خارج سلولی کوچک (sEVs)  مشتق از آن‌ها به عنوان یک رویکرد درمانی نوین، توجه گسترده‌ای را در مطالعه‌های پیش‌ بالینی و کارآزمایی‌های بالینی به خود جلب کرده‌اند. ذرات sEV‌ ضمن دارا بودن اثرات درمانی مشابه با سلول‌های مادر از ایمنی بالایی برخوردارند. از این‌رو جایگزین مناسبی برای سلول‌ درمانی مستقیم محسوب می‌شوند. شناسایی منبع سلولی مناسب و توسعه روش‌های کارآمد جهت استخراج این وزیکول‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از ژل وارتون بند ناف انسانی به دلیل دسترسی آسان، قدرت تکثیر بالا و خواص ایمنی ‌تنظیمی مطلوب، به عنوان یکی از منابع ارزشمند در این زمینه مطرح هستند. هدف از این مطالعه، ارائه دستورالعمل کاربردی، آسان و مقرون ‌به‌ صرفه برای استخراج و مشخصه‌یابی اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های مزانشیمی ژل وارتون بند ناف انسانی است تا دقت و تکرارپذیری فرآیندهای آزمایشگاهی ارتقا یابد. مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، سلول‌های بنیادی مزانشیمی از دو نمونه مجزای بافت ژل وارتون بند ناف انسانی با روش Explant استخراج شدند. پس از تأیید فنوتیپ سلول‌ها از نظر بیان مارکرهای CD73، CD45، CD34، CD105 و پتانسیل تمایزی آن‌ها به سلول‌های چربی و استئوبلاست‌ها، جهت استخراج sEVs، در هر نوبت 15 میلی‌لیتر از سوپرناتانت سلولی حاصل از چند فلاسک کشت تحت شرایط یکسان جمع‌آوری و با استفاده از کیت تجاری استخراج sEVs فرآوری شد. خصوصیات مورفولوژیک sEV‌ ها با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و غلظت پروتئینی آن‌ها با آزمون برادفورد مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته‌ها نتایج فلوسیتومتری نشان داد که سلول‌های مشتق از سلول‌های مزانشیمی ژل وارتون بند ناف انسانی، بیان بالایی از مارکرهای CD73 (98.8٪) و CD105 (93.8٪)  داشته در حالی که بیان مارکرهای خونساز CD34 و CD45 کمتر از 2% بود. هم‌چنین، توان تمایز سلول‌ها به رده‌های استخوانی و چربی تأیید شد. تصاویرSEM ، حفظ تمامیت غشایی و مورفولوژی کروی ذرات sEV‌ را در محدوده ابعادی مورد انتظار (~60-40 نانومتر) نشان داد. غلظت پروتئینی وزیکول‌های خارج سلولی کوچک استخراج ‌شده بر اساس آزمون برادفورد برابر با 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر (3 =n) محاسبه گردید. نتیجه گیری             نتایج این مطالعه نشان داد که روش Explant به همراه استفاده از کیت‌های مبتنی بر سانتریفیوژ شیب چگالی، روشی ساده، مقرون‌ به ‌صرفه و کارآمد برای استخراج سلول‌های بنیادی مزانشیمی ژل وارتون و تولید ذرات وزیکول‌های خارج سلولی کوچک با کیفیت مناسب است و می‌تواند به عنوان یک راه‌کار عملی جهت تولید ذرات وزیکول‌های خارج سلولی کوچک مورد استفاده قرار گیرد.  </div> <div>A B S T R A C T Background and Objectives Mesenchymal stem cells (MSCs) and their derived small extracellular vesicles (sEVs)- based therapies have attracted considerable attention as novel therapeutic strategies in preclinical studies and clinical trials. sEVs exhibit therapeutic effects similar to their parental cells while offering higher safety, making them a promising alternative to direct cell transplantation. Consequently, identifying optimal cellular sources and developing efficient methods for sEV isolation are of critical importance. Human umbilical cord Wharton’s jelly–derived MSCs (WJ-MSCs), represent a valuable source for sEV production due to ease accessibility; high proliferative capacity, and potent immunomodulatory properties. This study aimed to established a practical, streaight forward, and cost-effective protocol for the isolation and characterization of WJ-MSC-derived exosomes to enhance precision and reproducibility of laboratory processes. Materials and Methods In this Experimental study, MSCs were isolated from two independent human umbilical cord Wharton’s jelly specimens using the explant method. Following phenotypic characterization via assessment of surface markers expression  (CD73, CD105, CD34 and CD45) and differentiation assays, sEVs were isolated from conditioned medium. Per batch, 15 mL of conditioned medium was collected from multiple culture flasks maintained under identical conditions, using a commercial kit. The morphological characteristics of the isolated sEVs were evaluated by scanning electron microscopy (SEM), and their protein concentration was determined using the Bradford assay. Results Flowcytometric analysis revealed high expression of MSC-associated markers CD73 (98.8%) and CD105 (93.8%), while hematopoietic markers CD34 and CD45 were expressed at levels below 2%. The osteogenic and adipogenic differentiation potentials of the cells were also confirmed. SEM images demonstrated preserved membrane integrity and spherical morphology of the isolated sEVs, with a size distribution falling within the expected range of approximately 40–60 nm. The protein concentration of the isolated sEVs was quantified at 500 µg/mL based on the Bradford assay (n = 3). Conclusions  These findings indicate that the explant method, in conjunction with density gradient centrifugation–based commercial kits, provides a simple, cost-effective, and efficient approach for the isolation of WJ-MSCs and production of high-quality sEVs, thereby providing a practical platform for future preclinical and translational applications.  </div> بند ناف, ژل وارتون , سلول‌های بنیادی مزانشیمی, اگزوزوم ها Umbilical cord, Wharton Jelly, Mesenchymal stem cell, Extracellular Vesicles 34 44 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1599-1&slc_lang=fa&sid=1 Milad Khabareh میلاد خباره 9100319475328460027419 9100319475328460027419 No مرکز تحقیقات فرآورده‌های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Mahsa Salehi مهسا صالحی 9100319475328460027420 9100319475328460027420 No استادیار مرکز تحقیقات فرآورده های بیولوژیک و سلامت خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Somaye Sadeghi سمیه صادقی somaieh.sadeghi@yahoo.com 9100319475328460027421 0009-0008-7289-0117 Yes استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ‌