جلد 12، شماره 2 - ( تابستان 1394 )
جلد 12 شماره 2 صفحات 134-125 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Shirzad M, Heidarian E, Poorgheisari B, Amini Sarteshnizi N, Soorani Z, Beshkar P. The effect of hespertin in the induction of apoptosis and necrosis in lymphoblastic cell line Jurkat. bloodj 2015; 12 (2) :125-134
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-886-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-886-fa.html
شیرزاد معین، حیدریان اسفندیار، پورقیصری بتول، امینی سرتشنیزی نعمت‌اله، سودانی زهرا، بشکار پژمان. اثر هسپرتین بر القای آپوپتوز و نکروز در لاین سلولی لنفوبلاستیک Jurkat Cells. فصلنامه پژوهشی خون. 1394; 12 (2) :125-134
معین شیرزاد 
، اسفندیار حیدریان ، بتول پورقیصری ، نعمت‌اله امینی سرتشنیزی ، زهرا سودانی ، پژمان بشکار*
، اسفندیار حیدریان ، بتول پورقیصری ، نعمت‌اله امینی سرتشنیزی ، زهرا سودانی ، پژمان بشکار*
شهرکرد ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
متن کامل [PDF 681 kb]
(2280 دریافت)
| چکیده (HTML) (8504 مشاهده)
مقدمه
امروزه سرطان با بیش از 10 میلیون مورد جدید و بیش از 6 میلیون مرگ ناشی از آن هر ساله در سراسر جهان یکی از مهم‌ترین دلایل مرگ و میر محسوب می‌گردد. پیش‌بینی می‌شود که تا سال 2020 ، هر ساله 15 میلیون مورد جدید و 10 میلیون مرگ در اثر سرطان داشته باشیم. سرطانهای خون یا لوسمیها حدود 8% از کل سرطانهای جمعیت انسان را شامل میشوند و به عنوان پنجمین سرطان شایع جهان محسوب میگردند(1). لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، یک اختلال نئوپلاستیک لنفوسیتی میباشد(2). این بیماری یک بدخیمی شایع در کودکان است(3). به طوری که این بیماری به سرطان کودکان نیز معروف است. شیوع این بیماری در جنس مذکر بیشتر از جنس مؤنث است(4). ALL اغلب با یک توده توموری همراه با پیشرفت سریع بیماری میباشد(5). در حدود 30% از موارد ALL در همان سال اول عود می‌کنند و سرانجام منجر به مرگ می‌گردد(6). دو عامل ممکن است مقاومت سلول‌های لوسمی نابالغ را به داروهای شیمی درمانی متداول بیشتر کند. یکی این که گمان می‌رود که درصد بالایی از سلول‌های پیش‌ساز لوسمی، به صورت خاموش می‌باشند و این فاز خاموشی باعث کاهش حساسیت آن‌ها نسبت به داروهای اختصاصی سیکل سلولی می‌شود و دیگری، سلول‌های نابالغ خصوصیات سلول‌های بنیادی را با خود دارند که ممکن است باعث افزایش بیان ژن‌های انتقالی چند دارویی همانند MPR-1 و یا P-gp شود(7). این خاصیت منجر به پاکسازی سریع داروهای سایتوتوکسیک می‌گردد(7).
علی‌رغم پیشرفت خوب و موفقیت در درمان، در تعدادی از کودکان بیماری عود کرده و نهایتاً باعث از پا درآمدن بیمار می‌شود(8). داروهای سایتوتوکسیک مورد استفاده در درمان هر چند موفقیتهای قابل توجهی در سیر پیشرفت درمان ایجاد کردهاند اما عوارض جانبی آن‌ها از قبیل عوارض قلبی، کلیوی، سرکوب خونسازی و سیستم ایمنی هم چنان از علل مهم مرگ و میر بیماران به حساب میآید. ترکیبات مشتق از گیاهان که همواره از منابع مهم دارویی در درمان بیماریهای مختلف محسـوب مـیشوند،
اخیـراً از جـهت اثرات سایتوتوکسیک و نیز باز دارنده سرطان مورد توجه قرار گرفته‌اند(9). آپوپتوز یک مرگ برنامه‌ریزی شده میباشد که بدون ایجاد التهاب باعث هموستاز بافت‌ها می‌گردد. نقص در این برنامه می‌تواند باعث ایجاد سرطان و یا در برخی سرطان‌ها، باعث پیشرفت آن گردد.
یکی از اهداف درمانهای ضد سرطان و دارویی، القای آپوپتوز در سلولهاست(10). گیاهان منبع بسیار مهمی از محصولات طبیعی و فعالی هستند که از نظر ساختاری و خواص بیولوژیکی، وسعت وتنوع بسیاری دارند. آن‌ها نقش قابل توجهی را در طب سنتی کشورهای مختلف ایفا می‌کنند. در سالهای اخیر پیشگیری از سرطان و بیماریهای قلبی و عروقی با خوردن میوه، سبزیجات و گیاهان غنی از آنتی اکسیدانهای تازه وطبیعی همراه شده است(11). هسپرتین(Hesperitin) یک فلاونوئید است که در آب میوه‌هایی هم چون پرتقال و میوه‌های درون سرخ یافت می‌گردد(شکل 1).
شکل 1: ساختار شیمیایی آنتی‌اکسیدان هسپرتین
تحقیقات نشان داده است که هسپرتین آپوپتوز را در سلول‌های پانکراس انسان تحریک میکند، هم چنین به عنوان فعال‌کننده NOTCH-1 (افزایش دهنده تمایز سلول‌های اجدادی) و سرکوبگر تومورهای کارسینوئید میباشد(13، 12). آنتی‌اکسیدان‌ها توانایی بالایی در پاکسازی رادیکال‌های آزاد و هم چنین دارای فعالیت‌های ضد سرطانی هم چون ازدیاد سلولی، مهار رگزایی، مهار پیام درون سلولی و تحریک آنزیم‌های درگیر در ترمیمDNA دارند(14). هسپرتین فعالیت آنزیمی مرتبط با دفاع آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها را افزایش می‌دهد و نیز فعالیت ضد سرطانی بالقوه‌ای مثل عامل ضد رگزایی در سلول‌هایMES (Embryonic stem cells) را نشان می‌دهد(15). وقتی که سلول‌های MCF -7 با هسپرتین برای 48 تا 72 ساعت درمان شده بودند، توقف سیکل سلولی در فاز G1 مشاهده شده بود(16). هم چنین هسپرتین فلاوونوئیدی از دسته کوئرستین‌ها(Quercetin) بوده که در تومورهای پوستی نقش پروموتور و القاکننده آپوپتوز را دارد(17).
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع بنیادی- کاربردی بود که بر روی رده سلول‌های لوسمی لنفوبلاستیک(Jurkat) انجام پذیرفت.
تهیه مواد:
محیط کشت RPMI1640 ، پنی‌سیلین، استرپتومایسین، دی‌متیل سولفوکساید(DMSO)، تریپان بلو و آنتی‌اکسیدان هسپرتین از شرکت سیگما تهیه شدند. سرم جنینی گاو(Fetal Bovine Serum) از شرکت گیبکو(آمریکا)،MTS از شرکت مِرک و پلیت‌های 96 و 6 خانه و فلاسک‌های کشت از شرکت جت بایوفیول خریداری گردید. کیت رنگ‌آمیزی Annexin/PI از شرکت BD آمریکا خریداری شد.
کشت سلولی:
رده سلولی لنفوبلاستیک C121 یا jurkat cell از انستیتو پاستور ایران خریداری شد و در محیط RPMI1640 با FBS 10% و PEN/STREP و در فلاسک 25T و 75T کشت داده شدند. پس از کشت، سلول‌ها در انکوباتور CO2 دار(5%) با رطوبت کافی(98%) در دمای 37درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
شمارش سلولی:
برای شمارش سلول‌ها پس از رشد 80 درصدی، سلول‌ها جمع‌آوری شده و با رنگ‌آمیزی توسط تریپان بلو (سیگما)، درصد سلول‌های زنده تعیین شدند. سلول‌های زنده نسبت به ورود رنگ نفوذناپذیر بوده و حال آن که سلول‌های مرده رنگ را جذب می‌نمایند. درصد سلول‌های زنده با شمارش مستقیم سلول‌های زنده و مرده محاسبه می‌شود. درصد سلول‌های زنده برابر است با تعداد سلول‌های زنده به تعداد کل سلول‌ها(Hogberg j 1981 ، Moldeus). در این روش پس از جدا کردن سلول‌ها، μL50 سوسپانسیون سلولی را با μL50 محلول تریپان بلو مخلوط نموده و توسط هموسیتومتر(لام نئوبار) مورد شمارش قرار گرفت.
تیمار سلول‌ها:
پس از شمارش سلولی، میزان 10000 سلول را در هر خانه از پلیت 96 خانه قرار داریم. آنتی‌اکسیدان هسپرتین در 1/0% DMSO حل گردید. پس از 24 ساعت انکوبه شدن در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، CO2 5% و رطوبت کافی، سلول‌ها را با غلظت‌های مختلف هسپرتین(0 تا 1000 میکرومولار) مواجهه کرده و در زمان‌های 24 ، 48 و 72 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند.
آزمایش MTS (بررسی میزان زیستایی سلول‌ها):
بعد از گذشت زمان 24 ، 48 و 72 ساعت از درمان، سلول‌ها با 20 میکرولیتر محلول MTS به مدت 3 ساعت انکوبه شدند.(3-MTS)-5-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-3-2H - (4 -sulfophenyl)- 2 - (carboxymethoxyphenyl tetrazolium) ، میزان حیات سلولی را بررسی میکند. معرف واکنشگر، ترکیبی از MTS و فنازین متوسولفات (PMS) جفت شده با الکترون میباشد.
حاصل این واکنش احیا(کاهشی)، تولید فومارازان است و این واکنش در سلول‌هایی که آنزیم‌های میتوکندریایی فعال دارند، اتفاق می‌افتد(سلول‌های زنده). پس از 3 ساعت انکوبه شدن در تاریکی(محلول MTS به نور حساس میباشد) جذب نوری در طول موج 490 تا 630 نانومتر توسط الایزا ریدر (stat fax-2100 awarenes) خوانده شده است. میزان سلول‌های زنده در هر چاهک محاسبه شده و نسبت به گروه کنترل(تیمار نشده) بررسی گردید و غلظت IC50 مشخص شد، که در این غلظت 50% سلول‌ها زنده می‌باشند و این درصد بقای سلولی (Viability) است.
بررسی آپوپتوز:
برای بررسی آپوپتوز، پس از شمارش، میزان 200000 سلول به هر چاهک از پلیت 6 خانه منتقل شد. پس از 24 ساعت در انکوباتور، سلول‌ها تحت درمان با غلظت‌های نزدیک به IC50 از آنتی‌اکسیدان هسپرتین قرار گرفته و مجدداً به مدت 48 ساعت در انکوباتور نگهداری شدند. سپس سلول‌ها را جمع‌آوری کرده و با سانتریفوژ کردن محلول رویی را دور ریخته و رسوب را براساس کیت آپوپتوز(بیوساینس BD) با binding buffer به صورت سوسپانسیون درآوردیم. به میزان 100000 سلول را به دو لوله برده و به یکی FITC/PI افزوده و دیگری بدون FITC/PI به عنوان کنترل منفی به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق و تاریکی قرار داده شد. سپس توسط دستگاه فلوسیتومتری(Cyflow Partec Germany) مورد بررسی قرار گرفتند. با استفاده از رنگ Annexin/PI سلول‌ها از نظر وجود فسفاتیدیل سرین در سطح (آپوپتوز) و نفوذپذیری سلولی به رنگ PI (propidium Iodide)( نکروز) به کمک فلوسایتومتری بررسی شدند. اساس این روش بر این مبنا است که در طی آپوپتوز، فسفاتیدیل سرین از سطح داخلی به سطح خارجی غشای سلول منتقل می‌شود و آنکسین به فسفاتیدیل سرین در سطح خارجی متصل می‌گردد و توسط دستگاه تشخیص داده می‌شود. PI در طول موج 488 نانومتر تهییج و در موج 617 نانومتر، بازتابش دارد. FITC (Fluorescein Isothyocyanat) در طول موج 488 نانومتر تهییج و در طول موج 519 نانومتر بازتابش دارد.
هر غلظت حداقل 4 مرتبه تکرار گردید و نتایج به صورت SD ± Mean گزارش شد. داده‌ها با استفاده از آزمون آماری ANOVA یا آزمون Kruskal-Wallis و با کمک نرم‌افزار 17 SPSS و(آمریکا، 01/5 V.) GraphPad Prism مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
یافته‌ها
اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیکJURKAT :
سلول‌های JURKAT در مجاورت غلظت‌های مختلف از آنتی‌اکسیدان هسپرتین قرار گرفتند. در بررسی MTS، کریستال‌های زرد رنگ MTS توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز(از آنزیم‌های چرخه تنفسی میتوکندری) احیا شده و موجب تشکیل کریستال‌های ارغوانی رنگ می‌شود.
نمودار 1: اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از 48 ساعت(p= p value)
نمودار 2: اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از 24 ساعت (p = p value)
نمودار3 : اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از 72 ساعت(p = p value)
میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد. در این مطالعه مشاهده شد که پس از درمان سلول‌های سرطانی با هسپرتین در غلظت‌های مختلف(μM 1000-0)، 50% سلول‌های سرطانی در زمان 24 و 48 و 72 ساعت به ترتیب در غلظت 100، 200 و
250 میکرومول، از بین رفته‌اند و یا به عبارت دیگر 50% بقای سلولی داشته‌ایم(IC50). بدین معنی که در غلظت IC50، سلول نسبت به کنترل(غلظت صفر) 50% سلول زنده دارد. هم چنین یک اثر سایتوتوکسیک وابسته به دوز و زمان نشان داده شده است(نمودار‌های 3-1).
برای بررسی اثر آپوپتوزی هسپرتین در رده سلولی لنفوبلاستیک، از دستگاه فلوسایتومتری استفاده گردید. سلول‌ها پس از 48 ساعت درمان با این آنتی‌اکسیدان، با رنگ Annexin/PI رنگ‌آمیزی گردیدند. مطابق با تاثیر ضد تکثیری که توسط MTS نشان داده شده است، در بررسی آپوپتوز نیز هسپرتین در غظت‌های مختلف(نزدیک به IC50) بر روی سلول مؤثر بوده و توانسته آپوپتوز را القا کند. برای تجزیه و تحلیل اطلاعات به دست آمده از دستگاه فلوسایتومتری از برنامهFlow-max استفاده گردید. (شکل‌های 5-2)(نمودار 4).
نمودار 4: اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر القای آپوپتوز رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از48 ساعت(p = p value)
بحث
شیمی درمانی به عنوان درمان اصلی برای بیشتر سرطان‌ها در نظر گرفته می‌شود، اما به علت اثرات جانبی فراوان این نوع درمان، تلاش‌های اخیر بیشتر بر روی ترکیبات طبیعی برای جلوگیری از گسترش سرطان صورت می‌گیرد.
در این مطالعه اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری سلول‌های لنفوبلاستیک(C515) مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده از آزمایش MTS ، هسپرتین در غلظت μM200 موجب کاهش معناداری در میزان تکثیر سلول(تیمار شده) نسبت به گروه کنترل شد. این بررسی نشان داد که غلظت بالای μM200 آنتی‌اکسیدان هسپرتین دارای اثرات مشخص
در in vitro میباشد. در روش MTS ، شدت رنگ ایجاد شده با سلول‌هایی که دارای میتوکندری فعال می‌باشند، متناسب است. مطالعه انجام شده توسط ویل کوکس و همکاران در همین راستا نیز نشان‌دهنده این بود که هسپرتین ترشح apoB هپاتوسیت‌ها را در غلظت 200 میکرومولار به طور معناداری کاهش می‌دهد(18). در مطالعه‌های دیگر غلظت‌های مختلفی از این ترکیب استفاده شد که این موضوع به دلیل تفاوت در نوع سلول‌ها و هم چنین شرایط انجام آزمایش میباشد. در بررسی دیگری اثر آپوپتوزی هسپرتین بر روی سلول‌های سرطانی رحم، مشاهده گردید که این آنتی‌اکسیدان در غلظت 650 میکرومولار، حدود 50% سلول‌ها را متوقف نموده است. آلشاوی و همکارانش نیز در این مطالعه گزارش کردند که ایـن ترکیــب دارای اثـرات ضــد سرطانی از طریق کاهش توانایی سلول‌های زنده(Viability) و القای آپوپتوز میباشد(19). در مطالعه دیگری بر روی سلول‌های PC-3 پروستات، هسپرتین در غلظت40 میکرومولار باعث از بین رفتن 50% (IC50) سلول‌ها گردیده است(20).
آپوپتوزیس، اتوفاژی و نکروز انواعی از مرگ سلولی محسوب میشوند و در میان این سه مسیر مرگ سلولی، آپوپتوزیس بهترین مسیر مرگ سلولی میباشد(21). در صورتی که این فرآیند مختل شود، باعث ایجاد سرطان یا دیگر اختلالات می‌گردد. بیش از 40% از نئوپلاسم‌ها در سیستم آپوپتوزی دچار اختلال میشوند که منجر به ازیاد سلولی غیر نرمال می‌گردد(22). از این رو، تنظیم آپوپتوز در درمان سرطان با اهمیت است(23). در مطالعه حاضر برای اثبات القای آپوپتوز توسط هسپرتین در لاین سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد(C515)، از آنالیز فلوسایتومتری استفاده شد و مشخص گردید که با افزایش غلظت دارو، میزان سلول‌های آپوپتوز شده(آنکسین مثبت و PI منفی) افزایش می‌یابد. بدین صورت که در غلظت μM 200، حدود 50% آپوپتوز نسبت به گروه کنترل مشاهده گردید. این نتایج در تایید MTS به ما نشان می‌دهد که سلول‌هایی که در روش MTS تحت تاثیر هسپرتین بوده‌اند، دچار آپوپتوز شده‌اند و این آنتی‌اکسیدان بر روی این رده سلولی در شرایط آزمایشگاهی مؤثر میباشد. مطالعه‌ای بر روی آرتریـت در رده سلولی مایع مفصلی فیبروبلاست مانند FLS ، نشان داده است که هسپرتین آپوپتوز را در محیط in vitro تحریک می‌نماید. این یافته توسط رنگ‌آمیزی هوخست و بررسی مورفولوژی که با بی‌نظمی در شکل، چروکیدگی هسته و متراکم شدن کروماتین همراه بود و نیز رنگ آمیزی Annexin V-FITC/PI و آنالیز فلوسایتومتری تایید گردید(24). اما در مطالعه‌ای دیگر مشخص گردید که هسپرتین درصد سلول‌های آپوپتوز شده را در سلول‌های H9C2 تحریک شده با LPS کاهش می‌دهد. آن‌ها یافتند که هسپرتین از طریق افزایش بیان Bcl-2 و کاهش بیان Bax و از طریق مسیر JNK ، خواص آنتی‌آپوپتوزی خود را آشکار میکند(25). این یافته با یافته‌های اکثر مطالعه‌ها که اثر آپوپتوزی این ترکیب را اثبات نمودند، مغایرت دارد. مطالعه سیواگامی و همکاران نیز تاثیر هسپرتین بر روی لاین سلولی HT-29 سرطان کولورکتال را ثابت کردند. آن‌ها دریافتند که این آنتی‌اکسیدان آپوپتوز را توسط فعال کردنBAX و سیتوکرومC و هم چنین مهار BCL-2 ، تحریک میکند(26). در مطالعه حاضر تنها القا و میزان آپوپتوز و نه مسیر آن بررسی گردیده است.
جیونگ چوی و همکارانش دریافتند که هسپرتین در سلول‌های MCF-7 سرطان پستان موجب توقف چرخه سلولی در مرحله G1 می‌گردد(16). هم چنین در مطالعه‌ای دیگر نشان داده شده است که هسپرتین که از هسپریدین (شکل گلیکوزیدی) متابولیزه می‌گردد، سلول‌ها را از آسیب به DNAمحافظت میکند(27). به علاوه اثرات ضد التهابی هسپرتین بررسی گردید و نتایج بدین صورت بود که این ترکیب بیان سیتوکاین‌های التهابی را کاهش می‌دهد و آن‌ها از این آنتی‌اکسیدان در درمان آسم استفاده نمودند(28). اما جونگ سوک چوی و همکاران نشان دادند که هسپرتین و اپی گالوکاته چین گالات(Epigallocatechin gallate) در سلول‌های اندوتلیال مواجه شده با LDL نقش آنتی‌آپوپتوزی دارند که این اطلاعات برخلاف مطالعه‌های
قبلی و مطالعه ما میباشد(29). هم چنین مطالعه‌های دیگر نشان دادند که هسپرتین بیان GLUT1, GLUT4 را در سلول‌های سرطانی پستان کاهش می‌دهد که موجب کاهش جذب گلوکز می‌گردد. پس این آنتی‌اکسیدان می‌تواند ازیاد سلول‌های سرطانی را کاهش دهد که در نتیجه موجب اختلال در جذب گلوکز باشد(30).
علاوه بر مطالعه‌های In vitro ، در بررسی هسپرتین بر روی رت‌ها مشخص گردید که این آنتی‌اکسیدان به طور قابل توجهی میزان آپوپتوز را افزایش می‌دهد. طی مطالعه دیگری سلکوک کارا و همکارانش گزارش نمودند که هسپرتین به دلیل دارا بودن خاصیت آنتی‌آپوپتوزی مانع صدمات ناشی از ایسکمی در بافت چشم موش می‌شود که با مطالعه ما از نظر القای آپوپتوز متفاوت است. آن‌ها ذکر نمودند که این دارو در بیماریهای ایسکمیک می‌تواند مفید باشد. مطالعه‌های کامل‌تری جهت بررسی این تناقض لازم است، اما احتمالاً مسیر القا در این سلول‌ها متفاوت باشد(31). هم چنین عدن و همکارش در یک مطالعه دیگر با تاثیر هسپرتین بر روی لاین سلولی پرومیلوسیتیک گزارش نمودند که این ترکیب باعث کاهش سلول‌ها از طریق القای آپوپتوز می‌شود(32).
نتیجه‌گیری
گر چه مطالعه‌ها در زمینه اثرات آپوپتوزی محدود میباشد، اما با توجه به نتایج حاصل گردیده از این مطالعه به نظر می‌رسد این آنتی‌اکسیدان در درمان بدخیمی‌های لنفوسیتی از طریق القای آپوپتوز مفید باشد، گرچه پیشنهاد می‌شود مطالعه‌هایی در In vivo نیز صورت پذیرد تا با اطمینان بیشتری این موضوع تایید شود.
تشکر و قدردانی
از کلیه همکاران محترم در مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد که ما را در انجام این مطالعه یاری نمودند تشکر می‌کنیم.
متن کامل: (2970 مشاهده)
اثر هسپرتین بر القای آپوپتوز و نکروز در لاین سلولی لنفوبلاستیک
Jurkat Cells
معین شیرزاد1، اسفندیار حیدریان2، بتول پورقیصری3، نعمت‌اله امینی سرتشنیزی4، زهرا سورانی5، پژمان بشکار6
چکیده
سابقه و هدف
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، یک اختلال نئوپلاستیک و یک بدخیمی شایع در کودکان است. آپوپتوز، مرگ برنامه‌ریزی شده و فیزیولوژیک سلولی بوده که جهت هموستاز بافت‌ها ضروری میباشد. در برخی از سرطان‌ها، ناکارآمدی در این پروسه باعث پیشرفت سرطان می‌گردد. این پروسه می‌تواند توسط عوامل مختلف درمانی از جمله شیمی درمانی القا شود. هسپرتین یک فلاونوئید در آب میوه‌هایی هم چون پرتقال و میوه‌های درون سرخ بوده و بر اساس تحقیقات آپوپتوز را در سلول‌های پانکراس انسان تحریک میکند. هم چنین به عنوان فعال‌کننده NOTCH-1 و سرکوبگر تومور کارسینوئید میباشد.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع بنیادی ـ کاربردی بود. لاین سلولی مورد استفاده در این مطالعه، C121 (Jurkat cell)، در محیط مکمل RPMI1640 با10% سرم جنینی گاو(FBS) و پنی‌سیلین/ استرپتومایسین کشت داده شد. میزان رشد و بقای سلولی با غلظت‌های مختلف هسپرتین توسط کیت MTS بررسی گردید. میزان مرگ سلولی توسط رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو و هم چنین توسط کیت آپوپتوزیس و با دستگاه فلوسایتومتری(Partec) مورد بررسی قرار گرفت.
یافته‌ها
رده سلول‌های لنفوبلاستیک(C121) در مواجهه با غلظت‌های مختلف هسپرتین (محلول شده در DMSO 1/0%) تحت تاثیر قرار گرفته و غلظت µM 200 دارو در زمان 48 ساعت به عنوان غلظت مهاری یاIC50 گزارش شد. نوع مرگ القایی توسط این دارو با استفاده از بررسی مورفولوژیک و نیز فلوسیتومتری به صورت آپوپتوز بوده است.
نتیجه گیری
با توجه به این که هسپرتین توانایی القای آپوپتوز را دارد و هم چنین باعث کاهش فعالیت سلولی می‌شود، به نظر می‌رسد داروی مناسبی برای مهار رشد سلول‌های توموری باشد.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، هسپرتین، Jurkat Cells ، آپوپتوز
تاریخ دریافت : 27/5/93
تاریخ پذیرش : 9/12/93
1- دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی بالینی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
2- PhD بیوشیمی ـ استاد مرکز تحقیقات سلولی مولکولی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
3- PhD هماتولوژی ـ دانشیار دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
4- دانشجوی کارشناسی ارشد زیست‌شناسی سلولی و مولکولی ـ دانشکده علوم دانشگاه محقق اردبیلی ـ اردبیل ـ ایران
5- دانشجوی کارشناسی ارشد ایمنی‌شناسی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
6- مؤلف مسؤول: دانشجـوی PhD همـاتـولـوژی ـ مـرکـز تحقیقـات سازمـان انتقـال خـون ـ مـؤسسه عالـی آمـوزشـی و پـژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
Jurkat Cells
معین شیرزاد1، اسفندیار حیدریان2، بتول پورقیصری3، نعمت‌اله امینی سرتشنیزی4، زهرا سورانی5، پژمان بشکار6
چکیده
سابقه و هدف
لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، یک اختلال نئوپلاستیک و یک بدخیمی شایع در کودکان است. آپوپتوز، مرگ برنامه‌ریزی شده و فیزیولوژیک سلولی بوده که جهت هموستاز بافت‌ها ضروری میباشد. در برخی از سرطان‌ها، ناکارآمدی در این پروسه باعث پیشرفت سرطان می‌گردد. این پروسه می‌تواند توسط عوامل مختلف درمانی از جمله شیمی درمانی القا شود. هسپرتین یک فلاونوئید در آب میوه‌هایی هم چون پرتقال و میوه‌های درون سرخ بوده و بر اساس تحقیقات آپوپتوز را در سلول‌های پانکراس انسان تحریک میکند. هم چنین به عنوان فعال‌کننده NOTCH-1 و سرکوبگر تومور کارسینوئید میباشد.
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع بنیادی ـ کاربردی بود. لاین سلولی مورد استفاده در این مطالعه، C121 (Jurkat cell)، در محیط مکمل RPMI1640 با10% سرم جنینی گاو(FBS) و پنی‌سیلین/ استرپتومایسین کشت داده شد. میزان رشد و بقای سلولی با غلظت‌های مختلف هسپرتین توسط کیت MTS بررسی گردید. میزان مرگ سلولی توسط رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو و هم چنین توسط کیت آپوپتوزیس و با دستگاه فلوسایتومتری(Partec) مورد بررسی قرار گرفت.
یافته‌ها
رده سلول‌های لنفوبلاستیک(C121) در مواجهه با غلظت‌های مختلف هسپرتین (محلول شده در DMSO 1/0%) تحت تاثیر قرار گرفته و غلظت µM 200 دارو در زمان 48 ساعت به عنوان غلظت مهاری یاIC50 گزارش شد. نوع مرگ القایی توسط این دارو با استفاده از بررسی مورفولوژیک و نیز فلوسیتومتری به صورت آپوپتوز بوده است.
نتیجه گیری
با توجه به این که هسپرتین توانایی القای آپوپتوز را دارد و هم چنین باعث کاهش فعالیت سلولی می‌شود، به نظر می‌رسد داروی مناسبی برای مهار رشد سلول‌های توموری باشد.
کلمات کلیدی: لوسمی لنفوبلاستیک حاد، هسپرتین، Jurkat Cells ، آپوپتوز
تاریخ دریافت : 27/5/93
تاریخ پذیرش : 9/12/93
1- دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی بالینی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
2- PhD بیوشیمی ـ استاد مرکز تحقیقات سلولی مولکولی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
3- PhD هماتولوژی ـ دانشیار دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
4- دانشجوی کارشناسی ارشد زیست‌شناسی سلولی و مولکولی ـ دانشکده علوم دانشگاه محقق اردبیلی ـ اردبیل ـ ایران
5- دانشجوی کارشناسی ارشد ایمنی‌شناسی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
6- مؤلف مسؤول: دانشجـوی PhD همـاتـولـوژی ـ مـرکـز تحقیقـات سازمـان انتقـال خـون ـ مـؤسسه عالـی آمـوزشـی و پـژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه
امروزه سرطان با بیش از 10 میلیون مورد جدید و بیش از 6 میلیون مرگ ناشی از آن هر ساله در سراسر جهان یکی از مهم‌ترین دلایل مرگ و میر محسوب می‌گردد. پیش‌بینی می‌شود که تا سال 2020 ، هر ساله 15 میلیون مورد جدید و 10 میلیون مرگ در اثر سرطان داشته باشیم. سرطانهای خون یا لوسمیها حدود 8% از کل سرطانهای جمعیت انسان را شامل میشوند و به عنوان پنجمین سرطان شایع جهان محسوب میگردند(1). لوسمی لنفوبلاستیک حاد(ALL)، یک اختلال نئوپلاستیک لنفوسیتی میباشد(2). این بیماری یک بدخیمی شایع در کودکان است(3). به طوری که این بیماری به سرطان کودکان نیز معروف است. شیوع این بیماری در جنس مذکر بیشتر از جنس مؤنث است(4). ALL اغلب با یک توده توموری همراه با پیشرفت سریع بیماری میباشد(5). در حدود 30% از موارد ALL در همان سال اول عود می‌کنند و سرانجام منجر به مرگ می‌گردد(6). دو عامل ممکن است مقاومت سلول‌های لوسمی نابالغ را به داروهای شیمی درمانی متداول بیشتر کند. یکی این که گمان می‌رود که درصد بالایی از سلول‌های پیش‌ساز لوسمی، به صورت خاموش می‌باشند و این فاز خاموشی باعث کاهش حساسیت آن‌ها نسبت به داروهای اختصاصی سیکل سلولی می‌شود و دیگری، سلول‌های نابالغ خصوصیات سلول‌های بنیادی را با خود دارند که ممکن است باعث افزایش بیان ژن‌های انتقالی چند دارویی همانند MPR-1 و یا P-gp شود(7). این خاصیت منجر به پاکسازی سریع داروهای سایتوتوکسیک می‌گردد(7).
علی‌رغم پیشرفت خوب و موفقیت در درمان، در تعدادی از کودکان بیماری عود کرده و نهایتاً باعث از پا درآمدن بیمار می‌شود(8). داروهای سایتوتوکسیک مورد استفاده در درمان هر چند موفقیتهای قابل توجهی در سیر پیشرفت درمان ایجاد کردهاند اما عوارض جانبی آن‌ها از قبیل عوارض قلبی، کلیوی، سرکوب خونسازی و سیستم ایمنی هم چنان از علل مهم مرگ و میر بیماران به حساب میآید. ترکیبات مشتق از گیاهان که همواره از منابع مهم دارویی در درمان بیماریهای مختلف محسـوب مـیشوند،
اخیـراً از جـهت اثرات سایتوتوکسیک و نیز باز دارنده سرطان مورد توجه قرار گرفته‌اند(9). آپوپتوز یک مرگ برنامه‌ریزی شده میباشد که بدون ایجاد التهاب باعث هموستاز بافت‌ها می‌گردد. نقص در این برنامه می‌تواند باعث ایجاد سرطان و یا در برخی سرطان‌ها، باعث پیشرفت آن گردد.
یکی از اهداف درمانهای ضد سرطان و دارویی، القای آپوپتوز در سلولهاست(10). گیاهان منبع بسیار مهمی از محصولات طبیعی و فعالی هستند که از نظر ساختاری و خواص بیولوژیکی، وسعت وتنوع بسیاری دارند. آن‌ها نقش قابل توجهی را در طب سنتی کشورهای مختلف ایفا می‌کنند. در سالهای اخیر پیشگیری از سرطان و بیماریهای قلبی و عروقی با خوردن میوه، سبزیجات و گیاهان غنی از آنتی اکسیدانهای تازه وطبیعی همراه شده است(11). هسپرتین(Hesperitin) یک فلاونوئید است که در آب میوه‌هایی هم چون پرتقال و میوه‌های درون سرخ یافت می‌گردد(شکل 1).
شکل 1: ساختار شیمیایی آنتی‌اکسیدان هسپرتین
تحقیقات نشان داده است که هسپرتین آپوپتوز را در سلول‌های پانکراس انسان تحریک میکند، هم چنین به عنوان فعال‌کننده NOTCH-1 (افزایش دهنده تمایز سلول‌های اجدادی) و سرکوبگر تومورهای کارسینوئید میباشد(13، 12). آنتی‌اکسیدان‌ها توانایی بالایی در پاکسازی رادیکال‌های آزاد و هم چنین دارای فعالیت‌های ضد سرطانی هم چون ازدیاد سلولی، مهار رگزایی، مهار پیام درون سلولی و تحریک آنزیم‌های درگیر در ترمیم
مواد و روش‌ها
این مطالعه از نوع بنیادی- کاربردی بود که بر روی رده سلول‌های لوسمی لنفوبلاستیک(Jurkat) انجام پذیرفت.
تهیه مواد:
محیط کشت RPMI1640 ، پنی‌سیلین، استرپتومایسین، دی‌متیل سولفوکساید(DMSO)، تریپان بلو و آنتی‌اکسیدان هسپرتین از شرکت سیگما تهیه شدند. سرم جنینی گاو(Fetal Bovine Serum) از شرکت گیبکو(آمریکا)،MTS از شرکت مِرک و پلیت‌های 96 و 6 خانه و فلاسک‌های کشت از شرکت جت بایوفیول خریداری گردید. کیت رنگ‌آمیزی Annexin/PI از شرکت BD آمریکا خریداری شد.
کشت سلولی:
رده سلولی لنفوبلاستیک C121 یا jurkat cell از انستیتو پاستور ایران خریداری شد و در محیط RPMI1640 با FBS 10% و PEN/STREP و در فلاسک 25T و 75T کشت داده شدند. پس از کشت، سلول‌ها در انکوباتور CO2 دار(5%) با رطوبت کافی(98%) در دمای 37درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
شمارش سلولی:
برای شمارش سلول‌ها پس از رشد 80 درصدی، سلول‌ها جمع‌آوری شده و با رنگ‌آمیزی توسط تریپان بلو (سیگما)، درصد سلول‌های زنده تعیین شدند. سلول‌های زنده نسبت به ورود رنگ نفوذناپذیر بوده و حال آن که سلول‌های مرده رنگ را جذب می‌نمایند. درصد سلول‌های زنده با شمارش مستقیم سلول‌های زنده و مرده محاسبه می‌شود. درصد سلول‌های زنده برابر است با تعداد سلول‌های زنده به تعداد کل سلول‌ها(Hogberg j 1981 ، Moldeus). در این روش پس از جدا کردن سلول‌ها، μL50 سوسپانسیون سلولی را با μL50 محلول تریپان بلو مخلوط نموده و توسط هموسیتومتر(لام نئوبار) مورد شمارش قرار گرفت.
تیمار سلول‌ها:
پس از شمارش سلولی، میزان 10000 سلول را در هر خانه از پلیت 96 خانه قرار داریم. آنتی‌اکسیدان هسپرتین در 1/0% DMSO حل گردید. پس از 24 ساعت انکوبه شدن در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، CO2 5% و رطوبت کافی، سلول‌ها را با غلظت‌های مختلف هسپرتین(0 تا 1000 میکرومولار) مواجهه کرده و در زمان‌های 24 ، 48 و 72 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند.
آزمایش MTS (بررسی میزان زیستایی سلول‌ها):
بعد از گذشت زمان 24 ، 48 و 72 ساعت از درمان، سلول‌ها با 20 میکرولیتر محلول MTS به مدت 3 ساعت انکوبه شدند.(3-MTS)-5-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-3-2H - (4 -sulfophenyl)- 2 - (carboxymethoxyphenyl tetrazolium) ، میزان حیات سلولی را بررسی میکند. معرف واکنشگر، ترکیبی از MTS و فنازین متوسولفات (PMS) جفت شده با الکترون میباشد.
حاصل این واکنش احیا(کاهشی)، تولید فومارازان است و این واکنش در سلول‌هایی که آنزیم‌های میتوکندریایی فعال دارند، اتفاق می‌افتد(سلول‌های زنده). پس از 3 ساعت انکوبه شدن در تاریکی(محلول MTS به نور حساس میباشد) جذب نوری در طول موج 490 تا 630 نانومتر توسط الایزا ریدر (stat fax-2100 awarenes) خوانده شده است. میزان سلول‌های زنده در هر چاهک محاسبه شده و نسبت به گروه کنترل(تیمار نشده) بررسی گردید و غلظت IC50 مشخص شد، که در این غلظت 50% سلول‌ها زنده می‌باشند و این درصد بقای سلولی (Viability) است.
بررسی آپوپتوز:
برای بررسی آپوپتوز، پس از شمارش، میزان 200000 سلول به هر چاهک از پلیت 6 خانه منتقل شد. پس از 24 ساعت در انکوباتور، سلول‌ها تحت درمان با غلظت‌های نزدیک به IC50 از آنتی‌اکسیدان هسپرتین قرار گرفته و مجدداً به مدت 48 ساعت در انکوباتور نگهداری شدند. سپس سلول‌ها را جمع‌آوری کرده و با سانتریفوژ کردن محلول رویی را دور ریخته و رسوب را براساس کیت آپوپتوز(بیوساینس BD) با binding buffer به صورت سوسپانسیون درآوردیم. به میزان 100000 سلول را به دو لوله برده و به یکی FITC/PI افزوده و دیگری بدون FITC/PI به عنوان کنترل منفی به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق و تاریکی قرار داده شد. سپس توسط دستگاه فلوسیتومتری(Cyflow Partec Germany) مورد بررسی قرار گرفتند. با استفاده از رنگ Annexin/PI سلول‌ها از نظر وجود فسفاتیدیل سرین در سطح (آپوپتوز) و نفوذپذیری سلولی به رنگ PI (propidium Iodide)( نکروز) به کمک فلوسایتومتری بررسی شدند. اساس این روش بر این مبنا است که در طی آپوپتوز، فسفاتیدیل سرین از سطح داخلی به سطح خارجی غشای سلول منتقل می‌شود و آنکسین به فسفاتیدیل سرین در سطح خارجی متصل می‌گردد و توسط دستگاه تشخیص داده می‌شود. PI در طول موج 488 نانومتر تهییج و در موج 617 نانومتر، بازتابش دارد. FITC (Fluorescein Isothyocyanat) در طول موج 488 نانومتر تهییج و در طول موج 519 نانومتر بازتابش دارد.
هر غلظت حداقل 4 مرتبه تکرار گردید و نتایج به صورت SD ± Mean گزارش شد. داده‌ها با استفاده از آزمون آماری ANOVA یا آزمون Kruskal-Wallis و با کمک نرم‌افزار 17 SPSS و(آمریکا، 01/5 V.) GraphPad Prism مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
یافته‌ها
اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیکJURKAT :
سلول‌های JURKAT در مجاورت غلظت‌های مختلف از آنتی‌اکسیدان هسپرتین قرار گرفتند. در بررسی MTS، کریستال‌های زرد رنگ MTS توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز(از آنزیم‌های چرخه تنفسی میتوکندری) احیا شده و موجب تشکیل کریستال‌های ارغوانی رنگ می‌شود.
نمودار 1: اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از 48 ساعت(p= p value)
نمودار 2: اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از 24 ساعت (p = p value)
نمودار3 : اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از 72 ساعت(p = p value)
میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد. در این مطالعه مشاهده شد که پس از درمان سلول‌های سرطانی با هسپرتین در غلظت‌های مختلف(μM 1000-0)، 50% سلول‌های سرطانی در زمان 24 و 48 و 72 ساعت به ترتیب در غلظت 100، 200 و
250 میکرومول، از بین رفته‌اند و یا به عبارت دیگر 50% بقای سلولی داشته‌ایم(IC50). بدین معنی که در غلظت IC50، سلول نسبت به کنترل(غلظت صفر) 50% سلول زنده دارد. هم چنین یک اثر سایتوتوکسیک وابسته به دوز و زمان نشان داده شده است(نمودار‌های 3-1).
جدول 1: میانگین و انحراف معیار آزمایش MTT assay در ساعت 24 ، 48 و 72 (SD ± Mean)
بررسی آپوپتوز در رده سلولی لنفوبلاستیک:| غلظت | 0 | 50 | 100 | 150 | 200 | 250 | 300 |
| ساعت 24 | 0 ± 100 | 2 ± 93 | 055/3 ± 67/87 | 4 ± 72 | 51/3 ± 67/60 | 58/4 ± 50 | 5/5 ± 67/38 |
| ساعت 48 | 0 ± 100 | 5/5 ± 33/88 | 55/6 ± 74 | 02/6 ± 67/61 | 5/6 ± 6/51 | 5/6 ± 34 | 11/6 ± 33/20 |
| ساعت 72 | 0 ± 100 | 5/6 ± 74 | 5/7 ± 33/53 | 5/6 ± 67/42 | 509/4 ± 33/35 | 7 ± 25 | 50/5 ± 33/13 |
برای بررسی اثر آپوپتوزی هسپرتین در رده سلولی لنفوبلاستیک، از دستگاه فلوسایتومتری استفاده گردید. سلول‌ها پس از 48 ساعت درمان با این آنتی‌اکسیدان، با رنگ Annexin/PI رنگ‌آمیزی گردیدند. مطابق با تاثیر ضد تکثیری که توسط MTS نشان داده شده است، در بررسی آپوپتوز نیز هسپرتین در غظت‌های مختلف(نزدیک به IC50) بر روی سلول مؤثر بوده و توانسته آپوپتوز را القا کند. برای تجزیه و تحلیل اطلاعات به دست آمده از دستگاه فلوسایتومتری از برنامهFlow-max استفاده گردید. (شکل‌های 5-2)(نمودار 4).
نمودار 4: اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر القای آپوپتوز رده سلولی لنفوبلاستیک JURKAT بعد از48 ساعت(p = p value)
بحث
شیمی درمانی به عنوان درمان اصلی برای بیشتر سرطان‌ها در نظر گرفته می‌شود، اما به علت اثرات جانبی فراوان این نوع درمان، تلاش‌های اخیر بیشتر بر روی ترکیبات طبیعی برای جلوگیری از گسترش سرطان صورت می‌گیرد.
در این مطالعه اثر آنتی‌اکسیدان هسپرتین بر فعالیت تکثیری سلول‌های لنفوبلاستیک(C515) مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده از آزمایش MTS ، هسپرتین در غلظت μM200 موجب کاهش معناداری در میزان تکثیر سلول(تیمار شده) نسبت به گروه کنترل شد. این بررسی نشان داد که غلظت بالای μM200 آنتی‌اکسیدان هسپرتین دارای اثرات مشخص
در in vitro میباشد. در روش MTS ، شدت رنگ ایجاد شده با سلول‌هایی که دارای میتوکندری فعال می‌باشند، متناسب است. مطالعه انجام شده توسط ویل کوکس و همکاران در همین راستا نیز نشان‌دهنده این بود که هسپرتین ترشح apoB هپاتوسیت‌ها را در غلظت 200 میکرومولار به طور معناداری کاهش می‌دهد(18). در مطالعه‌های دیگر غلظت‌های مختلفی از این ترکیب استفاده شد که این موضوع به دلیل تفاوت در نوع سلول‌ها و هم چنین شرایط انجام آزمایش میباشد. در بررسی دیگری اثر آپوپتوزی هسپرتین بر روی سلول‌های سرطانی رحم، مشاهده گردید که این آنتی‌اکسیدان در غلظت 650 میکرومولار، حدود 50% سلول‌ها را متوقف نموده است. آلشاوی و همکارانش نیز در این مطالعه گزارش کردند که ایـن ترکیــب دارای اثـرات ضــد سرطانی از طریق کاهش توانایی سلول‌های زنده(Viability) و القای آپوپتوز میباشد(19). در مطالعه دیگری بر روی سلول‌های PC-3 پروستات، هسپرتین در غلظت40 میکرومولار باعث از بین رفتن 50% (IC50) سلول‌ها گردیده است(20).آپوپتوزیس، اتوفاژی و نکروز انواعی از مرگ سلولی محسوب میشوند و در میان این سه مسیر مرگ سلولی، آپوپتوزیس بهترین مسیر مرگ سلولی میباشد(21). در صورتی که این فرآیند مختل شود، باعث ایجاد سرطان یا دیگر اختلالات می‌گردد. بیش از 40% از نئوپلاسم‌ها در سیستم آپوپتوزی دچار اختلال میشوند که منجر به ازیاد سلولی غیر نرمال می‌گردد(22). از این رو، تنظیم آپوپتوز در درمان سرطان با اهمیت است(23). در مطالعه حاضر برای اثبات القای آپوپتوز توسط هسپرتین در لاین سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد(C515)، از آنالیز فلوسایتومتری استفاده شد و مشخص گردید که با افزایش غلظت دارو، میزان سلول‌های آپوپتوز شده(آنکسین مثبت و PI منفی) افزایش می‌یابد. بدین صورت که در غلظت μM 200، حدود 50% آپوپتوز نسبت به گروه کنترل مشاهده گردید. این نتایج در تایید MTS به ما نشان می‌دهد که سلول‌هایی که در روش MTS تحت تاثیر هسپرتین بوده‌اند، دچار آپوپتوز شده‌اند و این آنتی‌اکسیدان بر روی این رده سلولی در شرایط آزمایشگاهی مؤثر میباشد. مطالعه‌ای بر روی آرتریـت در رده سلولی مایع مفصلی فیبروبلاست مانند FLS ، نشان داده است که هسپرتین آپوپتوز را در محیط in vitro تحریک می‌نماید. این یافته توسط رنگ‌آمیزی هوخست و بررسی مورفولوژی که با بی‌نظمی در شکل، چروکیدگی هسته و متراکم شدن کروماتین همراه بود و نیز رنگ آمیزی Annexin V-FITC/PI و آنالیز فلوسایتومتری تایید گردید(24). اما در مطالعه‌ای دیگر مشخص گردید که هسپرتین درصد سلول‌های آپوپتوز شده را در سلول‌های H9C2 تحریک شده با LPS کاهش می‌دهد. آن‌ها یافتند که هسپرتین از طریق افزایش بیان Bcl-2 و کاهش بیان Bax و از طریق مسیر JNK ، خواص آنتی‌آپوپتوزی خود را آشکار میکند(25). این یافته با یافته‌های اکثر مطالعه‌ها که اثر آپوپتوزی این ترکیب را اثبات نمودند، مغایرت دارد. مطالعه سیواگامی و همکاران نیز تاثیر هسپرتین بر روی لاین سلولی HT-29 سرطان کولورکتال را ثابت کردند. آن‌ها دریافتند که این آنتی‌اکسیدان آپوپتوز را توسط فعال کردنBAX و سیتوکرومC و هم چنین مهار BCL-2 ، تحریک میکند(26). در مطالعه حاضر تنها القا و میزان آپوپتوز و نه مسیر آن بررسی گردیده است.
جیونگ چوی و همکارانش دریافتند که هسپرتین در سلول‌های MCF-7 سرطان پستان موجب توقف چرخه سلولی در مرحله G1 می‌گردد(16). هم چنین در مطالعه‌ای دیگر نشان داده شده است که هسپرتین که از هسپریدین (شکل گلیکوزیدی) متابولیزه می‌گردد، سلول‌ها را از آسیب به DNAمحافظت میکند(27). به علاوه اثرات ضد التهابی هسپرتین بررسی گردید و نتایج بدین صورت بود که این ترکیب بیان سیتوکاین‌های التهابی را کاهش می‌دهد و آن‌ها از این آنتی‌اکسیدان در درمان آسم استفاده نمودند(28). اما جونگ سوک چوی و همکاران نشان دادند که هسپرتین و اپی گالوکاته چین گالات(Epigallocatechin gallate) در سلول‌های اندوتلیال مواجه شده با LDL نقش آنتی‌آپوپتوزی دارند که این اطلاعات برخلاف مطالعه‌های
قبلی و مطالعه ما میباشد(29). هم چنین مطالعه‌های دیگر نشان دادند که هسپرتین بیان GLUT1, GLUT4 را در سلول‌های سرطانی پستان کاهش می‌دهد که موجب کاهش جذب گلوکز می‌گردد. پس این آنتی‌اکسیدان می‌تواند ازیاد سلول‌های سرطانی را کاهش دهد که در نتیجه موجب اختلال در جذب گلوکز باشد(30).
علاوه بر مطالعه‌های In vitro ، در بررسی هسپرتین بر روی رت‌ها مشخص گردید که این آنتی‌اکسیدان به طور قابل توجهی میزان آپوپتوز را افزایش می‌دهد. طی مطالعه دیگری سلکوک کارا و همکارانش گزارش نمودند که هسپرتین به دلیل دارا بودن خاصیت آنتی‌آپوپتوزی مانع صدمات ناشی از ایسکمی در بافت چشم موش می‌شود که با مطالعه ما از نظر القای آپوپتوز متفاوت است. آن‌ها ذکر نمودند که این دارو در بیماریهای ایسکمیک می‌تواند مفید باشد. مطالعه‌های کامل‌تری جهت بررسی این تناقض لازم است، اما احتمالاً مسیر القا در این سلول‌ها متفاوت باشد(31). هم چنین عدن و همکارش در یک مطالعه دیگر با تاثیر هسپرتین بر روی لاین سلولی پرومیلوسیتیک گزارش نمودند که این ترکیب باعث کاهش سلول‌ها از طریق القای آپوپتوز می‌شود(32).
نتیجه‌گیری
گر چه مطالعه‌ها در زمینه اثرات آپوپتوزی محدود میباشد، اما با توجه به نتایج حاصل گردیده از این مطالعه به نظر می‌رسد این آنتی‌اکسیدان در درمان بدخیمی‌های لنفوسیتی از طریق القای آپوپتوز مفید باشد، گرچه پیشنهاد می‌شود مطالعه‌هایی در In vivo نیز صورت پذیرد تا با اطمینان بیشتری این موضوع تایید شود.
تشکر و قدردانی
از کلیه همکاران محترم در مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد که ما را در انجام این مطالعه یاری نمودند تشکر می‌کنیم.
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
