چکیده سابقه و هدف سلولهای بنیادی مزانشیمی(MSC) از طریق ترشح فاکتورهای محلول، تماس سلول با سلول و غیره، عملکرد بنیادی سلولهای بنیادی خونساز(HSC) را حفظ میکنند. به تازگی مشخص شده است که MSC قطعات غشایی به نام میکرووزیکول و یا میکروپارتیکل را تولید میکند که در انتقال پیام آن نقش دارد. مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، از 3 عدد جفت که تحت شرایط استریل به دست آمده بودند، استفاده شد. سلولهای مزانشیمی و سپس میکرووزیکولهای آنها توسط اولترا سانتریفوژ در دور g 100.000 جدا گردید. غلظت میکرووزیکولها در 2 نمونه، با روش بردفورد تعیین و خصوصیات آنها توسط فلوسیتومتری و میکروسکوپ الکترونی تعیین شد. یافته‌ها سلولهای مزانشیمی جفت در روز 14 پس از جداسازی به پاساژ اول رسیدند که در مقایسه با سلولهای مزانشیمی مغز استخوان زمان بیشتری برای رشد اولیهشان، لازم بود. میکرووزیکولها دارای اندازههای متفاوت، حدود 40 تا 160 نانومتر بودند. میانگین غلظت آنها µg/mL 125 بود(حداقل غلظت µg/mL 100و حداکثر µg/mL 150) و شاخصهای CD44 ، CD29 ، CD73 و CD105 را بر سطح خود بیان میکردند. نتیجه گیری میکرووزیکولها، مارکرهای سلول مزانشیمی را که برای چسبندگی به سلولهای دیگر لازم است، بیان میکنند و بنابراین میتوانند در اعمال اثرات سلول مزانشیمی در کشتهای مختلف از جمله هم کشتی با سلول بنیادی خونساز نقش داشته باشند. کلمات کلیدی:سلولهای مشتق از میکروپارتیکل‌ها، سلولهای بنیادی مزانشیمی، جفت
تاریخ دریافت : 6 /2 /93 تاریخ پذیرش : 26/8/93
1- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسؤول: PhD هماتولوژی و بانک خون ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665 3- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 4- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 5- پزشک عمومی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه MSC یکی از سلولهای استرومایی مهم در مغز استخوان میباشد. این سلول قادر به بازسازی محیط مغز استخوان بوده و با ارتباط نزدیکی که با سلولهای مغز استخوان برقرار میکند، از آنها حمایت میکند(1). به همین دلیل از این سلول به عنوان تغذیه‌کننده(feeder) برای تکثیر HSC استفاده میشود. MSC از طریق ترشح فاکتورهای محلول، تماس سلول با سلول و غیره عملکرد بنیادی HSC را حفظ میکند(2، 1). امروزه به قطعات غشایی کروی که میکرووزیکول (MV) نامیده میشوند و سالهای زیادی نادیده گرفته می‌شدند، توجه شده است(3). MVها اگزوزومهایی با قطر nm1000-30 هستند که در شرایط نرمال و پاتولوژیک، از غشاء پلاسمایی انواع مختلف سلولها از جمله سلولهای خونی، سلولهای بنیادی و پیشسازها آزاد میشوند(7-4). تشکیل MVها یک پدیده فیزیولوژیک است اما افزایش سطح آنها در بیماریهای مختلفی مانند سندرم حاد قلبی، افزایش فشار خون، بیماریهای التهابی، اتوایمنی، آترواسکلروز، عفونت، سرطان یا بیماریهای قلبی عروقی دیده میشود(9، 8). MVها به عنوان مکانیسم جدید ارتباط سلولها با هم در نظر گرفته میشوند، با توجه به سلول منشا و شرایط از نظر ترکیب با هم متفاوتند و آنتیژنهای سلول منشا را بیان میکنند(10، 7، 5). از آن‌جایی که هنگام ترشح شدن، مقداری از سیتوپلاسم سلول را بر میدارند، ممکن است دارای سایتوکاین، پروتئینهای سیگنالینگ، miRNA و mRNA های مشتق از سلول باشند(8). بر طبق مطالعه‌های انجام شده، MVها شامل miRNA هایی هستند که در اثرات بیولوژیک آنها نقش دارند و بعد از ورود MVها به سلول هدف، وارد سلول شده و اثرات خود را ایفا میکنند. به عنوان مثال، MVهای مشتق از MSC باعث بهبود آسیب حاد کلیوی در موش SCID شده است(11، 5). نظر به این که از MSC به عنوان تغذیه‌کننده برای کشت HSC استفاده میشود، احتمالاً MVها در ایجاد اثرات آن نقش دارند. هدف از این مطالعه، جداسازی میکرووزیکول ها از منبع جفـت بـه جـای مغز استخوان، تعیین خصوصیات و سپس استفاده از آنها در مطالعه‌های هم کشتی با HSC بود.
مواد و روش‌ها جداسازی سلول بنیادی مزانشیمی: در یک مطالعه تجربی، نمونه جفت با کسب رضایت از اهداکنندگان سالم بیمارستان میلاد، تحت شرایط استریل گرفته و در محلول PBS-EDTA که حاوی 1% آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین و استرپتومایسین بود، به آزمایشگاه آورده شد. زیر هود لامینار، نمونه در پلیت استریل با تیغ بیستوری کاملاً ریز شده و در لوله فالکون 50 ریخته شد و سپس با 20 میلی‌لیتر PBS به مدت 5 دقیقه با دور rpm 1500 شستشو داده شد. به رسوب حاصل، 25 میلی لیتر محلول کلاژناز (آمریکا، سیگما) اضافه شده، با ورتکس کاملاً مخلوط و به مدت 2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 قرار داده شد تا بافت حل شود. سپس محلول را از صافی گذرانده، 3-2 بار با PBS شستشو داده شده و گلبولهای قرمز باقی‌مانده توسطمحلولهایپوتونکلرید آمونیوم(آمریکا،فارمینژن) لیز وپساز۱۰دقیقهمجدداً شستشوشد. در نهایت پلیت سلولی،درون فلاسک T75 برده شد، mL 10 محیط DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium-Low Glucose ، آمریکا، گیبکو) حاوی 10% FBS (آمریکا، گیبکو) و 1% آنتی‌بیوتیک اضافه شد و در انکوباتور، قرار داده شد. پس از دو روز محیط تعویض شد تا سلولهای غیر چسبنده خارج شوند و پس از آن هر 4 روز یک بار تا زمانی که سلولها برای پاساژ آماده شدند، محیط سلولها تعویض شد. در روز 14 کشت، چندین کلنی در نقاط مختلف فلاسک رشد کرده بود، برای تحریک رشد بهتر، سلولها پاساژ داده شدند و پس از پاساژ دوم، رشد سلولها به صورت فزایندهای افزایش یافت.
ایمونوفنوتیپ سلولهای مزانشیمی: جهت تائید هویت سلولهای مزانشیمی، از آنتیبادیهای CD45-FITC ، CD34-PE ، CD44-FITC (آمریکا،فارمین ژن)، CD166-PE،CD105-FITC ،CD73-PE ، CD29-FITC ، CD90-PE (دانمارک، داکو) و ایزوتیپ کنترلهای IgG1-FITC ، IgG1-PE (آمریکا، فارمین ژن) استفاده شد.
تمایز سلولهای مزانشیمی به استخوان و چربی: 105 سلول در هر چاهک پلیت 6 خانه کشت داده شد. وقتی تراکم سلولها به 90% رسید، محیط DMEM-LG را خارج کرده و سلولها با PBS به آرامی شسته شدند و سپس به چاهکها محیط استئوژنیک و آدیپوژنیک، اضافه شد و هر 3 روز یک بار تعویض محیط صورت گرفت. به موازات، نمونه کنترل در محیط DMEM-LG کشت داده شد. محیط تمایز استئوسیتی شامل محیط(Dulbecco's Modified Eagle Medium-DMEM-HG High Glucose ، گیبکو) همراه با 10% FBS و 10 میلی‌مولار در لیتر دگزامتازون، 10 نانو مولار در لیتر ویتامین D3 و 50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر اسید آسکوربیک و محیط تمایز آدیپوسیتی شامل DMED-HG به همراه 10% FBS و 1 میکرو مولار در لیتر دگزامتازون، 10 میکرو مولار در لیتر انسولین و 200 میکرو مولار در لیتر ایندومتاسین بود. پس از گذشت 12 روز، سلولها در محیط استئوژنیک، تغییر شکل داده و متراکم شدند. در این زمان، رنگ‌آمیزی آلیزارین رد جهت تایید رده استخوانی انجام شد. هم چنین درون سیتوپلاسم سلولها در محیط آدیپوژنیک، واکوئلهای چربی مشاهده و برای تایید آن، رنگ‌آمیزی Oil-Red-O انجام شد.
جداسازی میکرووزیکولها: سلولهای مزانشیمی جدا شده از جفت در طی چند هفته پاساژ داده شدند. زمانی که سلولهای پاساژ 6 ، به
تراکم 90% رسیدند، محیط روی آنها تخلیه و با RPMI دارای 5/0%BSA جایگزین شد. پـس از 18 ساعت محیط رویی سلولها جدا و با دور g 350 ، به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، برای حذف دبری و بقایای سلولی سانتریفوژ شد .مجدداً مایع رویی را برداشته و این بار با دور g2000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ گردید و در نهایت سوپ رویی به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با دور g 100.000 سانتریفوژ(آمریکا، L5-50 بکمن) شد. پلیت میکرووزیکولی برای انجام ایمونوفنوتایپ در محیط 199 و جهت بررسی با میکروسکوپ الکترونی، در گلوتارالدئید 5/2% حل شد.
تعیین خصوصیات میکرووزیکولهای جدا شده از سلولهای مزانشیمی بافت جفت: 1- عکس برداری توسط میکروسکوپ الکترونی: برای این منظور میکرووزیکولها در 30 میکرولیتر گلوتارالدئید 5/2% شناور شده و برای بررسی و عکس‌برداری به بخش میکروسکوپ الکترونی دانشگاه ایران، تحویل داده شد.
2- تعیین غلظت میکرووزیکولها با روش بردفورد: برای این کار، رقتهای مختلفی از(µg/mL 700) BSA ساخته شد. سپس 200 میکرولیتر از محلول بردفورد را درون 6 چاهک ریخته و 10 میکرولیتر از رقتهای تهیه شـده بـه آن اضافـه گردید و جذب نوری در طول موج nm 595 خوانده و توسـط آن منحنی استاندارد کشیده شد. سپس با استفاده از منحنی استاندارد، غلظت میکرووزیکولها تعیین شد(غلظت میکرووزیکولها تنها تا رقت 8/1 اندازه‌گیری شد)(جدول 1).
جدول 1: غلظت میکرو وزیکولها با روش برد فورد
رقت جذب نوری
1
2/1
4/1
8/1
16/1
32/1
جذب نوری BSA (nm 595)
71/2
99/1
52/1
38/1
08/1
02/1
(µg/mL) غلظت BSA
700
350
175
5/87
75/43
85/21
جذب نوری MV ها (nm 595 )
35/1
19/1
06/1
98/0
-
-
(µg/mL) غلظت MV ها
125
62
31
5/15
-
-
3- ایمونوفنوتایپ میکرووزیکولها توسط فلوسیتومتری: میکرووزیکولها از نظر وجود مارکرهای CD29 ، CD105 ، CD44 و CD73 بررسی گردیدند. بدین صورت کهدر لولههای آزمایش و کنترل منفی، (µg/mL 20) µL 50 میکرووزیکول، ریخته و به لولهها µg 3 آنتیبادیهای مربوطه، اضافه و توسط روش فلوسیتومتری ارزیابی شدند. در ضمن از بیدهای 1 میکرون کونژوگه به FITC جهت تعیین سایز و محل قرارگیری تقریبی MVها استفاده شد.
یافته‌ها تایید هویت سلولهای مزانشیمی جدا شده از بافت جفت: 1- بررسی ایمونوفنوتیپ سلولی: سلولهای مزانشیمی جدا شده از جفت، شاخصهای CD29 ، CD44 ، CD90 ، CD73 ، CD105 و CD166 را به طور قوی بیان کردند ولی از نظر بیان شاخصهای CD34 و CD45 منفی بودند(شکل1).
شکل1: بررسی خصوصیات ایمونوفنوتیپی سلولهای مزانشیمی جدا شده از بافت جفت، A: از چپ به راست: پراکندگی سایز و گرانولیتی، کنترل ایزوتیـپ، گـرافهـای منفی از نظـر شاخصهـای(5/1%) CD45 و (3/2%) CD34 ، B : بـه ترتیب از چپ به راست مثبت از نظر: (99%) CD105 ، (99%) CD73 ، (99%) CD90 ، C : بـه ترتیـب از چـپ بـه راست مثبت از نظر: (99%) CD44 ، (99%) CD166 ، (99%) CD29 . شکل2: رنگ‌آمیزی اختصاصی بر روی سلولهای تحت کشت در محیط تمایزی و کنترل، A و B : رنگ‌آمیزی Alizarian Red ، A : محیط کنترل، B: در محیط تمایز استئوسیتی، C وD : رنگ آمیزیOil-Red-O ، C : محیط کنترل، D : در محیط آدیپوسیتی.
شکل 3 : تعیین خصوصیات میکرووزیکولهای جدا شده از سلولهای مزانشیمی بافت جفت، A : میکرووزیکولهای جدا شده، دارای اندازههای متفاوت(حدود 40 تا 160 نانومتر) بودند، B : از چپ به راست، پراکندگی سایز و گرانولیتی میکرووزیکولها، کنترل ایزوتیپ، گراف مربوط به بیدهای 1 میکرون کونژوگه شده با FITC ، C : میکرووزیکولها از نظر بیان شاخصهای(49%) CD105 ، (56%) CD29 ، (16%) CD73 ، (33%) CD44 مثبت بودند، D: روش بردفورد،منحنی بالا غلظت میکرووزیکولها را در یکی از دفعات جداسازی نشان میدهد، غلظت میکرووزیکولها، µg/mL 100 است.
2- بررسی خصوصیات تمایزی: پس از گذشت 12 روز، سلولها در محیط استئوسیتی تغییر شکل واضح داده، متراکم و سنگ‌فرشی شدند که به علت رسوب کلسیم با رنگ آلیزارین رد به رنگ قرمز در آمدند. هم چنین درون سلولهای محیط آدیپوسیتی پس از 12 روز واکوئلهای چربی مشاهده شد که با رنگ Oil- Red-O واکوئلهای چربی به رنگ قرمز درآمدند. در حالی که تغییری در سلولهای کنترل مشاهده نشد(شکل2).
تعیین خصوصیات میکرووزیکولها: تجزیه و تحلیل با استفاده از میکروسکوپ الکترونی، وزیکولهایی با سایزهای متفاوت، در رنج 40 تا 160 نانومتر را نشان داد(شکل A 3)، میکرووزیکولها در مقایسه با بیدهای 1 میکرون، کوچکتر و هتروژنتر بودند(شکل B 3)، شاخصهای CD105 ، CD29 ، CD44 و CD73 ، را بیان کردند(شکل C 3) و میانگین غلظت آنها در طی 2 بار جداسازی µg/mL 125 بود، منحنی یکی از دفعات جداسازی در شکل آورده شده است(شکل D 3).
بحث یکی از مکانیسمهای ارتباط سلولی، میکرووزیکولها میباشند. از میکرووزیکولهای به دست آمده از مغز استخوان، در چندین مطالعه استفاده شده است(13-11 ، 5). MVها یا در نزدیکی سلول منشاشان باقی می‌مانند و یا این که وارد مایعات بیولوژیک مانند پلاسما، ادرار، شیر، مایع مغزی - نخاعی، مایعآمنیوتیک، ترشحات توموری، لنف یا مایعات دیگر شده و به سلولهای دیگر با فاصلهی زیاد می‌رسند(9، 3). اطلاعات خود را منتقل میکنند و بدینوسیله فعالسازی سلول،اصلاحات فنوتیپی و برنامه‌ریزی مجدد عملکرد سلول را میانجیگری میکنند(14، 8، 3). از آن جا که مشخص شده، سلولهای مزانشیمی بافتهای جنینی مانند بافت جفت، شباهت فنوتیپی با سلول مزانشیمی مغز استخوان دارند و از طرفی تهیه بافت جفت نسبت به مغز استخوان بسیار آسانتر و مقرون به صرفه‌تر است، در این مطالعه، از سلولهای مزانشیمی بافت جفت برای تهیه میکرووزیکولها استفاده شد. رشد اولیه سلولها کند بود و زمان بیشتری برای رسیدن به پاساژ اول نیاز داشت، برای این منظور در روز 14 پس از جداسازی، سلولها پاساژ داده شدند تا به رشد تصاعدی آنها کمک شود. پس از پاساژ 2، سلولها رشد چشمگیری داشتند که نسبت به سلولهای مغز استخوان قابل توجه بود. به این موضوع در مطالعه بارلو و همکارانش نیز اشاره شده است(16). اندازه میکرووزیکولها از 40 تا 160 نانومتر متغیر بود که نشان‌دهنده منشا متفاوت این وزیکولها بود(8). در تحقیق برونو و همکارانش میانگین سایز میکرووزیکولهای جدا شده از مغز استخوان nm 135 عنوان شده است(11). میانگین غلظت میکرووزیکولها µg/mL 125 بود. شاخصهای CD29 ، CD44 ، CD73 ، CD105 بر سطح میکرووزیکولها بیان شد، در مطالعه برونو و همکارانش این شاخصها بر سطح میکرووزیکولهای به دست آمده از مزانشیم مغز استخوان بیان شدند که این موضوع، شباهت وزیکولهای جدا شده از 2 منبع مجزا را نشان میدهد(11). از طرفی این موضوع نشانگر اهمیت نقش چسبندگی این وزیکولها و اعمال اثرات مختلف بر دیگر سلولها میباشد زیرا در مطالعه برونو و همکارانش، حذف مارکرهای سطحی به وسیله تریپسین، ورودشان به سلولهای اپیتلیال کلیوی را مهار کرد(11). به هر حال به دلیل کشف اهمیت استفاده از میکرووزیکولها، در سالهای اخیر مطالعه‌های بسیاری در این زمینه، انجام شده است و به دنبال این تحقیق، ما استفاده از سلولهای مزانشیمی بافت جفت را به جای سلولهای مغز استخوان، به عنوان منبع میکرووزیکولها پیشنهاد میکنیم.
نتیجه‌گیری با توجه به نتایج به دست آمده میکرووزیکولهای جداشده از سلول مزانشیمی جفت ، تشابه زیادی با انواع جدا شده از سلول مزانشیمی مغزاستخوان دارند و میتوانند در ارتباطات سلولـی و اعمال اثرات سلول مزانشیمی نقش داشته باشند.
تشکر و قدردانی اینتحقیقحاصلپایاننامهکارشناسیارشد هماتولوژی مصوبمرکزتحقیقاتمؤسسهعالیآموزشی وپژوهشی طبانتقالخونمیباشد. بدین وسیله نویسندگان مقالهاز مرکز تحقیقات بیوشیمی ـ بیوفیزیک دانشگاه تهران و بخش میکروسکوپ الکترونی دانشگاه ایران قدردانی می‌نمایند.
