فصلنامه پژوهشی خون

مقدمه ‌
    یرسینیا انتروکولیتیکا، باکتری روده‌ای و یکی از عوامل مهم بیماری‌های دستگاه گوارش می‌باشد. این باکتری در یک سوم موارد، به صورت عفونت بدون علامت بوده و یک منبع بالقوه خطر است که در غربالگری اهداکنندگان شناسایی نمی‌شوداز دست می رود و هنوز هم یکی از علل مرگ و میر در تزریق خون ناشی از شوک اندوتوکسیک می باشد(3-1).
    عفونت با سوش پاتوژنیک آن در هر رده سنی اتفاق می‌افتد. ولی بیماری بالینی اغلب در بچه‌ها و جوانان گزارش شده است(4). عفونت بدون علامت در بالغین شایع است و با خوردن آب یا غذای آلوده به مدفوع انسان یا حیوان، منتقل می‌شود(5، 4). یرسینیا دارای پروتئین‌های متعددی است که از طریق آن‌ها می‌تواند به میزبان آسیب رساند، در میان این پروتئین‌ها(آنتی‌ژن‌ها)، گروه(Yersinia Outer Membrane) YOPs PROTEINS که پروتئین‌های خارجی یرسینیا هستند، سبب آسیب میزبان می‌گردند(7-4). بعد از ابتلا به عفونت با تحریک مخاط میزبان، به میزان فراوان آنتی‌‌بادی‌های IgA ، IgM و IgG بر علیه لیپوساکاریدها و پروتئین‌های YOPs یرسینیا تولید می‌شود، این آنتی‌بادی‌ها کاملاً محافظت کننده نبوده و در 30%-20% موارد، عفونت به صورت نامشخص تداوم پیدا می‌کند(8، 7). IgG ضد یرسینیا به مدت طولانی در خون باقی مانده و نشانگر ابتلای افراد در گذشته می‌باشد، IgA دارای نیمه عمر کوتاه (6-5 روز) است(4). یرسینیا در محیط غنی از آهن تکثیر یافته و تزریق چنین خونی می‌تواند سبب سپتی سمی، شوک اندوتوکسیک، DIC و مرگ گردد(9، 4).
    از سال 1982 تا 1992، 33 مورد اندوتوکسمی ناشی از یرسینیا در انگلیس مشاهده شده که سبب مرگ 19 نفر شده است(4).
    از سال 1991تا 1996، 10 مورد مرگ و میر ناشی از یرسینیا در امریکا به دنبال تزریق خون گزارش شده است(4). بین سال‌های 1991 تا 1997، 700000 مورد تزریق گلبول قرمز در نیوزلند صورت گرفت. 10 مورد سپتی‌سمی یرسینیا بروز کرد که 6 مورد آن با مرگ همراه بود(4). در بررسی که در استرالیا در سال 2006 از جمعیت سالم به عمل آمد، شیوع سرمی یرسینیا در سنین مختلف بین 38 % -4 % بود(10). شیوع سرمی یرسینیا در امریکا در جمعیت سالم در سال، 4/1% با تیتر بالا و در اسکاندیناوی 4% گزارش شده است(4). در آلمان شیوع سرمی حدود 40% گزارش شده است(7). تاکنون در انتقال خون ایران بررسی در مورد یرسینیا در اهداکنندگان و یا خون‌های اهدایی انجام نشده است. در این مطالعه، ابتدا شیوع سرمی یرسینیا در جمعیت اهداکنندگان خون با الایزا و با کیت اختصاصی anti YOP IgA Immunoassay بررسی شد و سپس خون اهداکنندگان سروپوزیتیو با آزمایش اختصاصی وسترن بلات و کشت خون ارزیابی گردید و در آخر، این دو روش(کشت و الایزا) با هم مقایسه شدند.
 
مواد و روش‌ها
    مطالعه انجام شده از نوع توصیفی بود و در سه ماه اول سال 1390 ، در پایگاه انتقال خون تهران و ستاد مرکزی انجام شد. حجم نمونه با توجه به حداقل شیوع سرمی یرسینیا یعنی 24 % در جمعیت سالم، تعداد 492 اهداکننده سالم(بدون سابقه اسهال اخیر و یا عدم تماس نزدیک با افراد مبتلا به عفونت گوارشی) انتخاب شد. سپس از آن‌ها طبق روند جاری به میزان 45 ± 450 میلی‌لیتر در کیسه‌های حاوی CPDA-1 خونگیری به عمل آمد. بر روی سرم آن‌ها(سرم به دست آمده از لوله پیلوت)، آزمایش anti-YOP IgA به روش الایزا(کیت recomwell IgA از میکروژن آلمان) انجام شد. در بررسی حاضر از کیت آماده الایزا، تولیدی شرکت میکروژن آلمان که در آن آنتی‌ژن‌های متعدد سطح یرسینیا انتروکولیتیکا(آنتی‌ژن‌های YOP) به کار گرفته و کوت شده است، استفاده گردید. کیت مربوطه دارای کنترل منفی، کنترل مثبت و کنترل cut off می‌باشد. تشخیص در این کیت بر اساس cut  off که در بروشور کیت توصیف گردیده است، می‌باشد. به طور خلاصه مراحل الایزا به ترتیب شامل تهیه کنترل‌ها و نمونه‌های کاری، انکوباسیون، شستشو، ریختن کونژوگه، انکوباسیون، شستشو، ریختن سوبسترا، ریختن محلول stopping و خوانش محلول نهایی در طول موج nm 450 می‌باشد. سپس جهت تایید، سرم افراد سروپوزیتیو به روش وسترن بلات(کیت recomline IgA از میکروژن آلمان) آزمایش شدند. در مرحله بعد کیسه خون اهداکنندگان سروپوزیتیو را جدا کرده و به مدت 35 روز در دمای 6-1 درجه بالای صفر نگهداری کردیم. به این صورت که 20 میلی‌لیتر خون از یکی از ورودی‌های کیسه خون با سرنگ استریل تهیه و به دو محیط کشت خون بی فازیک، هر یک جداگانه 10 میلی‌لیتر تلقیح نمودیم. یکی از محیط‌های کشت را در دمای اتاق و ظرف دیگر را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت یک هفته نگهداری کردیم. در پایان روز هفتم زمان انکوباسیون، محیط‌های کشت از نظر رشد میکروب مورد بررسی قرار گرفتند. 
 
یافته‌ها
    در این بررسی 492 اهداکننده خون از نظر anti-YOP IgA مورد آزمایش سرمی قرار گرفتند. سرم 62 اهداکننده از نظر anti- YOP IgA Antibody مثبت شدند یا به عبارت دیگر 6/12% اهداکنندگان از نظر یرسینیا سروپوزیتیو بودند. از این میان، 60 نفر از آن‌ها مرد(7/96%) و 2 نفر زن(3/3%) بودند. می نیممحداقل سن افراد 19و ماکزیمم حداکثر 62 سال(35/11 SD=) بود(جدول 1).
 
جدول 1: توزیع موارد مثبت یرسینیا انتروکولیتیکا بر حسب سن با الایزا
 

گروه‌های سنی بر حسب سال	موارد مثبت	درصد سنی	تعداد زن	تعداد مرد
29-19	13	96/20	2	11
40-30	16	8/25	-	16
51-41	17	4/27	-	17
62-51	16	8/25	-	16

 
    بر روی 60 نمونه سروپوزیتیو، آزمایش وسترن بلات با کیت recomline Yersinia IgA (میکروژن، آلمان) انجام شد که 42 مورد(5/8%) مثبت شدند. به طور کلی می‌توان نتیجه گرفت که 5/8% از اهداکنندگان خون تهران با وسترن بلات از نظر یرسینیا سروپوزیتیو هستند. کشت کیسه خون افراد سروپوزیتیو(62 مورد) بعد از 35 روز نگهداری در یخچال منفی شدند.
 
بحث
    با وجود غربالگری اهداکنندگان از نظر یرسینیا(مصاحبه با اهداکنندگان)، هنوز هم بروز باکتریمی و سپتی‌سمی ناشی از عفونت یرسینیا به دنبال تزریق خون آلوژنیک و اتولوگ گزارش می‌شود که عده‌ای آن را به عفونت بی‌علامت نسبت می‌دهند(4). بعد از عفونت یرسینیا، تحریک موضعی اپیتلیوم دستگاه گوارش سبب پاسخ ایمنی و تولید فراوان آنتی‌بادی ضد یرسینیا از نوع IgM ، IgA و IgG بر علیه آنتی‌ژن های لیپوپلی ساکاریدی(LPS-lipopolysaccharide ) و پروتئین‌های سطحی یرسینیا (YOP) می‌شود.
    برای شناسایی عفونت یرسینیایی، از روش‌های مختلف از جمله کشت مدفوع و خون استفاده می‌شود. اخیراً برای بررسی‌های اپیدمیولوژیک و هم چنین شناسایی منشا عفونت در اهداکنندگان خون که خونشان سبب باکتریمی یا سپتی‌سمی در گیرنده خون شده، آزمایش‌های سرولوژی یرسینیا توصیه شده است(4).
    انواع آزمایش‌های سرولوژی مورد استفاده شامل آگلوتیناسیون لوله ای، روش هماگلوتیناسیون، ایمونوفلوئورسانس، الایزا و رادیو اسی می‌باشد. روش آگلوتیناسیون لولـه‌ای نتایـج مثبـت کاذب فراوانی دارد(11).   
    در این مطالعه شیوع سرمی anti-YOP IgAYersinia antibody در اهداکنندگان سالم انتقال خون تهران به روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت. برای اولین بار است که شیوع سرمی یرسینیا در اهداکنندگان خون ایران گزارش و میزان سروپوزیتیویتی با کشت خون مقایسه می‌شود.
    در این مطالعه از anti-YOP IgA EIA که برای گونه یرسینیا خیلی اختصاصی است، با نام کیت recomwell Yersinia IgA استفاده شد. این کیت از پروتئین‌های غشاء خارجی یرسینیا به روش ریکامبیننت ساخته می‌شود.
    برای انجام این مطالعه، الایزا روش مناسب و دقیقی بود و یکی از روش‌های الایزا که اخیراً به آن توجه زیادی شده، استفاده از آنتی‌ژن‌های پروتئینی سطح یرسینیا(YOP) می‌باشد که در پلاسمید آن کد می‌شود و عامل پاتوژنیسیتی میکروب مذکور است. این آنتی‌ژن فقط به یرسینیا انترو کولیتیکا ویرسینیا سودوتوبرکولوزیس اختصاص دارد(4). دلیل استفاده از Anti-YOP IgA EIA در الایزا، نیمه عمر کوتاه (6 روز در مقابل 23 روز IgG)، پاسخ سریع به عفونت یرسینیا و تولید دایمی آن در برابر عفونت بدون علامت است(4).
    Anti-YOP IgA EIA به عنوان نشانه عفونت یرسینیا در همه نمونه‌های خونی که سبب اندوتوکسمی شده، مشاهده شده است(4).
    anti-YOP IgA حساسیت و اختصاصیت معناداری نسبت به LPS EIA دارد(4).
    5/12% از اهداکنندگان سالم خون در مرکز خون تهران  به روش الایزا سروپوزیتیو بودند. میزان شیوع سرمی به روش الایزا در فنلاند و آلمان به ترتیب 19% و33% بود(9).
در آزمایش تاییدی وسترن بلات که بر روی اهداکنندگان سروپوزیتیو تهران انجام شد، میزان شیوع از 6/12% در اهداکنندگان سالم به 5/8% کاهش یافت. در آلمان و فنلاند، میزان شیوع در آزمایش خون اهداکنندگان سالم(نه فقط اهداکنندگان سروپوزیتیو بلکه تمامی اهداکنندگان) با وسترن بلات افزایش نشان داد( به ترتیب 31% و43%). درصد بالای شیوع IgA در اهداکنندگان سالم در آلمان، وجود عفونت‌های نهانی زیاد یرسینیا را در این جوامع مطرح می‌سازد(7). در بررسی دیگر که در مجارستان و بر روی 112 اهداکننده خون سالم انجام شد، شیوع سرمی  یرسینیا انتروکولیتیکا با Anti-YOP IgA EIA 1/15% گزارش شد که با آزمایش تاییدی ایمونو بلات به میزان 8/9% کاهش یافت(12). در مطالعه دیگری که در اهداکنندگان شهری در نیوزلند انجام گردید، میزان شیوع  یرسینیا انتروکولیتیکا به روش الایزای مرسوم، 1/2%گزارش گردید(13).
    کشت خون کیسه‌های سروپوزیتیو اهداکنندگان سالم (62 مورد) پایگاه تهران بعد از 35 روز نگهداری، منفی گزارش شد. در مطالعه دیگری که در نیوزلند بر روی 495 اهداکننده سالم از نظر کشت خون به عمل آمد، نتیجه مشابه به دست آمد و همگی منفی شدند(4).8  در حالی که 4% آن‌ها از نظر سرمی دارای  Anti-YOP IgA EIAمثبت بودند. در یک گزارش موردی توسط هولن و همکاران از سپتی‌سمی یرسینیایی که به دنبال تزریق خون رخ داده بود،‌ آن‌ها نمونه همه اهداکنندگان را از نظر Anti - YOP IgA EIA مورد آزمایش قرار دادند. در مطالعه آن‌ها یکی از اهداکنندگان سروپوزیتیو بود و در کشت مدفوع وی، یرسینیا رشد کرده بود. ولی با وجود این در آنالیز DNA ، یرسینیای نمونه اهداکننده با گونه یرسینیای بیمار متفاوت گزارش گردید.13(1).
    نتایج اپیدمیولوژیک در دنیا نشانگر میزان شیوع عفونت در جوامع می‌باشد. هر چه میزان شیوع سرمی بالاتر باشد، نشانه این است که آن بیماری در جامعه شایع‌تر است که می‌تواند در افزایش آلودگی خون‌ها مؤثر باشد(4).
    با توجه به نادر بودن باکتریمی(1در 5/6 میلیون در فرانسه و 1 در 9 میلیون در امریکا)، انجام غربالگری با anti-YOPIgA EIA با هدف کاهش خطر یرسینیا در اهداکنندگان سالم کار بیهوده‌ای است زیرا می‌تواند در افزایش فوق‌العاده هزینه و حذف تعداد بالای اهداکننده اثرات منفی داشته باشد.
    با وجود این در بعضی از گزارش‌ها برای شناسایی منشا باکتریمی در گیرندگان خون، وقتی که  کشت خون و مدفوع اهداکننده منفی می‌گردد،  Anti-YOP IgAمثبت را ملاک می‌دانند(4). به همین جهت در بعضی از کشورها مثل زلاندنو که به دنبال تزریق صد هزار کیسه خون یک بار سپتی سمی بروز می‌کند، خون اهداکنندگان را با Anti-YOP IgA EIA آزمایش می‌کنند و در صورت سروپوزیتیو بودن، اهداکننده را رد می‌کنند. البته این کار میزان رد اهداکنندگان را از 5/2% به 5/6% افزایش می‌دهد. یادآوری می‌گردد در سایر مطالعه‌ها، غربالگری خون‌ها با این آزمایش توصیه نگردیده است.
    در ایران میزان اهداکنندگان عفونی مردود شده به وسیله پرسش و پاسخ 6/1% می‌باشد در حالی که اگر از کیت فوق استفاده شود، 5/12% به مردودی‌ها افزوده می‌شود. در این صورت سبب کاهش شدید ذخیره خونی می‌گردد در حالی که هیچ گونه توجیهه علمی ندارد.
نتیجه‌گیری
    با وجود شیوع نسبتاً بالای سروپوزیتیویتی یرسینیا در اهداکنندگان، هیچ توجیهه علمی جهت غربالگری اهداکنندگان بـا کیت Anti-YOPIgA EIA وجود ندارد زیرا
علاوه بر هزینه بالا، سبب مردود شدن بیشتر اهداکنندگان سالم می‌گردد. لذا کماکان سؤال و جواب از اهداکنندگان جهت حذف افراد مشکوک به یرسینیا هنوز از موارد استاندارد غربالگری محسوب می‌شود.