جلد 10، شماره 4 - ( زمستان 1392 )
جلد 10 شماره 4 صفحات 371-364 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Nikoozad R, Mahzounieh M, Naghavi N. Genomic detection of parvovirus B19 in patients suffered from chronic anemia, leukemia/lymphoma in Isfahan, Iran. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2014; 10 (4) :364-371
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-828-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-828-fa.html
نیکوزاد راضیه، محزونیه محمدرضا، نقوی نقیسه‌السادات. جستجوی ژنومی پارو ویروس B19 در بیماران مبتلا به کم خونی مزمن، لوسمی/لنفوم در اصفهان، ایران. فصلنامه پژوهشی خون. 1392; 10 (4) :364-371
دانشکده علوم زیستی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان
متن کامل [PDF 267 kb]
(2414 دریافت)
| چکیده (HTML) (11526 مشاهده)
مقدمه
پاروویروس B19 ویروسی ساده و کوچک، فاقد پوشش لیپیدی با DNA تک رشتهای خطی می‌باشد که دو پروتئین کپسید، VP1 (83 کیلودالتون) و VP2 (58 کیلودالتون) و یک پروتئین غیر ساختاری به نام NS1 را کد میکند. پروتئین NS1 نقش مهمی را در مکانیسم عفونت‌زایی ویروس دارد و فعالیت ویروس و پروموتورهای سلولی را افزایش می‌دهد(4-1). این ویروس از خانواده پاروویریده و متعلق به جنس اریتروویروس است و تمایل به تکثیر در پیش‌سازهای سلول‌های قرمز خون در مغزاستخوان دارد. گرایش ویروس به سلول‌های پیش‌ساز اریتروئید، ناشی از به کارگیری آنتی‌ژن P اریتروسیتی توسط ویروس به عنوان گیرنده سلولی برای ورود به داخل سلول می‌باشد(6، 5). ویروس در بیشتر موارد از طریق تنفس منتقل می‌شود ولی با این حال خون و فرآورده‌های خونی نیز میتوانند موجب انتقال پاروویروس B19 شوند، هم‌چنین میتواند از مادر آلوده به جنین نیز انتقال یابد(8، 7). عفونت با این ویروس بسیار شایع است و بسته به وضعیت ایمونولوژیک و هماتولوژیک بیمار ممکن است منجر به طیف وسیعی از تظاهرات بالینی شود. شایع‌ترین ظهور کلینیکی عفونت پاروویروس B19 ، اریتم عفونی یا بیماری پنجم است که به شکل بثورات پوستی در دوران کودکی ایجاد می‌شود. در بزرگسالان، عفونت ممکن است موجب آرتروپاتی حاد شود. در زنان باردار، عفونت پاروویروس B19 به دنبال انتقال عفونت از جفت به جنین میتواند کم خونی جنین، سقط جنین یا هیدروپس فتالیس را ایجاد کند(11-9). عفونت پاروویروس B19 در بیماران مبتلا به اختلالات خونی به خصوص کم خونی همولیتیک مزمن منجر به بحران آپلاستیک گذرا می‌شود. در این بیماران، تشکیل سلول‌های پیش‌ساز اریتروئید برای جبران لیز گلبولهای قرمز خون افزایش مییابد، عفونت پاروویروس B19 میتواند ساخت گلبولهای قرمز را موقتاً مهار و اریتروبلاستوپنی حاد ایجاد کند که اغلب به عنوان بحران آپلاستیک گذرا گفته می‌شود(12). هم چنین در افراد با سیستم ایمنی سرکوب شده ممکن است منجر به عفونت‌های پایدار گردد و کم خونیهای مزمن و آپلازی خالص گلبول قرمز(pure red cell aplasia) و گاهی اوقات ترومبوسیتوپنی، پان‌سیتوپنی و نوتروپنی را ایجاد نماید(14، 13). در مطالعه آس و همکاران، عفونت شایع با ویروس B19 در بین گروهی از بیماران مبتلا به انواع لوسمی، لنفوم بدخیم، کم خونی مزمن و تالاسمی گزارش گردید. به طور کلی نتایج آن‌ها نشان داد، افراد مبتلا به بیماری‌های بدخیم، بیماری‌های سرکوب‌کننده سیستم ایمنی و کمخونیهای همولیتیک به عنوان گروههای پر خطر برای این ویروس هستند و ارتباط این بیماری‌ها با عفونت B19 در آن‌ها تایید شد(6). تاکنون در اکثر مطالعه‌های منتشر شده از ایران، پژوهشها به تعیین میزان شیوع و تشخیص حضور آنتی‌بادی‌های ضد پاروویروس B19 با روش سرولوژی (الایزا) پرداخته‌اند که نتایج آن هم نشان‌دهنده عفونت قبلی با این ویروس است و کمتر از روشهای تشخیص مولکولی که عفونت فعال را نشان دهد، استفاده گردیده است. از طرف دیگر اطلاعاتی در مورد ارتباط عفونت فعال این ویروس با کم خونی، اختلالات خونی و بدخیمی‌ها در ایران در دست نیست، از این رو مطالعه روی تعیین عفونت فعال در بین افراد به ظاهر سالم و مبتلا به مشکلات خونی از اهمیت خاصی برخوردار خواهد بود. در این مطالعه تلاش شد تا از روش تشخیص مولکولی نستد ـ پی‌سی‌آر، که از حساسیت بسیار بالایی برخوردار است، جهت جستجوی ژنومی پاروویروس B19 در بین افراد با اختلالات خونی در استان اصفهان استفاده شود. هم چنین با استفاده از آزمون‌های آماری، ارتباط عوامل احتمالی خطرساز مانند سن، جنس، مدت زمان ابتلا به بیماری، سابقه سقط جنین و سابقه دریافت خون با آلودگی به ویروس B19 ارزیابی گردید. در صورت تایید هر گونه ارتباط عفونت با این ویروس و سایر فاکتورها، یافته‌های این تحقیق اطلاعاتی را به دست خواهد داد که در مدیریت درمان و پیشگیری از عفونت با این ویروس مفید خواهد بود.
مواد و روش‌ها
بیماران:
در ایـن مطالعـه مقطعـی- توصیفـی، جستجـوی ژنومی
پاروویروس B19 در میان 65 بیمار مبتلا به اختلالات خونی به طور خوشه‌ای تصادفی(cluster sampling) شامل 35 نفر مبتلا به کم خونی مزمن و 30 نفر مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حادALL))، لوسمی میلوئیدی حاد((AML و لنفوم‌های بدخیم در مقایسه با 30 فرد سالم به عنوان کنترل در محدوده سنی مشابه با بیمارانی که به طور تصادفی وارد این تحقیق شده بودند، تحت مطالعه قرار گرفتند. به طور کلی در بین نمونه‌ها 57 نفر زن بودند که 7 نفر آن‌ها سابقه سقط جنین داشتند.
جمع‌آوری نمونه‌های سرمی:
سرم از خون جمع‌آوری شده از بیماران پس از سانتریفیوژ و جدا کردن از لخته، بلافاصله در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. هم چنین مشخصات بیماران شامل نام و نام خانوادگی، سن، جنس، مدت ابتلا به بیماری، یافته‌های آزمایشگاهی در مورد تعداد و مشخصات گلبولهای قرمز و سفید، سابقه دریافت خون و سابقه سقط جنین در فرم‌هایی حین نمونه‌برداری ثبت شدند. به منظور تجزیه و تحلیل آماری اطلاعات حاصل از نتایج، از نرم‌افزار آماری 15 SPSS و مدل آماری مربع کای در سطح اطمینان 95% (05/0p ≤ ) و آزمون t استفاده گردید.
واکنش PCR دو مرحله‌ای:
استخراج DNA ویروسی از سرم بیماران با استفاده از کیت استخراج اسید نوکلئیک ویروسی(GF-1 Viral Nucleic Acid Extraction Kit) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. آزمایش خلوصDNA استخراج شده در
طول موج 280/260 توسط دستگاه بیوفتومتر(آلمان، اپندرف) در محدوده 8/1 برآورد گردید. برای بررسی حضور توالی اختصاصی DNA ویروسی، مطابق روش منتشر شده توسط زربینی و همکاران(1996) و ون و همکاران(2011)، از واکنش PCR دو مرحله‌ای(Nested polymerase chain reaction) با استفاده از 2جفت آغازگر استفاده شد(16، 15). حساسیت این روش نسبت به PCR مرسوم 10000 برابر بیشتر است(17). برای کنترل آلودگی و عدم وجود مهارکننده در مرحله PCR ، از آب مقطر به عنوان کنترل منفی و از یک نمونه سرم مثبت که پس از تعیین توالی نوکلئوتیدی به تایید بخش ویروس‌شناسی دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران، حاوی ژنوم B19 بود، به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.
مواد مورد نیاز در این روش به شرح زیر می‌باشد:
25 میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 5/2 میکرولیتر بافر PCR با غلظت x 10 ، 1 میکرولیتر داکسی‌نوکلئوتیدتری فسفات(dNTP)، 5/1 میکرولیتر کلرید منیزیم(MgCl2)، 5/0 میکرولیتر Taq پلیمراز ، 1 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای مستقیم(جلوبرنده) و معکوس(عقب‌برنده)، 5/14 میکرولیتر آب دیونیزه و 3 میکرولیتر از نمونه DNA استخراج شده. در مرحله اول از آغازگرهای A 1 و S 2 و در مرحله دوم از آغازگرهای A 3 و S 4 استفاده شد (جدول1). 35 سیکل تحت شرایط دمایی زیر برای هر دو مرحله PCR به کار برده شد:
یک دقیقه دمای 95 درجه سانتی‌گراد برای مرحله تقلیب (denaturation)، 5/1 دقیقه دمای 55 درجه سانتی‌گراد برای مرحله به هم پیوستن(annealing) و 1 دقیقه دمای 72 درجه سانتی‌گراد برای مرحله ساخت DNA
(extension)و در نهایت 7 دقیقه دمای 72 درجه سانتی‌گراد برای مرحله گسترش نهایی. در مرحله دوم Nested-PCR ، 2 میکرولیتر از واکنش اخیر به 23 میکرولیتر از مخلوط PCR با آغازگرهای A 3 و S 4 اضافه شد.
در نهایت محصولات PCR در ژل آگار 2% الکتروفورز شدند و با توجه به موقعیت قرار گرفتن باندها نسبت به DNA مارکر، بر روی ژل مورد بررسی قرار گرفتند که در مرحله اول اندازه محصول مورد انتظار bp 1112 و در مرحله دوم bp 104 بود.
یافته‌ها
میزان آلودگی به ویروس B19 به ترتیب در گروه آنمی مزمن، لوسمی/ لنفوم و شاهد، 1/17 ، 30 و صفر درصد بود. 50 نفر(9/76%) نیز از نظر آلودگی به ویروس B19 منفی بودند. در سرم 30 فرد شاهد نیز هیچ نمونه مثبتی یافت نشد. آزمون آماری کای‌دو نشان داد که بین گروه بیماران و گروه شاهد اختلاف معناداری وجود دارد (001/0= p)(جدول2). گروه افراد آلوده به پاروویروس B19 و افراد غیر آلوده، از نظر جنسیت، سن، مدت زمان ابتلا به بیماری، سابقه سقط جنین و سابقه تزریق خون، با استفاده از آزمون آماری کای‌دو مورد بررسی قرار گرفتند.
جدول 2: توزیع فراوانی موارد آلودگی به پاروویروس B19 بین گروه بیماران و گروه شاهد
بررسی‌های آماری انجام شده روی عوامل احتمالی خطرساز برای ابتلا به ویروس B19 نشان داد که بین جنسیت، سن، سابقه سقط جنین و آلودگی به ویروس B19 رابطه معناداری وجود ندارد(جداول 3 و 4).
جدول 3: توزیع فراوانی گروه آلوده به ویروس B19 و گروه غیر آلوده به تفکیک جنسیت
جدول 4: توزیع فراوانی گروه آلوده به ویروس B19 و گروه غیر آلوده بر حسب رده‌های سنی
در افراد آلوده به پاروویروس B19 ، 11مورد(4/73%) سابقه دریافت خون و فرآورده‌های خونی داشتند که بر اساس آزمون آماری، کای دو محاسبه شده در سطح 05/0p≤ معنادار بود، بنابراین اختلاف معناداری بین داشتن سابقه تزریق خون و ابتلا به ویروس B19 دیده شد(جدول 5).
جدول 5 : توزیع فراوانی سابقه دریافت خون در گروه آلوده به پاروویروس B19 و افراد غیر آلوده
طول مدت بیماری در 60% از افراد آلوده به ویروس B19 ، بالای 12 ماه بود. بر اساس آزمون آماری، کای‌دو محاسبه شده در سطح 05/0p≤ معنادار بوده، بنابراین از نظر مدت زمان ابتلا به بیماری‌های هماتولوژیک و آلودگی به ویروس B19 ، ارتباط معناداری دیده شد(جدول 6).
جدول 6 : توزیع فراوانی گروه آلوده به ویروس B19 و گروه غیر آلوده بر حسب مدت زمان ابتلا به بیماری
برای بررسی تفاوت متغیرهای کمی از جمله مقادیر فاکتورهای خونی مورد بررسی در دو گروه آلوده به عفونت فعال ویروس B19 و گروه غیرآلوده، از آزمون آماری t استفاده گردید(جدول 7).
بحث
مطالعه حاضر روی 65 بیمار مبتلا به کم خونیهای مزمن، لوسمی لنفوبلاستیک حاد، لوسمی میلوئید حاد و لنفوم‌های بدخیم در استان اصفهان انجام شد. نتایج آزمایش PCR در این بررسی نشان‌دهنده حضور توالی نوکلئوتیدی اختصاصی پاروویروس B19 در 1/23% از بیماران مبتلا به اختلالات خونی بود که با بسیاری از نتایج مطالعه‌های انجام گرفته در کشورهای دیگر هم‌خوانی دارد. اگر چه در آزمایش‌های سرولوژی مقدار IgG بالا بود اما مقادیر IgM و DNA در محدودهی یکسانی گزارش شد.
در مطالعه‌های هیگارد و همکاران در دانمارک، شواهدی از عفونت فعال ویروس B19 در 30% از بیماران مبتلا به کم خونیهای مزمن یافت شد(18). هم چنین در یک بررسی در هند، این فراوانی 9/25% گزارش شد(19). در یک مطالعه که توسط ریگایا در تونس انجام شد، آنتی‌بادی‌های IgG ضد پاروویروس B19 در 5/56% از بیماران با اختلالات خونی مزمن یافت شد، در حالی که تنها 7/8% بیماران حاوی DNA ویروسی بودند که در مقایسه با نتایج مطالعه‌های ما کمتر بود(10). در بررسی دیگری در ترکیه در سال 2007، در 1/29% حضور DNA ویروسی و یا آنتی‌بادی IgM گزارش شد(6). هم چنین در مطالعه‌ای توسط کیشوره و همکاران، IgM anti-B19 که نشان‌دهنده عفونت تازه یا حاد است در 1/17% از کودکان مبتلا به بدخیمی‌های هماتولوژیک یافت شد (3).
وینی‌تا و همکاران در سال 2012، DNA ویروس B19 را در 3/27% در بین 66 بیمار با آنمی آپلاستیک در مقابل 2/2% در گروه کنترل گزارش کردند. در این بررسی آنتی‌بادی‌های IgM ضد پاروویروس B19 نیز در 8/25% از گروه بیماران و 2/2% از گروه کنترل یافت شد(20).
به طور کلی نتایج مطالعه‌های انجام شده در کشورهای مختلف نشان می‌دهد میزان آلودگی در افراد مورد بررسی خیلی بالاست زیرا در افراد در معرض خطر بالا، جستجوی ژنومی ویروس B19 صورت گرفته است.
عفونت B19 یک عفونت شایع است ولی اکثر افراد،
مبتلا به عفونت فعال نیستند زیرا در مطالعه‌های انجام گرفته در ایران و سایر کشورها به ترتیب فراوانی IgG ضد ویروس و DNA در افراد به ظاهر سالم در حدود 58% و صفر درصد بوده است. در مطالعه ما نیز در گروه شاهد هیچ نمونه مثبتی یافت نشد که این نتایج با مطالعه‌‌هایی که در تهران روی اهداکنندگان خون و هم چنین در کشورهای هند، تونس، چین، عربستان، تایلند و ایالات متحده انجام گرفته بود، هم‌خوانی داشت. موارد مثبت از صفر درصد در تهران تا یک درصد در ایالات متحده گزارش شده بود(24-21، 12، 10، 3). نتایج به دست آمده در این مطالعه و هم چنین سایر مطالعه‌های منتشر شده در سطح جهان با نتایج به دست آمده از اهداکنندگان خون در ویتنام(4/21%) کاملاً مغایرت داشت(25).
از آن جا که این عفونت در دوران کودکی شایع است و منجر به بروز بیماری پنجم می‌شود، مشخص نیست حضور ژنوم ویروسی در کودکان از چه طریقی بوده است، چون این افراد از نظر ایمنی ساپرس هستند، بنابراین عفونت نهفته میتواند در آن‌ها فعال شود.
نتیجه‌گیری
توصیه می‌شود که در همه موارد اختلالات هماتولوژیکی، غربالگری آنتی‌بادی ضد ویروس و بررسی حضور توالی نوکلئوتیدی اختصاصی پاروویروس B19 توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در دستور کار متخصصان تشخیص و درمان قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد دانشجویی
می‌باشـد. بدین‌وسیلـه از زحمـات خانم مرضیه صفرپور و
فاطمه یکتنه در دانشگاه شهرکرد که در مراحل انجام این پایان‌نامه کمک نمودند تشکر می‌گردد. هم چنین از همکاری مسؤولین محترم بیمارستان و آزمایشگاه سیدالشهداء اصفهان که در نمونه‌گیری مساعدت فرمودند سپاسگزاری می‌گردد.
متن کامل: (5485 مشاهده)
جستجوی ژنومی پارو ویروس B19 در بیماران مبتلا به کم خونی مزمن،
لوسمی/لنفوم در اصفهان، ایران
راضیه نیکوزاد1، محمدرضا محزونیه2، نفیسه سادات نقوی3
چکیده
سابقه و هدف
پاروویروس B19 موجب بروز طیفی از تظاهرات بالینی از جمله اریتم عفونی، هیدروپس فتالیس، آرتروپاتی و بحران آپلاستیک گذرا می‌شود. ویروس بسیار بیماری‌زا است و از طریق تنفس، خون و فرآورده‌های آن انتقال مییابد. هدف این مطالعه، جستجوی ژنومی پاروویروس انسانی B19 در افراد مبتلا به اختلالات خونی بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه توصیفی، عفونت به پاروویروس B19 در بین بیماران مبتلا به اختلالات خونی و افراد سالم مقایسه گردید. در این مطالعه سرمها از دو گروه شامل 35 بیمار مبتلا به کم خونی مزمن و 30 فرد مبتلا به لوسمی/ لنفوم از اصفهان جمع‌آوری شدند. 30 فرد سالم نیز به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. پس از استخراج DNA از نمونه‌های سرمی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت جستجوی ژنومی پاروویروس B19 انجام شد. یافته‌ها توسط آزمون‌های کای‌دو، t و نرم‌افزار آماری 15 SPSS تجزیه و تحلیل شدند.
یافته‌ها
توالی نوکلئوتیدی اختصاصی پاروویروس B19 در 15 نمونه(1/23%) از سرم بیماران مشاهده گردید. از این تعداد 6 نفر(1/17%) از میان 35 بیمار، مبتلا به اختلالات خونی خوش خیم و 9 نفر(30%) از گروه بیماران بدخیم بودند. در سرم 30 فرد شاهد نیز هیچ نمونه مثبتی یافت نشد.
نتیجه گیری
نتایج بررسی انجام شده با نتایج مطالعه‌های بسیاری از کشورها مطابقت دارد که این نشان‌دهنده بالا بودن عفونت پاروویروس B19 در افراد در معرض خطر بالا از جمله بیماران مبتلا به اختلالات خونی می‌باشد.
کلمات کلیدی: پاروویروس، بیماری‌های خونی، PCR، ایران
تاریخ دریافت : 18/11/91
تاریخ پذیرش : 28/3 /92
1- مؤلف مسؤول: دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی ـ دانشکده علوم زیستی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان ـ فلاورجان ـ ایران ـ صندوق پستی: 155/84515
2- PhD میکروبیولوژی ـ دانشیار پژوهشکده بیماری‌های مشترک انسان و دام ـ دانشگاه شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
3- PhD میکروبیولوژی ـ استادیار دانشکده علوم زیستی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان ـ فلاورجان ـ ایران
لوسمی/لنفوم در اصفهان، ایران
راضیه نیکوزاد1، محمدرضا محزونیه2، نفیسه سادات نقوی3
چکیده
سابقه و هدف
پاروویروس B19 موجب بروز طیفی از تظاهرات بالینی از جمله اریتم عفونی، هیدروپس فتالیس، آرتروپاتی و بحران آپلاستیک گذرا می‌شود. ویروس بسیار بیماری‌زا است و از طریق تنفس، خون و فرآورده‌های آن انتقال مییابد. هدف این مطالعه، جستجوی ژنومی پاروویروس انسانی B19 در افراد مبتلا به اختلالات خونی بود.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه توصیفی، عفونت به پاروویروس B19 در بین بیماران مبتلا به اختلالات خونی و افراد سالم مقایسه گردید. در این مطالعه سرمها از دو گروه شامل 35 بیمار مبتلا به کم خونی مزمن و 30 فرد مبتلا به لوسمی/ لنفوم از اصفهان جمع‌آوری شدند. 30 فرد سالم نیز به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. پس از استخراج DNA از نمونه‌های سرمی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت جستجوی ژنومی پاروویروس B19 انجام شد. یافته‌ها توسط آزمون‌های کای‌دو، t و نرم‌افزار آماری 15 SPSS تجزیه و تحلیل شدند.
یافته‌ها
توالی نوکلئوتیدی اختصاصی پاروویروس B19 در 15 نمونه(1/23%) از سرم بیماران مشاهده گردید. از این تعداد 6 نفر(1/17%) از میان 35 بیمار، مبتلا به اختلالات خونی خوش خیم و 9 نفر(30%) از گروه بیماران بدخیم بودند. در سرم 30 فرد شاهد نیز هیچ نمونه مثبتی یافت نشد.
نتیجه گیری
نتایج بررسی انجام شده با نتایج مطالعه‌های بسیاری از کشورها مطابقت دارد که این نشان‌دهنده بالا بودن عفونت پاروویروس B19 در افراد در معرض خطر بالا از جمله بیماران مبتلا به اختلالات خونی می‌باشد.
کلمات کلیدی: پاروویروس، بیماری‌های خونی، PCR، ایران
تاریخ دریافت : 18/11/91
تاریخ پذیرش : 28/3 /92
1- مؤلف مسؤول: دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی ـ دانشکده علوم زیستی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان ـ فلاورجان ـ ایران ـ صندوق پستی: 155/84515
2- PhD میکروبیولوژی ـ دانشیار پژوهشکده بیماری‌های مشترک انسان و دام ـ دانشگاه شهرکرد ـ شهرکرد ـ ایران
3- PhD میکروبیولوژی ـ استادیار دانشکده علوم زیستی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان ـ فلاورجان ـ ایران
مقدمه
پاروویروس B19 ویروسی ساده و کوچک، فاقد پوشش لیپیدی با DNA تک رشتهای خطی می‌باشد که دو پروتئین کپسید، VP1 (83 کیلودالتون) و VP2 (58 کیلودالتون) و یک پروتئین غیر ساختاری به نام NS1 را کد میکند. پروتئین NS1 نقش مهمی را در مکانیسم عفونت‌زایی ویروس دارد و فعالیت ویروس و پروموتورهای سلولی را افزایش می‌دهد(4-1). این ویروس از خانواده پاروویریده و متعلق به جنس اریتروویروس است و تمایل به تکثیر در پیش‌سازهای سلول‌های قرمز خون در مغزاستخوان دارد. گرایش ویروس به سلول‌های پیش‌ساز اریتروئید، ناشی از به کارگیری آنتی‌ژن P اریتروسیتی توسط ویروس به عنوان گیرنده سلولی برای ورود به داخل سلول می‌باشد(6، 5). ویروس در بیشتر موارد از طریق تنفس منتقل می‌شود ولی با این حال خون و فرآورده‌های خونی نیز میتوانند موجب انتقال پاروویروس B19 شوند، هم‌چنین میتواند از مادر آلوده به جنین نیز انتقال یابد(8، 7). عفونت با این ویروس بسیار شایع است و بسته به وضعیت ایمونولوژیک و هماتولوژیک بیمار ممکن است منجر به طیف وسیعی از تظاهرات بالینی شود. شایع‌ترین ظهور کلینیکی عفونت پاروویروس B19 ، اریتم عفونی یا بیماری پنجم است که به شکل بثورات پوستی در دوران کودکی ایجاد می‌شود. در بزرگسالان، عفونت ممکن است موجب آرتروپاتی حاد شود. در زنان باردار، عفونت پاروویروس B19 به دنبال انتقال عفونت از جفت به جنین میتواند کم خونی جنین، سقط جنین یا هیدروپس فتالیس را ایجاد کند(11-9). عفونت پاروویروس B19 در بیماران مبتلا به اختلالات خونی به خصوص کم خونی همولیتیک مزمن منجر به بحران آپلاستیک گذرا می‌شود. در این بیماران، تشکیل سلول‌های پیش‌ساز اریتروئید برای جبران لیز گلبولهای قرمز خون افزایش مییابد، عفونت پاروویروس B19 میتواند ساخت گلبولهای قرمز را موقتاً مهار و اریتروبلاستوپنی حاد ایجاد کند که اغلب به عنوان بحران آپلاستیک گذرا گفته می‌شود(12). هم چنین در افراد با سیستم ایمنی سرکوب شده ممکن است منجر به عفونت‌های پایدار گردد و کم خونیهای مزمن و آپلازی خالص گلبول قرمز(pure red cell aplasia) و گاهی اوقات ترومبوسیتوپنی، پان‌سیتوپنی و نوتروپنی را ایجاد نماید(14، 13). در مطالعه آس و همکاران، عفونت شایع با ویروس B19 در بین گروهی از بیماران مبتلا به انواع لوسمی، لنفوم بدخیم، کم خونی مزمن و تالاسمی گزارش گردید. به طور کلی نتایج آن‌ها نشان داد، افراد مبتلا به بیماری‌های بدخیم، بیماری‌های سرکوب‌کننده سیستم ایمنی و کمخونیهای همولیتیک به عنوان گروههای پر خطر برای این ویروس هستند و ارتباط این بیماری‌ها با عفونت B19 در آن‌ها تایید شد(6). تاکنون در اکثر مطالعه‌های منتشر شده از ایران، پژوهشها به تعیین میزان شیوع و تشخیص حضور آنتی‌بادی‌های ضد پاروویروس B19 با روش سرولوژی (الایزا) پرداخته‌اند که نتایج آن هم نشان‌دهنده عفونت قبلی با این ویروس است و کمتر از روشهای تشخیص مولکولی که عفونت فعال را نشان دهد، استفاده گردیده است. از طرف دیگر اطلاعاتی در مورد ارتباط عفونت فعال این ویروس با کم خونی، اختلالات خونی و بدخیمی‌ها در ایران در دست نیست، از این رو مطالعه روی تعیین عفونت فعال در بین افراد به ظاهر سالم و مبتلا به مشکلات خونی از اهمیت خاصی برخوردار خواهد بود. در این مطالعه تلاش شد تا از روش تشخیص مولکولی نستد ـ پی‌سی‌آر، که از حساسیت بسیار بالایی برخوردار است، جهت جستجوی ژنومی پاروویروس B19 در بین افراد با اختلالات خونی در استان اصفهان استفاده شود. هم چنین با استفاده از آزمون‌های آماری، ارتباط عوامل احتمالی خطرساز مانند سن، جنس، مدت زمان ابتلا به بیماری، سابقه سقط جنین و سابقه دریافت خون با آلودگی به ویروس B19 ارزیابی گردید. در صورت تایید هر گونه ارتباط عفونت با این ویروس و سایر فاکتورها، یافته‌های این تحقیق اطلاعاتی را به دست خواهد داد که در مدیریت درمان و پیشگیری از عفونت با این ویروس مفید خواهد بود.
مواد و روش‌ها
بیماران:
در ایـن مطالعـه مقطعـی- توصیفـی، جستجـوی ژنومی
پاروویروس B19 در میان 65 بیمار مبتلا به اختلالات خونی به طور خوشه‌ای تصادفی(cluster sampling) شامل 35 نفر مبتلا به کم خونی مزمن و 30 نفر مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حادALL))، لوسمی میلوئیدی حاد((AML و لنفوم‌های بدخیم در مقایسه با 30 فرد سالم به عنوان کنترل در محدوده سنی مشابه با بیمارانی که به طور تصادفی وارد این تحقیق شده بودند، تحت مطالعه قرار گرفتند. به طور کلی در بین نمونه‌ها 57 نفر زن بودند که 7 نفر آن‌ها سابقه سقط جنین داشتند.
جمع‌آوری نمونه‌های سرمی:
سرم از خون جمع‌آوری شده از بیماران پس از سانتریفیوژ و جدا کردن از لخته، بلافاصله در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. هم چنین مشخصات بیماران شامل نام و نام خانوادگی، سن، جنس، مدت ابتلا به بیماری، یافته‌های آزمایشگاهی در مورد تعداد و مشخصات گلبولهای قرمز و سفید، سابقه دریافت خون و سابقه سقط جنین در فرم‌هایی حین نمونه‌برداری ثبت شدند. به منظور تجزیه و تحلیل آماری اطلاعات حاصل از نتایج، از نرم‌افزار آماری 15 SPSS و مدل آماری مربع کای در سطح اطمینان 95% (05/0p ≤ ) و آزمون t استفاده گردید.
واکنش PCR دو مرحله‌ای:
استخراج DNA ویروسی از سرم بیماران با استفاده از کیت استخراج اسید نوکلئیک ویروسی(GF-1 Viral Nucleic Acid Extraction Kit) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. آزمایش خلوصDNA استخراج شده در
طول موج 280/260 توسط دستگاه بیوفتومتر(آلمان، اپندرف) در محدوده 8/1 برآورد گردید. برای بررسی حضور توالی اختصاصی DNA ویروسی، مطابق روش منتشر شده توسط زربینی و همکاران(1996) و ون و همکاران(2011)، از واکنش PCR دو مرحله‌ای(Nested polymerase chain reaction) با استفاده از 2جفت آغازگر استفاده شد(16، 15). حساسیت این روش نسبت به PCR مرسوم 10000 برابر بیشتر است(17). برای کنترل آلودگی و عدم وجود مهارکننده در مرحله PCR ، از آب مقطر به عنوان کنترل منفی و از یک نمونه سرم مثبت که پس از تعیین توالی نوکلئوتیدی به تایید بخش ویروس‌شناسی دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران، حاوی ژنوم B19 بود، به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.
مواد مورد نیاز در این روش به شرح زیر می‌باشد:
25 میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 5/2 میکرولیتر بافر PCR با غلظت x 10 ، 1 میکرولیتر داکسی‌نوکلئوتیدتری فسفات(dNTP)، 5/1 میکرولیتر کلرید منیزیم(MgCl2)، 5/0 میکرولیتر Taq پلیمراز ، 1 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای مستقیم(جلوبرنده) و معکوس(عقب‌برنده)، 5/14 میکرولیتر آب دیونیزه و 3 میکرولیتر از نمونه DNA استخراج شده. در مرحله اول از آغازگرهای A 1 و S 2 و در مرحله دوم از آغازگرهای A 3 و S 4 استفاده شد (جدول1). 35 سیکل تحت شرایط دمایی زیر برای هر دو مرحله PCR به کار برده شد:
یک دقیقه دمای 95 درجه سانتی‌گراد برای مرحله تقلیب (denaturation)، 5/1 دقیقه دمای 55 درجه سانتی‌گراد برای مرحله به هم پیوستن(annealing) و 1 دقیقه دمای 72 درجه سانتی‌گراد برای مرحله ساخت DNA
جدول 1: توالی آغازگرهای به کار رفته برای جستجوی ویروس B19 و وزن محصول PCR در هر مرحله
| آغازگر | نام و موقعیت توالی در ژنوم | توالی آغازگر ′3→′5 |
اندازه محصول (bp) |
| دوره اول | 1A 2095-2924 2S 4016-3997 |
CTTTAGGTATAGCCAACTGG ACACTGAGTTTACTAGTGGC |
1112 |
| دوره دوم | 3A 3187-3206 4S 3290-3271 |
CAAAAGCATGTGGAGTGAGG CCTTATAATGGTGCTCTGGG |
104 |
(extension)و در نهایت 7 دقیقه دمای 72 درجه سانتی‌گراد برای مرحله گسترش نهایی. در مرحله دوم Nested-PCR ، 2 میکرولیتر از واکنش اخیر به 23 میکرولیتر از مخلوط PCR با آغازگرهای A 3 و S 4 اضافه شد.
در نهایت محصولات PCR در ژل آگار 2% الکتروفورز شدند و با توجه به موقعیت قرار گرفتن باندها نسبت به DNA مارکر، بر روی ژل مورد بررسی قرار گرفتند که در مرحله اول اندازه محصول مورد انتظار bp 1112 و در مرحله دوم bp 104 بود.
یافته‌ها
میزان آلودگی به ویروس B19 به ترتیب در گروه آنمی مزمن، لوسمی/ لنفوم و شاهد، 1/17 ، 30 و صفر درصد بود. 50 نفر(9/76%) نیز از نظر آلودگی به ویروس B19 منفی بودند. در سرم 30 فرد شاهد نیز هیچ نمونه مثبتی یافت نشد. آزمون آماری کای‌دو نشان داد که بین گروه بیماران و گروه شاهد اختلاف معناداری وجود دارد (001/0= p)(جدول2). گروه افراد آلوده به پاروویروس B19 و افراد غیر آلوده، از نظر جنسیت، سن، مدت زمان ابتلا به بیماری، سابقه سقط جنین و سابقه تزریق خون، با استفاده از آزمون آماری کای‌دو مورد بررسی قرار گرفتند.
جدول 2: توزیع فراوانی موارد آلودگی به پاروویروس B19 بین گروه بیماران و گروه شاهد
| گروه‌ها | نتیجه آزمایش PCR | p | |
| + فراوانی(%) |
- فراوانی(%) |
||
| آنمی مزمن (35 n=) |
6 (1/17) | 29 (9/82) | 001/0 |
| لوسمی/لنفوم (30 n=) |
9 (30) | 21 (70) | |
| شاهد (30 n=) |
0 (0) | 30 (100) | |
| کل (95 n=) |
15 (8/15) | 80 (2/84) | |
جدول 3: توزیع فراوانی گروه آلوده به ویروس B19 و گروه غیر آلوده به تفکیک جنسیت
| جنسیت | گروه آلوده فراوانی (درصد) |
گروه غیر آلوده فراوانی (درصد) |
کل فراوانی (درصد) |
| مؤنث | 10 (7/66) | 46 (5/57) | 56 (9/58) |
| مذکر | 5 (3/33) | 34 (5/42) | 39 (1/41) |
| کل | 15 (100) | 80 (100) | 95 (100) |
جدول 4: توزیع فراوانی گروه آلوده به ویروس B19 و گروه غیر آلوده بر حسب رده‌های سنی
| رده‌های سنی | گروه آلوده به ویروس B19 فراوانی (درصد) |
گروه غیر آلوده به ویروس B19 فراوانی (درصد) |
کل فراوانی (درصد) |
| 20-1 سال | 5 (4/33) | 36 (45) | 41 (15/43) |
| 40-20 سال 60-40 سال |
5 (3/36) | 17 (25/21) | 22 (16/23) |
| بالای 60 سال | 5 (3/33) | 27 (75/33) | 32 (69/33) |
| کل | 15 (100) | 80 (100) | 95 (100) |
در افراد آلوده به پاروویروس B19 ، 11مورد(4/73%) سابقه دریافت خون و فرآورده‌های خونی داشتند که بر اساس آزمون آماری، کای دو محاسبه شده در سطح 05/0p≤ معنادار بود، بنابراین اختلاف معناداری بین داشتن سابقه تزریق خون و ابتلا به ویروس B19 دیده شد(جدول 5).
جدول 5 : توزیع فراوانی سابقه دریافت خون در گروه آلوده به پاروویروس B19 و افراد غیر آلوده
| سابقه تزریق خون | گروه آلوده به ویروس B19 فراوانی (درصد) |
گروه غیر آلوده به ویروس B19 فراوانی (درصد) |
کل فراوانی (درصد) |
p-value |
| بلی | 11 (4/73) | 35 (8/43) | 46 (4/48) | 035/0 |
| خیر | 4 (6/26) | 45 (2/56) | 49 (6/51) | |
| کل | 15 (100) | 80 (100) | 95 (100) |
طول مدت بیماری در 60% از افراد آلوده به ویروس B19 ، بالای 12 ماه بود. بر اساس آزمون آماری، کای‌دو محاسبه شده در سطح 05/0p≤ معنادار بوده، بنابراین از نظر مدت زمان ابتلا به بیماری‌های هماتولوژیک و آلودگی به ویروس B19 ، ارتباط معناداری دیده شد(جدول 6).
جدول 6 : توزیع فراوانی گروه آلوده به ویروس B19 و گروه غیر آلوده بر حسب مدت زمان ابتلا به بیماری
| مدت ابتلا | گروه آلوده به ویروس B19 فراوانی (درصد) |
گروه غیر آلوده به ویروس B19 فراوانی (درصد) |
کل فراوانی (درصد) |
p-value | ||
| 6-1 ماه | 5 (4/33) | 8 (16) | 13 (20) | 048/0 | ||
| 12-6 ماه | 1 (6/6) | 5 (10) | 6 (24/9) | |||
| بالای 12 ماه | 9 (60) | 37 (74) | 46 (76/70) | |||
| کل | 15 (100) | 50 (100) | 65 (100) | |||
برای بررسی تفاوت متغیرهای کمی از جمله مقادیر فاکتورهای خونی مورد بررسی در دو گروه آلوده به عفونت فعال ویروس B19 و گروه غیرآلوده، از آزمون آماری t استفاده گردید(جدول 7).
جدول 7: شاخص‌های توصیفی فاکتورهای خونی در گروه آلوده به پاروویروس B19 و گروه غیر آلوده
| گروه آلوده به ویروس B19 | گروه غیر آلوده به ویروس B19 | t | df درجه آزادی |
p | |
| انحراف معیار ± میانگین | انحراف معیار ± میانگین | ||||
| (U/L 103 *) W.B.C | 3/2 ± 6/4 | 09/2 ± 5/5 | 5/1 | 93 | 1/0 |
| (U/L 106 *) RBC | 7/1 ± 08/4 | 07/1 ± 5/4 | 98/0 | 93 | 3/0 |
| HGB (g/dl) | 5/1 ± 8/10 | 7/2 ± 1/12 | 7/1 | 33 | 01/0 |
| HCT (%) | 4/5 ± 5/34 | 4/7 ± 1/37 | 2/1 | 93 | 1/0 |
| (U/L 103 *) PLT | 1/105 ± 7/321 | 93 ± 03/309 | 4/0 | 93 | 6/0 |
| M.C.V (FL) | 1/9 ± 1/82 | 7/7 ± 28/87 | 5/2 | 93 | 1/0 |
| M.C.H (pg) | 09/3 ± 3/26 | 4/3 ± 7/28 | 5/2 | 93 | 1/0 |
بحث
مطالعه حاضر روی 65 بیمار مبتلا به کم خونیهای مزمن، لوسمی لنفوبلاستیک حاد، لوسمی میلوئید حاد و لنفوم‌های بدخیم در استان اصفهان انجام شد. نتایج آزمایش PCR در این بررسی نشان‌دهنده حضور توالی نوکلئوتیدی اختصاصی پاروویروس B19 در 1/23% از بیماران مبتلا به اختلالات خونی بود که با بسیاری از نتایج مطالعه‌های انجام گرفته در کشورهای دیگر هم‌خوانی دارد. اگر چه در آزمایش‌های سرولوژی مقدار IgG بالا بود اما مقادیر IgM و DNA در محدودهی یکسانی گزارش شد.
در مطالعه‌های هیگارد و همکاران در دانمارک، شواهدی از عفونت فعال ویروس B19 در 30% از بیماران مبتلا به کم خونیهای مزمن یافت شد(18). هم چنین در یک بررسی در هند، این فراوانی 9/25% گزارش شد(19). در یک مطالعه که توسط ریگایا در تونس انجام شد، آنتی‌بادی‌های IgG ضد پاروویروس B19 در 5/56% از بیماران با اختلالات خونی مزمن یافت شد، در حالی که تنها 7/8% بیماران حاوی DNA ویروسی بودند که در مقایسه با نتایج مطالعه‌های ما کمتر بود(10). در بررسی دیگری در ترکیه در سال 2007، در 1/29% حضور DNA ویروسی و یا آنتی‌بادی IgM گزارش شد(6). هم چنین در مطالعه‌ای توسط کیشوره و همکاران، IgM anti-B19 که نشان‌دهنده عفونت تازه یا حاد است در 1/17% از کودکان مبتلا به بدخیمی‌های هماتولوژیک یافت شد (3).
وینی‌تا و همکاران در سال 2012، DNA ویروس B19 را در 3/27% در بین 66 بیمار با آنمی آپلاستیک در مقابل 2/2% در گروه کنترل گزارش کردند. در این بررسی آنتی‌بادی‌های IgM ضد پاروویروس B19 نیز در 8/25% از گروه بیماران و 2/2% از گروه کنترل یافت شد(20).
به طور کلی نتایج مطالعه‌های انجام شده در کشورهای مختلف نشان می‌دهد میزان آلودگی در افراد مورد بررسی خیلی بالاست زیرا در افراد در معرض خطر بالا، جستجوی ژنومی ویروس B19 صورت گرفته است.
عفونت B19 یک عفونت شایع است ولی اکثر افراد،
مبتلا به عفونت فعال نیستند زیرا در مطالعه‌های انجام گرفته در ایران و سایر کشورها به ترتیب فراوانی IgG ضد ویروس و DNA در افراد به ظاهر سالم در حدود 58% و صفر درصد بوده است. در مطالعه ما نیز در گروه شاهد هیچ نمونه مثبتی یافت نشد که این نتایج با مطالعه‌‌هایی که در تهران روی اهداکنندگان خون و هم چنین در کشورهای هند، تونس، چین، عربستان، تایلند و ایالات متحده انجام گرفته بود، هم‌خوانی داشت. موارد مثبت از صفر درصد در تهران تا یک درصد در ایالات متحده گزارش شده بود(24-21، 12، 10، 3). نتایج به دست آمده در این مطالعه و هم چنین سایر مطالعه‌های منتشر شده در سطح جهان با نتایج به دست آمده از اهداکنندگان خون در ویتنام(4/21%) کاملاً مغایرت داشت(25).
از آن جا که این عفونت در دوران کودکی شایع است و منجر به بروز بیماری پنجم می‌شود، مشخص نیست حضور ژنوم ویروسی در کودکان از چه طریقی بوده است، چون این افراد از نظر ایمنی ساپرس هستند، بنابراین عفونت نهفته میتواند در آن‌ها فعال شود.
نتیجه‌گیری
توصیه می‌شود که در همه موارد اختلالات هماتولوژیکی، غربالگری آنتی‌بادی ضد ویروس و بررسی حضور توالی نوکلئوتیدی اختصاصی پاروویروس B19 توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در دستور کار متخصصان تشخیص و درمان قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد دانشجویی
می‌باشـد. بدین‌وسیلـه از زحمـات خانم مرضیه صفرپور و
فاطمه یکتنه در دانشگاه شهرکرد که در مراحل انجام این پایان‌نامه کمک نمودند تشکر می‌گردد. هم چنین از همکاری مسؤولین محترم بیمارستان و آزمایشگاه سیدالشهداء اصفهان که در نمونه‌گیری مساعدت فرمودند سپاسگزاری می‌گردد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
