جلد ۱۰، شماره ۳ - ( پاييز ۱۳۹۲ )
جلد ۱۰ شماره ۳ صفحات ۲۹۶-۲۸۹ |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Hashemi Tayer A, Amirizadeh N, Almasi Hashiani A, Kamravan M, Mohammadi M. A new fibrin sealant: hemostatics evaluation in the animal model. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2013; 10 (3) :289-296
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-798-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-798-fa.html
هاشمی طیر اکبر، امیری‌زاده ناصر، الماسی حشیانی امیر، کامروان مریم، محمدی محمد حسین. ارزیابی هموستاتیک چسب فیبرینی جدید در مدل حیوانی. فصلنامه پژوهشی خون. ۱۳۹۲; ۱۰ (۳) :۲۸۹-۲۹۶
دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی اراک
متن کامل [PDF 313 kb]
(۳۱۱۱ دریافت)
| چکیده (HTML) (8650 مشاهده)
مقدمه
از دست رفتن خون در حین جراحی بیمارانی که داروهای ضد انعقادی مصرف می‌کنند، به عنوان یک مشکل خاص قلمداد می‌شود(2، 1). در طی 20 سال گذشته عوامل هموستاتیک و چسب‌های بافتی متعددی به وجود آمده‌اند و در بسیاری از اعمال جراحی جهت کنترل خونریزی و ترمیم بافت‌های آسیب‌دیده کاربرد فراوانی دارند. نمونه‌ای از چسب‌های بافتی، چسب فیبرینی می‌باشد که به بافت چسبیده و محل بریده شده را می‌بندد. چسب فیبرینی فرآورده بیولوژیک مشتق از پلاسما است که جدا از جنبه هموستاتیک موضعی آن، اندیکاسیون‌های روزافزونی در رشته‌های مختلف جراحی پیدا کرده است و به طور گسترده‌ای در بیماران تحت عمل جراحی قلب باز که به نوعی نیازمند مصرف داروهای ضد انعقادی هستند و هم چنین در جراحی‌های کبدی استفاده می‌گردد(5-3). هپارین شایع‌ترین داروی ضد انعقاد مصرفی در چنین جراحی‌هایی می‌باشد و با غلظت خونی U/mL 3-2، خاصیت ضد انعقادی مطلوبی را در این موارد فراهم می‌کند(6). چسب فیبرینی از دو جزء اصلی فیبرینوژن و ترومبین تشکیل شده و مرحله نهایی آبشار طبیعی انعقاد را تقلید می‌کند. بدین صورت که با تاثیر ترومبین بر روی فیبرینوژن و دخالت فاکتور XIII ، لخته مستحکم و چسبنده‌ای تشکیل می‌شود. این فرآورده به صورت تجاری موجود بوده و یا می‌توان آن را در بانک خون از پلاسمای واحد انسانی به صورت اتولوگ یا همولوگ تهیه نمود. در نوع تجاری، کماکان معایبی هم چون خطر انتقال عوامل عفونی شناخته شده و ناشناخته علی‌رغم روش‌های مناسب ویروس‌زدایی وجود داشته، هم چنین هزینه‌های تولید آن بالا است و در بسیاری از کشورها مصرف محدودی دارد(7).
مزایای عمده چسب فیبرینی شامل تسریع هموستاز، تسریع ترمیم زخم، کاهش خونریزی از ناحیه جراحی، ایجاد انسجام بافتی مناسب و دفاع در مقابل عفونت‌های باکتریایی می‌باشد و نسبت به سایر چسب‌های سنتتیک، دارای مزایایی هم چون سازگاری بافتی، قابلیت جذب و عدم القای واکنش‌های التهابی و یا نکروز بافتی می‌باشد(9، 8). جهت تهیه چسب فیبرینی در بانک خون، از رسوب کرایو به طور مستقیم به عنوان منبع فیبرینوژن استفاده می‌شود و فیبرینوژن موجود توسط روش‌های رسوبی، با پروتامین سولفات بازیافت می‌گردد. در این روش تقریباً تمام فیبرینوژن موجود در پلاسما در مدت زمان کوتاهی رسوب می‌یابد. در برخی از کشورهای در حال توسعه، از ترومبین گاوی جهت تهیه چسب فیبرینی استفاده می‌شود. استفاده از ترومبین گاوی باعث واکنش‌های نامطلوب بافتی و عوارض خونریزی‌دهنده در گیرنده می‌گردد. لذا در سال‌های اخیر کوشش‌های فراوانی جهت تهیه ترومبین از پلاسمای انسانی صورت گرفته است. بدین منظور با فعال‌سازی روند انعقاد و رسوب پروتئین‌های پلاسما، ترومبین تشکیل شده جداسازی می‌شود(11، 10، 7). در این مطالعه بعد از تهیه چسب فیبرینی، کارآیی هموستاتیک آن در برش‌های خونریزی‌دهنده کبدی در مدل حیوانی خرگوش ارزیابی شد.
مواد و روش‌ها
تهیه چسب فیبرینی:
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. بعد از کسب رضایت اهداکنندگان داوطلب و به شرط نرمال بودن آزمایش‌های انعقادی PT (Prothrombin Time) و PTT (Partial Thromboplastin Time)، پلاسما با روش آفرزیس در ضد انعقاد سیترات سدیم 4% و با استفاده از دستگاه Hemonetics (آمریکا، PCS2 ، Hemonetics corporation)، در کیسه‌های سه تایی جمع‌آوری و در دمای ºC80- نگهداری شد. جهت تهیه ترومبین، پلاسما با ترکیبی از کلرید کلسیم 25 میلی‌مولار، اتانول خالص 9/99% و پودر شیشه مخلوط و بعد از لخته شدن پلاسما و سانتریفوژ کردن لوله، محلول رویی که حاوی ترومبین می‌باشد جمع‌آوری گردید. جهت تهیه فیبرینوژن نیز در ابتدا رسوب کرایو تهیه شد. بدین منظور کیسه پلاسما را در دمای ºC 4 ذوب نموده و رسوب کرایو ایجاد شده را به نسبت مساوی با پروتامین سولفات(آمریکا، سیگما) مخلوط و به مدت 10 دقیقه با دور rpm 3000 سانتریفوژ شد. بعد از خالی نمودن مایع رویی، رسوب فیبرینوژن حاصل در سیترات سدیم 2/0 مولار(4/7= pH)(آمریکا، سیگما) حل گردید و غلظت فیبرینوژن با استفاده از آزمایش الایزا(Assay Max Human Fibrinogen (FBG) ELISA Kit مورد ارزیابی قرار گرفت. در هنگام استفاده، کنسانتره‌های ترومبین و فیبرینوژن وارد دو سرنگ جداگانه شدند. هردو سرنگ به یک اپلیکاتور دو مجرایی با پلانگر مشترک متصل شده و باعث می‌شود که هر دو محلول با حجم یکسانی به موضع تزریق شده و در عرض چند ثانیه لخته چسبنده و محکمی تشکیل گردد.
مدل حیوانی:
در این آزمایش از 12 خرگوش(با وزن650 ± 3700 گرم) استفاده شد. خرگوش‌ها به طور تصادفی به دو گروه 6 تایی تقسیم شدند. حیوان با کمک اتر و تزریق داخل پریتوئن کتامین 10% (25 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم)(الفاسان، ایران) و دیازپام(5 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم)(الفاسان، ایران) کاملاً بیهوش شد و در وضعیت خوابیده به پشت قرار گرفت. با کمک تیغ بیستوری، برشی در ناحیه شکم داده شد و ارگان‌های داخلی در معرض قرار گرفتند. در یک گروه بعد از لاپاراتومی حیوان، ضد انعقاد هپارین(100 واحد در میلی‌لیتر) در وناکاوا تزریق شد تا غلظت خونی آن به حدود 2 الی 3 واحد در میلی‌لیتر برسد. قبل از ایجاد برش در ارگان‌های داخلی، مایعات حفره شکمی را به وسیله گاز استریل خشک نموده و سپس با استفاده از تیغ اسکالپل، دو برش به طول 5/0 ± 3 سانتی‌متر و عمق 1/0 ± 5/0 سانتی‌متر بر روی کبد زده شد و خونریزی به مدت 5 ثانیه جریان داشت. سپس محل برش‌ها را با گاز خشک نموده و بر روی یکی از برش‌ها مقدار 2 میلی‌لیتر چسب فیبرینی با استفاده از دو سرنگ با نیدل مشترک استفاده شد و زمان متوقف شدن خونریزی ثبت گردید.
میزان از دست رفتن خون از طریق جذب خون توسط گازهای استریل از قبل توزین شده، بدون این که گاز با زخم تماس پیدا کند محاسبه شد. جهت جلوگیری از تبخیر گازهای آغشته به خون از فاصله زمانی جذب تا توزین، آن‌ها را در کیسه‌های پلاستیکی زیپ‌دار نگهداری نموده و این کار تا زمانی ادامه داشت که گاز توسط خون رنگی نشود. زمان خونریزی به عنوان فاصله زمانی از کاربرد چسب فیبرینی در محل برش تا زمانی که گازها رنگی نشوند ثبت گردید. در پایان کار، نمونه‌ای از خون حیوان از طریق قلب گرفته شد و جهت آنالیز خونی از دستگاه شمارنده سلولی خودکار استفاده شد(سیس‌مکس، آمریکا). تجزیه و تحلیل اطلاعات با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 16 و آزمون‌های آماری کولموگروف اسمیرنوف، ANOVA و آزمون تکمیلی توکی انجام شد. 05/0 p< سطح معنادار انتخاب شد.
یافته‌ها
با توجه به این که از هر کیسه پلاسما تقریباً mL 4 کنسانتره فیبرینوژن استحصال می‌گردد، غلظت فیبرینوژن اندازه‌گیری شده با روش الایزا در حدود mg/mL 6 ± 71 تعیین شد، بنابراین مقدار فیبرینوژن تام در کنسانتره فیبرینوژن تقریباً mg 284 در mL 4 می‌باشد. قابلیت عملکردی فیبرینوژن حاصل خوب بوده و در محیط آزمایشگاه در حضور ترومبین در مدت زمان حدود 6/0 ± 5 ثانیه، لخته تشکیل شد(جدول 1).
با استفاده از چسب فیبرینی در برش‌های ایجاد شده بر روی کبد حیوان، در مدت زمان کوتاهی برش مورد نظر مسدود و زمان خونریزی کاهش یافت(شکل 1). کارآیی هموستاتیک چسب فیبرینی در کنترل زمان خونریزی و میزان خون از دست رفته در 4 برش ایجاد شده در مدل حیوانی خرگوش به صورت A: خرگوش غیر هپارینه به همراه چسب فیبرینی، B: خرگوش غیر هپارینه بدون چسب، C: خرگوش هپارینه به همراه چسب فیبرینی و D: خرگوش هپارینه بدون چسب ارزیابی شد(نمودارهای 1 و 2).
استفاده از چسب فیبرینی در برش‌های ایجاد شده بر روی کبد خرگوش غیر هپارینه نسبت به برش‌های مقایسه‌ای، میزان خونریزی را به طور قابل توجهی کاهش داد(001/0 p<). هم چنین زمان خونریزی و حجم خون از دست رفته در خرگوش هپارینه نسبت به برش کنترلی در همان گروه به دنبال استفاده از چسب فیبرینی به طور قابل ملاحظه‌ای کاهش یافت(001/0 p<). هر چند که استفاده از چسب فیبرینی میزان از دست رفتن خون و زمان خونریـزی را در هر دو گروه هپارینه و غیر هپارینه، نسبت به زخم‌هـای کنتـرل بـه طـور قابـل تـوجهی کاهش می‌داد(001/0 p<)، اما در گروه هپارینه نسبت به غیـر هپارینـه تنهـا افزایش مختصری وجود داشته و از نظر آمـاری تفـاوت معنـاداری بیـن دو گروه مشاهده نشد.
جدول 1: شمارش تام خون خرگوش‌ها بعد از لاپاراتومی حیوان، نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است.
شکل 1: ارزیابی هموستاتیک چسب فیبرینی در مدل حیوانی خرگوش. A: ایجاد دو برش در کبد و استفاده از چسب بر روی یکی از برش‌ها، B: مسدود شدن برش مورد نظر و متوقف شدن خونریزی در مقایسه با برش کنترل.
نمودار 1: تاثیر چسب فیبرینی بر زمان خونریزی در 4 برش A: غیر هپارینه به همراه چسب فیبرینی(04/2 ± 8.8 ثانیه)، B: غیر هپارینه بدون چسب فیبرینی(8/96 ± 3/643)، C: هپارینه به همراه چسب فیبرینی(9/17 ± 6/102) و D: هپارینه بدون چسب فیبرینی(5/73 ± 6/848)
نمودار 2: تاثیر چسب فیبرینی بر میزان خون از دست رفته در 4 برش ایجاد شده بر روی کبد حیوان.
A (4/0 ± 05/1 گرم)، B (2/1 ± 9/6)، C (3/0 ± 9/1)، D (9/0 ± 1/10)
متن کامل: (۳۷۴۷ مشاهده)
ارزیابی هموستاتیک چسب فیبرینی جدید در مدل حیوانی
اکبر هاشمی طیر1، ناصر امیری‌زاده2، امیر الماسی حشیانی3، مریم کامروان4، محمد حسین محمدی5
چکیده
سابقه و هدف
چسب‌های فیبرینی به طور گسترده‌ای جهت کاهش خونریزی در اعمال جراحی استفاده می‌گردند. هدف این مطالعه، تهیه چسب فیبرینی از ترومبین و فیبرینوژن و بررسی کارایی هموستاتیک چسب فیبرینی در مدل حیوانی خرگوش بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه تجربی، پلاسما به روش آفرزیس تهیه شد. فیبرینوژن با ترکیب کرایوپرسیپیتات و پروتامین سولفات استحصال و غلظت آن با روش الایزا اندازه‌گیری شد. چسب فیبرینی در برش‌های کبدی حیوان استفاده و زمان خونریزی و میزان خون از دست رفته اندازه‌گیری شد. هم چنین زمان خونریزی و میزان خون از دست رفته در خرگوش‌های هپارینه تعیین گردید.
یافته‌ها
غلظت فیبرینوژن رسوب داده شده با پروتامین سولفات mg/mL 6 ± 71 اندازه‌گیری شد. زمان تشکیل لخته فیبرینوژن با ترومبین 6/0 ± 5 ثانیه بود. استفاده از چسب فیبرینی در برش‌های کبدی خرگوش، زمان خونریزی (2 ± 8/8 ثانیه) و از دست دادن خون (4/0± 05/1 گرم) را در مقایسه با برش‌های کنترلی(96 ± 643 ثانیه، 2/1 ± 9/6 گرم) به طور قابل توجهی کاهش داد(001/0 p<). اگر چه میزان خون از دست رفته و زمان خونریزی در خرگوش‌های هپارینه نسبت به غیر هپارینه افزایش داشت اما از نظر آماری معنادار نبود.
نتیجه گیری
چسب فیبرینی تهیه شده از رسوب فیبرینوژن و ترومبین، یک رویکرد درمانی جدید را برای تهیه چسب فیبرینی جهت استفاده در بالین مطرح می‌کند.
کلمات کلیدی: مدل حیوانی، چسب فیبرینی، هموستاتیک
تاریخ دریافت : 10/5/91
تاریخ پذیرش : 1 /8/91
1ـ مؤلف مسؤول: کارشناس ارشد هماتولوژی ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی اراک ـ اراک ـ ایران ـ صندوق پستی: 72334-12456
2- PhD هماتولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- کارشناس ارشد اپیدمیولوژی ـ دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی اراک ـ اراک ـ ایران
4- کارشناس پرستاری ـ دانشگاه علوم پزشکی اراک ـ اراک ـ ایران
5- دانشجوی PhD هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
اکبر هاشمی طیر1، ناصر امیری‌زاده2، امیر الماسی حشیانی3، مریم کامروان4، محمد حسین محمدی5
چکیده
سابقه و هدف
چسب‌های فیبرینی به طور گسترده‌ای جهت کاهش خونریزی در اعمال جراحی استفاده می‌گردند. هدف این مطالعه، تهیه چسب فیبرینی از ترومبین و فیبرینوژن و بررسی کارایی هموستاتیک چسب فیبرینی در مدل حیوانی خرگوش بود.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه تجربی، پلاسما به روش آفرزیس تهیه شد. فیبرینوژن با ترکیب کرایوپرسیپیتات و پروتامین سولفات استحصال و غلظت آن با روش الایزا اندازه‌گیری شد. چسب فیبرینی در برش‌های کبدی حیوان استفاده و زمان خونریزی و میزان خون از دست رفته اندازه‌گیری شد. هم چنین زمان خونریزی و میزان خون از دست رفته در خرگوش‌های هپارینه تعیین گردید.
یافته‌ها
غلظت فیبرینوژن رسوب داده شده با پروتامین سولفات mg/mL 6 ± 71 اندازه‌گیری شد. زمان تشکیل لخته فیبرینوژن با ترومبین 6/0 ± 5 ثانیه بود. استفاده از چسب فیبرینی در برش‌های کبدی خرگوش، زمان خونریزی (2 ± 8/8 ثانیه) و از دست دادن خون (4/0± 05/1 گرم) را در مقایسه با برش‌های کنترلی(96 ± 643 ثانیه، 2/1 ± 9/6 گرم) به طور قابل توجهی کاهش داد(001/0 p<). اگر چه میزان خون از دست رفته و زمان خونریزی در خرگوش‌های هپارینه نسبت به غیر هپارینه افزایش داشت اما از نظر آماری معنادار نبود.
نتیجه گیری
چسب فیبرینی تهیه شده از رسوب فیبرینوژن و ترومبین، یک رویکرد درمانی جدید را برای تهیه چسب فیبرینی جهت استفاده در بالین مطرح می‌کند.
کلمات کلیدی: مدل حیوانی، چسب فیبرینی، هموستاتیک
تاریخ دریافت : 10/5/91
تاریخ پذیرش : 1 /8/91
 |
1ـ مؤلف مسؤول: کارشناس ارشد هماتولوژی ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی اراک ـ اراک ـ ایران ـ صندوق پستی: 72334-12456
2- PhD هماتولوژی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- کارشناس ارشد اپیدمیولوژی ـ دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی اراک ـ اراک ـ ایران
4- کارشناس پرستاری ـ دانشگاه علوم پزشکی اراک ـ اراک ـ ایران
5- دانشجوی PhD هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
مقدمه
از دست رفتن خون در حین جراحی بیمارانی که داروهای ضد انعقادی مصرف می‌کنند، به عنوان یک مشکل خاص قلمداد می‌شود(2، 1). در طی 20 سال گذشته عوامل هموستاتیک و چسب‌های بافتی متعددی به وجود آمده‌اند و در بسیاری از اعمال جراحی جهت کنترل خونریزی و ترمیم بافت‌های آسیب‌دیده کاربرد فراوانی دارند. نمونه‌ای از چسب‌های بافتی، چسب فیبرینی می‌باشد که به بافت چسبیده و محل بریده شده را می‌بندد. چسب فیبرینی فرآورده بیولوژیک مشتق از پلاسما است که جدا از جنبه هموستاتیک موضعی آن، اندیکاسیون‌های روزافزونی در رشته‌های مختلف جراحی پیدا کرده است و به طور گسترده‌ای در بیماران تحت عمل جراحی قلب باز که به نوعی نیازمند مصرف داروهای ضد انعقادی هستند و هم چنین در جراحی‌های کبدی استفاده می‌گردد(5-3). هپارین شایع‌ترین داروی ضد انعقاد مصرفی در چنین جراحی‌هایی می‌باشد و با غلظت خونی U/mL 3-2، خاصیت ضد انعقادی مطلوبی را در این موارد فراهم می‌کند(6). چسب فیبرینی از دو جزء اصلی فیبرینوژن و ترومبین تشکیل شده و مرحله نهایی آبشار طبیعی انعقاد را تقلید می‌کند. بدین صورت که با تاثیر ترومبین بر روی فیبرینوژن و دخالت فاکتور XIII ، لخته مستحکم و چسبنده‌ای تشکیل می‌شود. این فرآورده به صورت تجاری موجود بوده و یا می‌توان آن را در بانک خون از پلاسمای واحد انسانی به صورت اتولوگ یا همولوگ تهیه نمود. در نوع تجاری، کماکان معایبی هم چون خطر انتقال عوامل عفونی شناخته شده و ناشناخته علی‌رغم روش‌های مناسب ویروس‌زدایی وجود داشته، هم چنین هزینه‌های تولید آن بالا است و در بسیاری از کشورها مصرف محدودی دارد(7).
مزایای عمده چسب فیبرینی شامل تسریع هموستاز، تسریع ترمیم زخم، کاهش خونریزی از ناحیه جراحی، ایجاد انسجام بافتی مناسب و دفاع در مقابل عفونت‌های باکتریایی می‌باشد و نسبت به سایر چسب‌های سنتتیک، دارای مزایایی هم چون سازگاری بافتی، قابلیت جذب و عدم القای واکنش‌های التهابی و یا نکروز بافتی می‌باشد(9، 8). جهت تهیه چسب فیبرینی در بانک خون، از رسوب کرایو به طور مستقیم به عنوان منبع فیبرینوژن استفاده می‌شود و فیبرینوژن موجود توسط روش‌های رسوبی، با پروتامین سولفات بازیافت می‌گردد. در این روش تقریباً تمام فیبرینوژن موجود در پلاسما در مدت زمان کوتاهی رسوب می‌یابد. در برخی از کشورهای در حال توسعه، از ترومبین گاوی جهت تهیه چسب فیبرینی استفاده می‌شود. استفاده از ترومبین گاوی باعث واکنش‌های نامطلوب بافتی و عوارض خونریزی‌دهنده در گیرنده می‌گردد. لذا در سال‌های اخیر کوشش‌های فراوانی جهت تهیه ترومبین از پلاسمای انسانی صورت گرفته است. بدین منظور با فعال‌سازی روند انعقاد و رسوب پروتئین‌های پلاسما، ترومبین تشکیل شده جداسازی می‌شود(11، 10، 7). در این مطالعه بعد از تهیه چسب فیبرینی، کارآیی هموستاتیک آن در برش‌های خونریزی‌دهنده کبدی در مدل حیوانی خرگوش ارزیابی شد.
مواد و روش‌ها
تهیه چسب فیبرینی:
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. بعد از کسب رضایت اهداکنندگان داوطلب و به شرط نرمال بودن آزمایش‌های انعقادی PT (Prothrombin Time) و PTT (Partial Thromboplastin Time)، پلاسما با روش آفرزیس در ضد انعقاد سیترات سدیم 4% و با استفاده از دستگاه Hemonetics (آمریکا، PCS2 ، Hemonetics corporation)، در کیسه‌های سه تایی جمع‌آوری و در دمای ºC80- نگهداری شد. جهت تهیه ترومبین، پلاسما با ترکیبی از کلرید کلسیم 25 میلی‌مولار، اتانول خالص 9/99% و پودر شیشه مخلوط و بعد از لخته شدن پلاسما و سانتریفوژ کردن لوله، محلول رویی که حاوی ترومبین می‌باشد جمع‌آوری گردید. جهت تهیه فیبرینوژن نیز در ابتدا رسوب کرایو تهیه شد. بدین منظور کیسه پلاسما را در دمای ºC 4 ذوب نموده و رسوب کرایو ایجاد شده را به نسبت مساوی با پروتامین سولفات(آمریکا، سیگما) مخلوط و به مدت 10 دقیقه با دور rpm 3000 سانتریفوژ شد. بعد از خالی نمودن مایع رویی، رسوب فیبرینوژن حاصل در سیترات سدیم 2/0 مولار(4/7= pH)(آمریکا، سیگما) حل گردید و غلظت فیبرینوژن با استفاده از آزمایش الایزا(Assay Max Human Fibrinogen (FBG) ELISA Kit مورد ارزیابی قرار گرفت. در هنگام استفاده، کنسانتره‌های ترومبین و فیبرینوژن وارد دو سرنگ جداگانه شدند. هردو سرنگ به یک اپلیکاتور دو مجرایی با پلانگر مشترک متصل شده و باعث می‌شود که هر دو محلول با حجم یکسانی به موضع تزریق شده و در عرض چند ثانیه لخته چسبنده و محکمی تشکیل گردد.
مدل حیوانی:
در این آزمایش از 12 خرگوش(با وزن650 ± 3700 گرم) استفاده شد. خرگوش‌ها به طور تصادفی به دو گروه 6 تایی تقسیم شدند. حیوان با کمک اتر و تزریق داخل پریتوئن کتامین 10% (25 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم)(الفاسان، ایران) و دیازپام(5 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم)(الفاسان، ایران) کاملاً بیهوش شد و در وضعیت خوابیده به پشت قرار گرفت. با کمک تیغ بیستوری، برشی در ناحیه شکم داده شد و ارگان‌های داخلی در معرض قرار گرفتند. در یک گروه بعد از لاپاراتومی حیوان، ضد انعقاد هپارین(100 واحد در میلی‌لیتر) در وناکاوا تزریق شد تا غلظت خونی آن به حدود 2 الی 3 واحد در میلی‌لیتر برسد. قبل از ایجاد برش در ارگان‌های داخلی، مایعات حفره شکمی را به وسیله گاز استریل خشک نموده و سپس با استفاده از تیغ اسکالپل، دو برش به طول 5/0 ± 3 سانتی‌متر و عمق 1/0 ± 5/0 سانتی‌متر بر روی کبد زده شد و خونریزی به مدت 5 ثانیه جریان داشت. سپس محل برش‌ها را با گاز خشک نموده و بر روی یکی از برش‌ها مقدار 2 میلی‌لیتر چسب فیبرینی با استفاده از دو سرنگ با نیدل مشترک استفاده شد و زمان متوقف شدن خونریزی ثبت گردید.
میزان از دست رفتن خون از طریق جذب خون توسط گازهای استریل از قبل توزین شده، بدون این که گاز با زخم تماس پیدا کند محاسبه شد. جهت جلوگیری از تبخیر گازهای آغشته به خون از فاصله زمانی جذب تا توزین، آن‌ها را در کیسه‌های پلاستیکی زیپ‌دار نگهداری نموده و این کار تا زمانی ادامه داشت که گاز توسط خون رنگی نشود. زمان خونریزی به عنوان فاصله زمانی از کاربرد چسب فیبرینی در محل برش تا زمانی که گازها رنگی نشوند ثبت گردید. در پایان کار، نمونه‌ای از خون حیوان از طریق قلب گرفته شد و جهت آنالیز خونی از دستگاه شمارنده سلولی خودکار استفاده شد(سیس‌مکس، آمریکا). تجزیه و تحلیل اطلاعات با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 16 و آزمون‌های آماری کولموگروف اسمیرنوف، ANOVA و آزمون تکمیلی توکی انجام شد. 05/0 p< سطح معنادار انتخاب شد.
یافته‌ها
با توجه به این که از هر کیسه پلاسما تقریباً mL 4 کنسانتره فیبرینوژن استحصال می‌گردد، غلظت فیبرینوژن اندازه‌گیری شده با روش الایزا در حدود mg/mL 6 ± 71 تعیین شد، بنابراین مقدار فیبرینوژن تام در کنسانتره فیبرینوژن تقریباً mg 284 در mL 4 می‌باشد. قابلیت عملکردی فیبرینوژن حاصل خوب بوده و در محیط آزمایشگاه در حضور ترومبین در مدت زمان حدود 6/0 ± 5 ثانیه، لخته تشکیل شد(جدول 1).
با استفاده از چسب فیبرینی در برش‌های ایجاد شده بر روی کبد حیوان، در مدت زمان کوتاهی برش مورد نظر مسدود و زمان خونریزی کاهش یافت(شکل 1). کارآیی هموستاتیک چسب فیبرینی در کنترل زمان خونریزی و میزان خون از دست رفته در 4 برش ایجاد شده در مدل حیوانی خرگوش به صورت A: خرگوش غیر هپارینه به همراه چسب فیبرینی، B: خرگوش غیر هپارینه بدون چسب، C: خرگوش هپارینه به همراه چسب فیبرینی و D: خرگوش هپارینه بدون چسب ارزیابی شد(نمودارهای 1 و 2).
استفاده از چسب فیبرینی در برش‌های ایجاد شده بر روی کبد خرگوش غیر هپارینه نسبت به برش‌های مقایسه‌ای، میزان خونریزی را به طور قابل توجهی کاهش داد(001/0 p<). هم چنین زمان خونریزی و حجم خون از دست رفته در خرگوش هپارینه نسبت به برش کنترلی در همان گروه به دنبال استفاده از چسب فیبرینی به طور قابل ملاحظه‌ای کاهش یافت(001/0 p<). هر چند که استفاده از چسب فیبرینی میزان از دست رفتن خون و زمان خونریـزی را در هر دو گروه هپارینه و غیر هپارینه، نسبت به زخم‌هـای کنتـرل بـه طـور قابـل تـوجهی کاهش می‌داد(001/0 p<)، اما در گروه هپارینه نسبت به غیـر هپارینـه تنهـا افزایش مختصری وجود داشته و از نظر آمـاری تفـاوت معنـاداری بیـن دو گروه مشاهده نشد.
جدول 1: شمارش تام خون خرگوش‌ها بعد از لاپاراتومی حیوان، نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است.
| پارامترها | مقادیر |
| گلبول‌های قرمز(/L 109 * ) | 4/1 ± 2/5 |
| گلبول‌های سفید(/L 109 * ) | 9/1 ± 1/7 |
| ترومبوسیت‌ها(/L 109 * ) | 110 ± 350 |
| هموگلوبین(g/dL) | 3/2 ± 1/12 |
| هماتوکریت(%) | 1/6 ± 40 |
شکل 1: ارزیابی هموستاتیک چسب فیبرینی در مدل حیوانی خرگوش. A: ایجاد دو برش در کبد و استفاده از چسب بر روی یکی از برش‌ها، B: مسدود شدن برش مورد نظر و متوقف شدن خونریزی در مقایسه با برش کنترل.
نمودار 1: تاثیر چسب فیبرینی بر زمان خونریزی در 4 برش A: غیر هپارینه به همراه چسب فیبرینی(04/2 ± 8.8 ثانیه)، B: غیر هپارینه بدون چسب فیبرینی(8/96 ± 3/643)، C: هپارینه به همراه چسب فیبرینی(9/17 ± 6/102) و D: هپارینه بدون چسب فیبرینی(5/73 ± 6/848)
نمودار 2: تاثیر چسب فیبرینی بر میزان خون از دست رفته در 4 برش ایجاد شده بر روی کبد حیوان.
A (4/0 ± 05/1 گرم)، B (2/1 ± 9/6)، C (3/0 ± 9/1)، D (9/0 ± 1/10)
بحث
هدف از این مطالعه، ارزیابی کارایی هموستاتیک چسب فیبرینی تهیه شده از پلاسمای واحد انسانی در مدل حیوانی خرگوش بود. در مطالعه حاضر جهت استحصال فیبرینوژن از کرایوپرسیپیتات، از روش رسوبی پروتامین سولفات استفاده شد. در مطالعه امیری‌زاده و همکاران نشان داده شده که با روش رسوبی پروتامین سولفات، می‌توان تا میزان 93% فیبرینوژن موجود در کرایو را استحصال نمود(7). قابلیت عملکردی فیبرینوژن حاصل از این روش خوب بوده و در حضور ترومبین در مدت زمان حدود 6/0± 5 ثانیه، لخته تشکیل شد. جهت بررسی غلظت فیبرینوژن، از آزمایش الایزا استفاده شد و غلظت فیبرینوژن در حدود mg/mL 6 ±71 اندازه‌گیری گردید که در مقایسه با سایر مطالعه‌ها، بیانگر فعالیت مناسب انعقادی فیبرینوژن با این روش می‌باشد. روش تهیه ترومبین نیز ساده بوده و تنها به کمتر از 30 دقیقه زمان نیاز دارد(14-12، 6). نشان داده شده که ترومبین تولیدی با روش دستی، فعالیت مناسبی برای تشکیل لخته و تولید کافی فیبرین دارد و به مدت 6 ساعت در دمای ºC4 و بیش از سه ماه در دمای ºC20- پایدار می‌باشد(13، 11، 7). در رویکرد آماده‌سازی چسب فیبرینی تهیه شده در بانک خون، تقریباً نیمی از فاکتور XIII موجود در کرایو با
روش رسوبی پروتامین سولفات بازیافت می‌شود در حالی که در چسب‌های تجاری تهیه شده از پلاسماهای پولد شده، طی روش‌های غیر فعال‌سازی ویروس‌ها، مقدار زیادی از فاکتور XIII تخریب می‌شود. فاکتور XIII به همراه یون کلسیم که کوفاکتور آنزیم می‌باشد، به عنوان اتصال‌دهنده متقاطع منومرهای نامحلول فیبرینی شناخته شده و در سرعت بخشیدن به تشکیل یک ساختار هموستاتیک مؤثر نقش مهمی را ایفا می‌کند(15، 10). چسب فیبرینی اتولوگ تهیه شده در بانک خون نسبت به سایر چسب‌های تجاری، سهل‌الوصول‌تر و کم هزینه‌تر است و خطر کمتری برای انتقال عوامل عفونی و ازدیاد حساسیت آلرژیک را فراهم می‌کند(13). استفاده از چسب فیبرینی در مدل حیوانی خرگوش در هر دو گروه هپارینه و غیر هپارینه، میزان از دست رفتن خون و زمان خونریزی را نسبت به زخم‌های کنترل به طور قابل توجهی کاهش داد. استفاده از چسب فیبرینی در خرگوش‌های غیر هپارینه، باعث فعال شدن لخته در محل برش می‌شود و با همکاری سیستم انعقاد طبیعی حیوان، میزان از دست رفتن خون از محل برش و زمان خونریزی را کاهش می‌دهد. اما در خرگوش‌های هپارینه، عملکرد طبیعی انعقاد با هپارین مهار شده و این با افزایش زمان خونریزی و حجم خون از دست رفته همراه است. هپارین با تقویت عملکرد آنتی‌ترومبین، از فعال شدن ترومبین و تشکیل لخته جلوگیری می‌کند(15، 14). افزایش از دست رفتن خون و زمان خونریزی در گروه هپارینه نسبت به گروه غیر هپارینه، مؤید این قضیه است که سیستم انعقاد طبیعی حیوان در کاهش حجم خون از دست رفته و زمان خونریزی نقش ویژه‌ای دارد.
اگر چه میزان از دست رفتن خون و زمان خونریزی در گروه هپارینه نسبت به گروه غیر هپارینه افزایش مختصری داشت، اما از نظر آماری تفاوت معناداری بین دو گروه مشاهده نشد. این یافته با مطالعه آلستون و همکارانش در تناقض است(6). در مطالعه ذکر شده، تاثیر هموستاتیک چسب فیبرینی بر روی برش‌های ایجاد شده در کلیه رت بررسی شد و بین زمان خونریزی در رت‌های هپارینه در مقایسه با رت‌های غیر هپارینه تفاوت آماری معناداری وجود داشت.
هر چند که ضد انعقاد هپارین در خرگوش‌های هپارینه باعث طولانی شدن زمان خونریزی می‌گردد اما مقدار دقیق ضد انعقاد موجود در گردش خون حیوان قابل اندازه‌گیری نبوده و این یکی از محدودیت‌های این مطالعه بود. در این زمینه مطالعه‌های بیشتری مورد نیاز است تا عملکرد چسب فیبرینی در حضور داروهای مهارکننده پلاکتی نظیر آسپرین و هم چنین عواملی که گیرنده‌های پلاکتی را مهار می‌کنند نظیر کلوپیدوگرل(مهارکننده گیرنده P2Y12) ارزیابی گردد.
از آن جایی که استفاده از چسب فیبرینی زمان
خونریزی و حجـم خون از دست رفتـه از برش‌های ایجاد
شده در خرگوش‌های هپارینه را کاهش می‌دهد، بنابراین می‌توان از این ترکیب در کنترل خونریزی در بیمارانی که به دلایلی نیازمند درمان ضد انعقادی هستند استفاده نمود. هرچند که ممکن است مقادیر باقی‌مانده هپارین در سیستم گردش خون به علت خنثی‌سازی ناکافی ضد انعقاد توسط پروتامین یا به علت واکنش هپارین به دنبال بای‌پس قلبی- عروقی منجر به خونریزی ناخواسته از محل بخیه گردد.
نتیجه‌گیری
چسب فیبرینی اتولوگ تهیه شده از اجزای ترومبین و فیبرینوژن رسوب داده شده با پروتامین سولفات، به عنوان یک رویکرد درمانی جدید در بیماران مصرف‌کننده داروهای ضد انعقادی مطرح می‌باشد و می‌توان از این فرآورده به عنوان یک عامل هموستاتیک مؤثر در کنترل خونریزی حین یا بعد از اعمال جراحی استفاده نمود. هر چند که داده‌های موجود در این زمینه ناکافی بوده و لزوم انجام مطالعه‌های بیشتر در این زمینه را مطرح می‌نماید.
تشکروقدردانی
بدین‌وسیله نویسندگان مقاله بر خود لازم می‌دانند تا از همکاری معاون محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک در تامین هزینه و اجرای این طرح تحقیقاتی تشکر و قدردانی نمایند.
هدف از این مطالعه، ارزیابی کارایی هموستاتیک چسب فیبرینی تهیه شده از پلاسمای واحد انسانی در مدل حیوانی خرگوش بود. در مطالعه حاضر جهت استحصال فیبرینوژن از کرایوپرسیپیتات، از روش رسوبی پروتامین سولفات استفاده شد. در مطالعه امیری‌زاده و همکاران نشان داده شده که با روش رسوبی پروتامین سولفات، می‌توان تا میزان 93% فیبرینوژن موجود در کرایو را استحصال نمود(7). قابلیت عملکردی فیبرینوژن حاصل از این روش خوب بوده و در حضور ترومبین در مدت زمان حدود 6/0± 5 ثانیه، لخته تشکیل شد. جهت بررسی غلظت فیبرینوژن، از آزمایش الایزا استفاده شد و غلظت فیبرینوژن در حدود mg/mL 6 ±71 اندازه‌گیری گردید که در مقایسه با سایر مطالعه‌ها، بیانگر فعالیت مناسب انعقادی فیبرینوژن با این روش می‌باشد. روش تهیه ترومبین نیز ساده بوده و تنها به کمتر از 30 دقیقه زمان نیاز دارد(14-12، 6). نشان داده شده که ترومبین تولیدی با روش دستی، فعالیت مناسبی برای تشکیل لخته و تولید کافی فیبرین دارد و به مدت 6 ساعت در دمای ºC4 و بیش از سه ماه در دمای ºC20- پایدار می‌باشد(13، 11، 7). در رویکرد آماده‌سازی چسب فیبرینی تهیه شده در بانک خون، تقریباً نیمی از فاکتور XIII موجود در کرایو با
روش رسوبی پروتامین سولفات بازیافت می‌شود در حالی که در چسب‌های تجاری تهیه شده از پلاسماهای پولد شده، طی روش‌های غیر فعال‌سازی ویروس‌ها، مقدار زیادی از فاکتور XIII تخریب می‌شود. فاکتور XIII به همراه یون کلسیم که کوفاکتور آنزیم می‌باشد، به عنوان اتصال‌دهنده متقاطع منومرهای نامحلول فیبرینی شناخته شده و در سرعت بخشیدن به تشکیل یک ساختار هموستاتیک مؤثر نقش مهمی را ایفا می‌کند(15، 10). چسب فیبرینی اتولوگ تهیه شده در بانک خون نسبت به سایر چسب‌های تجاری، سهل‌الوصول‌تر و کم هزینه‌تر است و خطر کمتری برای انتقال عوامل عفونی و ازدیاد حساسیت آلرژیک را فراهم می‌کند(13). استفاده از چسب فیبرینی در مدل حیوانی خرگوش در هر دو گروه هپارینه و غیر هپارینه، میزان از دست رفتن خون و زمان خونریزی را نسبت به زخم‌های کنترل به طور قابل توجهی کاهش داد. استفاده از چسب فیبرینی در خرگوش‌های غیر هپارینه، باعث فعال شدن لخته در محل برش می‌شود و با همکاری سیستم انعقاد طبیعی حیوان، میزان از دست رفتن خون از محل برش و زمان خونریزی را کاهش می‌دهد. اما در خرگوش‌های هپارینه، عملکرد طبیعی انعقاد با هپارین مهار شده و این با افزایش زمان خونریزی و حجم خون از دست رفته همراه است. هپارین با تقویت عملکرد آنتی‌ترومبین، از فعال شدن ترومبین و تشکیل لخته جلوگیری می‌کند(15، 14). افزایش از دست رفتن خون و زمان خونریزی در گروه هپارینه نسبت به گروه غیر هپارینه، مؤید این قضیه است که سیستم انعقاد طبیعی حیوان در کاهش حجم خون از دست رفته و زمان خونریزی نقش ویژه‌ای دارد.
اگر چه میزان از دست رفتن خون و زمان خونریزی در گروه هپارینه نسبت به گروه غیر هپارینه افزایش مختصری داشت، اما از نظر آماری تفاوت معناداری بین دو گروه مشاهده نشد. این یافته با مطالعه آلستون و همکارانش در تناقض است(6). در مطالعه ذکر شده، تاثیر هموستاتیک چسب فیبرینی بر روی برش‌های ایجاد شده در کلیه رت بررسی شد و بین زمان خونریزی در رت‌های هپارینه در مقایسه با رت‌های غیر هپارینه تفاوت آماری معناداری وجود داشت.
هر چند که ضد انعقاد هپارین در خرگوش‌های هپارینه باعث طولانی شدن زمان خونریزی می‌گردد اما مقدار دقیق ضد انعقاد موجود در گردش خون حیوان قابل اندازه‌گیری نبوده و این یکی از محدودیت‌های این مطالعه بود. در این زمینه مطالعه‌های بیشتری مورد نیاز است تا عملکرد چسب فیبرینی در حضور داروهای مهارکننده پلاکتی نظیر آسپرین و هم چنین عواملی که گیرنده‌های پلاکتی را مهار می‌کنند نظیر کلوپیدوگرل(مهارکننده گیرنده P2Y12) ارزیابی گردد.
از آن جایی که استفاده از چسب فیبرینی زمان
خونریزی و حجـم خون از دست رفتـه از برش‌های ایجاد
شده در خرگوش‌های هپارینه را کاهش می‌دهد، بنابراین می‌توان از این ترکیب در کنترل خونریزی در بیمارانی که به دلایلی نیازمند درمان ضد انعقادی هستند استفاده نمود. هرچند که ممکن است مقادیر باقی‌مانده هپارین در سیستم گردش خون به علت خنثی‌سازی ناکافی ضد انعقاد توسط پروتامین یا به علت واکنش هپارین به دنبال بای‌پس قلبی- عروقی منجر به خونریزی ناخواسته از محل بخیه گردد.
نتیجه‌گیری
چسب فیبرینی اتولوگ تهیه شده از اجزای ترومبین و فیبرینوژن رسوب داده شده با پروتامین سولفات، به عنوان یک رویکرد درمانی جدید در بیماران مصرف‌کننده داروهای ضد انعقادی مطرح می‌باشد و می‌توان از این فرآورده به عنوان یک عامل هموستاتیک مؤثر در کنترل خونریزی حین یا بعد از اعمال جراحی استفاده نمود. هر چند که داده‌های موجود در این زمینه ناکافی بوده و لزوم انجام مطالعه‌های بیشتر در این زمینه را مطرح می‌نماید.
تشکروقدردانی
بدین‌وسیله نویسندگان مقاله بر خود لازم می‌دانند تا از همکاری معاون محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک در تامین هزینه و اجرای این طرح تحقیقاتی تشکر و قدردانی نمایند.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
