بررسی ارتباطFGBrs1800790 با سطح فیبرینوژن خون
امیر مشایخی1، شیرین شهبازی2
چکیده سابقه و هدف فیبرینوژن یا فاکتور 1 انعقادی، یک گلیکو پروتئین محلول در پلاسما است که در آبشار انعقاد توسط ترومبین به رشتههای فیبرین تبدیل میشود. پلیمورفیسمهای متعددی بر روی ژن زنجیره بتا یا ژن FGB مطالعه شدهاند و پلیمورفیسم پروموتری (rs1800790) G455A، ارتباط معناداری با سطح فیبرینوژن نشان داده است. در این مطالعه شیوع این پلیمورفیسم در جمعیت ایرانی محاسبه و ارتباط آن با سطح فیبرینوژن پلاسما مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روشها در یک مطالعه مورد شاهدی، پس از جمعآوری نمونههای خون و استخراج DNA، به کمک آغازگرهای اختصاصی، ناحیه در برگیرنده پلیمورفیسم HaeIII تکثیر و محصول PCR پس از ارزیابیهای انجام شده با روش RFLP ، ژنوتیپ شد. سطح فیبرینوژن خون نیز اندازهگیری و اطلاعات در نرمافزار 16 SPSS و آزمون کایدو تجزیه و تحلیل شدند. یافتهها سطح فیبرینوژن خون اندازهگیری شده با ژنوتیپ FGBrs1800790، ارتباط معناداری نشان داد(253/3-347/0 = 95% CI ، 021/0 p=). فراوانی آلل مینور حدود 28/0 محاسبه گردید که با الگوی پیشبینی شده مطابقت داشت. نتیجه گیری ارتباط معنادار بین سطح فیبرینوژن و ژنوتیپ rs1800790 ، تایید کننده اهمیت بررسی این واریانت در موارد پاتولوژیک افزایش یا کاهش فیبرینوژن خون میباشد. از آن جایی که عملکرد این واریانت ژنتیکی، هم پروموتری به طور مستقیم بر بیان ژن است و هم در تشدید اثر فاکتورهای محیطی نقش دارد، میتواند در بیماریهای قلبی و عروقی بیشتر مورد توجه و مطالعه قرار گیرد. کلمات کلیدی: فیبرینوژن، پلیمورفیسم,ژنتیک، RFLP
تاریخ دریافت : 23/2/92 تاریخ پذیرش : 16/7/92
1- دانشجوی دکترای ژنتیک پزشکی ـ دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران 2- مؤلف مسؤول: PhD ژنتیک ـ استادیار دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 331-14115
مقدمه فیبرینوژن یا فاکتور 1 انعقادی، یک گلیکوپروتئین محلول در پلاسما است که در آبشار انعقاد توسط ترومبین به رشتههای فیبرین تبدیل میشود. هم چنین با اتصال به گیرندههای GpIIb/IIIa در پلاکتها، مانند پلی در اتصال آنها به هم نقش بازی میکند. این پروتئین 340 کیلو دالتونی در کبد ساخته شده و با غلظتی حدود 5/1 تا 3 گرم در لیتر، در پلاسما قابل اندازهگیری است. در طی روند طبیعی انعقاد خون، رشتههای این پروتئین محلول به فرم نامحلول فیبرین تبدیل میشود که در نتیجه اثر فاکتور 13 به فرم شبکه در میآید(1). مقادیر بالاتر فیبرینوژن در مبتلایان به بیماریهای قلبی ـ عروق دیده میشود. هم چنین در التهاباتی مانند بیماریهای لثه نیز افزایش فیبرینوژن قابل مشاهده است(2). در بارداری نیز میزان فیبرینوژن تا 5/4 گرم در لیتر افزایش مییابد(3). از طرف دیگر کاهش میزان فیبرینوژن میتواند شاهدی بر افزایش عملکرد سیستم انعقاد باشد که ناشی از مصرف این فاکتور بیش از تولید آن است. این وضعیتی است که در موارد (DIC)Disseminated Intravascular Coagulation مشاهده میشود(4). پروتئین فیبرینوژن یک هگزامر است که از دو سری سه تایی زنجیره، شامل زنجیرههای β ، α و γ ، شکل گرفته است. این زنجیرهها توسط پیوندهای دیسولفیدی به هم متصل هستند که عموماً توسط سیستئینهای N-terminal ایجاد میشوند. ناحیه C-terminal زنجیرهها در بر همکنش پروتئین - پروتئین (protein-protein interactions)نقش بازی میکنند(6، 5). روند تبدیل فیبرینوژن به فیبرین در چند مرحله صورت میگیرد. ابتدا ترومبین ناحیه N-terminal زنجیرههای آلفا و بتا میشکند و به ترتیب از آنها فرم فیبرینوپپتید A و B را میسازد(7). این منومرهای فیبرین سپس از انتها با هم پلیمر شده و پروتوفیبریلها را که متعاقباً تبدیل به رشتههای فیبرین میشوند، شکل میدهند(8). نهایتاً این رشتههـای فیبرینـی در کنـار هـم بـه شکـل ژل فیبرینی در میآیند(9). سه زنجیره آلفا، بتا و گاما توسط سه ژن مجزا که بر روی بازوی بلند کروموزوم 4 در یک کلاستر قرار دارند، کد میشوند. ترتیب قرارگیری آنها به صورت گاما، آلفا و بتا است که در فاصله حدود 50 کیلو باز گسترش یافتهاند به طوری که جهت رونویسی بتا بر خلاف دو ژن دیگر است(10). پلیمورفیسمهای متعددی برای این کلاستر شناسایی شده اما آنهایی که بر روی ژن زنجیره بتا یا ژن FGB قرار دارند، بیشتر مطالعه شدهاند. به علاوه مطالعههای in vitro نشان دادهاند که میزان ساخت زنجیره بتا یک عامل محدودکننده تولید فیبرینوژن است(11). در نتیجه پلیمورفیسمهای تاثیرگذار ساخت این زنجیره، با احتمال بیشتری سطح فیبرینوژن را تحت تاثیر قرار خواهند داد. در مجموع مطالعههای زیادی یک ارتباط قوی بین ژنوتیپ FGB و سطح سرمی فیبرینوژن نشان دادهاند. در این میان پلیمورفیسم پروموتری G455A - (FGBrs1800790) یکی از پر مطالعهترینها است(13، 12). اگر چه نتایج متناقضی نیز در ارتباط با سطح فیبرینوژن و این پلیمورفیسم مشاهده شده اما در اکثر مطالعهها، ارتباط معناداری گزارش گردیده است(16-14). در این مطالعه شیوع پلیمورفیسم FGBrs1800790 در جمعیت ایرانی محاسبه شد و ارتباط آن با سطح فیبرینوژن پلاسما مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها مطالعه به شکل مورد ـ شاهد طراحی گردید به صورتی که بین واجدان آلل AFGBrs1800790 به عنوان گروه مورد با واجدان آلل وحشی G به عنوان گروه شاهد از نظر تفاوت در سطح فیبرینوژن مقایسه انجام شد. در طول سال 91 از بیش از 100 داوطلب شرکت در مطالعه از بین افراد سالم ساکن تهران که بین 15 تا 30 ساله بودند، اطلاعات اولیه جمعآوری شد. افراد مورد مطالعه از بین جوانان انتخاب شدند تا فاکتور اختلالات عروقی و بیماریهای مزمن و ثانویه در آنان به حداقل برسد. با کمک پرسشنامه، سابقـه پزشکی بیماران، مصرف دارو و تاریخچه خانوادگی ابتلا به بیماری در آنان ثبت شد. سپس خونگیری از 80 نفر از آنان پس از کسب رضایت جهت سنجش میزان فیبرینوژن انجام و سلولهای جمعآوری شده برای استخراج DNA به آزمایشگاه مولکولی تحویل داده شدند. از نمونهها، DNA به روش Salting out استخراج و پس از غلظت سنجی تا انجام مراحل بعدی در 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید. برای تکثیر ناحیه واجد پلیمورفیسم، آغازگرهای اختصاصی با کمک نرمافزار Generuner طراحی و با استفاده از وب سایت BLAST ، اختصاصی بودن آنها تایید گردید. توالی آغازگر مستقیم 5`-GGG CCT CAT TTA GTC TGT GAG C-3` و آغازگر معکوس 5`-ATG GGA AGT TAG GGC ACT CCT C-3` در نظر گرفته شد. واکنش PCR با مقادیر زیردر حجم نهایی 25 میکرولیتر صورت پذیرفت: 2X PCR master mix (GenetBio) که حاوی حجم نهایی 5/1 میلیمولار MgCl2 ، 2/0 میلیمولار dNTPs و1 واحد آنزیم Taq polymerase میباشد، آغازگرهای جلوبرنده و معکوس هر کدام در حجم نهایی 4/0 میلیمولار و DNA الگو 40 نانوگرم در میکرولیتر. در طی 30 چرخه PCR با برنامه زیر: 95 درجه 30 ثانیه ، 59 درجه 30 ثانیه ، 72 درجه 30 ثانیه به دنبال یک مرحله دناتوراسیون اولیه، 95 درجه 5 دقیقه قبل از شروع چرخهها و یک اکستنشن نهایی 72 درجه 5 دقیقه بعد از شروع چرخهها انجام گرفت. محصولات PCR بعد از ارزیابی بر روی ژل آگارز 2% با مشخص شدن باندهای bp604 جهت مراحل RFLP در نظر گرفته شدند. در یک واکنش با حجم نهایی 20 میکرولیتری، RFLP صورت پذیرفت. در این واکنش از 1 واحد آنزیمHaeIII(BshFI) (مبین آزما طب Metabion)، بافر X 10 آنزیم مذکور، به همراه 7 میکرولیتر محصول PCR استفاده گردید. طبق دستور شرکت سازنده، واکنش حاضر به مدت 3 تا 5/3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد و سپس بر روی ژل آگارز 2% ، مورد ارزیابی قرار گرفت. انتظار میرفت ژنوتیپ AA یک باند bp 604 ، ژنوتیپ GG یک باند bp 382 و یک باند 222 bp و ژنوتیپ AG سه بانـد 604 و bp 382 و bp 222را نشان دهند. جهت تایید نتایج، تعدادی از نمونهها به طور تصادفی برای تعیین توالی انتخاب شدند. نتایج تعیین توالی با نرمافزار Chromas مورد ارزیابی قرار گرفت. بعد از جمعآوری اطلاعات، با تهیه فایل آماری 16 SPSS دادهها جمعبندی گردید. آنالیز دادهها با نرمافزار SPSS نسخه 16 انجام شد. جهت مقایسه گروهها در مورد دادههای کمی از آنالیز واریانس یک طرفه و در مورد دادههای کیفی از آنالیز کایدو استفاده شد. در این آنالیزها،p-value کمتر از 05/0 از نظر آماری معنادار لحاظ شد. شاخص نشانگر فراوانی آلل مینور، MAF (Minor Allele Frequency)، برای گزارش شیوع آلل کوچکتر (مغلوب) این پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی به کار گرفته شد که در جمعبندی با فراوانی آلل وحشی به عدد 1 میرسد.
یافتهها محصول PCR به صورت باندهای 604 bp بر روی ژل آگارز قابل رؤیت بود که در تمام موارد به صورت تک باند ملاحظه گردید. محصولات PCR بعد از اثر آنزیم HaeIII و RFLP بر روی ژل آگارز 2% مشاهده گردیدند(شکل 1).
شکل 1: ستون 1 ؛ مارکر bp 100 ، ستونهای 2 و 3 و 6 و 7 ژنوتیپ GG باند bp 382، ستونهای 4 و 8 و 9 ژنوتیپ AG باند bp 222 و ستون 5 ژنوتیپ AA باند bp 604 را نشان میدهند.
جدول 1: فراوانی ژنوتیپهای FGBrs1800790 در جمعیت ایرانی
ژنوتیپ
فرکانس(درصد)
GG
62
AG
5/34
AA
5/3
جهت تایید RFLP انجام شده، تعدادی از نمونهها در هر دو جهت مستقیم و معکوس تعیین توالی شدند(شکل 2). فراوانی ژنوتیپهای FGBrs1800790 در موارد مطالعه شده در این تحقیق در جدول 1 آورده شده است. همان گونه که مشاهده میشود ژنوتیپ GG 62% از کل موارد و ژنوتیپ AA تنها 5/3% موارد را به خود اختصاص داده است. در نتیجه آلل G با فراوانی 72/0 آلل غالب
جمعیت بوده و آلل A با MAF محاسبه شده 28/0 ، فراوانی کمتری در جمعیت مورد مطالعه نشان دادند. مقادیر به دست آمده با الگوی پیشبینی شده مطابقت داشت. فیبرینوژن پلاسما با دستورالعمل رایج (Clauss Method) اندازهگیری شده و نتایج در مقیاس گرم در لیتر با دامنه طبیعی 5/1 تا 5/4 گزارش گردید. آنالیزهای صورت گرفته بر روی میزان فیبرینوژن اندازهگیری شده و ژنوتیپ افراد که در نرمافزار 16 SPSS وارد شده بود، نشان داد که در افراد با ژنوتیپ GG ، متوسط سطح فیبرینوژن پایینتر از بقیه ژنوتیپهاست(2/3 در مقابل6/3)(جدول 2). با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه سطح فیبرینوژن خون اندازهگیری شده با ژنوتیپ FGBrs1800790، ارتباط معناداری با 021/0 p= و فاصله اطمینان 253/3-347/0 = 95% CI نشان داد.
شکل 2: شکل سمت چپ تعیین توالی مستقیم و شکل سمت راست تعیین توالی معکوس را نشان میدهد. در هر دو شکل سطر بالا ژنوتیپ AA، سطر وسط ژنوتیپ GG و سطر پایین ژنوتیپ AG را نشان میدهد.
جدول 2: میانگین، انحراف معیار، خطای استاندارد و فاصله اطمینان سطح فیبرینوژن خون به تفکیک ژنوتیپها
ژنوتیپ
میانگین
انحراف معیار
خطای استاندارد
فاصله اطمینان 95%
باند بالا
باند پایین
GG
235/3
77855
101
436/3
033/3
GA
627/3
62983
136
897/3
357/3
AA
597/3
77536
422
436/4
758/2
بحث نقش فیبرینوژن در مسیرهای انعقاد و ترومبوز، اهمیت بررسی سطح پلاسمایی آن را آشکار میکند. تغییرات میزان فیبرینوژن از عوامل مستعدکننده بیماریهای قلبی عروقی و سکتههای قلبی در نظر گرفته میشود(18، 17). هم چنین اخیراً افزایش سطح فیبرینوژن پلاسما با آمبولی ریه نیز ارتباط معناداری نشان داده است(19). در همین خصوص، پلیمورفیسمهای متعددی از ژن FGB مورد بررسی قرار گرفته است. در این میان rs1800790 که در نواحی پروموتر قرار دارد، دارای بیشترین میزان بررسی و توجه است. از میان بیش از 20 مطالعه مختلف، اغلب مطالعهها ارتباط معناداری بین این واریانت و سطح فیبرینوژن یا استعداد ابتلا به بیماریهای قلبی عروقی، مشاهده کردهاند(25-20، 17). علاوه بر بررسی اثر این واریانت با بیماریهای قلبی به طور مستقیم، اثرات آن به طور غیر مستقیم بر عوامل ایجاد بیماریهای عروقی مانند دیابت نیز بررسی شده است(26). مطالعهای نشان داد آزمایش تحمل گلوکز در افراد واجد آللA این پلیمورفیسم مختل بوده و امکان ابتلا به دیابت در آنان بالاتر است(27). علاوه بر این موارد، نقش rs1800790 در بیماریهای دیگری مانند سپسیس نیز بررسی گردیده است. مطالعهای در کشور کانادا با نتایج جالبی نشان داد، این واریانت با افزایش سطح فیبرینوژن، مقاومت بالاتری در بیماران مبتلا به سپسیس ایجاد کرده و میزان مرگ و میر را کاهش میدهد. این واریانت در یک هاپلوتایپ بررسی شده بود(28). در مطالعههای انجام گرفته، MAF یا فرکانس آلل مینور حدود 20/0 گزارش شده که مربوط به آلل A میشود (29). مشخص شده است حضور آلل A باعث افزایش سطح فیبرینوژن به بالاتر از 3 گرم در لیتر میشود. در حالی که سطح فیبرینوژن افراد با ژنوتیپ هموزیگوت GG کمتر از میزان یاد شده است. این تغییر در طی مطالعههای مختلف به افزایش عملکرد پروموتر با حضور آلل A نسبت داده شده است(30، 12). MAF در جمعیت آفریقایی میزان کمتری نسبت به جمعیت اروپایی و آسیایی دارد به صورتی که MAF جمعیت آسیایی حدود 26/0 گزارش شده است. در ایران مطالعهای میزان فرکانس آللی A را بین قومیتهای مختلف به طور میانگین 22/0 گزارش کرده است که پایینتر از میزان گزارش شده در مطالعه ما میباشد(31).
نتیجهگیری بررسی ارتباط FGBrs1800790 با میزان فیبرینوژن پلاسما اولین بار در تحقیقات ما در ایران صورت پذیرفته است. در این مطالعه ارتباط معناداری بین این واریانت و سطح پلاسمایی فیبرینوژن در جمعیت ایرانی دیده شده است. این یافتهها پیشنهاد کننده انجام مطالعه بعدی در بیماران قلبی و عروقی کشورمان میباشد. از آن جا که میزان ابتلا و مرگ و میر بیماریهای قلبی و عروقی در کشور ایران بالاست و عوامل مستعدکننده بیشتری در شهرهای بزرگ به خطرات زمینهای اضافه شده است، تحقیقات در زمینه شناخت عوامل ژنتیکی اهمیت خاصی دارد. فاکتورهای انعقادی یکی از اولین کاندیدها در این تحقیقات هستند که میتوانند در بررسیهای جامع و چند قطبی مورد مطالعه قرار گیرند.
تشکر و قدردانی از داوطلبانی که در این مطالعه شرکت نمودند، قدردانی مینماییم.
Mashayekhi A, Shahbazi S. Evaluation of the association between FGBrs1800790 and plasma fibrinogen levels. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2015; 11 (1) :48-55 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-855-fa.html
مشایخی امیر، شهبازی شیرین. بررسی ارتباطFGBrs1800790 با سطح فیبرینوژن خون. فصلنامه پژوهشی خون. 1393; 11 (1) :48-55