نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله: هماتولوژي انتشار: 1394/12/22
متن کامل: (4503 مشاهده)
تعیین ژنوتیپ RHD جنین در مادران RhD منفی با استفاده از Real Time PCR
محمد حسین احمدی1، ناصر امیری‌زاده2، صدیقه حنطوش‌زاده3، محمد علی اخوت4، محمد صیادی1، امیر ولی‌خانی1، آزیتا آذرکیوان5
چکیده سابقه و هدف آنتی‌ژن RhD ، نقش مهمی را در ایجاد بیماری همولیتیک جنین و نوزاد ایفا می‌کند. هدف از انجام این مطالعه، تعیین ژنوتیپ RhD جنین در پلاسمای مادران RhD منفی و هم چنین تعیین جنسیت جنین در هفته‌های نخست بارداری با استفاده از روش Real Time PCR بود. مواد و روش‌ها در این مطالعه توصیفی، 21 نمونه DNA ، از پلاسمای مادران باردارRhD منفی که در سنین بارداری بین 8 تا 39 هفته قرار داشتند استخراج و در مورد هر یک از آنها، ژنهای بتا گلوبین، SRY و اگزون‌های 5، 7 و 10 از ژن RHD با استفاده از روش RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل از آن با نتایج فنوتیپی نوزاد مقایسه گردید. یافته‌ها توسط آزمون‌های کای‌دو و کوهن و نرم‌افزار 22 SPSS تجزیه و تحلیل شدند. یافته‌ها 11 مورد(4/52%) از نوزادان جنس مذکر داشتند که در10 مورد(91%) از آنها فنوتیپ RhD مثبت و در یک مورد(9%) منفی گزارش شد. هم چنین 10 مورد(6/47%) از نوزادان جنس مؤنث داشتند که 9 مورد(90%) فنوتیپ RhD مثبت و یک مورد(10%) RhD منفی گزارش گردید. این نتایج با نتایج ژنوتیپی به دست آمده از اگزون‌هایRHD و SRY مطابقت کامل داشت.[Okhovat1] نتیجه گیری نتایج نشان داد که بررسی ژنوتیپ RHD جنین را می‌توان با استفاده از پلاسمای مادر و به کارگیری روش RT-PCR با حساسیت و اختصاصیت بالا انجام داد. این روش کمک شایانی به مادران باردار RhD منفی در مورد به کارگیری صحیح از ایمونوگلوبولین D و هم چنین در مورد مدیریت و جلوگیری از بروز بیماری همولیتیک جنین و نوزاد می‌کند. کلمات کلیدی:غربالگری قبل از تولد، سیستم گروه خونی Rh ، بررسی تعیین جنسیت، روش‌های تعیین ژنوتیپ Real-Time PCR
تاریخ دریافت: 31/4/94 تاریخ پذیرش: 10/9/94
1ـ کارشناس ارشد خون‌شناسی آزمایشگاهی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2ـ PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- متخصص زنان و زایمان ـ استاد مرکز تحقیقات مادر، جنین و نوزاد ـ بیمارستان ولیعصر ـ دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 4- کارشناس علوم آزمایشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم و فن‌آوری تشخیص آزمایشگاهی ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شیراز ـ شیراز ـ ایران 5- مؤلف مسئول: فوق تخصص خون و انکولوژی کودکان ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون و درمانگاه تالاسمی ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه سیستم گروه خونی Rh ، پیچیده‌ترین و پلی‌مورفیک‌ترین سیستم گروه خونی در انسان می‌باشد(1). این سیستم دارای بیش از 50 نوع آنتی‌ژن است و در انتقال خون بعد از ABO ، مهم‌ترین سیستم از نظر بالینی می‌باشد و نقش مهمی را در ایجاد بیماری همولیتیک جنین و نوزاد (HDFN) ایفا می‌کند(2). 50% از موارد وقوع HDFN مربوط به آنتیD (IgG) مادری می‌باشد که از جفت عبور می‌کند و با اتصال به گلبول‌های قرمز جنین، باعث تخریب آنها و در نتیجه بروز آنمی در نوزاد یا جنین و یا عوارض شدیدتر مانند هیدروپس فتالیس و حتی مرگ جنین می‌شود(3، 2). از اواخر دهه 1960 میلادی به بعد، با تزریق ایمونوگلوبولین D به مادر بعد از تولد نوزاد، میزان ایمونیزاسیون RhD مادر از 14% به 5/1% کاهش یافت. در تعدادی از کشورها تزریق قبل از تولد ایمونوگلوبولین D نیز پیشنهاد گردید که همین امر موجب کاهش بیشتر میزان ایمونیزاسیون مادر شد و این مقدار به 2/0 تا 4/0 درصد رسید(5، 4). از آن جایی که در بسیاری از کشورها از جمله ایران، فنوتیپ RhD جنین تا زمان تولد مشخص نمی‌شود، همه مادران RhD منفی که همسران RhD مثبت دارند، ایمونوگلوبولین D را به صورت پیشگیرانه قبل از تولد نوزادشان در سه ماهه سوم بارداری دریافت می‌کنند. در صورتی که درصد قابل توجهی از این مادران باردار، ایمونوگلوبولین D را به صورت غیر ضروری دریافت می‌کنند(6). ایمونوگلوبولین D منشأ انسانی دارد و لذا خطر انتقال عوامل عفونی به خصوص ویروس‌های بیماری‌زا از طریق آن وجود دارد. لذا در صورت امکان باید تلاش گردد که مواجهه غیر ضروری صورت نگیرد(10-7).[Okhovat2] با تعیین قبل از تولد ژنوتیپ RHD جنین می‌توان تزریق ایمونوگلوبولین D را به صورت هدفمند و تنها در مادران باردار RhD منفی که جنین RhD مثبت حمل می‌کنند انجام داد و از تماس بی‌مورد آنها با ایمونوگلوبولین D اجتناب نمود(14-11). مزیت دیگر تعیین ژنوتیپ RHD جنین، مربوط به مادران بارداری می‌باشد که به دلایل مختلف نسبت به آنتی‌ژن D ایمونیزه شده‌اند و در سرمشان آنتیD وجود دارد. در مورد این افراد اگر مشخص شود که جنین فنوتیپ RhD منفی دارد، خطری برای بروز HDFN در آنها وجود ندارد و لذا از اقدامات تهاجمی نظیر آمنیوسنتز سریالی، کوردوسنتز و هم چنین زایمان زودرس در مورد آنها جلوگیری می‌شود و اگر RhD جنین به صورت مثبت گزارش شود، اقدامات لازم درمانی مناسب و به موقع به عمل خواهد آمد(15، 1). با کشف DNA آزاد جنینـی (Cell free fetal DNA = CffDNA) در پلاسمای مادران باردار توسط دنیس‌لو در سال 1997، امکان تعیین ژنوتیپ RHD جنین به روش غیر تهاجمی میسر گشت(16). به طور کلی غلظت CffDNA در جریان خون مادر بسیار کم می‌باشد و با افزایش سن بارداری، مقدار آن نیز افزایش می‌یابد و طی 1 الی 2 روز بعد از زایمان به طور کامل از جریان خون مادر پاک می‌شود(19-17). تعیین ژنوتیپ RHD جنین را با روش‌های معمولی PCR نیز می‌توان انجام داد، اما روش Real Time PCR از دقت، اختصاصیت و حساسیت بیشتری برخوردار می‌باشد (21، 20).[Okhovat3] هدف از این مطالعه، بررسی میزان تطابق بین نتایج حاصل از ژنوتیپ RHD جنین با استفاده از روشReal Time PCR و نتایج فنوتیپی RhD نوزاد با روش سرولوژی و هم چنین تعیین جنسیت جنین در هفته‌های نخست بارداری بود.
مواد و روش‌ها در این مطالعه توصیفی، تعداد 21 مادر باردار RhD منفی که همسر RhD مثبت داشتند مورد ارزیابی قرار گرفتند. حجم نمونه با توجه به مطالعه‌های مشابه پیشین و با استفاده از فرمول شارل کوکران محاسبه گردید. نمونه‌ها از مادرانی که جهت مشاوره‌های زنان و زایمان در محدوده زمانی آبان ماه تا اسفند ماه سال 1393 به بیمارستان‌های امام خمینی(ره) و میرزا کوچک خان تهران مراجعه نمودند، جمـع‌آوری گردیـد. ضمناً تمام نمونه‌ها با جلب رضایت از افـراد و تکمیـل فـرم رضایت‌نامـه توسط ایشان جمع‌آوری شد. [Okhovat4]
جمع‌آوری نمونه‌ها و آماده‌سازی آنها: هر نمونه که حاوی 5 میلی‌لیتر از خون کامل مادر در لوله حاوی ضد انعقاد EDTA بود، بلافاصله پس از انتقال به مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران، به مدت 10 دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفوژ شد و پلاسمای رویی آن جدا و به میکروتیوب استریل منتقل گردید. سپس این قسمت از پلاسما مجدداً به مدت 10 دقیقه، ولی این بار با دور rpm 13000 سانتریفوژ گردید تا به طور کامل از سلول‌ها جدا شود. در نهایت قسمت رویی پلاسما برداشته و به میکروتیوب استریل دیگر منتقل و برای انجام مراحل بعـدی کـار، در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
استخراج DNA : CffDNA با استفاده از کیت Cinna Pure DNA (محصول شرکت سینا کلون، ایران) استخراج شد. طبق دستورالعمل کیت، µL 100 از پلاسمای ذوب شده با µL 400 از محلول لیز کننده و µL 300 محلول پرسیپیتاسیون مخلوط و سپس تمام این حجم به میکروتیوب فیلتردار منتقل و سانتریفوژ شد. طی 3 مرحله شستشو با بافرهای شستشوی شماره 1 و 2، نهایتاً DNAدر µL 30 از محلول الوشن حل و برای انجام مراحل بعدی کار، در 80- درجه سانتی‌گراد ذخیره گردید. لازم به ذکر است که برای کاهش خطر آلودگی، تمامی مراحل جداسازی DNA در زیر هود لامینار کلاس 2 و با استفاده از نوک سمپلرهای استریل فیلتردار انجام گرفت.
واکنش Real Time PCR : جنسیت جنین و ژنوتیپ RHD جنین، با استفاده از روش Real Time PCR و به وسیله دستگاه Rotor Gene - 3000 (محصول کشور آلمان) بررسی گردید. آغازگرهای انتخاب شده و اختصاصی برای ژنهای RHD ، SRY و بتاگلوبین به وسیله شرکت ژن فناوران(دانمارک) تهیه و مورد استفاده قرار گرفت. برای افزایش اختصاصیت مطالعه، سه منطقه ژنی از لکوس RHD (شامل اگزون‌های 5 ، 7 و 10) ارزیابی و برای تایید حضور DNA نیز از ژن بتاگلوبین و SRY استفاده شد(جدول 1). هر واکنش حاوی µL 10 از مستر میکس X2 سایبرگرین Amplicon (محصول کشور دانمارک)، µL 5 نمونه DNA ، µL 5/0 آغازگر جلوبرنده ، µL 5/0 آغازگر معکوس و µL 4 از آب مقطر بود که در حجم نهایی µL 20 مورد ارزیابی قرار گرفت.
جدول 1: توالی آغازگرهای جلوبرنده و معکوس از ژنهای RHD و SRY و بتاگلوبین
ژن
آغازگر
توالی
اندازه
ACTB
جلوبرنده
GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA
bp 102
معکوس
CCTTGATACCAACCTGCCCAG
SRY
جلوبرنده
TGGCGATTAAGTCAAATTCGC
bp 137
معکوس
CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT
Exon5
جلوبرنده
CGCCCTCTTCTTGTGGATG
bp 82
معکوس
GAACACGGCATTCTTCCTTTC
Exon7
جلوبرنده
CTCCATCATGGGCTACAA
bp 90
معکوس
CCGGCTCCGACGGTATC
Exon10
جلوبرنده
CCTCTCACTGTTGCCTGCATT
bp 74
معکوس
AGTGCCTGCGCGAACATT
شرایط انجام واکنش نیز به ترتیب مقابل بود: 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به عنوان دناتوراسیون اولیه و برای هر چرخه نیز 30 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد جهت دناتوراسیون، 30 ثانیه در 61 درجه سانتی‌گراد جهت اتصال آغازگرها(این دما برای همه آغازگرها یکسان بود) و 30 ثانیه نیز در دمای 72 درجه سانتی‌گراد جهت تکثیر که در مجموع در 50 چرخه انجام شد. به منظور افزایش حساسیت آزمایش، نمونه‌ها به صورت دوتایی (Duplicate) مورد ارزیابی قرار گرفتند و به همراه آنها از کنترل منفی(فرد مؤنث و RhD منفی)، کنترل مثبت (فرد مذکر و RhD مثبت) و کنترل بدون DNA الگو (NTC) استفاده شد. نمـودار تکثیـر هـر یـک از ژنهای RHD ، SRY و بتـاگلوبین برای نمونه‌های مورد نظر مورد بررسی قرار گرفت و تفسیر نتایج به این ترتیب انجام شد که اگر هر دو واکنش از هر یک از ژنهای مذکور، مثبت می‌گردید نتیجه برای آن ژن مثبت در نظر گرفته می‌شد. اگر هر دو واکنش منفی یا تنها یکی از دو واکنش مثبت می‌شد، آزمایش مجدداً به صورت دوتایی تکرار و در مجموع 4 واکنش نیز، اگر 2 واکنش یا بیشتر مثبت می‌شد نتیجه برای ژن مورد نظر مثبت و در غیر این صورت منفی تلقی می‌گردید. یکی از آیتم‌هایی که در تفسیر نتایج می‌تواند راهگشا باشد، بحث چرخه آستانه Ct (Threshold Cycle) می‌باشد. اگر تفاوت Ct بین اگزون‌های RHD و ژن بتاگلوبین کمتر از 2 باشد، احتمالاً بیانگر آن است که مادر دارای یک ژن غیر قابل بیان یا واریانتی از ژن RHD است که منجر به منفی شدن فنوتیپ RhD وی شده که در این صورت جواب به صورت غیر قابل گزارش محسوب می‌گردد و نیاز به مطالعه ژن RHD بر روی ژنوم مادر می‌باشد(11). Ct اگزون‌های RHD در مواردی که جنین به صورت RHD مثبت می‌باشد، حداقل 4 تا 6 عدد بیشتر از Ct ژن کنترل (بتاگلوبین) است(22). اگر جنین به صورت RHD منفی تعیین ژنوتیپ می‌شد، نتیجه SRY جهت تایید حضور DNA جنینی در مواردی که جنین پسر بود مورد استفاده قرار می‌گرفت. اگر در بین 3 اگزون، واکنش تنها در اگزون 10 مثبت و در دو اگزون 5 و 7 منفی می‌شد، این احتمال وجود داشت که جنین دارای یکی از واریانت‌های RHD مثبت باشد و لذا در نهایت مثبت در نظر گرفته می‌شد.
تایید ژنوتیپ RHD و جنسیت جنین: خون محیطی و یا خون بند ناف در هنگام تولد از نوزاد جمع‌آوری و آزمون سرولوژی جهت تعیین فنوتیپ RhD انجام گرفت. جنسیت نوزاد نیز در هنگام تولد مشخص گردید.
تجزیه و تحلیل آماری: داده‌ها توسط نرم‌افزار 22 SPSS و با استفاده از آزمون‌های آماری Chi-square و Cohen’s Kappaکه تطابق بین نتایج به دست آمده و مورد انتظار را نشان می‌دهد، مورد ارزیابی قرار گرفت و مقدار p کمتر از 05/0 از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد. آزمون‌های تعیین حساسیت، ویژگی و دقت آزمایش نیز مورد استفاده قرار گرفت. [Okhovat5]
یافته‌ها در مطالعه حاضر نمونه‌های پلاسمای به دست آمده از 21 زن باردار در محدوده سنی 28-19 سال (میانگین: 4/3 ± 6/24) که در سنین بارداری 8 الی 38 هفته (میانگین: 8/7 ± 7/32 هفته) قرار داشتند، بررسی گردید و نتایج ژنوتیپی حاصل از آزمایش Real Time PCR با نتایج سرولوژیکی بعد از تولد مقایسه شد. همـه زنـان گزارش دادنـد کـه در 3 مـاه گذشتـه خون دریافت نکرده‌اند و هرگز عمل پیوند نداشته‌اند. لازم به ذکر است، هر دو این احتمالات می‌تواند منجر به تغییر در نتایج ژنوتیپ به دلیل امکان سنجش DNA فرد اهداکننده شود.[Okhovat6] فنوتیپ RhD مادران در20 مورد(2/95%) از نمونه‌ها به صورت ccddee و در 1 مورد(8/4%) نیز به صورت CCddee تعیین شد. نتایج ژنوتیپ RHD جنین با آنالیز پلاسمای مادر نشان داد که 17 مورد(71/85%) از نمونه‌ها RHD مثبت و 4 نمونه(29/14%) RHD منفی بودند. کلیه نتایج به دست آمده با نتایج سرولوژی حاصل از خون بند ناف تطابق صددرصدی را نشان داد(جدول 2).
جدول 2: نتایج حاصل از ژنوتایپینگ RHD و SRY جنینی توسط روش Real-Time PCR
جنسیت
فنوتیپ Rh نوزاد
ژنوتیپ جنین با استفاده از RT-PCR
فنوتیپ مادر
سن بارداری
نمونه
SRY
Exon10
Exon7
Exon10
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
8
1
مرد
D +
P
P
P
P
-
23
2
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
23
3
زن
D -
N
N
N
N
ccddee
25
4
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
29
5
مرد
D +
P
P
P
P
ccddee
30
6
مرد
D -
P
N
N
N
ccddee
32
7
زن
D +
N
P
P
P
-
33
8
مرد
D +
P
P
P
P
ccddee
34
9
مرد
D +
P
P
P
P
ccddee
35
10
مرد
D +
P
P
P
P
CCddee
35
11
مرد
D +
P
P
P
P
ccddee
35
12
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
37
13
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
37
14
مرد
D -
P
N
N
N
ccddee
38
15
مرد
D -
P
N
N
N
ccddee
38
16
مرد
D +
P
P
P
P
ccddee
38
17
مرد
D +
P
P
P
P
ccddee
39
18
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
39
19
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
39
20
زن
D +
N
P
P
P
ccddee
39
21
جدول 3: ارزیابی میزان تطابق و تعیین حساسیت، ویژگی و دقت آزمایش ژنوتایپینگ
RHD
SRY
تطابق
(21/21) 100%
(21/21) 100%
حساسیت
100%
100%
منفی کاذب
اختصاصیت
100%
100%
مثبت کاذب
دقت
100%
100%
p value
0005/0 <
0005/0 <
Cohen’s Kappa
1
1
لذا، اختصاصیت، حساسیت و دقت آزمون تعیین ژنوتیپ RHD جنین با استفاده از روش Real Time PCR در این مطالعه 100% تعیین گردید(100% K= ؛ 0005/0 p<) (جدول 3). آنالیز نتایج Real Time PCR در مورد ژن SRY نیز در هر 21 نمونه با جنسیت نوزاد بعد از تولد مطابقت داشت. 11 مورد (3/52%) از نمونه‌ها به صورت مذکر و 10 مورد (7/47%) نیز به صورت مؤنث تعیین جنسیت شدند که در مـورد ایـن ژن نیـز اختصاصیت، حساسیت و دقت آزمایش، 100% محاسبـه شـد(100% K= ؛ 0005/0 p<). ژن ACTB در تمام نمونه تشخیص داده شد(جداول 2 و 3).[Okhovat7] بحث در مطالعه حاضر، با بررسی ژنوتیپ RHD جنین در 21 نمونه DNA که از پلاسمای مادران RHD منفی استخراج شده بود، مشخص شد که 71/85% از نمونه‌ها، RHD مثبت و 29/14% منفی هستند که این نتایج با یافته‌های آزمایش سرولوژی بعد از تولد مطابقت کامل داشتند. هم چنین در آزمایش ژنوتایپینگ تعیین جنسیت با ژن SRY 11 مورد (3/52%) از نمونه‌ها مذکر و 10 مورد (7/47%) مؤنث تشخیص داده شدند که صحت کلیه نتایج به دست آمده بعد از تولد نوزادان به اثبات رسید.[Okhovat8] در تعیین ژنوتیپ RHD جنین چالش‌های فراوانی وجود دارد که توجه به آنها جهت دستیابی به نتایج دقیق دارای اهمیت فراوانی می‌باشد. از آن جایی که سیستم Rh بسیار پیچیده است، احتمال نتایج مثبت و منفی کاذب در تعیین ژنوتیپ RHD جنین همواره وجود دارد که باید به این مسأله توجه داشت. به طور کلی تعیین پلی‌مورفیسم‌های یک ژن و فراوانی آنها در یک جمعیت خاص، مرحله‌ای مهم در تعیین ژنوتیپ RHD جنین محسوب می‌شود که تاکنون مطالعه‌ای در این زمینه در کشور ایران صورت نگرفته است لذا تا حد امکان باید سعی کرد که اگزون‌ها و آغازگرها به گونه‌ای انتخاب و طراحی شوند که با استفاده از آنها بتوان نتایج مثبت و منفی حقیقی را از واریانت‌های RHD افتراق داد. جهت دستیابی به این مهم، می‌توان از مقالات معتبری که در این زمینه فعالیت کرده‌اند، استفاده و کسب تجربه نمود(23). به عنوان نمونه محققان برای اجتناب از نتایج منفی کاذب، معمولاً بررسی حداقل دو اگزون از ژن RHD را پیشنهاد می‌کنند(25، 24). آیکوت و همکارانش در سال 2013، با استفاده از آغازگرهای دو اگزون 7 و 10، ژنوتیپ RHD جنین را مورد ارزیابی قرار دادند که نتایج با یافته‌های سرولوژیکی بعد از تولد، مطابقت کامل داشت(26). در مطالعه حاضر نیز سه اگزون 5، 7 و 10 مورد ارزیابی قرار گرفت. علت استفاده از اگزون 10 در کنار اگزون 5 و 7 این بود که در اکثر واریانت‌های هیبرید ژن RHD ، اگزون 10 دست نخورده باقی می‌ماند و لذا اگر درReal Time PCR نتایج مربوط به اگزون‌های 5 و 7 منفی و اگزون 10 مثبت شود، احتمال حضور یک واریانت از ژن RHD را مطرح می‌کند. به این ترتیب با انتخاب صحیح اگزون‌ها از نتایج منفی کاذب در تعیین ژنوتیپ RHD جنین جلوگیری شد(23). به علت وجود تشابه تقریبا 96 درصدی بین قطعات ژنی RHD و RHCE ، آغازگرها باید به گونه‌ای انتخاب شوند که قابلیت تمایز بین این دو ژن را به خوبی داشته باشند. در مطالعه حاضر نیز آغازگرها با توجه به توالی نوکلئوتیدی این دو ژن و اطلاعات موجود در مقالات به گونه‌ای انتخاب گردید که تنها، اختصاصی برای ژن RHD بوده و توانایی اتصال و تکثیر اگزون‌های ژن RHCE را نخواهند داشت(27، 1). مسأله دیگری که در تعیین ژنوتیپ RHD جنین، باید به آن توجه داشت، مسأله غلظت CffDNA در پلاسمای مادر می‌باشد. یکی از علل عمده نتایج منفی کاذب در تعیین ژنوتیپ RHD جنین، غلظت کم CffDNA در پلاسمای مادر است. با افزایش سن بارداری، غلظت CffDNA نیز افزایش می‌یابد (به ویژه در 3 ماهه آخر بارداری) بنابراین در مواقعی که ژنوتیپ RHD جنین در هفته‌های ابتدایی بارداری، به صورت منفی تعیین شد، ممکن است علت آن کم بودن غلظت CffDNA باشد، لذا برای تایید آن می‌توان آزمایش را چند هفته بعد، با نمونه‌گیری مجدد، تکرار نمود(29، 28). استفاده از یک ژن خاص به عنوان کنترل داخلی، برای تایید حضور DNA تام (مجموع DNA مادری و جنینی) در پلاسمای مادر ضروری می‌باشد. البته گفتنی است که استفاده از این ژن‌ها، تنها بیانگر حضور DNA در پلاسما است و نمی‌تواند DNA جنینی را از DNA مادری افتراق دهد. ژن بتا گلوبین به همین منظور در مطالعه حاضر استفاده شده است(30). جهت تمایز DNA جنینی از DNA مادری و به عبارتی تایید حضور CffDNA در پلاسمای مادر نیز، نیاز به مارکری است که اولاً اختصاصی جنین باشد و ثانیاً در پلاسمای مادر حضور داشته باشد. یکی از مارکرهایی که امروزه در این زمینه استفاده می‌شود، ژن SRY است که بر روی کروموزوم Y قرار دارد. حضور ژن SRY در پلاسمای مادر، از طرفی بیانگر حضور جنین مذکر در رحم مادر است و از طرف دیگر، مؤید حضور CffDNA در پلاسمای مادر می‌باشد(29، 1). وانگ و همکارانش در سال 2009 که بر روی تعیین ژنوتیپ RHD جنین با روش Real Time PCR کار می‌کردند، از ژن بتاگلوبین به عنوان کنترل داخلی و از ژن SRY برای تایید حضور DNA جنینی استفاده کردند. 56/52% از نمونه‌ها، نتایج مثبت از نظر SRY را نشان داد که با جنسیت نوزادان بعد از تولد، مطابقت کامل داشت و به عبارتی آنها توانستند در 41 نمونه(از مجموع 72 نمونه) حضور DNA جنینی را به اثبات برسانند(30). در مطالعه حاضر نیز با استفاده از ژن SRY و مثبت شدن 3/52% از نمونه‌ها (11 نمونه) در واکنش Real Time PCR که با جنسیت نوزادان بعد از تولد مطابقت کامل داشت، حضـور DNA جنینی در 11 نمونه پلاسما به اثبات رسیده است. اما زمانی که مادر حامل جنین مونث با ژنوتیپ RHD منفی می‌باشد، استفاده از مارکر SRY برای تایید حضور CffDNA دیگر کمکی نخواهد کرد(1). برای حل این مشکل امروزه از مارکرهای دیگری استفاده می‌شود که پر کاربردترین آنها ژنی است به نام RASSF1A (RAS association family 1 A) کهیک ژن سرکوبگر تومور می‌باشد. پروموتر این ژن در DNA جنینی به صورت هایپر متیله و در DNA مادری به صورت هایپو متیله می‌باشد و مارکر مناسبی در تعیین DNA جنینی است(32، 31). به این منظور از آنزیمی به نام Bst U1 استفاده می‌گردد که موجب هضم سکانس‌های DNA مادری (که در آن ژن RASSF1A به صورت هایپو متیله است) می‌شود، در صورتی که در DNA جنینی(که ژن RASSF1A به صورت هایپر متیله می‌باشد) تغییری ایجاد نمی‌کند. سپس می‌توان سکانس‌های هضم نشده DNA جنینی را برای تعیین ژنوتیپ RHD ، مورد بررسی قرار داد(24). لازم به ذکر است که محدودیت مطالعه حاضر، عدم وجود کنترل داخلی مناسب با قابلیت آنالیز بیشتر(مارکری هم چون RASSF1A) جهت تایید حضور DNA جنینی در
مواقعی که همه نتایج Real Time PCR به جز بتاگلوبین منفی گردد، می‌باشد و امید است که در مطالعه‌های بعدی به این موضوع نیز پرداخته شود.
نتیجه‌گیری مطالعه حاضر، دقت آزمایش تعیین ژنوتیپ RHD جنین را در پلاسمای مادر (بدون نتیجه منفی کاذب) تایید می‌کند. تعیین ژنوتیپ RHD جنین به چند علت می‌تواند در مراکز کلینیکی و آزمایشگاهی مفید و کاربردی باشد. اول این که از تزریق غیر ضروری ایمونوگلوبولین D به خانم‌های باردار با جنین RhD منفی که در این مطالعه شامل 9/14% از نمونه‌ها بود، جلوگیری خواهد شد. مورد بعدی این که از انجام روش‌های تهاجمی در مادران باردار حساس شده با آنتی D که جنین RhD منفی دارند اجتناب می‌گردد و هم چنین زمان کافی جهت انجام اقدامات لازم و به موقع در درمان مادرانی که جنین RhD مثبت حمل می‌کنند، وجود خواهد داشت و دلیل دیگر این که تعیین ژنوتیپ RHD جنین می‌تواند در مواردی که نتایج فنوتیپی RhD نوزاد به صورت منفی کاذب گزارش می‌شود، کمک کند و با تزریق به موقع روگام، از حساس شدن مادر و بروز HDFN در حاملگی های بعدی جلوگیری نماید. انجام چنین مطالعه‌ای با تعداد نمونه بیشتر می‌تواند انجام روتین این آزمایش را در آزمایشگاه‌های بالینی ایران، امکان‌پذیر سازد. اما قبل از آن باید مشخص نمود که آیا تعیین ژنوتیپ RHD و SRY جنین در کشور ایران از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است یا خیر و در آن زمان است که استفاده از این آزمایش به دلایلی که پیشتر به آنها اشاره شد می‌تواند مفید و کاربردی باشد.
تشکر و قدردانی اینتحقیقحاصلپایاننامهکارشناسیارشدرشته هماتولوژی و بانک خونمصوبمرکزتحقیقاتمؤسسهعالیآموزشیو پژوهشیطبانتقالخونمیباشد.
[Okhovat1]مورد دوازدهم: فراوانی ها به صورت درصد ذکر گردیدند.
[Okhovat2]مورد هشتم: [Okhovat2]با توجه به اینکه آنتی D محصولی با منشا انسانی می باشد لذا همواره خطر انتقال ویروس را هر چند در موارد بسیار نادر بهمراه دارد «حتی با یکبار تزریق» و بهتر است تا حد امکان از تزریق غیر ضروری آن جلوگیری شود. ضمنا یکی از اهداف اصلی مراکز انتقال خون و آزمایشگاهی دنیا که این طرح را بصورت روتین انجام می دهند همین مسئله و بعبارتی هدفمند کردن تزریق آنتی D عنوان می نمایند. مضافا اینکه هدف انجام طرح حاضر تنها جلوگیری از تزریق بی مورد آنتی D نمی باشد و کاربرد ها و منافع دیگری نیز در پی دارد که در قسمت مقدمه و نتیجه گیری به آنها اشاره شده است و همچنین بیان کردیم که سودمندی و صرفه ی اقتصادی این تست در ایران را باید با انجام تحقیقات جامع و گسترده تر مورد ارزیابی قرار دهیم. البته گفتنی است که هزینه ی انجام این تست در یک مرکز آزمایشگاهی بعنوان یک تست روتین و در حجم نمونه بالا چندان توفیقی با هزینه یک آمپول روگام «بدون یارانه» نخواهد داشت «با توجه به هزینه های انجام شده در این طرح».
[Okhovat3]مورد دهم: [Okhovat3]به طور کلی روش Real time PCR نسبت به PCR معمولی دارای دقت، اختصایت و حساسیت بیشتری می باشد. مطالعات پیشین و منابع آورده شده نیز این مورد را تایید می کنند.
[Okhovat4]مورد ششم: [Okhovat4]نوع مطالعه و روش نمونه گیری اضافه گردید. مورد نهم: نحوه انتخاب و حجم نمونه اضافه گردید.
[Okhovat5]مورد ششم: [Okhovat5]روش های آماری به کار رفته و نحوه تجزیه و تحلیل داده ها اضافه گردید.
[Okhovat6]مورد سیزدهم: اطلاعات دموگرافیک اضافه گردید.
[Okhovat7]مورد ششم: نتایج تست های آماری و p value به بخش یافته ها اضافه گردید.
مورد پنجم: [Okhovat8]پاراگراف اول بخش بحث تصحیح گردید.
Ahmadi M, Amirizadeh N, Hantushzadeh S, Okhovat M, Sayyadi M, Valikhani A et al . Fetal RHD genotyping of RhD negative women by Real-time PCR . Sci J Iran Blood Transfus Organ 2016; 13 (1) :19-28 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-981-fa.html
احمدی محمد حسین، امیری‌زاده ناصر، حنطوش‌زاده صدیقه، اخوت محمد علی، صیادی محمد، ولی‌خانی امیر و همکاران.. تعیین ژنوتیپ RHD جنین در مادران RhD منفی با استفاده از Real Time PCR. فصلنامه پژوهشی خون. 1395; 13 (1) :19-28
