Journal of Iranian Blood Transfusion

fa تولید رده سلولی K562 بیان کننده اندونوکلئاز Cas9 (CRISPR-associated9) Generation of K562 cell line expressing Cas9 endonuclease (CRISPR-associated9) بيوتكنولوژي Biotechnology پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده سابقه و هدف امروزه ژنوم رده‌های سلولی به منظور ایجاد مدل‌های بیماری و درمان آن‌ها ویرایش می‌شود. البته بزرگی ژن Cas9 موجب مشکلاتی از جمله پایین بودن کارآیی سیستم CRISPR شده است. برای حل این مشکل، رده‌های سلولی بیان‌کننده Cas9 تولید شده‌اند که در آن‌ها تنها باید بخش RNA راهنمای CRISPR به سلول ترانسفکت شود. مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، قطعه PGK-PURO/CMV (PPC) با PCR از وکتور pAAVS1-puro-DNR  تکثیر شده و در وکتور  pTG19-Tهمسانه‌سازی شد. سپس قطعه PPC از این وکتور با آنزیم‌های KpnI و EcoRI خارج شد. وکتور pCas-Guide-AAVS1 نیز تحت برش آنزیمی مشابه قرار گرفت و اتصال آن با قطعه PPC منجر به ساخت وکتور pPPC-Cas گردید. پس از بهینه کردن شرایط الکتروپوریشن، وکتور pPPC-Cas به درون سلول‌های K562 الکتروپوریت شد و سلول‌های مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند و میزان بیان Cas9 در آن‌ها با Real-time PCR بررسی شد. یافته‌ها با PCR قطعه‌ای به طول 2514 جفت باز تکثیر شد. وکتورpPPC-Cas  طی دو مرحله همسانه‌سازی ساخته شد. سلول‌های ترانسفکت شده مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند. انتخاب کلونی در ادامه انجام شد و سه کلونی که نسبت به هم بیان‌های بالا، متوسط و پایین داشتند، انتخاب شدند. نتیجه گیری در این مطالعه سلول‌های K562 بیان‌کننده Cas9 به دست آمدند که از آن‌ها می‌توان در مطالعه‌های آتی‌ژنومیک عملکردی و نیز تولید مدل‌های سلولی بیماری‌های انسانی استفاده کرد.  </div> <div dir="rtl" style="text-align: left;">Abstract Background and Objectives The genome of cell lines is nowadays edited to create disease models and treat them. Of course, the size of the cas9 gene has caused problems like the low efficiency of the CRISPR system. To solve this problem, Cas9 expressing cell lines have been generated in which CRISPR RNA should only be transfected to the cell.   Materials and Methods This article is experimental. PGK-PURO / CMV (PPC) fragment was amplified with PCR from pAAVS1-puro-DNR vector and cloned in pTG19-T vector. The PPC fragment from this vector was removed by KpnI and EcoRI enzymes. Also the pCas-Guide-AAVS1 vector was subjected to the same enzymatic cutting and its attachment to the PPC fragment resulted in the production of the pPPC-Cas vector. After optimizing the electroporation conditions, the pPPC-Cas vector was electroporated into K562 cells and puromycin -resistant cells were selected and Cas9 expression level was evaluated by Real-time PCR.   Results A PCR fragment of 2514 bp was amplified. The vector pPPC-Cas was cloned in two steps. puromycin -resistant transfected cells were selected. Clonal selection was carried out and three colonies with high, medium and low expression level of Cas9 were isolated.   Conclusions  The Cas9-expressing K562 cells derived in this study can be applied both for functional genomic researches and design cellular models of human diseases in future.    </div> کلمات کلیدی: رده سلولی, الکتروپوریشن, ویرایش ژنی Key words: Cell Line, Electroporation, Gene Editing 32 43 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1275-1&slc_lang=fa&sid=1 F. Ensari فائزه انصاری faezeh.ansari@yahoo.com 9100319475328460023850 9100319475328460023850 No مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون M. Nikougoftar مهین نیکوگفتار ظریف nikougoftar@gmail.com 9100319475328460023851 9100319475328460023851 No دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون A.A. Hamidieh امیرعلی حمیدیه aahamidieh@tums.ac.ir 9100319475328460023852 9100319475328460023852 No مرکز طبی کودکان ـ دانشگاه علوم پزشکی تهران M. Shamsara مهدی شمس آرا shamsa@nigeb.ac.ir 9100319475328460023853 9100319475328460023853 Yes استادیار پژوهشکده زیست فناوری کشاورزی ـ پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری