fa کارآیی ترشح و گاماکربوکسیلاسیون فاکتور IX نوترکیب انسانی در سلول‌های پایدار دروزوفیلا ژنتيك Genetis پژوهشي Research <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;">چکیده</p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong><em>سابقه و هدف </em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong>فاکتور </strong><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> طی بلوغ خود در کبد، نیازمند کربوکسیلاسیون اسیدآمینه‌های گلوتامیک در ناحیه گلا می‌باشد که در ترشح و فعالیت آن نقش دارد. با توجه به ناکارآمدی سیستم بیانی پستانداران در ترشح و گاماکربوکسیلاسیون کامل فاکتورهای انعقادی نوترکیب و فعالیت بالاتر آنزیم گاماکربوکسیلاز در سامانه دروزوفیلا (</strong><strong><span dir="LTR">S2</span></strong><strong>)، مطالعه حاضر با هدف بررسی قابلیت این سامانه در گاماکربوکسیلاسیون و لذا ترشح و فعالیت فاکتور </strong><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> انجام شد.&nbsp;&nbsp; </strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.85pt;"><strong><em>مواد و روش‌ها</em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong>در این پژوهش تجربی، به دنبال تراآلایی سلول‌های </strong><strong><span dir="LTR">S2</span></strong><strong> با وکتور </strong><strong><span dir="LTR">pMT-hFIX</span></strong><strong>، برای ارزیابی کمی بیان و فعالیت فاکتور </strong><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> از روش الایزا و</strong><strong><span dir="LTR"> aPTT </span></strong><strong>و برای بررسی گاماکربوکسیلاسیون فاکتور </strong><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> از روش رسوب‌دهی پروتئین‌های محیط کشت به وسیله باریوم سیترات استفاده شد. نمونه‌ها در سه روز متوالی و با سه تکرار و توسط آزمون‌های واریانت آنوا و دانکن در سطح 5% بررسی شدند. </strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong><em>یافته‌ها</em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong>نتایج آزمون انعقاد، ترشح فاکتور </strong><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> فعال توسط سلول‌های </strong><strong><span dir="LTR">S2</span></strong><strong> پایدار را نشان داد. هم چنین ارزیابی کمی فاکتور </strong><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> در محیط کشت و لیز سلولی با الایزا، کارآیی</strong><strong> 94 درصدی ترشح را نشان داد. نتایج الایزا نیز در ارزیابی کمی فاکتور</strong><strong><span dir="LTR"> IX </span></strong><strong>رسوب داده شده با باریوم سیترات نشان داد که حدود 45% از فاکتور</strong><strong><span dir="LTR"> IX </span></strong><strong>&nbsp;مترشحه از سلول‌های</strong> <strong><span dir="LTR">S2</span></strong><strong>، کاملاً کربوکسیله‌اند.&nbsp; </strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><strong><em>نتیجه گیری</em></strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.25pt;"><a name="OLE_LINK9"></a><a name="OLE_LINK8"><strong>فعالیت فاکتور </strong></a><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> و رسوب آن توسط باریوم سیترات موید قابلیت سلول‌های </strong><strong><span dir="LTR">S2</span></strong><strong> برخلاف سایر سلول‌های‌ حشرات در گاماکربوکسیلاسیون فاکتور </strong><strong><span dir="LTR">IX</span></strong><strong> است. نتایج تحقیق، شواهد متقاعد کننده‌ای را فراهم می‌کند که گاما‌کربوکسیلاز دروزوفیلا، گاماکربوکسیلاسیون لازم که برای ترشح و فعالیت انعقادی فاکتور</strong><strong><span dir="LTR"> IX </span></strong><strong>لازم است را انجام می‌دهد.</strong></p> <p dir="RTL" style="margin-right:36.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong>Abstract</strong></p> <p style="margin-left:35.1pt;"><strong><em>Background and Objectives</em></strong></p> <p style="margin-left:34.85pt;">Human factor IX (hFIX) during maturation in the liver requires carboxylation of glutamic amino acids in the Gla domain, which is involved in its secretion and activity. Due to the deficiency of mammalian expression systems in the secretion and fully <a name="OLE_LINK7"></a><a name="OLE_LINK6">&gamma;_carboxylation </a>of recombinant coagulation factors and higher activity of &gamma;_carboxylase enzyme in Drosophila S2system, the present study was performed to evaluate ability of this system in &gamma;_carboxylation, secretion and activity of recombinant hFIX.&nbsp;</p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong><em>Materials and Methods</em></strong></p> <p style="margin-left:34.85pt;">In this study, following transfection of S2 cells with pMT-hFIX vector, the ELISA and aPTT tests were used to evaluate the expression and activity of recombinant hFIX. In <a name="OLE_LINK13"></a><a name="OLE_LINK12">addition, &gamma;_carboxylation</a> of factor IX was approved by barium citrate precipitation. The samples were analyzed on three consecutive days and being repeated three times.</p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong><em>Results</em></strong></p> <p style="margin-left:34.85pt;">The coagulation results showed the secretion of active recombinant hFIX by stable S2 cells. Quantitative assessment of recombinant hFIX in medium and cell lysis with ELISA showed 94% secretion efficiency. The results of ELISA on precipitated FIX with barium citrate also indicated that about 45% of secreted recombinant hFIX from S2 cells are fully carboxylated.&nbsp;&nbsp;</p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"><strong><em>Conclusions</em></strong></p> <p style="margin-left:34.85pt;">Activity and barium citrate precipitation of recombinant hFIX confirmed the ability of S2 cells, unlike other insect cells, in the &gamma;_carboxylation of factor IX. So, our results provide convincing evidence that Drosophila &gamma;_carboxylase perform necessary &gamma;_carboxylation required<a name="_GoBack"></a> for secretion and coagulation activity of recombinant hFIX.</p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p> <p style="margin-left:34.85pt;"></p> کلمات کلیدی: فاکتور IX انعقادی, هموفیلی B , گاما گلوتامیک کربوکسیلار, پپتیدگلا Key words: Coagulation factor IX, Hemophilia B, gamma-glutamyl carboxylase, GALA peptide 233 242 http://bloodjournal.ir/browse.php?a_code=A-10-996-1&slc_lang=fa&sid=1 S. Khalilzadeh سمیرا خلیل زاده 9100319475328460014324 9100319475328460014324 No سبزوار ـ ایران J. Vatandoost جعفر وطن دوست j.vatan@hsu.ac.ir 9100319475328460014325 9100319475328460014325 Yes سبزوار ـ ایران