ارزیابی اثرات ترمیمی سلول‌های بنیادی مزانشیمی کشت داده شده با سکرتوم حاصل از سلول‌های بنیادی دست‌ورزی شده با Nrf2 بر روی آسیب حاد کلیوی در موش صحرایی
 
فاطمه ژاله¹، فاطمه امیری²، مژگان دهقان هراتی³، مهریار حبیبی رودکنار⁴، محمد علی جلیلی⁵
 
 
چکیده
سابقه و هدف
کاهش شدید بقای سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از پیوند، از چالش‌های اساسی استفاده از این سلول‌ها است. در این مطالعه با هدف افزایش بقای این سلول‌ها پس از پیوند، سلول‌های بنیادی مزانشیمی دست‌ورزی نشده تحت تیمار با سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 قرار گرفتند. سپس اثرات درمانی این سلول‌ها در مدل حیوانی آسیب حاد کلیوی مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی پلاسمید نوترکیب pcDNA3.1-Nrf2  به درون سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان ترانسفکت شد و سکرتوم سلول‌ها جمع‌آوری گردید. سلول‌های بنیادی مزانشیمی در سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 کشت داده شدند. سلول‌های مجاور شده با سکرتوم، به موش‌های صحرایی (گروه 10 تایی) دچار آسیب حاد کلیوی تزریق شد و اثر درمانی این سلول‌ها با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی و پاتولوژی مورد ارزیابی قرار گرفت.
یافته‌ها
14 روز پس از درمان، کاهش BUN در گروهی که تزریق سلول‌های کشت داده شده در سکرتوم داشتند (mg/dL 5/3 ± 48) نسبت به گروهی که سلول‌های طبیعی دریافت کرده بودند(mg/dL 9/9 ± 100) تفاوت معناداری داشت(001/0 p<). تعداد کست(26/0) مشاهده شده در مقاطع بافتی این گروه نیز کمتر از گروه دریافت‌کننده سلول‌های طبیعی(51/0) بود.
نتیجه گیری
کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی در سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 ، اثرات ترمیمی این سلول‌ها را در بهبود آسیب حاد کلیوی افزایش می‌دهد.
کلمات کلیدی: سلول‌های بنیادی مزانشیمی، آسیب حاد کلیوی، کاندیشن مدیوم
 
 
 
 
تاریخ دریافت: 20/4 /94
تاریخ پذیرش : 14/7/95
 

1- کارشناس ارشد زیست‌ فن‌آوری پزشکی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- کارشناسی ارشد زیست فن‌آوری پزشکی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
4- PhD زیست فن‌آوری پزشکی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
5- مؤلف مسئول: PhD شیمی دارویی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665

مقدمه ‌
    سلول‌های بنیادی مزانشیمی(Mesenchymal Stem Cells) گروهی از سلول‌های کلونی‌زا و چند توان هستند که می‌توانند به رده‌های مختلف سلولی از جمله استخوان، چربی، غضروف و سلول‌های عضله قلبی و اسکلتی تمایز یابند(3-1). این سلول‌ها در انجام روش سلول درمانی جهت درمان بسیاری از بیماری‌ها کاربرد دارند(6-4).
    یکی از مشکلات عمده در استفاده از سلول‌های بنیادی مزانشیمی، کاهش بقای سلول‌ها به دنبال پیوند می‌باشد. بنابراین به نظر می‌رسد یافتن راهکاری جهت افزایش بقای سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از پیوند حائز اهمیت باشد (8، 7).
    دست‌ورزی ژنتیکی سلول‌های بنیادی مزانشیمی با عوامل محافظت‌کننده سلولی از راه‌کارهای مؤثر در جهت افزایش بقای آن‌ها است. از این عوامل محافظت‌کننده سلولی می‌توان [Nuclear factor-erythroid2 (NF-E2)-Related Factor2 [ را نام برد. Nrf2 نقش مهمی در حفاظت علیه استرس‌های اکسیداتیو، آسیب‌های سلولی ناشی از مواد شیمیایی، حفاظت از تشکیل سرطان و ترمیم زخم دارد(10، 9). تقویت ویژگی ضد آپوپتوز و ضد اکسیداتیو سلول‌های بنیادی مزانشیمی به دنبال آلودگی با آدنو ویروس‌های محتوی ژن Nrf2 می‌تواند به عنوان یکی از روش‌های محافظت سلول‌های پیوندی در برابر مرگ سلولی به کار رود(11).
    اما دست‌ورزی ژنتیکی سلول‌ها با هدف استفاده در درمان در مرحله بالینی مورد تائید سازمان بهداشت جهانی و سازمان‌های معتبری هم چون سازمان غذا و داروی آمریکا نیست.
    مطالعه‌های اخیر نشان می‌دهد که سلول‌های مزانشیمی، بسیاری از فاکتورهای رشد، سیتوکاین‌ها و کموکاین‌ها را به محیط ترشح می‌کنند که این مواد فعال زیستی ترشح شده ضمن افزایش بقای این سلول‌ها می‌توانند باعث افزایش اثرات ترمیم بافتی آن‌ها شوند(15-12).
    بیماری‌های کلیوی مانند آسیب حاد کلیوی (Acute kidney injury: AKI)، به عنوان یکی از مشکلات تهدیدکننده سلامت جامعه مطرح می باشند. در حالی که روش‌های درمانی موجود(دیالیز و پیوند کلیه) تنها باعث افزایش طول عمر بیمار شده و علاوه بر هزینه‌های بالای درمان، موفقیت آن‌ها مستلزم مراقبت مستمر پزشکی می‌باشد(16). بنابراین در این مطالعه به منظور مرتفع نمودن مشکل ممانعت استفاده از سلول‌های بنیادی دست‌ورزی شده در سطح بالینی و با هدف افزایش بقای این سلول‌ها پس از پیوند، سلول‌های بنیادی مزانشیمی دست‌ورزی نشده تحت تیمار با سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 قرار گرفتند. پس از کشت این سلول‌ها در مجاورت سکرتوم به منظور افزایش مقاومت سلولی در برابر شرایط نامناسب محیطی، این سلول‌ها به موش‌های صحرایی مدل آسیب حاد کلیوی تزریق شدند و اثرات درمانی آن‌ها در روزهای مختلف ارزیابی گردید.
 
مواد و روش‌ها
    در این مطالعه تجربی، از سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان موجود در ذخیره‌ سلولی مرکز تحقیقات مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون که قبلاً مارکرهای سطحی و توانایی تمایز آن‌ها به سه رده‌ چربی، استخوان و غضروف بررسی و تأیید شده بود، استفاده شد(11). پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 pcDNA3.1-Nrf2)) که با روش‌های PCR ، هضم آنزیمی و توالی‌یابی DNA تأیید شده بود، به صورت ذخیره(Stock) در باکتری اشرشیاکولی نوعDH5α  در مرکز تحقیقات مذکور موجود بود(11).
 
آماده‌سازی و استخراج پلاسمید نوترکیب:
    باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب pcDNA3.1-Nrf2 از فریزر 80- درجه سانتی‌گراد خارج شد. به اندازه یک لوپ از این باکتری در 10 میلی‌لیتر محیط کشت LB مایع حاوی یک درصد آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین به مدت یک شب در انکوباتور شیکردار(شرکت ایوی من استرالیا) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد کشت داده شد. پلاسمیدها با استفاده از کیت اختصاصی استخراج پلاسمید(شرکت رُوش آلمان) و بر اساس روش کار توصیفی کیت، استخراج شدند. سپس غلظت پلاسمیدهای استخراج شده و کیفیت آن‌ها با استفاده از اسپکتروفتومتر نانودراپ(شرکت‌های تک آمریکا) ارزیابی شد.
 
آماده‌سازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان:
    سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان از دمای 80- درجه سانتی‌گراد یا تانک ازت خارج شده، پس از یخ‌زدایی با محیط کشت سلولی DMEM-Low glucose حاوی 10% سرم جنین گاوی(FBS) و 1% آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین و آمپی‌سیلین‌(هر سه ماده از شرکت اینویتروژن آمریکا) مخلوط شدند. مخلوط حاصل به ظروف کشت مناسب و استریل منتقل و در انکوباتور استاندارد کشت سلولی کشت داده شدند. سپس تعداد 200 هزار عدد از این سلول‌ها در هر چاهک پلیت‌ 6 خانه‌ای کشت داده شدند و پس از چسبیدن سلول‌ها به کف پلیت، از آن‌ها جهت انجام مراحل ترانسفکشن(ورود DNA پلاسمیدی به داخل سلول) استفاده شد.
 
ترانسفکشن پلاسمیدهای نوترکیب به داخل سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
    در این مطالعه از ماده‌ فیوژن اچ‌دی(شرکت رُوش آلمان) جهت وارد کردن pcDNA3.1-Nrf2 به درون سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان استفاده شد. نسبت‌های مناسب از فیوژن اچ‌‌دی با pcDNA3.1-Nrf2 ، (4 به 1، 6 به 2 و 5 به 5/1) مخلوط شده و پس از گذشت 5/0 ساعت به محیط کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی کشت داده شده در چاهک‌های مختلف پلیت‌های 6 خانه‌ای اضافه شد. پس از گذشت 5-4 ساعت، محیط کشت سلول‌ها با استفاده از محیط کشت سلولی DMEM-Low glucose حاوی 10% سرم جنین گاوی(FBS) و 1% آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین و آمپی‌سیلین تازه تعویض شد.
 
تأیید بیان ژن‌های Nrf2 به روش PCR ترانس کریپتاز معکوس(RT-PCR) و وسترن بلات:
    72 ساعـت پس از ترانسفکشن بیان Nrf2 در سلول‌های ترانسفکت شده با pcDNA3.1-Nrf2 (که MSC-Nrf2 نامیده
شدند) به روش PCR ترانس کریپتاز معکوس (Reverse transcriptase-PCR) و وسترن بلات بررسی شد. RNA سلول‌های MSC-Nrf2 و سلول‌های بنیادی مزانشیمی دست‌ورزی نشده(MSC) به عنوان گروه کنترل با استفاده از ماده‌ ترایزول(شرکت اینویتروژن آمریکا) و طبق دستورالعمل کیت استخراج شد. cDNA آن‌ها با استفاده از کیت ساخت cDNA (شرکت بیونیر آمریکا) و بر اساس روش کار توصیفی کیت ساخته شد. آغازگرهای اختصاصی ژن Nrf2 با استفاده از سایت NCBI طراحی و بلاست شدند. توالی آغازگرهای طراحی شده بدین شرح بود:  آغازگر جلوبرنده: 5'GTT GGC AGA TCC ACT GGT TTC TG3
و
آغازگر معکوس: 5´ GCG ACG GAA AGA GTA TGA GCT GG 3´.
    واکنش‌های PCR با استفاده از دوره‌های دمایی و زمانی مناسب ایجاد شده توسط دستگاه PCR (شرکت تاکارای ژاپن) و همانند مطالعه‌های قبلی انجام شد(15، 11). محصولات به دست آمده بر روی ژل آگارز 2% الکتروفورز شده با رنگ اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی شد. باندهای ایجاد شده با دستگاه ترانس لومیناتور(شرکت تتروی انگلیس) مشاهده و تفسیر گردید. هم چنین جهت تأیید بیان پروتئین Nrf2 در سطح پروتئین از روش وسترن بلات استفاده شد. بدین منظور 72 ساعت پس از ترانسفکشن، لیزات سلولی سلول‌های بنیادی مزانشیمی ترانسفکت شده با وکتور نوترکیبpcDNA3.1-Nrf2 با استفاده از بافر لیزکننده M (شرکت رُوش آلمان) تهیه شد. لیزات سلول‌های بنیادی مزانشیمی ترانسفکت نشده نیز به عنوان گروه کنترل تهیه گردید. به منظور جدا کردن پروتئین‌ها بر اساس وزن مولکولی، ژل پلی‌آکریل آمید 12% استفاده شد(SDS-page). به دنبال الکتروفورز، نمونه‌ها به غشاء  PVDFمنتقل شده و با استفاده از آنتی‌بادی اولیه خرگوشی علیه پروتئین  Nrf2انسانی(شرکت ابکم انگلیس) و آنتی‌بادی ثانویه پلی‌کلونال بز بر علیه خرگوش متصل شده به آنزیم پراکسیداز(شرکت سل سیگنالینگ)، بیـان پـروتئیـن Nrf2 مورد ارزیابی قرار گرفت.
جمع‌آوری و تغلیظ سکرتوم سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
    سلول‌هـای بنیـادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان با پلاسمید نوترکیب ذکر شده و به روش توصیف شده ترانسفکت شدند. 48 ساعت بعد محیط کشت آن‌ها با محیط کشت دارای 1% آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین و آمپی‌سیلین فاقد سرم تعویض شد و 24 ساعت بعد محیط کشت رویی سلول‌ها جمع‌آوری و با استفاده از لوله‌های دارای فیلتر 3 کیلودالتون(شرکت سارتوریوس آلمان) و سانتریفوژ با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 90 دقیقه تغلیظ شد.
 
کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در مجاورت سکرتوم سلول‌های دست ورزی شده:
    تعداد 200 هزار سلول بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در پلیت 6 خانه‌ای در محیط DMEM-LG دارای 10%  FBSو 1% آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین و آمپی‌سیلین  کشت داده شدند. بعد از چسبیدن سلول‌ها، محیط کشت پلیت‌ها تخلیه شده و سلول‌ها در محیط کشت تازه حاوی 7% سکرتوم حاصل از سلول‌های ترانسفکت شده با Nrf2 (70 میکرولیتر سکرتوم به اضافه 930 میکرولیتر محیط کشت ذکر شده) کشت داده شدند. پلیت‌ها به مدت یک شب در انکوباتور استاندارد کشت سلولی نگهداری شدند. این گروه، S-Nrf2 نامیده شدند. هم زمان گروه کنترل MSC)) که شامل سلول‌های بنیادی مزانشیمی بدون دست‌ورزی ژنتیکی و تیمار سکرتومی بودند نیز کشت داده شدند.
 
بهینه‌سازی القای آسیب حاد کلیوی و ارزیابی آسیب با دو روش بیوشیمیایی و پاتولوژی:
     به منظور تعیین دوز بهینه برای القای آسیب حاد کلیوی(AKI) ، موش‌های صحرایی نر از گونه رتوس نروژیکوس با سن 12-8 هفته و وزن 250-180 گرم به مدت 18 ساعت در شرایط بی‌آبی قرار داده شدند در حالی که مواد غذایی طبق دستورالعمل استاندارد در اختیار حیوان قرار داده شد. مقادیر مختلف از محلول گلیسرول (5، 8، 10، 13 و 15 میلی لیتر بر کیلوگرم وزن حیوان) به صورت درون ماهیچه‌ای به حیوان تزریق شد. سپس در بازه‌های زمانی مختلف 24، 48 و 72 ساعت پس از تزریق، میزان آسیب ایجاد شده با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی و پاتولوژی مورد ارزیابی قرار گرفت تا بهترین مقدار و مناسب ترین زمان برای ایجاد آسیب تعیین شود.
 
گروه‌بندی موش‌های صحرایی و بررسی اثر درمانی سلول‌های بنیادی کشت داده شده در سکرتوم حاصل از سلول‌های بنیادی مزانشیمی دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 بر بهبود آسیب حاد کلیوی:
    پس از تزریق درون ماهیچه‌ای گلیسرول و القای موفقیت‌آمیز آسیب حاد کلیوی، موش‌های صحرایی به 4 گروه اصلی 10 تایی تقسیم شدند و سلول‌های مورد نظر به طور سیستمیک با استفاده از سرنگ انسولین به سیاهرگ دمی حیوان تزریق شدند. خصوصیات 4 گروه تحت مطالعه بدین شرح بود:
گروه 1: هیچ تزریقی صورت نگرفت (Cont.)
گروه 2: تزریق300 میکرولیتر بافر فسفات (PBS)
گروه 3: تزریق 300 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی حاوی بافر فسفات و تعداد 2 میلیون سلول‌های بنیادی مزانشیمیMSC))
گروه 4: تزریق 300 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی حاوی بافر فسفات و تعداد 2 میلیون سلول‌های بنیادی مزانشیمی کشت داده شده در مجاورت سکرتوم S-Nrf2)).
 
بررسی تاثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی کشت داده شده در سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 بر میزان اوره و کراتینین موش‌های صحرایی دچار آسیب حاد کلیوی:
    بر اساس گروه‌بندی انجام شده، در روزهای 3، 10 و 14 پس از تزریق، میزان اوره و کراتینین نمونه سرم مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین ترتیب نمونه‌های خون تهیه شده در دور rpm 4400 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شدند و پس از آن سرم خون از محتویات سلولی خون جدا شد. میزان اوره و کراتینین سرم تهیه شده در آزمایشگاه بیوشیمی سازمان انتقال خون ایران اندازه‌گیری شد.
 
بررسی تاثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی کشت داده شده  در سکرتـوم حـاصـل از سلـول‌هـای دست ‌ورزی شده با ژنNrf2  در بهبود شاخص‌های ریخت‌شناسی بافت کلیه:
    14 روز پس از سلول درمانی و به دنبال معدوم کردن موش‌های صحرایی طبق دستورالعمل استاندارد، مقاطع بافت کلیه تهیه گردید و رنگ‌آمیزی شد. به طور خلاصه مقاطع میکروسکوپی به ضخامت 5 میکرون، با استفاده از میکروتوم دوار(Rotary) از بافت کلیه تهیه شد. سپس نمونه‌ها با استفاده از الکل 20% فیکس‌شده و رنگ‌آمیزی به روش هماتوکسیلین- ائوزین صورت گرفت.
 
بررسی‌های آماری و تجزیه و تحلیل اطلاعات:
    داده‌ها و اطلاعات با استفاده از نرم‌افزار آماری 19 SPSS version و روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه (One way ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
دامنه طبیعی سازی و اختلاف معنادار با ارزش p کمتر از 05/0 گزارش شد.
 
یافته‌ها
سلول‌های ترانسفکت شده ژن ‌Nrf2 را بیان می‌کنند:
    72 ساعت پس از ترانسفکشن سلول‌ها با pcDNA3.1-Nrf2 ، بیان ژن‌ Nrf2 به روشPCR  ترانس کریپتاز معکوس و وسترن‌بلات در سلول‌های ترانسفکت شده در مقایسه با سلول‌های کنترل بررسی شد. سلول‌های ترانسفکت شده با  pcDNA3.1-Nrf2، که MSC-Nrf2 نامیده شدند، ژن Nrf2 را بیان کردند(شکل 1). در حالی که در سلول‌های دست‌ورزی نشده بیان این ژن مشاهده نشد. جهت کنترل مراحل آزمایش، بیان ژن بتااکتین نیز مورد بررسی قرار گرفت و هر دو گروه‌ مورد بررسی این ژن را به میزان مناسب بیان کردند(شکل 1). نتایج وسترن بلات و حضور باند مورد نظر در سلول‌های MSC-Nrf2 نشان داد که این سلول‌ها پروتئین Nrf2 را نیز بیان می‌کنند. سلول‌های مزانشیمی که ترانسفکت نشده بودند، این پروتئین را بیان نکردند (شکل2).
 

  

شکل 1: بررسی بیان ژن Nrf2 در سلول‌های MSCs ترانسفکت شده. شکل بالا: الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل اگارز 2% . M : مارکر bp100 ، MSCs-pcDNA3.1- Nrf2 : MSC ترانسفکت شده حاوی ژن Nrf2 ، Con-MSCs : MSC ترانسفکت نشده. شکل پایین: الکتروفورز محصول RT-PCR ژن بتا اکتین مربوط به همان گروه‌های سلولی.
 
 

شکل 2: بررسی بیان پروتئین Nrf2 در سلول‌های MSCs ترانسفکت شده: شکل بالا: Con-MSCs :MSC  ترانسفکت نشده،MSCs-pcDNA3.1- Nrf2 : MSC ترانسفکت شده حاوی ژن Nrf2 . شکل پایین: بیان پروتئین بتا اکتین مربوط به همان گروه‌های سلولی.


نمودار 1: بررسی میزان اوره سرم 24، 48 و 72 ساعت پس از تزریق مقادیر مختلف گلیسرول. میزان اوره پس از تزریق mL/kg 8 گلیسرول افزایش داشت (18 ±  388). تزریق مقادیر10 تا 15 mL/kg گلیسرول باعث افزایش مرگ و میر حیوانات می‌شد. مقدار mL/kg 8 به عنوان مقدار بهینه جهت القای آسیب کلیوی تعیین شد(001/0 p< : ***).



نمودار2: بررسی میزان کراتینین سرم 24، 48 و 72 ساعت پس از تزریق مقادیر مختلف گلیسرول. میزان کراتینین پس از تزریق mg/kg 8 افزایش داشت(6/0 ± 3/4). تزریق  مقادیر 10 تا 15 mg/kg گلیسرول باعث افزایش مرگ و میر حیوانات می‌شد. مقدار mL/kg 8 به عنوان مقدار بهینه جهت القای آسیب کلیوی تعیین شد(001/0 p< : ***).

تایید آسیب حاد کلیوی در موش‌های صحرایی:
    به منظور تعیین مقدار بهینه گلیسرول برای القای آسیب حاد کلیوی در موش‌های صحرایی، مقادیر مختلفی از گلیسرول به حیوانات تزریق شد و در بازه‌های زمانی مختلف میزان آسیب القا شده با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی و پاتولوژی مورد ارزیابی قرار گرفت .نتایج بیوشیمیایی و آسیب‌شناسی نشان داد که مقدار mL/kg 8 )میلی لیتر به کیلوگرم وزن حیوان) از محلول گلیسرول، 24 ساعت پس از تزریق منجر به ایجاد آسیب حاد کلیوی در موش‌های صحرایی می‌گردد. نمودار 1 و 2 به ترتیب نتایج بیوشیمیایی میزان اوره و کراتینین سرم خون را به عنوان دو شاخص اصلی آسیب حاد کلیوی نشان می‌دهد. میزان اوره و کراتینین به طور قابل ملاحظه‌ای در این مدل از آسیب حاد کلیوی افزایش می‌یابد که نشان‌دهنده نکروز پیش رونده بافتی و کاهش ناگهانی میزان قابلیت فیلتراسیون گلومرول بافت کلیه می‌باشد.
    نتایج تزریق مقادیر بالاتر گلیسرول نیز آسیب حاد کلیوی را نشان می‌داد اما میزان مرگ حیوانات در مقادیر گلیسرول 10 به بالا بسیار زیاد بود. هم چنین نتایج بافت‌شناسی آسیب‌های توبولی همانند فقدان حاشیه، فقدان سلول‌های اپی‌تلیال، بقایای سلولی در ناحیه لومن و کست‌های هیالینی را نشان می‌دهد که القای آسیب را در سطح بافتی تایید می‌کند(شکل 3). بنابراین مقدار  mL/kg8 از محلول گلیسرول بعد از گذشت 24 ساعت به عنوان مقدار و زمان بهینه برای القای آسیب حاد کلیوی تعیین شد.
 
سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 باعث بهبود اثرات درمانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بر روی آسیب حاد کلیوی می‌شود:
    بر اساس گروه‌بندی انجام شده، گروه‌های مختلف سلول‌های بنیادی مزانشیمی به موش‌های صحرایی تزریق شدند. میزان اوره و کراتینین نمونه سرم در روزهای 3، 7 و 14 پس از درمان در گروه‌های مختلف ارزیابی شد.
    طبق نتایج به دست آمده، در روز 3 تفاوت معناداری در
میزان اوره و کراتینین بین موش‌های صحرایی دچار آسیـب
حـاد کلیـوی دریافـت‌کننـده S-Nrf2 ، گروه MSC و گروه کنترل مشاهده نشد.
    در روز 7 میزان اوره سرم(mg/dL 9 ± 123) در گروه S-Nrf2 نسبت به گروه MSC (mg/dL 14±  209) به طور معناداری کاهش پیدا کرد(01/0 p<)(نمودار 3). هم چنین پس از گذشت 14 روز، اوره سرم( mg/dL5/3 ± 48) در گروه S-Nrf2 کاهش بیشتری در مقایسه با گروه MSC (mg/dL 9/9 ± 100) نشان داد(001/0 p< : ***). از طرفی از نظر کاهش کراتینین سرم نیز در روزهای 7 و 14 پس از درمان، تفاوت معنادار بین گروه S-Nrf2 نسبت به گروه MSC مشاهده شد. کاهش مقادیر به ترتیب در روز 7 ، mg/dL 35/0 ± 05/1 نسبت به mg/dL 43/0 ± 97/1 و در روز 14 ، mg/dL 15/0 ± 49/0 نسبت به mg/dL 26/0 ± 97/0 بود(نمودار 4)(به ترتیب 005/0 p< و 001/0 p<). این شواهد نشان‌دهنده تاثیر سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 بر روی بهبود اثرات درمانی سلول‌های بنیادی بود.
    14 روز پس از سلول درمانی، ترمیم بافت کلیه با بررسی مقاطع بافتی مورد ارزیابی قرار گرفت. در گروهی که سلول دریافت نکرده بودند آسیب کلیوی، از دست رفتن انسجام توبولی و پهن شدن سلول‌های اپی‌تلیال به وضوح دیده شد. در گروه MSC آسیب بافتی کمتر و بقایای سلولی مشاهده گردید. در حالی که در گروه دریافت‌کننده S-Nrf2 ، انسجام توبول‌ها مشابه حالت طبیعی بوده و آثار چندانی از آسیب بافتی مشاهده نشد(شکل C ، B ، A4).
    هم چنین بررسی مقاطع بافت‌شناسی در روز 14 پس از درمان و کمی‌سازی تعداد کست و میزان نکروز توبولی، تفاوت معناداری را بین تعداد کست‌های مشاهده شده در مقاطع بافت کلیه موش‌های صحرایی دچار آسیب حاد کلیوی تحت درمان با S-Nrf2 (تعداد کست: 26/0) و گروه MSC ( تعداد کست: 51/0) در مقایسه با گروه AKI که هیچ نوع سلولی دریافت نکرده بودند(تعداد کست: 6/3) نشان داد(001/0 p<). بررسی کمی میزان نکروز توبولی در همان روز نیز مبین بهبود بیشتر بافت کلیه در گروه S-Nrf2 (میزان نکروز توبولی: 97/0) در مقایسه با گروه MSC (میزان نکروز توبولی: 93/1) بود(001/0 p<)(شکل 4). در مجموع نتایج آزمایش‌های بیوشیمیایی و پاتولوژی مؤید تاثیر سکرتوم حاصل از سلول‌های دست‌ورزی شده با ژن Nrf2 بر بهبود اثرات درمانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بود(شکل D4).
 

 

شکل 3: نتایج ارزیابی پاتولوژی مقاطع بافت کلیه در موش‌های صحرایی 24 ساعت پس از تزریق درون ماهیچه‌ای mL/kg 8 گلیسرول. (+) : cast ، (-) : بقایای سلولی(Cell debries) و (*): از دست دادن هسته. وجود این مشخصات ریخت‌شناسی در مقاطع بافتی از علائم اصلی آسیب حاد کلیوی می‌باشند.
 
 

نمودار 3 : ارزیابی میزان اوره سرم در روزهای 3، 7 و 14 پس از درمان. 7 روز پس از درمان کاهش مقدار اوره در گروه  S-Nrf2 (9 ± 123) نسبت به گروه MSC (14 ± 209) معنادار بود(01/0 p< **). پس از گذشت 14 روز، اوره سرمی در گروه S-Nrf2 کاهش بیشتری (mg/dL 5/3  ± 48) در مقایسه با گروه MSC (( mg/dL9/9 ± 100) نشان داد(001/0 p< : ***).


نمودار 4: ارزیابی میزان کراتینین سرم در روزهای 3، 7 و 14 پس از درمان. در روز 7 کاهش مقدار کراتینین در گروه S-Nrf2 (35/0 ± 05/1) نسبت به گروه MSC (43/0 ± 97/1) معنادار بود(01/0 p< :**). پس از گذشت 14 روزکراتینین سرمی در گروه S-Nrf2 کاهش بیشتری (15/0 ± 49/0) در مقایسه با گروه MSC (26/0 ± 97/0) نشان داد(001/0 p< : ***).
 
 
شکل 4: بررسی پاتولوژی بافت کلیه در موش‌های صحرایی دچار آسیب حاد کلیوی ناشی از تزریق گلیسرول 14 روز پس از درمان سلولی: (A گروه AKI (بدون دریافت سلول): توبول‌های کلیوی انسجام خود را از دست داده‌اند، سلول‌های اپی‌تلیال پهن‌تر شده‌اند و بقایای سلولی مشاهده می‌گردند. (B گروه MSC : توبول‌ها منسجم‌تر می‌باشند، بقایای سلولی مشاهده می‌گردد و آسیب بافتی کمتری به نظر می‌رسد. (C گروه S-Nrf2 : انسجام توبول‌ها طبیعی می‌باشند و آثار چندانی از آسیب بافتی مشاهده نمی‌گردد. نمودار شمارش کست و نکروز توبولی در زمینه میکروسکوپی با بزرگ‌نمایی 400× . تعداد کست‌ها در گروه S-Nrf2 (میانگین 26/0) و گروه MSC (میانگین 51/0) در مقایسه با گروه AKI که هیچ نوع سلولی دریافت نکرده بودند(میانگین6/3) تفاوت معنادار داشت(001/0 p<). میزان نکروز توبولی در گروه S-Nrf2 (میانگین: 97/0) در مقایسه با گروه MSC (میانگین: 93/1) کاهش بیشتری داشت(001/0 p<).