fa جداسازی، همسانه‌سازی و بیان فاکتور سلول بنیادی با استفاده از سیستم بیانی پروکاریوتی بيوتكنولوژي Biotechnology پژوهشي Research <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;">چکیده</p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong><em>سابقه و هدف </em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong>فاکتور سلول بنیادی</strong><strong><span dir="LTR">(SCF)</span></strong><strong>، یک گلیکوپروتئین 28 تا 40 کیلودالتونی است که نقش مهمی را در تکثیر و تمایز سلول&shy;های بنیادی خونساز(</strong><strong><span dir="LTR">HSCs</span></strong><strong>) بازی می&shy;کند. هدف این مطالعه&shy; جداسازی، کلونینگ و بیان </strong><strong><span dir="LTR">SCF</span></strong><strong> در میزبان بیانی</strong><strong><span dir="LTR">Rosetta </span></strong><strong>&nbsp;بود. </strong><strong><span dir="LTR">Rosetta</span></strong><strong> علاوه بر ویژگی&shy;های میزبان بیانی پروکاریوتی، انتظار می‌رفت با فراهم کردن کدون&shy;های نادر پروتئین&shy;های یوکاریوتی، سطح بیان پروتئین نوترکیب را افزایش دهد.</strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong><em>مواد و روش‌ها</em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.85pt;"><strong>مطالعه انجام از نوع تجربی بود. </strong><strong><span dir="LTR">RNA</span></strong><strong> تام از سلول‌های </strong><strong><span dir="LTR">Hela</span></strong><strong> استخراج و به دنبال آن </strong><strong><span dir="LTR">cDNA</span></strong><strong> ساخته شد. توالی رمزکننده&shy; </strong><strong><span dir="LTR">SCF</span></strong><strong> ، به وسیله آغازگرهای اختصاصی جداسازی و تکثیر شد و با استفاده از وکتور بیانی </strong><strong><span dir="LTR">pET-32a</span></strong><strong> در </strong><strong><em><span dir="LTR">E.coli</span></em></strong><strong><span dir="LTR"> TOP 10</span></strong><strong> همسانه‌سازی شد. سازه نوترکیب به وسیله </strong><strong><span dir="LTR">PCR</span></strong><strong> ، هضم آنزیمی و تعیین توالی تایید ‌شد. وکتور نوترکیب در میزبان بیانی </strong><strong><span dir="LTR">Rosetta</span></strong><strong> تراریخت ‌شد. بیان </strong><strong><span dir="LTR">&nbsp;SCF</span></strong><strong> نوترکیب در حضور </strong><strong><span dir="LTR">IPTG</span></strong><strong> القا شد. بیان فاکتور سلول بنیادی انسانی(</strong><strong><span dir="LTR">hSCF</span></strong><strong>) با </strong><strong><span dir="LTR">SDS-PAGE</span></strong><strong> و وسترن بلات ارزیابی و تایید شد. </strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong><em>یافته‌ها</em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.85pt;"><strong>توالی رمزکننده </strong><strong><span dir="LTR">SCF</span></strong><strong> با موفقیت از سلول‌های </strong><strong><span dir="LTR">Hela</span></strong><strong> جداسازی و در وکتور بیانی </strong><strong><span dir="LTR">pET-32a</span></strong><strong> همسانه‌سازی و بیان پروتئین نوترکیب در میزبان بیانی </strong><strong><span dir="LTR">Rosetta</span></strong><strong> انجام شد.</strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong><em>نتیجه‌گیری</em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.85pt;"><strong>در سیستم بیانی </strong><strong><span dir="LTR">Rosetta</span></strong><strong> ، امکان تولید پروتئین‌های یوکاریوتی با کدون‌های نادر مثل </strong><strong><span dir="LTR">AGG</span></strong><strong> ، </strong><strong><span dir="LTR">AGA</span></strong><strong> ، </strong><strong><span dir="LTR">AUA</span></strong><strong> ، </strong><strong><span dir="LTR">CUA</span></strong><strong> ، </strong><strong><span dir="LTR">CCC</span></strong><strong> و </strong><strong><span dir="LTR">GGA</span></strong><strong> وجود دارد بنابراین به میزان بالایی پروتئین فاکتور سلول بنیادی تولید می‌شود.</strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong>Abstract</strong></p> <p style="margin-left:35.1pt;"><strong><em>Background and Objectives</em></strong></p> <p style="margin-left:34.85pt;">Stem cell factor (SCF) is a 28-40 kDa glycoprotein which plays an important role for the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells (HSCs). SCF binds to the C-kit receptor, and improves the survival of HSCs in vitro. SCF is one of the essential supplements for cultivation of HSCs in vitro. It plays a vital role to increase the number and size of HSC colonies.</p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong><em>Materials and Methods</em></strong></p> <table border="0" cellpadding="0" style="width:96.2%;" width="96%"> <tbody> <tr> <td style="width:99.32%;height:108px;"> <p style="margin-left:34.85pt;">In this experimental study, glycosylation of SCF does not seem to influence its biological activity; therefore, it would be possible to produce it in prokaryotic expression system. The aim of this study was isolation, cloning and expression of SCF in the Rosetta expression host<span dir="RTL">.</span> In addition to the features of prokaryotic expression system, Rosetta was expected to provide rare codons of eukaryotic proteins and increase the recombinant protein expression level.</p> </td> </tr> </tbody> </table> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong><em>Results</em></strong></p> <p style="margin-left:34.85pt;">The SCF coding sequence was isolated and amplified using the specific primers and cloned in E.coli TOP10 using pET-32a expression vector. The recombinant construct was confirmed by PCR, digestion and sequencing. The recombinant vector was transformed to the expression host, Rosetta.</p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong><em>Conclusions</em></strong></p> <p style="margin-left:34.85pt;">The SCF coding sequence was successfully isolated and cloned into the expression vector pET-32a, followed by recombinant protein expression in Rosetta host strain<span dir="RTL">.</span></p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p><p style="margin-left:34.85pt;"></p> کلمات کلیدی: گلیکوزیلاسیون, سلول بنیادی, PCR Key words: Glycosylation, Stem cell, PCR 53 64 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-1093-1&slc_lang=fa&sid=1 M. Nayebhashemi مهسا نایب هاشمی mnayebhashemi@gmail.com 9100319475328460018526 9100319475328460018526 No High institute for research and Education in Transfusion Medicine موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون M. Mohammadi pour مهشید محمدی پور m.mohammadipour@ibto.ir 9100319475328460018527 9100319475328460018527 No High institute for research and Education in Transfusion Medicine موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون H. Fahimii حسین فهیمی h.fahimi@modares.ac.ir 9100319475328460018528 9100319475328460018528 No Pharmaceutical Sciences Branch of Islamic Azad University (IAUPS) استادیار گروه علوم سلولی و مولکولی ـ دانشکده علوم و فناوری‌های نوین ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم دارویی M. Habibi Roudkenar مهریار حبیبی رودکنار m.habibiroudkenar@ibto.ir 9100319475328460018529 9100319475328460018529 No High institute for research and Education in Transfusion Medicine مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی ـ دانشکده پزشکی دانشگاه گیلان Mohammad Ali Jalili محمدعلی جلیلی m.jalili@ibto.ir 9100319475328460018530 9100319475328460018530 Yes High institute for research and Education in Transfusion Medicine استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون