Journal of Iranian Blood Transfusion

fa همسانه‌سازی و بیان ژن نوترکیب CD40Lانسانی در رده سلولی HEK293 Cloning and Expression of Recombinant Human CD40L in HEK293 Cell line بيوتكنولوژي Biotechnology پژوهشي Research چکیده سابقه و هدف CD40L ، پروتئینی غشایی و یکی از اعضای خانواده TNF است که نقش مهمی در انتقال پیام سلولی در ایمنی ذاتی و تطبیقی دارد. از آن جایی‌که این پروتئین نقش خود را از طریق تجمع گیرنده در سطح سلول هدف ایفا می‌کند، به ‌نظر می‌رسد فرم مالتی‌‌مری آن بتواند اثر قوی‌تری نسبت به فرم طبیعی ترایمری ایجاد کند. بر ‌این اساس در این مطالعه کلونینگ و بیان فرم کایمری و دودکامری CD40L محلول، از طریق پروتئین خود مالتی‌مر شونده سورفاکتانت پروتئین  (SP-D) D، در رده سلولی HEK293 مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. پروتئین SPD-CD40L به ‌صورت in silico طراحی و در پلاسمید pcDNA3.1(+) همسانه‌سازی شد. سلول‌های HEK293 به عنوان میزبان بیانی مورد استفاده قرار گرفته و ترانسفکت شدند. بیان CD40L نوترکیب در سطح RNA به وسیله RT-PCR بررسی شد. پس‌ از تخلیص پروتئین نوترکیب با روش کروماتوگرافی تمایلی، وزن مولکولی آن توسط SDS-PAGE تعیین گردید. به ‌منظور بررسی اختصاصیت پروتئین نیز از روش‌های ELISA وDot Blot  استفاده شد. یافته‌ها نتایج به دست آمده نشان‌دهنده ترانسفکشن سلول‌های HEK293 و بیان پروتئین نوترکیب پس از 24 و 48 ساعت از زمان ترانسفکشن بود. هم چنین نتایج حاصل از روش ELISA و Dot Blot بیانگر اختصاصیت پروتئین کایمری SPD-CD40L بود.  نتیجه گیری پروتئین کایمری SPD-CD40L از طریق وکتور بیانی pcDNA3.1(+) در رده سلولی یوکاریوتی HEK293 بهطور موفقیتآمیز بیان شد و وزن مولکولی پروتئین 4-ترایمری(دودکامری) با مقدار مورد انتظار تطابق داشت.   Abstract Background and Objectives CD40L is a membrane protein and a member of the tumor necrosis factor super family (TNFSF) that plays an important role in transferring cell signaling in innate and adaptive immunity. Since this protein plays its role through clustering the receptors on the target cell surface, it seems that the multimeric form of this molecule can have a stronger effect than the natural trimeric form. So in this study we describe cloning and expression of dodecameric soluble CD40L through self multimerizing protein, surfactant protein D (SP-D), in the HEK293 cell line.   Materials and Methods In this experimental study, the SPD-CD40L was designed in silico and cloned in pcDNA3.1(+) plasmid. HEK293 cells were transfected and used as the expression host cells. The expression of SPD-CD40L was determined at the RNA level by RT-PCR method. After the purification of the recombinant proteins by affinity chromatography, the molecular weight of the recombinant protein was determined by SDS-PAGE. To evaluate the specificity of protein, ELISA and Dot Blot were used.   Results The results indicated that HEK293 cells were transfected and recombinant protein was expressed 24 and 48 hours after Transfection. Moreover, the results of ELISA and Dot Blot methods represented the specificity of recombinant SPD-CD40L chimeric protein.   Conclusions  Chimeric protein SPD-CD40L was expressed successfully by pcDNA3.1(+) in eukaryotic HEK293 cell line and the molecular weight of 4-trimeric (dodecameric) protein was shown to be consistent with the expected amount.     کلمات کلیدی: CD40 لیگاند, رده سلولی HEK 293 , ترانسفکشن Key words: CD40 Ligand, HEK293 Cells, Transfection 227 236 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1158-1&slc_lang=fa&sid=1 F. Shokoohian بهاره شکوهیان 9100319475328460018630 9100319475328460018630 No مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون Z. Sharifi زهره شریفی 9100319475328460018631 9100319475328460018631 No مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون M. Mohammadi Pour مهشید محمدی پور 9100319475328460018632 9100319475328460018632 No مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون F. Yari فاطمه یاری f.yari@ibto.ir 9100319475328460018633 9100319475328460018633 Yes دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون