جلد 12، شماره 4 - ( زمستان 1394 )
جلد 12 شماره 4 صفحات 339-331 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Safa M, Bashash D, Hamidpoor M. Induction of cell death and decreased cell proliferation in acute promyelocytic leukemia cells (NB4) by caffeine. bloodj 2016; 12 (4) :331-339
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-881-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-881-fa.html
صفا مجید، بشاش داود، حمیدپور محسن. القای مرگ سلولی و کاهش تکثیر در سلول لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4 توسط کافئین . فصلنامه پژوهشی خون. 1394; 12 (4) :331-339
تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 63113-19839
متن کامل [PDF 409 kb]
(1759 دریافت)
| چکیده (HTML) (7107 مشاهده)
مقدمه
پیشگیری، درمان و کنترل سرطان با استفاده از مواد طبیعی در حال حاضر به عنوان یک استراتژی امیدوارکننده در نظر گرفته شده و در مدل‌های تجربی مشخص شده است که بسیاری از مواد طبیعی و یا رژیم غذایی موجب مهار سرطان می‌شوند(2، 1). در این خصوص، کافئین به دلیل مهار چند منظوره سرطان در سلول‌های کشت داده شده و یا مدل‌های حیوانی به تازگی توجه زیادی به خود جلب کرده است(3). کافئین یک ماده شیمیایی و خوردنی است که در گیاهان مختلفی از جمله قهوه، کاکائو، کولا و چای یافت می‌شود. این ماده، یک آلکالوئید از خانواده متیل گزانتین‌ها است و در فرم خالص، به صورت پودر سفید رنگ با مزه تلخ می‌باشد. کافئین که از ترکیب کربن، هیدروژن، نیتروژن و اکسیژن تشکیل شده است، نوعی محرک بوده و می‌تواند از خوابیدن جلوگیری کند. مطالعه‌های انجام شده طی دهه گذشته نشان داده است که کافئین دارای اثرات ضد سرطان بوده و احتمالاً این اثر را از طریق کاهش تکثیر سلولی و یا القای آپوپتوز در سرطان‌ها از جمله لوسمی‌ها اعمال می‌کند(4).
لوسمی‌ها، گروه ناهمگونی از بدخیمی‌ها هستند که از بدخیم شدن سلول‌های خونساز اولیه در مغز استخوان به وجود می‌آیند. لوسمی، در سال ١٨٧٠ به عنوان یک بیماری درگیرکننده مغز استخوان عنوان شد و در سال ١٩٣٠، انواع مورفولوژیک لوسمی‌های حاد و مزمن به خوبی مشخص شدند(5). لوسمی‌های حاد بر اساس رده سلولی به دو گروه بزرگ لوسمی حاد میلوبلاستیک(AML) و لوسمی حاد لنفوبلاستیک(ALL) تقسیم می‌شوند. لوسمی پرومیلوسیتیک حاد(APL) یکی از زیر گروه‌هایAML (AML-M3) می‌باشد. APL حدود 15%-10% انواع AMLرا به خود اختصاص داده و معمولاً در سنین 50-40 سالگی رخ می‌دهد(6). این بیماری در اثر نقص در بلوغ گلبول‌های سفید در رده میلوئیدی به وجود می‌آید که طی آن، روند بلوغ در سلول‌های رده گرانولوسیتی در مرحله پرومیلوسیت متوقف می‌شود. به دلیل انعقاد داخل عروقی منتشر(DIC) که ظاهراً ناشی از آزاد شدن مواد پیش انعقادی از گرانول‌های سلول‌های لوسمیک است، مشکلات خونریزی در این بیماری شایع بوده و از جمله علل اصلی مرگ و میر این بیماران محسوب می‌شود(7). در سال 1985 معرفی ATRA که مشتقی از ویتامین A است، افقی جدید در تاریخچه درمان APL گشود و از میزان مرگ و میر بیماری به طور قابل توجهی کاست. با این حال و علی‌رغم اثر بخشی این کافئین در درمان APL ، درصدی از بیماران دچار عود شده و در نهایت به مرگ بیمار منجر می‌شود(8).
با توجه به اثرات ضد سرطانی کافئین و از طرفی با در نظر گرفتن عدم موفقیت کامل راه‌کارهای درمانی معمول در APL ، برآن شدیم تا در این تحقیق اثربخشی این آلکالوئید متیل گزانتینی را علیه سلول‌های NB4 (رده سلولی لوسمی پرومیلوسیتیک حاد) بررسی کنیم. با انجام این تحقیق مشخص شد که کافئین از طریق افزایش بیان ژن‌های Bax و p21 و هم چنین فعال کردن آنزیم کاسپاز 3 موجب القای آپوپتوز در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4 می‌شود.
مواد و روش‌ها
کشت سلولی:
در یک مطالعه تجربی، سلول‌های NB4 (رده سلولی انسانی لوسمی پرومیلوسیتیک حاد) اولین بار در سال 1989 از مغز استخوان یک خانم جوان 23 ساله مبتلا به لوسمی پرومیلوسیتیک حاد جداسازی شد. سلـول‌های NB4 ، رده سلولی بسیار مناسبی برای مطالعه‌های in vitro در مورد لوسمی پرومیلوسیتیک حاد محسوب می‌شود. در این مطالعه، سلول‌های این رده سلولی که از انستیتو پاستور تهیه شده بود، در محیط کشت 1640 RPMI حاوی mM 2 از L -گلوتامین، 10% FBS ، پنی‌سیلین به میزان U/mL 100 و استرپتومایسین به میزان µg/mL 100 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و فشار 5% از CO2 کشت داده شدند.
تیمار با کافئین:
برای تیمار سلول‌ها، از کافئین(آمریکا، سیگما) استفاده شد. محلول ذخیره کافئین به واسطه حل کردن این ماده در آب مقطر استریل تهیه شد. محلول ذخیره را در میکروتیوب‌ها تقسیم کرده و آن‌ها را در دمای اتاق تا زمان مصرف نگهداری کردیم. به منظور تعیین اثرات بهینه کافئین، ٢ متغیر دوز و زمان در این تحقیق در نظر گرفته شد. سلول‌های سرطانی با غلظت‌های 1، 2 و 4 میلی‌مولار از کافئین تیمار شدند و به ترتیب پس از زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت مورد مطالعه قرار گرفتند. در ضمن به منظور افزایش بهره‌وری کار و بررسی مقایسه‌ای، آزمایش‌ها به صورت دوبار تکرار انجام شد.
Microculture Tetrazolium Test :
میزان حیات سلولی توسط آزمایش MTT بررسی شد. جهت انجام آزمایش بعد از دو بار پاساژ دادن، سلول‌ها به پلیت 96 خانه (5000 سلول در هر خانه) منتقل شدند. هنگامی که MTT زرد رنگ وارد سلول‌های زنده می‌شود، به وسیله آنزیم دهیدروژناز این سلول‌ها احیا می‌شود و رسوب بنفش رنگ ایجاد می‌کند. به طور خلاصه، بعد از اتمام زمان تیمار سلول‌ها با گلوکز، محلول MTT (mg/mL 5 در PBS) به چاهک‌های پلیت 96 خانه اضافه شده و به مدت 3 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند.
پس از طی زمان انکوباسیون، پلیت حاوی سلول‌ها با دور g 1000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس محلول رویی در چاهک‌ها خالی گردید و 100 میکرولیتر محلول DMSO (Dimethyl sulfoxide) به هر کدام اضافه شد و به مدت 10 دقیقه جهت حل کردن رسوب‌های بنفش MTT ، تکان داده شد. سپس توسط الایزا ریدر جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد. برای محاسبه اثر توکسیسیتی کافئین بر روی بقای سلول‌های NB4 و بررسی میزان مرگ سلول‌های تیمار شده، از فرمول زیر استفاده شد:
در این فرمول، OD exp و OD cont به ترتیب بیانگر جذب نوری سلول‌های تیمار شده و سلول‌های تیمار نشده (کنترل) می‌باشد.
آزمون BrdU :
اثر مهاری کافئین بر تکثیر سلول‌های NB4 از طریق تعیین میزان مشارکت برمو داکسی یوریدین در DNA سلول‌های NB4 با استفاده ازBrdU-based cell proliferation ELISA kit طبق دستورالعمل کیت اندازه‌گیری شد. به طور خلاصه، سلول‌ها به تعداد 5000 در هر چاهک درون پلیت 96 تایی در حضور یا عدم حضور کافئین کشت داده شدند. 12 ساعت مانده به انتهای زمان انکوباسیون، 10 میکرولیتر محلول BrdU که در کیت موجود می‌باشد، به سلول‌ها افزوده شد. در ادامه و با استفاده از محلول FixDenat ، سلول‌ها فیکس شده و DNA آن‌ها دناتوره گردید. سلول‌ها با آنتی‌بادی علیه BrdU که با آنزیم پراکسیداز کنژوگه می‌باشد، به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شده و در انتهای این زمان، 100 میکرولیتر سوبسترای TMB افزوده شد. پس از گذشت 30 دقیقه در دمای اتاق و آن هم به منظور پایان دادن به عملکرد آنزیم پراکسیداز، از محلول اسید سولفوریک 1 مولار استفاده شد. در انتها، میزان رنگ ایجاد شده در هر چاهـک بـا استفـاده از دستگاه الایزا ریدر در طول موج nm 450 خوانده شد. برای محاسبه اثر مهاری کافئین بر تکثیر سلول‌های NB4 و بررسی میزان کاهش ساخت DNA سلول‌های تیمار شده، از فرمول زیر استفاده شد:
در این فرمول، OD exp و OD cont به ترتیب بیانگر جذب نوری سلول‌های تیمار شده و سلول‌های تیمار نشده (کنترل) می‌باشد.
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاسپاز 3 :
برای ارزیابی اثر کافئین در القای آپوپتوز در سلول‌های NB4 ، روش رنگ‌سنجی فعالیت آنزیم کاسپاز 3 بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده(سیگما) انجام گرفت. اساس آزمایش، اندازه‌گیری اسپکتروفتومتریک رنگی بود که در اثر آزاد شدن مولکول pNA (متصل به سوبسترا) تحت تاثیر فعالیـت آنزیـم کاسپـاز 3 ایجـاد مـی‌شود. پس از تیمار 48
جدول 1: توالی آغازگرها
نمودار1: القای مهار رشد و مرگ سلولی توسط کافئین در سلول‌های NB4 . سلول‌های NB4 با دوزهای مختلف کافئین برای 24، 48 و 72 ساعت در محیط کشت حاوی FBS 10% تیمار شدند و میزان مرگ سلولی با روش MTT بررسی شد(3 n= ، mean ± SD). همان گونه که در شکل مشاهده می‌شود، کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان سبب القای مهار رشد و مرگ سلولی سلول‌هایNB4 می‌شود.
.jpg)
نمودار 2: کاهش میزان ساخت DNA توسط کافئین در سلول‌های NB4. سلول‌های NB4 با دوزهای مختلف کافئین برای 24، 48 و 72 ساعت در محیط کشت حاوی FBS 10% تیمار شدند و میزان ساخت DNA با روش BrdU بررسی شد(3 n= ، mean ± SD). همان گونه که در شکل مشاهده می‌شود، کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان قادر به کاهش میزان ساخت DNA در سلول‌هایNB4 می‌باشد.
کاهش میزان ساخت DNA توسط کافئین در سلول‌های NB4 :
به منظور تعیین اثربخشی کافئین بر روی تکثیر و ساخت DNA در رده سلولی NB4 ، آزمون BrdU انجام شد. طی بررسی‌های وابسته به دوز در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت مشخص گردید که کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان قادر به مهار تکثیر سلول‌هایNB4 می‌باشد. همان گونه که در نمودار 2 مشاهده می‌شود، غلظت mM 1 کافئین هیچ گونه اثری در مهار میزان سنتز DNA سلول‌ها ندارد، در حالی که در غلظت mM2، فعالیت تکثیر سلول‌ها در زمان‌های ذکر شده به ترتیب به 89% ، 78% و 70% کاهش یافت. با افزایش غلظت کافئین مشخص شد که کاهش تکثیر و مهار ساخت DNA در غلظت‌های 4 میلی مولار بیشتر از غلظت 2 میلی‌مولار بوده است؛ به گونه‌ای که میزان تکثیر سلول‌های NB4 تیمار شده به مدت 72 ساعت با دوزهای 4 میلی‌مولار به 51% کاهش پیدا کرد(نمودار 2). با توجه به این نتایج می‌توان به این نکته پی برد که هر چه سلول‌ها زمان طولانی‌تری تحت تیمار با کافئین قرار گرفته باشند، میزان رشدشان کمتر می‌شود. هم چنین در دوزهای بالاتر ممانعت از رشد سلولی سریعتر و به میزان بیشتری صورت می‌گیرد.
افزایش بیان ژن‌های Bax و p21 در اثر تیمار سلول‌های NB4 با کافئین:
پروتئین Bax به عنوان یک پروتئین کلیدی در آپوپتوز القا شده توسط عوامل مختلف در مسیر داخلی آپوپتوز عمل می‌کند. این پروتئین از طریق بر همکنش با پروتئین‌های غشای میتوکندری موجب افزایش نفوذپذیری غشای میتوکندری و آزاد شدن سیتوکروم C از میتوکندری و فعال شدن کاسپازها و در نهایت آپوپتوز می‌شود(9). پروتئین p21 به عنوان یک تنظیم‌کننده چرخه سلولی و دخیل در آپوپتوز مطرح می‌باشد(10). برای بررسی میزان تاثیر کافئین بر بیان ژن‌های Bax و p21 ، میزان بیان mRNA این دو ژن توسط روش Real-Time PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، سلول‌ها با دوز 4 میلی‌مولار کافئین در محیط کشت برای 48 ساعت انکوبه شدند و سپس سلول‌ها برداشت شده و RNA سلولی اسخراج گردید. همان طور که در نمودار 3 نشان داده شده است، کافئین به مقدار قابل توجهی میزان بیان mRNA ژن Bax و p21 را افزایش داد.
نمودار 3: تاثیر کافئین بر میزان بیان ژن‌های Bax و p21 . پس از تیمار سلول‌های NB4 با دوز 4 میلی‌مولار کافئین برای 48 ساعت، RNA از سلول‌ها استخراج گردید و میزان بیان نسبی mRNA هر کدام از ژن‌ها پس از نرمال‌سازی با ژن GAPDH محاسبه شد(3 n=، mean ± SD). همان طور که در نمودار نشان داده شده است، کافئین به مقدار قابل توجهی میزان بیان mRNA ژن Bax و p21 را افزایش داد.
افزایش فعالیت کاسپاز3 توسط کافئین در سلول‌های NB4 :
هسته مرکزی تشکیلات تخصصی آپوپتوز، یک سیستم پروتئولیتیک شامل خانواده‌ای از پروتئازها به نام کاسپازها می‌باشد(11). در این میان کاسپاز-٣، کاسپاز مهمی است که نقشی محوری در فاز اجرایی آپوپتوز سلولی دارد(13، 12). جهت بررسی اثر کافئین بر القای آپوپتوز در رده سلولی NB4 از طریق فعالیت آنزیم کاسپاز-3، فعالیت آنزیماتیک این آنزیم اندازه‌گیری شد. بدین منظور، سلول‌ها با غلظت‌های مورد نظر از کافئین به مدت 72 ساعت تیمار شده و میزان تغییر در فعالیت آنزیم کاسپاز-3 با اندازه‌گیری غلظت p-NA آزاد شده اندازه‌گیری شد. طی 72 ساعت از تیمار کافئینی سلول‌ها، کافئین به صورت وابسته به دوز و به ترتیب در دوزهای 2 و 4 میلی مولار موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز به میزان 62/1% و 42/3% می‌گردد ؛ این در حالـی اسـت کـه دوز 1 میلی‌مولار هیچ گونه تاثیری در
القای فعالیت آنزیم کاسپاز-3 در سلول‌های NB4 ندارد (نمودار 4).
نمودار 4: افزایش فعالیت کاسپاز 3 توسط کافئین در سلول‌های NB4. سلول‌ها به مدت 72 ساعت با کافئین تیمار شده و میزان تغییر در فعالیت آنزیم کاسپاز-3 اندازه‌گیری شد. طی 72 ساعت از تیمار، دوزهای 2 و 4 میلی مولار کافئین به ترتیب موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 به میزان 62/1% و 42/3 % می‌گردد.
بحث
کافئین از آلکالوئیدهای پورین بوده و یک جزء کلیدی از نوشیدنی‌های بسیاری از مردم به ویژه چای و قهوه است. این ماده دارای خواص فیزیولوژیکی خاص بوده و به علت اثرات تحریکی آن بر سیستم عصبی و هومورال، به عنوان یک عامل ضد خواب کاملاً شناخته شده است. اخیراً مطالعه‌های انجام شده نشان داده است که کافئین دارای اثرات ضد سرطان می‌باشد؛ با این حال مکانیسم اثرات ضد سرطان این آلکالوئید پورینی به خوبی معرفی نشده است(4). طی مطالعه‌ای مشخص شده است که کافئین به میزان قابل ملاحظه‌ای باعث افزایش آپوپتوز و آسیب میتوکندریال در سلول‌های سرطانی رده‌های HL-60وU937 تیمار شده با PD184352 (مهارکننده پروتئین کیناز فعال شونده توسط میتوژن) می‌شود(14). هم چنین نشان داده شده است که کافئین موجب مهار ATM3 و فعالیت کینازهای ATR شده و از بروز سرطان پیشگیری می‌کند(16، 15، 4). از جمله سایر مطالعه‌های مرتبط با اثرات ضد سرطان کافئین می‌توان به افزایش حساسیت سلول‌های جنین موش و سلول‌های رده Hella نسبت به اشعه، مهار سرطان پوست ناشی از پرتوی UVB در موش‌ها و افزایش حساسیت سلول‌ها به برخی از عوامل شیمی درمانی اشاره کرد(19-17، 4). در این مطالعه و با بررسی میزان بقای سلولی با استفاده از روش MTT مشخص شد که کافئین رشد سلوهای NB4 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش می‌دهد. هم چنین، طی بررسی‌های وابسته به دوز در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت مشخص گردید که کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان قادر به مهار تکثیر سلول‌هایNB4 می‌باشد. با این که مکانیسم اثرات ضد سرطان کافئین به خوبی مشخص نیست، اما می‌توان به اثرات این ماده بر تکثیر سلولی، آپوپتوز، آنژیوژنز و یا سیستم ایمنی اشاره داشت (4). در این خصوص، گزارش‌ها نشان می‌دهد که غلظت بالای کافئین به طور مستقیم موجب القای آپوپتوز سلولی می‌گردد(22-20). ژن Bax یکی از اعضای خانواده ژن BCL-2 است که باعث افزایش آپوپتوز می‌گردد. پروتئین شناخته شده Bcl-2 یک کمپلکس هترودایمر با پروتئین Bax در داخل سلول تشکیل می‌دهد و نسبت BCL-2 به Bax در این که آیا آپوپتوز القا و یا مهار شود، بسیار تعیین‌کننده می‌باشد(24، 23).
پروتئین Bax که یکی از ژن‌های هدف p53 است، کنترل مرگ سلولی را از طریق اخلال در میتوکندری، رها شدن سیتوکروم c از میتوکندری و در نهایت فعال شدن کاسپاز 3 انجام می‌دهد(25). برای بررسی مکانیسم اثر ضد سرطانی کافئین علیه سلول‌های NB4 ، فعالیت آنزیم کاسپاز 3 و هم چنین تغییر بیان ژن‌های Bax و p21 مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان داد که کافئین به صورت وابسته به دوز موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 و افزایش بیان mRNA ژن Bax و p21 می‌گردد. در همین راستا، دوبرز و همکاران گزارش کرده‌اند که کافئین موجب افزایش حساسیت سلول‌های رده H358 (سلول غیر کوچک سرطان ریه انسان) به آپوپتوز وابستـه بـه p53 از طریــق انتقـال پــروتئین Bax به داخل
میتوکندری می‌شود.
نتیجه‌گیری
در مجموع، نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که کافئین موجب مهار تکثیر و القای آپوپتوز در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4 می‌شود؛ از جمله مکانیسم‌های دخیـل در ایجـاد آپوپتـوز توسط کافئین می‌توان به افزایش
بیان ژن‌هایBax و p21 و هم چنین فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 اشاره کرد. با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که مصرف کافئین به عنوان ماده‌ای در چای می‌تواند یک عامل مفید در القای مرگ سلولی در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد عمل کند.
متن کامل: (3822 مشاهده)
القای مرگ سلولی و کاهش تکثیر در سلول لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4
توسط کافئین
مجید صفا1، داود بشاش2، محسن حمیدپور3
چکیده
سابقه و هدف
پیشگیری، درمان و کنترل سرطان با استفاده از مواد طبیعی در حال حاضر به عنوان یک استراتژی امیدوارکننده در نظر گرفته شده است. در این خصوص، کافئین که یک آلکالوئید پورینی موجود در گیاهان مختلف از جمله قهوه، کاکائو، کولا و چای می‌باشد، به دلیل مهار چند منظوره سرطان از جمله لوسمی‌ها به تازگی توجه زیادی به خود جلب کرده است.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی به منظور بررسی اثر کافئین در لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، سلول‌های NB4 در غلظت‌های 1، 2 و 4 میلی مولار کافئین کشت داده شد و متعاقباً از آزمون‌های MTT ،Caspase 3 ،BrdU cell proliferation assay و Quantitative Real-Time PCR جهت بررسی اثر کافئین در القای مرگ سلولی و مطالعه مکانیسم احتمالی آن استفاده شد. آزمون paired student t test و نرم‌افزار 16 SPSS جهت تحلیل داده‌ها به کار رفت.
یافته‌ها
بررسی میزان ساخت DNA و بقای سلولی با استفاده از روش‌های BrdU و MTT، نشان داد که کافئین میزان تکثیر و بقای سلوهای NB4 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش می‌دهد. هم چنین نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان داد که افزایش دوز کافئین موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 و افزایش بیان mRNA ژن Bax و p21 می‌گردد.
نتیجه گیری
در مجموع، با توجه به این که مشخص شد کافئین می‌تواند موجب مهار تکثیر و القای آپوپتوز در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4 شود، لذا می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که مصرف کافئین به عنوان ماده‌ای در چای ممکن است یک عامل مفید جهت القای مرگ سلولی این سلول‌های بدخیم در مبتلایان به لوسمی پرومیلوسیتیک حاد عمل کند.
کلمات کلیدی: لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، آپوپتوز، کافئین، کاسپاز
تاریخ دریافت : 5 /5/93
تاریخ پذیرش : 19/3/94
1- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات سلولـی و مولکولی ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی ایران ـ گروه هماتولوژی ـ تهران ـ ایران ـ کد پستی: 1449614535
2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه هماتولوژی ـ میدان قدس ـ خیابان دربند ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 1971653312
3- PhD هماتولوژی ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
توسط کافئین
مجید صفا1، داود بشاش2، محسن حمیدپور3
چکیده
سابقه و هدف
پیشگیری، درمان و کنترل سرطان با استفاده از مواد طبیعی در حال حاضر به عنوان یک استراتژی امیدوارکننده در نظر گرفته شده است. در این خصوص، کافئین که یک آلکالوئید پورینی موجود در گیاهان مختلف از جمله قهوه، کاکائو، کولا و چای می‌باشد، به دلیل مهار چند منظوره سرطان از جمله لوسمی‌ها به تازگی توجه زیادی به خود جلب کرده است.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی به منظور بررسی اثر کافئین در لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، سلول‌های NB4 در غلظت‌های 1، 2 و 4 میلی مولار کافئین کشت داده شد و متعاقباً از آزمون‌های MTT ،Caspase 3 ،BrdU cell proliferation assay و Quantitative Real-Time PCR جهت بررسی اثر کافئین در القای مرگ سلولی و مطالعه مکانیسم احتمالی آن استفاده شد. آزمون paired student t test و نرم‌افزار 16 SPSS جهت تحلیل داده‌ها به کار رفت.
یافته‌ها
بررسی میزان ساخت DNA و بقای سلولی با استفاده از روش‌های BrdU و MTT، نشان داد که کافئین میزان تکثیر و بقای سلوهای NB4 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش می‌دهد. هم چنین نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان داد که افزایش دوز کافئین موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 و افزایش بیان mRNA ژن Bax و p21 می‌گردد.
نتیجه گیری
در مجموع، با توجه به این که مشخص شد کافئین می‌تواند موجب مهار تکثیر و القای آپوپتوز در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4 شود، لذا می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که مصرف کافئین به عنوان ماده‌ای در چای ممکن است یک عامل مفید جهت القای مرگ سلولی این سلول‌های بدخیم در مبتلایان به لوسمی پرومیلوسیتیک حاد عمل کند.
کلمات کلیدی: لوسمی پرومیلوسیتیک حاد، آپوپتوز، کافئین، کاسپاز
تاریخ دریافت : 5 /5/93
تاریخ پذیرش : 19/3/94
 |
1- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات سلولـی و مولکولی ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی ایران ـ گروه هماتولوژی ـ تهران ـ ایران ـ کد پستی: 1449614535
2- مؤلف مسئول: PhD خون‌شناسی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه هماتولوژی ـ میدان قدس ـ خیابان دربند ـ تهران ـ ایران ـ کدپستی: 1971653312
3- PhD هماتولوژی ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
مقدمه
پیشگیری، درمان و کنترل سرطان با استفاده از مواد طبیعی در حال حاضر به عنوان یک استراتژی امیدوارکننده در نظر گرفته شده و در مدل‌های تجربی مشخص شده است که بسیاری از مواد طبیعی و یا رژیم غذایی موجب مهار سرطان می‌شوند(2، 1). در این خصوص، کافئین به دلیل مهار چند منظوره سرطان در سلول‌های کشت داده شده و یا مدل‌های حیوانی به تازگی توجه زیادی به خود جلب کرده است(3). کافئین یک ماده شیمیایی و خوردنی است که در گیاهان مختلفی از جمله قهوه، کاکائو، کولا و چای یافت می‌شود. این ماده، یک آلکالوئید از خانواده متیل گزانتین‌ها است و در فرم خالص، به صورت پودر سفید رنگ با مزه تلخ می‌باشد. کافئین که از ترکیب کربن، هیدروژن، نیتروژن و اکسیژن تشکیل شده است، نوعی محرک بوده و می‌تواند از خوابیدن جلوگیری کند. مطالعه‌های انجام شده طی دهه گذشته نشان داده است که کافئین دارای اثرات ضد سرطان بوده و احتمالاً این اثر را از طریق کاهش تکثیر سلولی و یا القای آپوپتوز در سرطان‌ها از جمله لوسمی‌ها اعمال می‌کند(4).
لوسمی‌ها، گروه ناهمگونی از بدخیمی‌ها هستند که از بدخیم شدن سلول‌های خونساز اولیه در مغز استخوان به وجود می‌آیند. لوسمی، در سال ١٨٧٠ به عنوان یک بیماری درگیرکننده مغز استخوان عنوان شد و در سال ١٩٣٠، انواع مورفولوژیک لوسمی‌های حاد و مزمن به خوبی مشخص شدند(5). لوسمی‌های حاد بر اساس رده سلولی به دو گروه بزرگ لوسمی حاد میلوبلاستیک(AML) و لوسمی حاد لنفوبلاستیک(ALL) تقسیم می‌شوند. لوسمی پرومیلوسیتیک حاد(APL) یکی از زیر گروه‌هایAML (AML-M3) می‌باشد. APL حدود 15%-10% انواع AMLرا به خود اختصاص داده و معمولاً در سنین 50-40 سالگی رخ می‌دهد(6). این بیماری در اثر نقص در بلوغ گلبول‌های سفید در رده میلوئیدی به وجود می‌آید که طی آن، روند بلوغ در سلول‌های رده گرانولوسیتی در مرحله پرومیلوسیت متوقف می‌شود. به دلیل انعقاد داخل عروقی منتشر(DIC) که ظاهراً ناشی از آزاد شدن مواد پیش انعقادی از گرانول‌های سلول‌های لوسمیک است، مشکلات خونریزی در این بیماری شایع بوده و از جمله علل اصلی مرگ و میر این بیماران محسوب می‌شود(7). در سال 1985 معرفی ATRA که مشتقی از ویتامین A است، افقی جدید در تاریخچه درمان APL گشود و از میزان مرگ و میر بیماری به طور قابل توجهی کاست. با این حال و علی‌رغم اثر بخشی این کافئین در درمان APL ، درصدی از بیماران دچار عود شده و در نهایت به مرگ بیمار منجر می‌شود(8).
با توجه به اثرات ضد سرطانی کافئین و از طرفی با در نظر گرفتن عدم موفقیت کامل راه‌کارهای درمانی معمول در APL ، برآن شدیم تا در این تحقیق اثربخشی این آلکالوئید متیل گزانتینی را علیه سلول‌های NB4 (رده سلولی لوسمی پرومیلوسیتیک حاد) بررسی کنیم. با انجام این تحقیق مشخص شد که کافئین از طریق افزایش بیان ژن‌های Bax و p21 و هم چنین فعال کردن آنزیم کاسپاز 3 موجب القای آپوپتوز در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4 می‌شود.
مواد و روش‌ها
کشت سلولی:
در یک مطالعه تجربی، سلول‌های NB4 (رده سلولی انسانی لوسمی پرومیلوسیتیک حاد) اولین بار در سال 1989 از مغز استخوان یک خانم جوان 23 ساله مبتلا به لوسمی پرومیلوسیتیک حاد جداسازی شد. سلـول‌های NB4 ، رده سلولی بسیار مناسبی برای مطالعه‌های in vitro در مورد لوسمی پرومیلوسیتیک حاد محسوب می‌شود. در این مطالعه، سلول‌های این رده سلولی که از انستیتو پاستور تهیه شده بود، در محیط کشت 1640 RPMI حاوی mM 2 از L -گلوتامین، 10% FBS ، پنی‌سیلین به میزان U/mL 100 و استرپتومایسین به میزان µg/mL 100 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و فشار 5% از CO2 کشت داده شدند.
تیمار با کافئین:
برای تیمار سلول‌ها، از کافئین(آمریکا، سیگما) استفاده شد. محلول ذخیره کافئین به واسطه حل کردن این ماده در آب مقطر استریل تهیه شد. محلول ذخیره را در میکروتیوب‌ها تقسیم کرده و آن‌ها را در دمای اتاق تا زمان مصرف نگهداری کردیم. به منظور تعیین اثرات بهینه کافئین، ٢ متغیر دوز و زمان در این تحقیق در نظر گرفته شد. سلول‌های سرطانی با غلظت‌های 1، 2 و 4 میلی‌مولار از کافئین تیمار شدند و به ترتیب پس از زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت مورد مطالعه قرار گرفتند. در ضمن به منظور افزایش بهره‌وری کار و بررسی مقایسه‌ای، آزمایش‌ها به صورت دوبار تکرار انجام شد.
Microculture Tetrazolium Test :
میزان حیات سلولی توسط آزمایش MTT بررسی شد. جهت انجام آزمایش بعد از دو بار پاساژ دادن، سلول‌ها به پلیت 96 خانه (5000 سلول در هر خانه) منتقل شدند. هنگامی که MTT زرد رنگ وارد سلول‌های زنده می‌شود، به وسیله آنزیم دهیدروژناز این سلول‌ها احیا می‌شود و رسوب بنفش رنگ ایجاد می‌کند. به طور خلاصه، بعد از اتمام زمان تیمار سلول‌ها با گلوکز، محلول MTT (mg/mL 5 در PBS) به چاهک‌های پلیت 96 خانه اضافه شده و به مدت 3 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند.
پس از طی زمان انکوباسیون، پلیت حاوی سلول‌ها با دور g 1000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس محلول رویی در چاهک‌ها خالی گردید و 100 میکرولیتر محلول DMSO (Dimethyl sulfoxide) به هر کدام اضافه شد و به مدت 10 دقیقه جهت حل کردن رسوب‌های بنفش MTT ، تکان داده شد. سپس توسط الایزا ریدر جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد. برای محاسبه اثر توکسیسیتی کافئین بر روی بقای سلول‌های NB4 و بررسی میزان مرگ سلول‌های تیمار شده، از فرمول زیر استفاده شد:
در این فرمول، OD exp و OD cont به ترتیب بیانگر جذب نوری سلول‌های تیمار شده و سلول‌های تیمار نشده (کنترل) می‌باشد.
آزمون BrdU :
اثر مهاری کافئین بر تکثیر سلول‌های NB4 از طریق تعیین میزان مشارکت برمو داکسی یوریدین در DNA سلول‌های NB4 با استفاده ازBrdU-based cell proliferation ELISA kit طبق دستورالعمل کیت اندازه‌گیری شد. به طور خلاصه، سلول‌ها به تعداد 5000 در هر چاهک درون پلیت 96 تایی در حضور یا عدم حضور کافئین کشت داده شدند. 12 ساعت مانده به انتهای زمان انکوباسیون، 10 میکرولیتر محلول BrdU که در کیت موجود می‌باشد، به سلول‌ها افزوده شد. در ادامه و با استفاده از محلول FixDenat ، سلول‌ها فیکس شده و DNA آن‌ها دناتوره گردید. سلول‌ها با آنتی‌بادی علیه BrdU که با آنزیم پراکسیداز کنژوگه می‌باشد، به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شده و در انتهای این زمان، 100 میکرولیتر سوبسترای TMB افزوده شد. پس از گذشت 30 دقیقه در دمای اتاق و آن هم به منظور پایان دادن به عملکرد آنزیم پراکسیداز، از محلول اسید سولفوریک 1 مولار استفاده شد. در انتها، میزان رنگ ایجاد شده در هر چاهـک بـا استفـاده از دستگاه الایزا ریدر در طول موج nm 450 خوانده شد. برای محاسبه اثر مهاری کافئین بر تکثیر سلول‌های NB4 و بررسی میزان کاهش ساخت DNA سلول‌های تیمار شده، از فرمول زیر استفاده شد:
در این فرمول، OD exp و OD cont به ترتیب بیانگر جذب نوری سلول‌های تیمار شده و سلول‌های تیمار نشده (کنترل) می‌باشد.
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاسپاز 3 :
برای ارزیابی اثر کافئین در القای آپوپتوز در سلول‌های NB4 ، روش رنگ‌سنجی فعالیت آنزیم کاسپاز 3 بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده(سیگما) انجام گرفت. اساس آزمایش، اندازه‌گیری اسپکتروفتومتریک رنگی بود که در اثر آزاد شدن مولکول pNA (متصل به سوبسترا) تحت تاثیر فعالیـت آنزیـم کاسپـاز 3 ایجـاد مـی‌شود. پس از تیمار 48
جدول 1: توالی آغازگرها
| ژن | آغازگر جلوبرنده (5'→3') | آغازگر معکوس (5'→3') | اندازه(bp) |
| HPRT | TGGACAGGACTGAACGTCTTG | CCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTA | 111 |
| p21 | CCTGTCACTGTCTTGTACCCT | GCGTTTGGAGTGGTAGAAATCT | 130 |
| Bax | CGAGAGGTCTTTTTCCGAGTG | GTGGGCGTCCCAAAGTAGG | 242 |
ساعته، سلول‌های NB4 را با دور g600 به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ کرده، رسوب سلولی را لیز نموده و لیزات سلولی را با دور g 20000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ کردیم. در حجم نهایی µL100، مقدار 5 میکروگرم از مایع رویی را با µL85 بافر آزمایش و µL10 از سوبسترای کاسپاز 3(Ac-DEVD-pNA) به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه نمودیم. پس از طی زمان مورد نظر، جذب نوری نمونه‌ها را در طول موج 405 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر قرائت نمودیم.
استخراج RNA و ساخت cDNA :
برای استخراج RNA از سلول‌های مورد مطالعه، از محلول TriPure Isolation Reagent (رُوش) طبق دستورالعمل استفاده شد. پس از تیمار سلول‌های NB4 با کافئین و متعاقب گذشت زمان 48 ساعت، RNA سلول‌ها استخراج شده و کمیت آن‌ها با روش اسپکتروفتومتری با استفاده از دستگاه نانودراپ ND-1000 اندازه‌گیری شد. برای انجام واکنش رونویسی معکوس از(فرمنتاژ) RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit استفاده شد. حجم مورد نظر برای انجام این واکنش 20 میکرولیتر و محتویـات آن شامل µL4 بافر X 5 PCR ، µL2 از dNTP ، µL1 راندم هگزامر، µL1 آب تیمار شده با DEPC ، µL1 مهار کننده RNase (U/µL 20)، µL1 ترانس کریپتاز معکوس M-MULV ( U/µL200) و µg 1 از RNA مورد آزمایش به ازای هر واکنش بود. محتوی مذکور به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد، 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و 1 ساعت در دمای 42 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند و در نهایت، واکنش ساخت cDNA به واسطه انکوباسیون 5 دقیقه‌ای در دمای 70 درجه سانتی‌گراد پایان پذیرفت. cDNA ساخته شده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
اندازه‌گیری کمی بیان ژن‌های Bax و p21 با RQ-PCR :
آزمون Real-time PCR در دستگاه Roter Gene 6000 Real Time PCR System (کیاژن) و در حجم 20 میکرو لیتر انجام شد. به ازای هر واکنش، µL10 از Maxima SYBR green master mix (فرمنتاز)، µL2 از محصول cDNA ، µL5/0 از هر یک از آغازگرها ( nmol20) و µL7 آب عاری از نوکلئاز استفاده شد. شرایط دمایی مورد استفاده شامل یک مرحله فعال‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و در ادامه، 45 سیکل برای دناتوراسیون (5 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد) و مرحله آنیلینگ/اکستنشن توام (20 ثانیه در60 درجه سانتی‌گراد) بود. برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت. در انتها برای محاسبـه نسبـی تعـداد نسخه mRNA تکثیر شده از فرمول –êêct 2 استفاده شد(جدول 1).
آنالیز آماری:
بـرای انجـام مطالعه‌های آماری از 16 SPSS استفاده شد. اختلاف آماری بین گروه‌های کنترل و تیمار شده با استفاده از Paired Student’s t-test بررسی شد. مقادیر به دست آمده با 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
بررسی میزان سیتوتوکسیسیتی کافئین بر سلول‌های رده NB4 :
پـس از کشـت رده سلولی NB4 در حضور غلظت‌های
مختلـف کافئیـن، میـزان بقـای سلولـی جهـت بررسی تاثیر کافئین به صورت روزانه طی 3 روز با استفاده از روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به دست آمده از روش MTTنشان داد که کافئین رشد سلوهای NB4 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش می‌دهد. همان
طور که در نمودار 1 نشان داده شده است، دوز 1 میلی‌مولار کافئین تاثیر چندانی بر بقای سلول‌ها ندارد؛ در حالی که کافئین به طور مؤثری موجب عدم رشد و القای مرگ سلول‌های NB4 با 4 میلی‌مولار IC50 (در 72 ساعت) می‌شود(نمودار 1).
استخراج RNA و ساخت cDNA :
برای استخراج RNA از سلول‌های مورد مطالعه، از محلول TriPure Isolation Reagent (رُوش) طبق دستورالعمل استفاده شد. پس از تیمار سلول‌های NB4 با کافئین و متعاقب گذشت زمان 48 ساعت، RNA سلول‌ها استخراج شده و کمیت آن‌ها با روش اسپکتروفتومتری با استفاده از دستگاه نانودراپ ND-1000 اندازه‌گیری شد. برای انجام واکنش رونویسی معکوس از(فرمنتاژ) RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit استفاده شد. حجم مورد نظر برای انجام این واکنش 20 میکرولیتر و محتویـات آن شامل µL4 بافر X 5 PCR ، µL2 از dNTP ، µL1 راندم هگزامر، µL1 آب تیمار شده با DEPC ، µL1 مهار کننده RNase (U/µL 20)، µL1 ترانس کریپتاز معکوس M-MULV ( U/µL200) و µg 1 از RNA مورد آزمایش به ازای هر واکنش بود. محتوی مذکور به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد، 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و 1 ساعت در دمای 42 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند و در نهایت، واکنش ساخت cDNA به واسطه انکوباسیون 5 دقیقه‌ای در دمای 70 درجه سانتی‌گراد پایان پذیرفت. cDNA ساخته شده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
اندازه‌گیری کمی بیان ژن‌های Bax و p21 با RQ-PCR :
آزمون Real-time PCR در دستگاه Roter Gene 6000 Real Time PCR System (کیاژن) و در حجم 20 میکرو لیتر انجام شد. به ازای هر واکنش، µL10 از Maxima SYBR green master mix (فرمنتاز)، µL2 از محصول cDNA ، µL5/0 از هر یک از آغازگرها ( nmol20) و µL7 آب عاری از نوکلئاز استفاده شد. شرایط دمایی مورد استفاده شامل یک مرحله فعال‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و در ادامه، 45 سیکل برای دناتوراسیون (5 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد) و مرحله آنیلینگ/اکستنشن توام (20 ثانیه در60 درجه سانتی‌گراد) بود. برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت. در انتها برای محاسبـه نسبـی تعـداد نسخه mRNA تکثیر شده از فرمول –êêct 2 استفاده شد(جدول 1).
آنالیز آماری:
بـرای انجـام مطالعه‌های آماری از 16 SPSS استفاده شد. اختلاف آماری بین گروه‌های کنترل و تیمار شده با استفاده از Paired Student’s t-test بررسی شد. مقادیر به دست آمده با 05/0 p< از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
بررسی میزان سیتوتوکسیسیتی کافئین بر سلول‌های رده NB4 :
پـس از کشـت رده سلولی NB4 در حضور غلظت‌های
مختلـف کافئیـن، میـزان بقـای سلولـی جهـت بررسی تاثیر کافئین به صورت روزانه طی 3 روز با استفاده از روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به دست آمده از روش MTTنشان داد که کافئین رشد سلوهای NB4 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش می‌دهد. همان
طور که در نمودار 1 نشان داده شده است، دوز 1 میلی‌مولار کافئین تاثیر چندانی بر بقای سلول‌ها ندارد؛ در حالی که کافئین به طور مؤثری موجب عدم رشد و القای مرگ سلول‌های NB4 با 4 میلی‌مولار IC50 (در 72 ساعت) می‌شود(نمودار 1).
نمودار1: القای مهار رشد و مرگ سلولی توسط کافئین در سلول‌های NB4 . سلول‌های NB4 با دوزهای مختلف کافئین برای 24، 48 و 72 ساعت در محیط کشت حاوی FBS 10% تیمار شدند و میزان مرگ سلولی با روش MTT بررسی شد(3 n= ، mean ± SD). همان گونه که در شکل مشاهده می‌شود، کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان سبب القای مهار رشد و مرگ سلولی سلول‌هایNB4 می‌شود.
نمودار 2: کاهش میزان ساخت DNA توسط کافئین در سلول‌های NB4. سلول‌های NB4 با دوزهای مختلف کافئین برای 24، 48 و 72 ساعت در محیط کشت حاوی FBS 10% تیمار شدند و میزان ساخت DNA با روش BrdU بررسی شد(3 n= ، mean ± SD). همان گونه که در شکل مشاهده می‌شود، کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان قادر به کاهش میزان ساخت DNA در سلول‌هایNB4 می‌باشد.
کاهش میزان ساخت DNA توسط کافئین در سلول‌های NB4 :
به منظور تعیین اثربخشی کافئین بر روی تکثیر و ساخت DNA در رده سلولی NB4 ، آزمون BrdU انجام شد. طی بررسی‌های وابسته به دوز در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت مشخص گردید که کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان قادر به مهار تکثیر سلول‌هایNB4 می‌باشد. همان گونه که در نمودار 2 مشاهده می‌شود، غلظت mM 1 کافئین هیچ گونه اثری در مهار میزان سنتز DNA سلول‌ها ندارد، در حالی که در غلظت mM2، فعالیت تکثیر سلول‌ها در زمان‌های ذکر شده به ترتیب به 89% ، 78% و 70% کاهش یافت. با افزایش غلظت کافئین مشخص شد که کاهش تکثیر و مهار ساخت DNA در غلظت‌های 4 میلی مولار بیشتر از غلظت 2 میلی‌مولار بوده است؛ به گونه‌ای که میزان تکثیر سلول‌های NB4 تیمار شده به مدت 72 ساعت با دوزهای 4 میلی‌مولار به 51% کاهش پیدا کرد(نمودار 2). با توجه به این نتایج می‌توان به این نکته پی برد که هر چه سلول‌ها زمان طولانی‌تری تحت تیمار با کافئین قرار گرفته باشند، میزان رشدشان کمتر می‌شود. هم چنین در دوزهای بالاتر ممانعت از رشد سلولی سریعتر و به میزان بیشتری صورت می‌گیرد.
افزایش بیان ژن‌های Bax و p21 در اثر تیمار سلول‌های NB4 با کافئین:
پروتئین Bax به عنوان یک پروتئین کلیدی در آپوپتوز القا شده توسط عوامل مختلف در مسیر داخلی آپوپتوز عمل می‌کند. این پروتئین از طریق بر همکنش با پروتئین‌های غشای میتوکندری موجب افزایش نفوذپذیری غشای میتوکندری و آزاد شدن سیتوکروم C از میتوکندری و فعال شدن کاسپازها و در نهایت آپوپتوز می‌شود(9). پروتئین p21 به عنوان یک تنظیم‌کننده چرخه سلولی و دخیل در آپوپتوز مطرح می‌باشد(10). برای بررسی میزان تاثیر کافئین بر بیان ژن‌های Bax و p21 ، میزان بیان mRNA این دو ژن توسط روش Real-Time PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، سلول‌ها با دوز 4 میلی‌مولار کافئین در محیط کشت برای 48 ساعت انکوبه شدند و سپس سلول‌ها برداشت شده و RNA سلولی اسخراج گردید. همان طور که در نمودار 3 نشان داده شده است، کافئین به مقدار قابل توجهی میزان بیان mRNA ژن Bax و p21 را افزایش داد.
نمودار 3: تاثیر کافئین بر میزان بیان ژن‌های Bax و p21 . پس از تیمار سلول‌های NB4 با دوز 4 میلی‌مولار کافئین برای 48 ساعت، RNA از سلول‌ها استخراج گردید و میزان بیان نسبی mRNA هر کدام از ژن‌ها پس از نرمال‌سازی با ژن GAPDH محاسبه شد(3 n=، mean ± SD). همان طور که در نمودار نشان داده شده است، کافئین به مقدار قابل توجهی میزان بیان mRNA ژن Bax و p21 را افزایش داد.
افزایش فعالیت کاسپاز3 توسط کافئین در سلول‌های NB4 :
هسته مرکزی تشکیلات تخصصی آپوپتوز، یک سیستم پروتئولیتیک شامل خانواده‌ای از پروتئازها به نام کاسپازها می‌باشد(11). در این میان کاسپاز-٣، کاسپاز مهمی است که نقشی محوری در فاز اجرایی آپوپتوز سلولی دارد(13، 12). جهت بررسی اثر کافئین بر القای آپوپتوز در رده سلولی NB4 از طریق فعالیت آنزیم کاسپاز-3، فعالیت آنزیماتیک این آنزیم اندازه‌گیری شد. بدین منظور، سلول‌ها با غلظت‌های مورد نظر از کافئین به مدت 72 ساعت تیمار شده و میزان تغییر در فعالیت آنزیم کاسپاز-3 با اندازه‌گیری غلظت p-NA آزاد شده اندازه‌گیری شد. طی 72 ساعت از تیمار کافئینی سلول‌ها، کافئین به صورت وابسته به دوز و به ترتیب در دوزهای 2 و 4 میلی مولار موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز به میزان 62/1% و 42/3% می‌گردد ؛ این در حالـی اسـت کـه دوز 1 میلی‌مولار هیچ گونه تاثیری در
القای فعالیت آنزیم کاسپاز-3 در سلول‌های NB4 ندارد (نمودار 4).
نمودار 4: افزایش فعالیت کاسپاز 3 توسط کافئین در سلول‌های NB4. سلول‌ها به مدت 72 ساعت با کافئین تیمار شده و میزان تغییر در فعالیت آنزیم کاسپاز-3 اندازه‌گیری شد. طی 72 ساعت از تیمار، دوزهای 2 و 4 میلی مولار کافئین به ترتیب موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 به میزان 62/1% و 42/3 % می‌گردد.
بحث
کافئین از آلکالوئیدهای پورین بوده و یک جزء کلیدی از نوشیدنی‌های بسیاری از مردم به ویژه چای و قهوه است. این ماده دارای خواص فیزیولوژیکی خاص بوده و به علت اثرات تحریکی آن بر سیستم عصبی و هومورال، به عنوان یک عامل ضد خواب کاملاً شناخته شده است. اخیراً مطالعه‌های انجام شده نشان داده است که کافئین دارای اثرات ضد سرطان می‌باشد؛ با این حال مکانیسم اثرات ضد سرطان این آلکالوئید پورینی به خوبی معرفی نشده است(4). طی مطالعه‌ای مشخص شده است که کافئین به میزان قابل ملاحظه‌ای باعث افزایش آپوپتوز و آسیب میتوکندریال در سلول‌های سرطانی رده‌های HL-60وU937 تیمار شده با PD184352 (مهارکننده پروتئین کیناز فعال شونده توسط میتوژن) می‌شود(14). هم چنین نشان داده شده است که کافئین موجب مهار ATM3 و فعالیت کینازهای ATR شده و از بروز سرطان پیشگیری می‌کند(16، 15، 4). از جمله سایر مطالعه‌های مرتبط با اثرات ضد سرطان کافئین می‌توان به افزایش حساسیت سلول‌های جنین موش و سلول‌های رده Hella نسبت به اشعه، مهار سرطان پوست ناشی از پرتوی UVB در موش‌ها و افزایش حساسیت سلول‌ها به برخی از عوامل شیمی درمانی اشاره کرد(19-17، 4). در این مطالعه و با بررسی میزان بقای سلولی با استفاده از روش MTT مشخص شد که کافئین رشد سلوهای NB4 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش می‌دهد. هم چنین، طی بررسی‌های وابسته به دوز در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت مشخص گردید که کافئین هم به طور وابسته به دوز و هم وابسته به زمان قادر به مهار تکثیر سلول‌هایNB4 می‌باشد. با این که مکانیسم اثرات ضد سرطان کافئین به خوبی مشخص نیست، اما می‌توان به اثرات این ماده بر تکثیر سلولی، آپوپتوز، آنژیوژنز و یا سیستم ایمنی اشاره داشت (4). در این خصوص، گزارش‌ها نشان می‌دهد که غلظت بالای کافئین به طور مستقیم موجب القای آپوپتوز سلولی می‌گردد(22-20). ژن Bax یکی از اعضای خانواده ژن BCL-2 است که باعث افزایش آپوپتوز می‌گردد. پروتئین شناخته شده Bcl-2 یک کمپلکس هترودایمر با پروتئین Bax در داخل سلول تشکیل می‌دهد و نسبت BCL-2 به Bax در این که آیا آپوپتوز القا و یا مهار شود، بسیار تعیین‌کننده می‌باشد(24، 23). پروتئین Bax که یکی از ژن‌های هدف p53 است، کنترل مرگ سلولی را از طریق اخلال در میتوکندری، رها شدن سیتوکروم c از میتوکندری و در نهایت فعال شدن کاسپاز 3 انجام می‌دهد(25). برای بررسی مکانیسم اثر ضد سرطانی کافئین علیه سلول‌های NB4 ، فعالیت آنزیم کاسپاز 3 و هم چنین تغییر بیان ژن‌های Bax و p21 مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان داد که کافئین به صورت وابسته به دوز موجب القای فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 و افزایش بیان mRNA ژن Bax و p21 می‌گردد. در همین راستا، دوبرز و همکاران گزارش کرده‌اند که کافئین موجب افزایش حساسیت سلول‌های رده H358 (سلول غیر کوچک سرطان ریه انسان) به آپوپتوز وابستـه بـه p53 از طریــق انتقـال پــروتئین Bax به داخل
میتوکندری می‌شود.
نتیجه‌گیری
در مجموع، نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که کافئین موجب مهار تکثیر و القای آپوپتوز در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد NB4 می‌شود؛ از جمله مکانیسم‌های دخیـل در ایجـاد آپوپتـوز توسط کافئین می‌توان به افزایش
بیان ژن‌هایBax و p21 و هم چنین فعال شدن آنزیم کاسپاز 3 اشاره کرد. با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که مصرف کافئین به عنوان ماده‌ای در چای می‌تواند یک عامل مفید در القای مرگ سلولی در سلول‌های لوسمی پرومیلوسیتیک حاد عمل کند.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
خون و انكولوژي
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
