چکیده سابقه و هدف عملکرد پلاکت‌ها در زمان نگهداری، متاثر از آسیب‌های دوران نگهداری می‌باشد که در میان شاخص‌های آن، بررسی تغییرات P-Selestin اهمیت به سزایی دارد. لذا برای ارزیابی کارآیی فرآورده‌های پلاکتی، بیان و ریزش این مارکر در پلاکت‌های فیلتر شده و عادی سنجیده شد. مواد و روش‌ها در یک مطالعه تجربی ـ کاربردی، 10 کیسه کنسانتره پلاکتی از پایگاه تهران تهیه و 5 روز نگهداری شدند. نیمی تحت فیلتراسیون کاهش لکوسیتی قرار گرفتند. 5 کیسه خون کامل منبع تهیه پلاکت کنترل بودند. از فلوسایتومتری و الایزا،به ترتیب برای بیان و ریزش مارکر P-Selectin استفاده شد. برای تحلیل داده‌ها، نرم‌افزار Graphpad و آزمون‌های Anova-one way و Mann-Whitney U test استفاده شد. یافته‌ها بیان P-Selectin فرآورده‌های فیلتر شده در روزهای 1، 3 و 5 به ترتیب 8/1% ± 5/13% ، 2/1% ± 2/15% و 5/2% ± 4/27% بود که در روز پنجم نسبت به سوم و اول افزایش معناداری داشت. در فرآورده‌های معمولی، بیان P-Selectin در روزهای 1، 3 و 5 به ترتیب 7/1% ± 4/7%، 2% ± 21٪ و 2/2% ± 10٪ بود که روز سومنسبت به اول افزایش و پنجم نسبت به سوم کاهش معناداری داشت. این کاهش می‌تواند به دلیل از دست رفتن رسپتورها حین ریزش و یا میکروپارتیکولاسیون متعاقب فعالیت شدید پلاکتی باشد. بررسی ریزش رسپتوری نیز نشان داد میزان P-Sel محلول فرآورده‌های فیلتری نسبت به غیر فیلتر در روز سوم به صورت معناداری کمتر بود. نتیجه گیری مطالعه‌ها نشان داد با توجه به بیان و ریزش این رسپتور، فیلتراسیون کاهش لکوسیتی می‌تواند منجر به کاهش آسیب‌های دوران نگهداری باشد. کلمات کلیدی:P-Selestin ، فرآیند کاهش لکوسیتی، فعالیت پلاکتی
تاریخ دریافت : 27/11/93 تاریخ پذیرش : 16/3 /94
1- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- PhD هماتولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- متخصص آسیب‌شناسی بالینی و تشریحی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- مؤلف مسؤول: دکترای علوم آزمایشگاهی، PhD بیوشیمی بالینی و فلوشیپ پلاکت و هموستاز ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه عملکرد اصلی پلاکت‌ها، شکل‌دهی پلاک هموستاتیک در پاسخ به آسیب عروقی به منظور توقف خونریزی است(1). فعال شدن پلاکت‌ها و اتصال آن‌ها به مکان‌های آسیب عروقی، یک فرآیند چند مرحله‌ای مشابه چسبندگی نوتروفیل‌ها به اندوتلیوم ملتهب است که به واسطه واکنش رسپتورهای سلکتینی و اینتگرینی با لیگاندهای مربوطه صورت می‌پذیرد(2). تزریق فرآورده‌های پلاکتی یکی از مهم‌ترین راه‌کارهای درمانی در مواجهه با بیماران ترومبوسیتوپنیک و هم چنین ممانعت و یا پیشگیری از عوارض خونریزی‌دهنده است. دو روش کلی برای تهیه پلاکت وجود دارد که شامل تهیه پلاکت از خون کامل و پلاکت آفرزیس می‌باشد. انواع فرآورده‌های پلاکتی شامل پلاسمای سرشار از پلاکت Platelet Rich Plasma (PRP)، بافی کوت Buffy coat (BC) و پلاکت حاصل از آفرزیس‌اند که هر کدام از آن‌ها ممکن است همراه با روش‌های کاهش لکوسیت نیز باشند(3). آسیب‌های دوران نگهداری پلاکت Platelet Storage Lesion (PSL) به مجموعه‌ای از اختلالات مرتبط با ذخیره‌سازی پلاکت اطلاق می‌شود که ناشی از بیش فعالی ناخواسته پلاکت‌ها در سطوح مختلف است(4). در شرایط in vitro ، کیفیت پلاکت‌های نگهداری شده را می‌توان با مطالعه مورفولوژی، چرخش(swirling)، نحوه پاسخ به آگونیست‌ها، بررسی بیان گلیکوپروتئین‌های سطحی(GPIb، GPIIb/GPIIIa) و بررسی مارکرهای فعال شدن پلاکت شامـل CD40L ، P-Sel و CD63 مـورد مطالعه قرار داد(5). مطالعه‌ها حاکی از یک ارتباط معکوس قوی بین بیان سطحی P-Sel و بازیابی فعالیت(recovery) در پلاکت‌های تزریقی می‌باشد(6). بنابراین در میان شاخص‌های مورد مطالعه در PSL ، بررسی میزان تغییرات P-Sel از اهمیت به سزایی برخوردار است که ناشی از افزایش برگشت ناپذیر سطوح کلسیم داخل سلولی و آزادسازی محتویات گرانولی آلفا می‌باشد(2). نقش P-Sel پلاکتی در جذب لکوسیت‌ها به ترومبوس در حال رشد بسیار حایز اهمیت است(7). هم‌زمان با توسعه تشکیل ترومبوس در in vivo به دلیـل افزایـش سطـوح کلسیـم داخـل سلولـی و متعاقبـاً فعالیت متالوپروتئینازهای غشایی، فرآیند ریزش(Shedding) رسپتورهای پیش التهابی نیز رخ می‌دهد که اهمیت به سزایی در تنظیم مراحل جذب و فراخوانی گلبول‌های سفید در محل لخته و در نتیجه تنظیم فرآیندهای التهابی دارد. با این وجود به رغم نقش فیزیولوژیکی رسپتورهای پیش التهابی، بیان این رسپتورها در فرآورده‌های پلاکتی نگهداری شده منجر به اختلالات عملکردی این عناصر در مواجهات سلولی متعاقب تزریق خواهد بود(6، 4). P-Sel محلول در فرآورده‌های پلاکتی نیز وجود دارد و این احتمال که افزایش آن بتواند به عنوان یک فاکتور خطر برای ترومبو آمبولیسم وریدی مطرح باشد، مد نظر محققین قرار گرفته است(8). بررسی‌های مختلف، ارتباط مستقیمی بین شکل محلول P-Sel و درصد پلاکت‌های P-Sel مثبت را گزارش می‌نماید و مطالعه‌های موجود حاکی از افزایش آن‌ها در فرآورده‌هـای پلاکتی متناسب با زمان نگهداری است(10-8). صرف نظر از افزایش بیان و یا ریزش رسپتورP-Sel در فرآورده‌ها، موضوع قابل توجه دیگر در این مطالعه، نقش واکنش‌های متقابل پلاکت- لکوسیتی، در القای فرآیندهای مرتبط با فعال‌سازی پلاکت‌ها می‌باشد. در این رابطه برخی از مطالعه‌های انجام شده حاکی از اثرات مضاعف تحریکی لکوسیت‌ها بر روی پلاکت‌های فعال شده است که این اثرات می‌تواند متاثر از واکنش محصولات گرانولی لکوسیت‌های تحریک شده با پلاکت‌های فعـال در یـک فـرآیند متقابل باشد(12، 11، 7). با توجه به این بررسی‌ها، احتمال این که حذف و یا کاهش لکوسیت‌ها در فرآورده‌های پلاکتی بتواند منجر به تاثیراتی در کاهش فرآیند PSL گردد، مد نظر خواهد بود. لذا در این مطالعه، از بررسی سطوح بیان و هم چنین ریزش رسپتور پیش التهابی P-Sel به عنوان یکی از شاخص‌های افزایش فعالیت پلاکتی در حین نگهداری و هم چنین شاخصی مفید جهت ارزیابی غیر مستقیم عملکرد فرآورده‌های عادی و فرآورده‌های کاهش لکوسیتی پلاکت در بالین استفاده خواهد شد. مواد و روش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی ـ کاربردی بود. جامعه مورد مطالعه کیسه‌های پلاکتی متراکم و کیسه‌های خون کامل تهیه شده در پایگاه انتقال خون تهران بودند. نمونه‌گیری به صورت انتخاب تصادفی انجام پذیرفت. 5 کیسه پلاکتی متراکم به صورت عادی و 5 کیسه پلاکتی به صورت فیلتر شده مورد بررسی قرار گرفتند. از 5 کیسه خون کامل نیز نمونه کنترل پلاکتی با استانداردهای آزمایشگاهی جداسازی گردید. در این روش برای تهیه پلاکت کنترل مرجع، ابتدا کیسه خون در دور سبک g300 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شد و پلاسمای سرشار از پلاکت(PRP) از رسوب RBC جدا گردید. سپس در مرحله بعد در دور g 1700 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گشت و پلاسمای رویی برداشته و تکمه پلاکتی در محلول تایرود حاوی 1 میلی‌مولار کلرید کلسیم و U/mL02/0Aprase سوسپانسیون مجدد گردید. در خصوص پلاکت کنسانتره تنها مرحله دوم سانتریفیگاسیون انجام پذیرفت و جداسازی پلاکت مطابق دستورالعمل ادامه یافت. فیلتراسیون کیسه‌های پلاکتی با استفاده از فیلترهایin line پلاکتی محصول شرکت PALL(Pall medical ref number PL1BE-America) صورت پذیرفت. برای این منظور ابتدا ورودی کیسه پلاکتی زیر هود باز و به فیلتر متصل گردید؛ لکوسیت‌های موجود در کیسه پلاکتی ضمن عبور از فیلتر، توسط فیلتر برداشته شدند و نمونه پلاکتی فاقد لکوسیت در کیسه متصل به فیلتر جمع‌آوری شد. با استفاده از دستگاه متصل‌کننده کوردهای کیسه‌های خون به شکل استریل(Terumo Sterile Tubing Welder TSCD-II- ژاپن Terumo Corporation-)، کیسه‌های پلاکتی عادی و فیلتر شده در شرایط بسته و استریل در کیسه‌های اقماری(آمریکا ـ JMS-North) به سه بخش تقریباً مساوی تقسیم شدند که تا زمان آزمایش در آژیتاتور پلاکتی انکوباتوردار و در دمای25درجه سانتی‌گراد نگهداری گردیدند. نمونه‌های حاصله از این سه بخش در روزهای متوالی 1، 3 و 5 بعد از نگهداری بررسی شدند. بعد از فیلتراسیون، گلبول‌های سفید با استفاده از چمبر نجـت(ChamberNageotte) شمـارش شدنـد تـا از کاهش شمارش لکوسیتی به زیر حد مجاز، یعنی 105 * 3/8 در هر کیسه پلاکتی، اطمینان حاصل شود(13). آگونیست قوی یونوفور کلسیم A23187 (سیگما، آلدریچ، آمریکا) منجر به افزایش شدید کلسیم داخل سلولی پلاکت و فعال‌سازی پلاکت‌ها در حد بسیار بالایی می‌شود و در این شرایط بالاترین سطح ریزش مارکرهای پلاکتی و به خصوص P-Sel را خواهیم داشت. به لوله‌های پلاکتی، یونوفور کلسیم A23187در غلظت نهایی 5 میکرومولار افزوده و بعد از طی 2 ساعت، انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، این لوله‌ها به مدت 5 دقیقه در دور g1700 سانتریفوژ و پلاسمای آن جدا گردید که بعد از جداسازی میکروپارتیکل‌ها، از این پلاسما به عنوان کنترل مثبت آزمایش الایزا برای بررسی حداکثر Shedding استفاده شد. جهت مطالعه‌های پاسخ پلاکت به تحریکات آگونیستی، میزان لازم از آگونیست TRAP (سیگما، آلدریچ، آمریکا) در غلظت نهایی 2 میکرومولار اضافه شد. این آگونیست جهت ایجاد پلاکت‌های تحریک شده، برای مطالعه پاسخ به آگونیست استفاده گردید. برای بررسی بیان P-Sel از دستگاه فلوسایتومتر(پارتک ـ آلمان) و جهت آنالیز یافته‌ها از نرم‌افزار flowjo استفاده گردید. ابتدا پلاکت‌ها را با محلولTyrode به کانت 108 * 5 در میکرولیتررساندیم، سپس به مدت 5 دقیقه در دور g 1700 سانتریفوژ نمودیم تا پلاسمای آن جدا گردید. تکمه پلاکتی را با Tyrode حاوی Apyrase (محصول سیگما) با غلظت نهایی U/mL 02/0 و کلرید کلسیم 1 میلی‌مولار سوسپانسیون مجدد کردیم و از آن برای فلوسایتومتری، سوسپانسیونی با کانت 107 * 3 در میکرولیتر تهیه نمودیم. پلاکت‌ها به لوله‌های اپندورف انتقال یافته و در صورت نیاز در مواجهه با آگونیست‌های TRAP (در غلظت نهایی 2 میکرومولار) و یونوفور کلسیم A23187 (در غلظت نهایی 5 میکرومولار) تیمار گردیدند و یا بدون آگونیست همراه با آنتی‌بادی ضد CD62P (mouse anti human CD62 P-PE-BD)(بیوساینس ـ نیوجرسی) و یا آنتی‌بادی علیه CD42b (anti human کالیفرنیاCD42b-FITC- e bioscience- ) به مدت 45 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. شایان ذکر است که لوله‌ای نیز به عنوان کنترل ایزوتایپ با اضافه نمودن IgG1 موشی(Mouse IgG1 Isotype control ـ میلتنی بیوتک ـ آلمان)، بدون آنتی‌بادی‌های اختصاصی در نظر گرفته شد. بعد از طی شدن زمان انکوباسیون، پلاکت‌ها با پارافرمالدهید 2%فیکس گردیده و متعاقباً جهت تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری به لوله‌های مخصوص منتقل گردیدند. در فلوسایتومتری ابتدا جمعیت پلاکتی توسط پلاکت‌های رنگ‌آمیزی شده با آنتی‌بادی علیه CD42b مشخص گردید. به منظور اطمینان از عملکردی بودن پلاکت‌ها، نمونه‌های پلاکتی روز اول که با آگونیست TRAP تیمار گردیده بود، در مقابل پلاکت در حال استراحت از نظر بیان P-Selمورد ارزیابی قرار گرفت. برای بررسی Shedding مولکول P-Sel ، پلاسمای جدا شده اولتراسانتریفوژ گردید. به این صورت که ابتدا پلاسما در دور g20000 به مدت 30 دقیقه و سپس به مدت 10 دقیقه دیگر، سانتریفوژ گشت تا میکروپارتیکل‌های احتمالی موجود، از پلاسما حذف شوند. برای سنجش کمی مولکول P-Sel محلول، کیت اندازه‌گیری از شرکت آبکام(P-انگلستانSelectin human ELISA Kit- abcam-) با روش ساندویچ مورد استفاده قرار گرفت.
برای تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار آماری Graphpad استفاده شد. برای مقادیر خام هر گروه، میانگین و انحراف معیار محاسبه شد و برای مشخص کردن منشا تفاوت احتمالی بین سه گروه، از آزمایش Anova-one way (با پست آزمایش Newman- Keuls Multiple Comparison) استفاده شد. برای مقایسه تفاوت‌های بین دو گروه از Mann- Whitney U test استفاده شد.
یافته‌ها در آنالیز فلوسایتومتری متعاقب بررسی پلاکتی روز اول، گیت پلاکتی مشخص شد و سطوح بیان P-Sel پلاکت‌ها در حالت استراحت و متعاقب آگونیست TRAP نشان داده شد (شکل 1). در فرآورده‌های پلاکتی عادی، سطوح بیان P-Sel در روزهای 1 ، 3 و 5 به ترتیب 7/1 ± 4/7 ، 2 ± 21 و 2/2 ± 10 درصد برحسب SE±mean بود. همان طور که اعداد نشان می‌دهد، بیان این مارکر در روز سوم نسبت به روز اول افزایش معناداری داشت(05/0 p<). هم چنین سطوح بیان P-Sel در روز پنجم نسبت به روز سوم کاهش نشان داد که این کاهش از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<). بیان P-Sel در روز 5 نسبت به روز 1 افزایش نشان داد که البته از نظر آماری معنادار نبود.
شکل 1: a- اسکترگرام دو بعدی( SSC/FSC) و گیت پلاکتی مربوطه را نشان می‌دهد. b-هیستوگرام، بیان P-Sel پلاکت در حال استراحت و فعال شده متعاقب آگونیست TRAP را نشان می‌دهد.
در فرآورده‌های فیلتر شده، سطوح بیان P-Sel در روزهای 1 و 3 و 5 به ترتیب 8/1 ± 5/13 ، 2/1 ± 2/15 و 5/2 ± 4/27 درصد بر حسب mean ± SE بود. P-Sel در روز سوم نگهداری نسبت به روز اول افزایش نشان داد که البته از نظر آماری معنادار نبود. سطوح بیان P-Sel در روز پنجم نسبت به روز سوم افزایش نشان داد که این افزایش از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<). بیان P-Sel در روز 5 نسبت به روز 1 افزایش نشان داد که از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<). میزان بیان P-Sel نمونه پلاکت کنترل در روز تهیه، 1% ± 9% بر حسب mean ± SE بود. میزان بیان رسپتور P-Sel در نمونه‌های غیر فیلتر تفاوت معناداری با نمونه کنترل تهیه شده در آزمایشگاه نداشت در حالی که میزان P-Sel فرآورده‌های فیلتر نسبت به کنترل افزایش معنادار نشان داد(05/0 p<).
نمودار 1: تغییرات بیان P-Sel فرآورده‌های فیلتر و غیر فیلتر در طی نگهداری * (05/0 p<). ** (01/0 p<). ns (no significant). (standard error) data are mean ± SE
در مقایسه فرآورده‌های فیلتر و غیر فیلتر مشاهده شد که بیان P-Sel در فرآورده‌های فیلتر شده در طی دوران نگهداری به صورت صعودی افزایش نشان داد؛ در حالی که در فرآورده‌های غیر فیلتر، افزایش بیان P-Sel در روز سوم با کاهش این مارکر در روز پنجم همراه بود.همان طور که پیشتر ذکر شد، در روز اول نگهداری تفاوت این مارکر بین این دو فرآورده از نظر آماری معنادار نبود اما در روز سوم و پنجم این تفاوت از نظر آماری معنادار بود که در روز سوم بیان این مارکر در فرآورده‌های غیر فیلتری نسبت به فیلتری بالاتر(05/0 p<) و در روز پنجم در فرآورده‌های فیلتری نسبت به غیر فیلتری بالاتر بود(01/0 p<)(نمودار 1). در آنالیز الایزا مشاهده شد که در فرآورده‌های غیر فیلتر، سطوح P-Sel محلول در روزهای 1 و 3 و 5 به ترتیب 6 ± 14 ، 35 ± 329 و 27 ± 395 ng/mL بر حسب mean ± SE بود. سطوح P-Selمحلول در طی نگهداری افزایش یافت. میزان این مولکول در روز اول نسبت به کنترل تفاوت معناداری نشان نداد. افزایش این مولکول در روز سوم نسبت به روز اول معنادار بود(001/0 p<)، اما افزایش در روز پنجم نسبت به روز سوم از نظر آماری معنادار نبود. P-Selمحلول در روز 5 نسبت به روز 1 افزایش نشان داد که این افزایش از نظر آماری معنادار بود(001/0 p<). در فرآورده‌های فیلتری، سطوح P-sel محلول در روزهای 1 و3و 5 به ترتیب 5 ± 25 ، 23 ± 133 و 45 ± 299 ng/mL بر حسب mean ± SE بود که مانند پلاکت‌های غیر فیلتر، الگوی افزایشی نشان داد. در این فرآورده‌ها نیز سطوح این مولکول در روز تهیه نسبت به کنترل تفاوت معناداری نشان نداد. در روز سوم نگهداری میزان این مولکول نسبت به روز اول افزایش معناداری داشت(05/0 p<). میزان P-Sel محلول در روز پنجم نسبت به روز سوم افزایش معنادار نشان نداد. میزان P-Sel محلول در روز پنجم نسبت به روز اول افزایش نشان داد که این افزایش از نظر آماری معنادار بود(001/0 p<). در مقایسه‌ای که بین فرآورده‌های فیلتر شده و غیر فیلتر صورت گرفت، در روز 1 نگهداری، اگر چه میزان این مولکول در پلاکت‌های فیلتر شده اندکی بالاتر از پلاکت‌های فیلتر نشده بود، اما از نظر آماری معنادار نبود. در روز سوم نگهداری، میزان P-Sel محلول در پلاکت‌های فیلتر نشده نسبت به فیلتر شده افزایش نشان داد که از نظر آماری معنادار بود(05/0 p<). در روز پنجم نگهداری، اگر چه میزان P-Sel محلول در پلاکت‌های فیلتر نشده نسبت به فیلتـر شـده بالاتر بود ، اما این تفاوت از نظر آماری معنادار نبود( نمودار 2).
نمودار 2: تغییرات میزان P-Sel محلول فرآورده‌های فیلتر و غیر فیلتر در طی نگهداری ns (no significant) * (05/0 p<) Mean ± SE (standard error)data are
بحث همان گونه که قبلاً ذکر شده است، امروزه مراکز انتقال خون دنیا فرآورده‌های پلاکتی را با روش‌های مختلفی تولید می‌کنند که تاکنون مطالعه‌های متعددی در خصوص مقایسه کیفیت این فرآورده‌ها با استفاده از روش‌های مرسوم صورت گرفته است. دسته‌ای از پژوهش‌ها به بررسی و مقایسه فرآورده‌های پلاکتی مشتق از بافی‌کوتbuffy coat (BC) و پلاسمای سرشار از پلاکت PLT-rich plasma (PRP) و هم چنین پلاکت‌های تهیه شده با روش آفرزیس پرداخته‌اند. از جمله این مطالعه‌ها، بررسی اسکریپ چنکو است که نتایج حاصله در تایید مطالعه‌های قبلی بوده است و حاکی از فعال شدن بیشتر پلاکت‌های حاصل از روش PRP در حین تولید در مقایسه با روش BC است. در محصولات آفرزیس نیز P-Sel به عنوان مارکر فعال شدن پلاکت در سطح پلاکت و در پلاسما سنجیده شد که بیانگر افزایش تدریجی آن در طول نگهداری بود(8). در مطالعه‌ای که روی محصولات PRP وBC انجام شد، محققان دریافتند که درصد بالاتری از پلاکت‌های P-Sel مثبت در محصولات تهیه شده با روش PRP نسبت به محصولات تهیه شده با روش BC وجود داشت(9). در بررسی مشابهی که توسط لویـن و همکارانـش انجام
500 400 300 200 100 0
روز 5 روز 3 روز 1 زمان
پذیرفته نیز مطالعه متغیرهایی چون pH ، PO2 ،PCO2 ، گلوکز و لاکتات به همراه P-Sel و CD42a حاکی از شاخص‌های پایین‌تر فعالیت پلاکتی در فرآوردهای تولیدی با روش BC نسبت به PRP بوده است(14). در مطالعه‌ای دیگر هولمز و همکارانش نشان دادند که متعاقب تهیه پلاکت‌های خون کامل و PRP ، بیان اندک P-Sel در حدود 10%-2% در روز اول دیده می‌شود؛ در حالی که بیان افزایشی P-Sel در حدود 30%-20% در پلاکت‌های کنسانتره روز اول دیده می‌شود(15). رایندر و همکارانش نشان دادند که بین 60%-40% از پلاکت‌ها در طول نگهداری P-Sel را بیان می‌کنند و درصد پلاکت‌های P-Selمثبت در طول نگهداری PRP ، به طور فزاینده‌ای افزایش می‌یابد(17، 16). در یک بررسی که توسط میدل برگ و همکارانش انجام شد، بیان P-Sel در هر روز حدود2/1% افزایش داشت(18). در رابطه با پلاکت‌های غیر فیلتر در مطالعه حاضر، نشان داده شده است که درصد بیان P-Sel در روز اول، تفاوت معناداری با کنترلدر حال استراحت نشان نداد. اما در روز سوم نگهداری نسبت به روز اول افزایش معناداری مشاهده شد که بیانگر اوج گرفتن فرآیند PSL بود. بیان این مارکر در روز پنجم با کاهش چشمگیری همراه بود که با توجه به بالا بودن بیان این مارکر در روز سوم، احتمال می‌رود که این کاهش ناشی از میکروپارتیکولاسیون و یا ترشح شدید P-Sel در مراحل نهایی فعال شدن پلاکت‌ها باشد. چرا که میکروپارتیکولاسیون پلاکتی باعث از دست رفتن عمده سطح غشایی پلاکت همراه با رسپتورهای سطحی موجود آن می‌شود. با این وجود یافته ما متفاوت از یافته‌های براون، رایندر و میدل برگ می‌باشد که افزایش مداوم درصد P-Sel را در طول دوران نگهداری نشان داده‌اند(18-16). این امر نیز می‌تواند به دلیل فعالیت بالاتر پلاکتی در روز پنجم نگهداری فرآوردهای ما باشد که منتج به ترشح بالاتر رسپتور و یا میکروپارتیکولاسیون شدیدتر پلاکتی گردیده است. به نظر می‌رسد بررسی هم زمان بیان PSel و آزادسازی میکروپارتیکل‌ها در مطالعه‌های آینده در تفسیر دلایل این کاهش راهگشا باشد(مطالعه منتشر نشده دکتر قاسم‌زاده و همکاران). اثرات روش‌های کاهش لکوسیتی در مقوله PSL تاکنون موضوعی بحث برانگیز(controversial) بوده است که طیفی از گزارش‌های متناقض را شامل می‌گردد. گزارش‌های معدودی وجود دارد که حاکی از نقش کاهنده فرآیند حذف لکوسیتی بر روی PSL و فعال شدن پلاکت‌ها می‌باشد. در یکی از این پژوهش‌ها، محققین نشان داده‌اند که فیلتراسیون قبل از ذخیره می‌تواند سرعت فعال شدن پلاکت‌ها را در مدت نگهداری کاهش دهد که این امر ناشی از حذف میزان قابل قبولی از گلبول‌های سفید است(19). در مطالعه دیگری که بر روی فرآورده‌های پلاکتی کاهش لکوسیتی پیش از ذخیره انجام شد، مشخص شد که فیلتراسیون کاهش لکوسیتی باعث کاهش بیان P-Sel و کاهش فرم محلول HLA-1 (sHLA-1) می‌گردد(20). این مطالعه‌ها در تناقض با یافته‌های برخی دیگر از محققین قرار دارد که معتقدند فیلتراسیون اثر منفی روی فعالیت پلاکت‌ها دارد به طوری که تماس فیزیکی بین فیلتر و پلاکت‌ها سبب فعال شدن پلاکت‌ها شده و در نهایت حیات و عملکرد آن‌ها را تحت تاثیر قرار می‌دهد. نمونه‌ای از این مطالعه‌ها توسط فوکوناگا و همکارانش انجام پذیرفته که نشان داده‌اند بیان آنتی‌ژن‌های P-Sel و CD63 (که به عنوان مارکرهای فعال شدن پلاکت شناخته می‌شوند)، در استفاده از فیلتر افزایش می‌یابد(21). در این رابطه، مطالعه برادلی و همکارانش در سال 1999 نشان داده است که فیلتراسیون پیش از ذخیره می‌تواند روند فعال شدن پلاکت‌ها در طی مدت ذخیره‌سازی را تسریع نماید.این گروه نشان دادند که پلاکت‌های فیلتر شده به طور قابل توجهی سطوح بالاتری از مارکرهای فعال شدن پلاکتی شامل P-Selو CD63 ، تغییرات مورفولوژی و افزایش میکروپارتیکل را در طول زمان نگهداری نشان می‌دهند(22). در مطالعه کاستلی و همکارانش نیز نشان داده شد در طی 8 روز نگهداری فرآورده‌های PRP فیلتر شده، افزایش ثابتی در درصد سلول‌های P-Sel مثبت دیده شد(9). مضـاف بـر ایـن پاره‌ای از مطالعه‌ها نیز وجود دارند که حاکی از تاثیرات نامحسوس و یا اندک فیلترهای کاهش لکوسیتی بر روی ارتقای عملکرد پلاکت‌ها در فرآورده‌های تولیدی می‌باشند که از جمله آن‌ها مطالعه‌ای از دزیک و همکارانش و سوئنی و همکارانش در خصوص اثر لکوسیت‌های باقی‌مانده بر فرآیند PSL می‌باشد(24، 23). فارغ از هرگونه مقایسه بین فرآورده‌های فیلتر شده و فیلتر نشده، در فرآورده‌های فیلتر شده کاهش لکوسیتی نیز همانند فرآورده‌های غیر فیلتر، افزایش فرآیند PSL رابطه مستقیمی با طول دوره نگهداری دارد و درصد بیان P-Sel در طول نگهداری افزایش می‌یابد که همراه با کاهش بقا می‌باشد(25). مطالعه‌های ما درخصوص فرآورده‌های فیلتر شده حاکی از آن است که میزان بیان P-Sel پلاکت‌ها در روز اول نگهداری، به شکل معناداری بالاتر از میزان یاد شده در نمونه کنترلی استاندارد بوده است. به نظر می‌رسد این افزایش بیان می‌تواند به علت تحریک پلاکت‌ها حین برخورد با فیلتر باشد. در پلاکت‌های فیلتر شده بیان P-Sel در روز سوم نگهداری افزایش یافت که البته معنادار نبود. به نظر می‌رسد دلیل عدم تفاوت معنادار افزایش P-Sel در روز سوم نسبت به روز اول که برخلاف نمونه غیر فیلتر بوده است، افزایش بیان ناخواسته موجود در روز اول نمونه فیلتر شده باشد که موجب کاهش این تفاوت گردیده است. در روز پنجم، بیان P-Sel نسبت به روز سوم و اول با افزایش همراه بود که با اهمیت تلقی می‌شد. در این پژوهش، بیان P-Sel در پلاکت‌های فیلتر و غیر فیلتر مقایسه گردید که با توجه به مجموع نتایج، تاثیر مثبت فیلتراسیون کاهش لکوسیتی را نشان داد که احتمالاً ناشی از حذف لکوسیت‌ها می‌باشد(نمودار 1). همان طور که در شکل مشاهده می‌شود، در روز پنجم، افزایش بیان P-Sel در کیسه‌های فیلتر شده به سیر صعودی خود ادامه داد که به طور غیر مستقیم نشان دهنده این است که پلاکت‌ها ممکن است دچار میکروپارتیکولاسیون و ریزش کمتر این مارکر در مقایسه با فرآورده فیلتر نشده‌ای گردیده باشند که در روز پنج نگهداری خود، بیان P-Sel آن‌ها با کاهش چشمگیری نسبت به روز سوم نگهداری همراه بود. این امر حاکی از این است که در فرآورده‌های فیلتر شده میزان فعالیت پلاکتی کمتر بوده است که در نتیجه آن چه به دلیل محتمل کمتر بودن Shedding اختصاصی رسپتور و یا چه به دلیل میکروپارتیکولاسیون کمتر و از دست رفتن کمتر غشای حامل رسپتور از سطح پلاکت، میزان بیان PSel در فرآورده فیلتره روز پنجم کاهش نیافته است. در خصوص سطح P-Sel محلول در فرآورده‌های پلاکتی نگهداری شده نیز مطالعه‌های متعددی توسط سایر محققان انجام شده است که مطالعه‌های ما نیز هم‌خوانی متناسبی را با تحقیقات نشان داده است. در تحقیقات ما با توجه به اولتراسانتریفوژ صورت گرفته در پلاسما، سطوح حاصله منعکس کننده میزان P-Sel ترشحی است و برخلاف اکثر مطالعه‌ها P-Sel موجود، میکروپارتیکل‌ها را شامل نمی‌شود. کاستلی و همکارانش اذعان داشتند که آنالیز ایمنواسی P-Sel محلول نسبت به فلوسایتومتری برای سنجش درصد سلول‌های P-Sel مثبت حساس‌تر است و منجر به شناسایی سریع‌تر فعال شدن پلاکت‌ها می‌شود. این مطالعه هم چنین حاکی از آن است که میزان P-Sel محلول در فرآورده‌های پلاکتی PRP به شکل معناداری نسبت به بافی کوت بالاتر است(05/0 p<). این گروه هم چنین نشان داد که در طول 8 روز نگهداری فرآورده‌های پلاکتی PRP فیلتر شده، افزایش پایداری در P-Sel محلول دیده می‌شود که به علاوه به طور معناداری مرتبط با درصد سلول‌های P-Sel مثبت بود(0001/0 p<)(9). در مطالعه ما نیز که روی پلاسمای اولتراسانتریفوژ شده حاصل از پلاکت‌های غیر فیلتر و فیلتر صورت گرفت، میزان P-Sel محلول فرآورده‌های پلاکتی نسبت مستقیمی با طول زمان نگهداری داشته است که این افزایش منعکس کننده میزان P-Sel ترشحی(shed شده) می‌باشد. میزان افزایش P-Sel محلول در روز سوم و پنجم نسبت به روز اول معنادار بود. افزایش shedding این مارکر در حین نگهداری می‌تواند وقوع PSL را پیش‌بینی کند. نتایج با پلاکت‌هـای کنترل مقایسه و تایید شد. به طور کلی میزان P-Sel محلول فرآورده‌های فیلتره نسبت به غیر فیلتره پایین‌تر است که نشان‌دهنده کیفیت بالاتر فرآورده‌های فیلتره می‌باشد. این کاهش به خصوص در روز سوم نگهداری در فرآورده‌های فیلتره به صورت معناداری پایین‌تر است.
نتیجه‌گیری بررسی‌های این پژوهشنشان داد که فرآیند فیلتراسیون کاهش لکوسیتی هر چند در روز اول نگهداری ممکن است به دلایلی منجر به افزایش اندک میزان بیان و سطح محلول P-Sel گردد، ولیکن به طور کلی کاهش لکوسیت‌ها می‌تواند اثر مثبتی در کاهش میزان P-Sel در طول دوره نگهداری فرآورده پلاکتی داشته باشد. این موضوع با توجه به سنجش بیان سطحی این مارکر و فرم محلول آن قابل استنباط است، زیرا همان طور که گفته شد، کاهش بیان سطحی P-Sel فرآورده‌های غیر فیلتر در روز پنجم می‌تواند ناشی از ریزش این مارکر به دلیل فعالیت شدیدتر پلاکتی باشد موضوعی که در فرآورده‌های فیلتر شده مشاهده نگردید. این یافته در راستای مطالعه‌های علوم پایه‌ای است که نشان داده‌اند، لکوسیت‌ها می‌توانند نقشی اساسیرا در فعال‌سازی پلاکت ایفا نمایند، با این وجود مطالعه سایر مارکرهای فعالیتی پلاکت‌ها می‌تواند جهت تایید یافته‌های موجود مغتنم باشد.
تشکر و قدردانی این مقاله منتج از طرح تحقیقاتی مصوب شماره 1496-33-01-1390 دکتر مهران قاسم‌زاده می‌باشد که بخشی از آن پایان‌نامه خانم مهدیه مهرپوری دانشجوی کارشناسی ارشد مصوب مرکز تحقیقات مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون است. نویسندگان از حمایت‌های مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون تشکر می‌نمایند، هم چنین همکاری مجدانه پایگاه انتقال خون استان تهران به خصوص خانم فاطمه عباسی نیز شایان تقدیر است. نویسندگان هم‌چنین از زحمات خانم مهندس مریم‌السادات طاهری تشکر می‌نمایند.
Mehrpoori M, Hosseini E, Amini Kafi-Abad S. The effect of pre-storage leukoreduction on the levels of expression and shedding of the pro-inflammatory molecule P-Sel in random PRP platelets. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2015; 12 (2) :153-162 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-942-fa.html
مهرپوری مهدیه، حسینی احترام‌السادات، امینی کافی‌آباد صدیقه، قاسم‌زاده مهران. اثر فرآیند کاهش لکوسیتی پیش از ذخیره بر سطوح بیان و ریزش رسپتور پیش التهابی P-Selectin در فرآورده‌های پلاکت رندوم حاصله از PRP. فصلنامه پژوهشی خون. 1394; 12 (2) :153-162
