فصلنامه پژوهشی خون

---

جداسازی، کلونینگ و بیان ژن فاکتور VII انعقادی نوترکیب انسانی در رده سلولی CHO راحله حلبیان۱، ناصر شاگردی اسماعیلی۲، آرزو اوودی۲، ناصر مسروری۳، دکتر ناصر امیری‌زاده۴، دکتر کامران موسوی حسینی۵، دکتر احمد قره‌باغیان۶، دکتر حوری رضوان۷، دکتر محمد علی جلیلی۸، دکتر مهریار حبیبی رودکنار۹ چکیده سابقه و هدف فاکتور VII ، یک گلیکوپروتئین پلاسمایی است که در آبشار انعقادی تشکیل فیبرین، شرکت دارد. فاکتور VII در مسیر انعقادی نقش مهمی داشته و آغازگر مسیر خارجی انعقاد است. هدف اساسی این مطالعه جداسازی و کلونینگ فاکتور VII نوترکیب انسانی و بیان آن در رده سلولی یوکاریوتی CHO جهت بیان فاکتور VII نوترکیب(FVII) بود. مواد وروش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. ابتدا cDNA ژن فاکتور VII از رده سلولی کبد انسان(HepG۲) جدا شده و در وکتور(+) ۱/۳ pcDNA کلون شده سپس وکتور نوترکیب به داخل سلول‌های CHO ترانسفکت شد. در نهایت، یک کلون سلولی که به طور پیوسته فاکتور VII را بیان می‌کند تثبیت شد. بیان فاکتور VII نوترکیب توسط روش‌های RT-PCR ، الایزا، SDS-PAGE و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. هم چنین تایید فعالیت بیولوژیکی فاکتور VII نوترکیب توسط آزمایش PT و ایجاد لخته در پلاسمای فاقد فاکتور VII صورت گرفت. یافته‌ها نتایج به دست آمده نشان‌دهنده کلونینگ و بیان موفقیت‌آمیز ژن فاکتور VII بود. پس از ۳ هفته کشت سلول‌های CHO در حضور جنتیسین، کلون سلول‌های پایدار به دست آمد. نتایج آزمایش‌های RT-PCR ، الایزا، SDS-PAGE و وسترن بلات حاصل از کلون‌ها، نشان‌دهنده بیان این پروتئین در رده سلولی CHO بود. کاهش ۳ الی ۴ برابری در زمان انعقاد نشان‌دهنده وجود فعالیت بیولوژیکی فاکتور VII نوترکیب بیان شده بود. نتیجه گیری سالانه حدود ۴۰۰۰ الی ۶۰۰۰ ویال(۳۳۶۰۰ تا ۵۰۴۰۰ میلی گرم) از این فرآورده وارد کشور می‌شود که دولت را متحمل هزینه بسیار بالایی می‌کند. بنابراین تولید فاکتور VII نوترکیب با استفاده از فناوری DNA نوترکیب در سطح آزمایشگاهی، می‌تواند اولین گام در راه فایق آمدن بر مشکلات فوق باشد.

---

  چکید ه

  سابقه و هدف

  امروزه استفاده از فاکتورهای رشد به صورت ژل پلاکتی، در ترمیم هر چه سریع‌تر زخم‌ها، رو به افزایش می‌باشد. هدف از مطالعه بررسی امکان استفاده از پلاکت‌های کهنه به عنوان منبع اصلی برای تهیه ژل پلاکتی و هم چنین جایگزین مکمل‌هایی مثل FCS و FBS در محیط کشت بود.

  مواد و روش‌ها

  در یک مطالعه تجربی پلاکت اهداکنندگان پس از خونگیری توسط سانتریفوژ جداسازی شد. به منظور اثبات این فرضیه که ژل پلاکتی و عوامل رشد حاصل از آن در پلاکت‌های تاریخ گذشته توانایی تکثیر سلول‌های مختلف را دارا هستند، از پلاسمای تازه غنی از پلاکت و پلاکت‌های تاریخ گذشته با روش‌های مختلف، عوامل رشد پلاکتی تهیه و میزان فاکتورهای رشد و رشد سلول‌ها در محیط کشت توسط روش الایزا و MTT اندازه‌گیری شد.

  یافته‌ها

  نتایج نشان داد که پلاکت‌های کهنه با کیفیتی مشابه با پلاکت‌های تازه می‌توانند در تهیه ژل پلاکتی مورد استفاده قرار گیرند، هم چنین میزان فاکتورهای رشد آزاد شده از پلاکت‌های تازه و کهنه در روش تهیه ژل پلاکتی از تمام روش‌های مورد استفاده در تحقیق بیشتر و اثر پرولیفراتیو عوامل رشد حاصل از آن‌ها نیز روی کشت سلولی یکسان می‌باشد.

  نتیجه گیری

  این مطالعه نشان داد میزان غلظت فاکتورهای رشد آزاد شده از پلاکت‌های کهنه با مقادیر حاصل از پلاکت‌های تازه یکسان و اثرات فاکتورهای رشد حاصل از هر دو گروه بر میزان رشد سلولی به یک اندازه است. این امر نویدبخش استفاده از پلاکت‌های کهنه در راستای کاربردهای نوین می‌باشد.

  کلمات کلیدی : پلاسمای غنی از پلاکت، عوامل رشد مشتق از پلاکت ، رده سلولی

 

---

  چکید ه

  سابقه و هدف

  مهم‌ترین مساله در پیوند سلول‌های بنیادی مزانشیمی( MSC )، بقای پایین پس از پیوند می‌باشد. دست‌ورزی ژنتیکی آن‌ها، یک استراتژی در جهت حفاظت سلولی علیه آسیب‌های محیطی است. حفظ خاصیت تمایزی این سلول‌ها پس از دست‌کاری، مهم می‌باشد. در این مطالعه توانایی تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از دست‌ورزی با NRF۲ بررسی شد.

  مواد و روش‌ها

  در یک مطالعه تجربی، سلول‌های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان جداسازی شد. ژن NRF۲ با روش TOPOcloning به وکتور pENTR وارد شد. با استفاده از تکنولوژی gateway ، ژن NRF۲ ، به وکتور pAd/CMV/V۵-DEST انتقال یافت. آدنوویروس نوترکیب در سلول‌های AD۲۹۳ تولید، سلول‌های بنیادی مزانشیمی به آن‌ها آلوده و بیان NRF۲ توسط RT-PCR تایید شد. پس از مواجهه سلول‌های بنیادی مزانشیمی دست‌ورزی شده با NRF۲ با شرایط استرسی، میزان بقا و آپوپتوز سلولی آن‌ها ارزیابی و تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی بیان کننده NRF۲ به رده استخوان و چربی بررسی شد.

  یافته‌ها

  ژن NRF۲ به طور موفقیت‌آمیزی در سلول‌های بنیادی مزانشیمی بیان شد. تمایز NRF۲-MSC ها به رده‌های استخوانی و چربی، نشان می‌دهد افزایش بیان NRF۲ ، خصوصیت تمایزی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را تغییر نمی‌دهد.

  نتیجه گیری

  بیان NRF۲ ، فاکتور به خوبی شناخته شده حفاظت سلولی، با استفاده از سیستم بیانی آدنو ویروس، با ظرفیت تمایزی آن‌ها تداخل نمی‌کند. NRF۲-MSC ها ممکن است در آینده جهت استفاده در سلول درمانی بر اساس سلول بنیادی قابل استفاده باشند.

 

---

  چکید ه

  سابقه و هدف

  آلودگی باکتریایی فرآورده­­های خونی، خطر عفونی عمده پایدار در طب انتقال خون نوین است. این مشکل به ویژه در مورد فرآورده­های پلاکتی که شرایط مطلوب برای رشد باکتری­ها را فراهم می­سازند، نگران‌کننده است. لیپوکالین- ۲، یک پروتئین احتباس‌کننده آهن در پاسخ ایمنی ذاتی است که به سیدروفور باکتری­ها متصل شده و از جذب آهن توسط آن­ها جلوگیری می­کند. این مطالعه برای نشان دادن اثرات آنتی­باکتریایی لیپوکالین- ۲ به عنوان یک عامل باکتریواستاتیک در جلوگیری از آلودگی باکتریایی پلاکت­ها طراحی شده است.

  مواد و روش‌ها

  در یک مطالعه تجربی، ابتدا حداقل غلظت مهارکننده لیپوکالین- ۲ نوترکیب بعد از ۲۴ ساعت انکوباسیون در دمای اتاق( º C ۲ ± ۲۲) تعیین شد. سپس اثر آنتی­باکتریایی لیپوکالین- ۲ در محیط پلاکتی هم‌زمان با تلقیح باکتری­های آلوده کننده پلاکتی و نگهداری در دمای اتاق( º C ۲ ± ۲۲) بررسی شد.

  یافته‌ها

  نتایج حاصل از کشت فرآورده پلاکتی حاوی لیپوکالین-۲ و رقت­های مختلف باکتری­ها نشان داد که لیپوکالین-۲ در غلظت ng/mL ۴۰ توانست باعث مهار رشد mL / CFU ۱۰^۴ × ۵/۱ استافیلوکوک اپیدرمیدیس، سودوموناس آئروژینوزا، اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه و انتروکوکوس فکالیس شود. هم چنین لیپوکالین-۲ در همین غلظت توانست باعث مهار رشد CFU/mL ۱۰^۳×۵/۱ استافیلوکوک اورئوس و پروتئوس میرابیلیس گردد.

  نتیجه گیری

  لیپوکالین-۲ نوترکیب بر روی طیف وسیعی از باکتری­های آلوده کننده پلاکتی اثر مهاری دارد و در صورت استفاده در فرآورده­های پلاکتی، می­تواند آلودگی باکتریایی این فرآورده و عوارض عفونی ناشی از انتقال پلاکت آلوده را در گیرنده کاهش دهد. ولی برای استفاده از آن، مطالعه‌های بیشتر و تکمیلی مورد نیاز است.

 

---

 

  چکید ه

  سابقه و هدف

  HO-۱ (هِم‌اکسیژناز-۱) یکی از عوامل قدرتمند محافظت کننده سلولی می‌باشد. هدف از این مطالعه، کلونینگ و بیان موقت ژن HO-۱ انسانی در سلول‌های بنیادی مزانشیمال( MSC ها) با استفاده از سیستم بیانی آدنوویروسی برمبنای تکنولوژی Gateway بود.

  مواد و روش‌ها

  در یک مطالعه تجربی، به منظور القای HO-۱ ، رده سلولی ۵۴۹ A به مدت ۱ ساعت با اشعه UV مواجه گردید. cDNA توتال HO-۱ جداسازی شد و از طریق واکنش کلونینگ TOPO به وکتور pENTR TOPO/D کلون گردید. برای ایجاد کلون بیانی، واکنش نوترکیبی LR بین کلون اولیه و وکتور مقصد( pAd/CMV/V۵-DEST ) به انجام رسید. ویروس نوترکیب در رده سلولی یوکاریوتی مناسب تشکیل شد. MSC ها به وسیله ویروس نوترکیب بیان‌کننده HO-۱ آلوده‌سازی شدند.

  یافته‌ها

  نتایج نشان داد که HO-۱ انسانی نوترکیب با موفقیت کلون شده و صحت و قرار گرفتن ژن در قالب صحیح درون وکتور به وسیله تعیین توالی DNA تایید شد. بیان HO-۱ در MSC ها به وسیله آنالیز RT-PCR و وسترن بلات تایید گردید. این نتایج حاکی از این بود که بیان HO-۱ موقت است.

  نتیجه گیری

  بیان موقت ژن HO-۱ انسانی در MSC ها با استفاده از سیستم بیانی آدنوویروسی، ممکن است یک استراتژی انتقال ژنی کارآمد در راستای ارتقای سلول درمانی فراهم نماید.

  

---

 

  چکید ه

  سابقه و هدف

  بررسی‌ها نشان داده که سلول‌های بنیادی مزانشیمال (MSC) در مدت زمان کوتاهی پس از پیوند می‌میرند، که به دلیل شرایط نامطلوب ریز محیط پیوندی در اثر افزایش عوامل استرسی، به ویژه استرس‌های اکسیداتیو، هایپوکسی و فقر غذایی می‌باشد. به دلیل اهمیت موضوع، در این مطالعه اثر اتوفاژی بر بقای سلول‌های بنیادی مزانشیمال پس از مواجهه با استرس اکسیداتیو(_۲ O _۲ H ) بررسی شد.

  مواد و روش‌ها

  در یک مطالعه تجربی، سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان MSCs) ) با استفاده از فایکول جداسازی و پاساژ سلولی چهارم انتخاب شد. وجود اتوفاژی از طریق شناسایی LC۳ (از اجزای اصلی اتوفاگوزوم) با ترانسفکشن وکتور حاوی GFP-LC۳ به MSCs بررسی گردید. راپامایسین جهت القای اتوفاژی و تری متیل آدنین( MA ۳) جهت مهار اتوفاژی به محیط کشت MSCs افزوده شدند. پس از طی دوره انکوباسیون، MSCs با غلظت‌های کشنده از _۲ O _۲ H مواجه و میزان بقای این سلول‌ها با روش MTT Assay ارزیابی شد.

  یافته‌ها

  نتایج نشان داد که القای اتوفاژی در MSCs موجب افزایش حساسیت در برابر استرس‌های اکسیداتیو و مهار اتوفاژی باعث افزایش مقاومت MSCs نسبت به استرس‌های اکسیداتیو و افزایش میزان بقای MSCs در مقایسه با سلول‌های کنترل شد.

  نتیجه گیری

  در این مطالعه نشان داده شد که مهار اتوفاژی در MSCs می‌تواند به میزان قابل توجهی بقای سلولی را در برابر استرس‌های اکسیداتیو بهبود بخشد. در نتیجه استفاده از مهارکننده‌های اتوفاژی از قبیل MA ۳ در پیوند MSCs ممکن است در آینده‌ای نزدیک، یک راه‌کار برای افزایش کارآمدی سلول درمانی را فراهم کند.

 

---

  چکید ه

  سابقه و هدف

  مطالعه‌ها بر روی سلول‌های مزانشیمال پیوندی نشان داده‌اند که شرایط نامساعد محیط بافت از جمله حضور رادیکال‌های آزاد اکسیژن و سایتوکاین‌های التهابی، قسمت اعظم آن‌ها را در روزهای ابتدایی پس از پیوند از بین می­برد. به منظور رفع این مشکل، در این مطالعه اثر پیش‌شرطی کردن سلول‌های مزانشیمال با H_۲O_۲ به منظور افزایش مقاومت آن‌ها در برابر شرایط اکسیداتیو کشنده بررسی شد.

  مواد و روش‌ها

  در یک مطالعه تجربی، سلول بنیادی مزانشیمی مغز استخوان با استفاده از فایکول جداسازی و پاساژ چهارم انتخاب شد. سلول‌های پاساژ چهارم با غلظت‌های مختلف H_۲O_۲ طی زمان‌های متفاوت، مجاور و انکوبه شدند. سپس سلول‌ها ریکاور شده و در شرایط معمول کشت سلول قرار گرفتند. در نهایت سلول‌های پیش شرطی شده تحت شرایط کشنده قرارگرفتند. پس از انجام این مراحل، میزان سلول‌های زنده با استفاده از رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو و روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. پس از انجام مراحل پیش شرطی و القای آپوپتوز، به منظور بررسی تاثیر پیش‌شرطی ‌کردن در قابلیت تمایز سلول‌های بنیادی و بنیادی بودن آن‌ها، سلول‌های پیش شرطی شده، به رده سلولی استئوسیت تمایز داده شدند.

  یافته‌ها

  نتایج نشان دادند که پیش شرطی کردن سلول‌های مزانشیمی با H_۲O_۲ موجب افزایش بقا و مقاومت آن ‌ ها در برابر استرس‌های اکسیداتیو کشنده در مقایسه با سلول‌های کنترل پیش شرطی نشده، می‌شود بدون این که تاثیر منفی در قابلیت تمایز آن‌ها داشته باشد.

  نتیجه گیری

  پیش شرطی کردن سلول‌های مزانشیمال با غلظت‌های بهینه H_۲O_۲ ، بقای آن‌ها را در برابر استرس‌های اکسیداتیو افزایش داده و ممکن است منجر به پیشبرد کارایی درمان سلولی شود.

 

---

---