|
پیش شرطی کردن سلولهای بنیادی مزانشیمال با غلظت‌های بهینه H2O2 به منظور افزایش بقای سلولی و افزایش مقاومت در برابر استرس‌های اکسیداتیو
|
حامد بشیری نهنجی   ، مهریار حبیبی رودکنار ، راحله حلبیان ، مهدی جلیلی ، محمد علی جلیلی* |
| استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون |
|
| واژه‌های کلیدی: H2O2، پیش شرطی کردن ایسکمیک، آپوپتوز، سلولهای استرومال مزانشیمی چند قوه |
|
|
متن کامل [PDF 523 kb]
(2209 دریافت)
| چکیده (HTML) (12579 مشاهده)
|
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
سلولهاي بنيادي
انتشار: 1392/7/15
|
|
|
|
|
|
|
متن کامل: (1817 مشاهده) |
پیش شرطی کردن سلولهای بنیادی مزانشیمال با غلظت‌های بهینه H2O2
به منظور افزایش بقای سلولی و افزایش مقاومت در برابر استرس‌های اکسیداتیو
حامدبشیری نهنجی1، مهریارحبیبی رودکنار2، راحله حلبیان3، مهدی جلیلی4، محمدعلی جلیلی5
چکیده
سابقه و هدف
مطالعه‌ها بر روی سلولهای مزانشیمال پیوندی نشان داده‌اند که شرایط نامساعد محیط بافت از جمله حضور رادیکال‌های آزاد اکسیژن و سایتوکاین‌های التهابی، قسمت اعظم آن‌ها را در روزهای ابتدایی پس از پیوند از بین میبرد. به منظور رفع این مشکل، در این مطالعه اثر پیش‌شرطی کردن سلولهای مزانشیمال با H2O2 به منظور افزایش مقاومت آن‌ها در برابر شرایط اکسیداتیو کشنده بررسی شد.
مواد و روش‌ها
در یک مطالعه تجربی، سلول بنیادی مزانشیمی مغز استخوان با استفاده از فایکول جداسازی و پاساژ چهارم انتخاب شد. سلولهای پاساژ چهارم با غلظت‌های مختلف H2O2 طی زمان‌های متفاوت، مجاور و انکوبه شدند. سپس سلول‌ها ریکاور شده و در شرایط معمول کشت سلول قرار گرفتند. در نهایت سلولهای پیش شرطی شده تحت شرایط کشنده قرارگرفتند. پس از انجام این مراحل، میزان سلولهای زنده با استفاده از رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو و روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. پس از انجام مراحل پیش شرطی و القای آپوپتوز، به منظور بررسی تاثیر پیش‌شرطی کردن در قابلیت تمایز سلولهای بنیادی و بنیادی بودن آن‌ها، سلولهای پیش شرطی شده، به رده سلولی استئوسیت تمایز داده شدند.
یافته‌ها
نتایج نشان دادند که پیش شرطی کردن سلولهای مزانشیمی با H2O2 موجب افزایش بقا و مقاومت آن‌ها در برابر استرس‌های اکسیداتیو کشنده در مقایسه با سلولهای کنترل پیش شرطی نشده، می‌شود بدون این که تاثیر منفی در قابلیت تمایز آن‌ها داشته باشد.
نتیجه گیری
پیش شرطی کردن سلولهای مزانشیمال با غلظت‌های بهینه H2O2، بقای آن‌ها را در برابر استرس‌های اکسیداتیو افزایش داده و ممکن است منجر به پیشبرد کارایی درمان سلولی شود.
کلمات کلیدی: H2O2 ، پیش شرطی کردن ایسکمیک، آپوپتوز، سلولهای استرومال مزانشیمی چند قوه
تاریخ دریافت : 19/6 /91
تاریخ پذیرش : 23/11/91
1- کارشناس ارشد هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
2- PhD بیوتکنولوژی پزشکی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران
3- دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی ـ مربی مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج) ـ تهران ـ ایران
4- دکترای عمومی دامپزشکی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج ـ کرج ـ ایران
5- مؤلف مسؤول: PhD شیمی‌دارویی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه
سلولهای بنیادی مزانشیمال(MSCs)، سلولهای استرومایی غیر هماتوپوئتیک هستند که قادر به تمایز و شرکت در بازسازی بافت‌های مزانشیمال از قبیل استخوان، غضروف، عضله و چربی می‌باشند(1). امروزه سلولهای بنیادی مزانشیمال به یک هدف امید بخش در خصوص سلول درمانی و ژن درمانی برای بیماری‌های مختلف و نیز مهندسی بافت تعدیل شده‌اند. به عنوان مثال در زمینه پیوند سلولهای بنیادی هماتوپوئتیک(HSC)، سلولهای بنیادی مزانشیمال موجب پیشرفت و بهبود پیوند HSCs و تسریع در بازسازی بافت خونساز می‌شوند. هم چنین با توجه به قابلیت تعدیل‌کنندگی سیستم ایمنی، موجب درمان GVHD حاد می‌‌گردند. با این وجود به علت شرایط زیان بار محیط گیرنده پیوند از جمله نبود اکسیژن، فقر غذایی و نبود عروق تغذیه‌کننده، وجود رادیکال‌های آزاد اکسیژن، افزایش سایتوکاین‌های التهابی و عوامل دیگر، همگی باعث مرگ زودرس قسمت اعظم این سلول‌ها در روزهای ابتدایی پس از پیوند می‌شوند که به موجب آن میزان کارایی درمان سلولی بسیار پایین‌تر از حد انتظار است(2). بنابراین لازم است برای افزایش کارایی درمان مؤثر، راه‌کاری ارایه شود تا سلولهای بنیادی را در برابر این شرایط سخت مقاوم کرده و مدت بقای این سلول‌ها را در محیط پیوند افزایش دهد. برای نیل به این هدف، مطالعه‌های زیادی در خصوص دست‌ورزی ژنتیکی MSCs به وسیله ژن‌های بقا و ضد آپوپتوزی و دیگر عوامل انجام شده ولی به علت خطر جهش‌زایی، از دیدگاه ایمن بودن این روش هنوز مورد تردید است و کاربرد بالینی پیدا نکرده است. یکی از روش‌هایی که در طی چند سال اخیر توجه بسیار ویژه‌ای به آن شده است، استفاده از پیش شرطی کردن (preconditioning) می‌باشد که اثرات بسیار سودمندی در محافظت سلولی دارد(3).
در پیش شرطی کردن از عوامل مختلفی می‌توان استفاده کرد، از قبیل فاکتورهای رشد، عوامل استرس‌زا مانند H2O2، هیپوکسی، لیپوپلی ساکارید (LPS) و شوک حرارتی، انواع سایتوکاین‌ها و کموکاین‌ها، مواد دارویی و دیگر موارد که سودمندی هر کدام از آن‌ها در رده‌های سلولی مختلـف بـه
منظور سلول درمانی به اثبات رسیده است. در این روش سلول را با غلظت‌های بهینه عوامل مختلف مانند H2O2 یا فقر غذایی، به طور دوره‌ای مواجه می‌کنند که باعث می‌شود بیان ژن‌های بقا و محافظت‌کننده سلولی در سلول افزایش یابد، سلول را در برابر عوامل زیانبار در محیط پیوند حفظ کنند و بقای سلول پیوندی به میزان زیادی افزایش یابد که در نتیجه آن کارایی پیوند سلول بنیادی به میزان بسیار زیادی افزایش می‌یابد. یکی از مزیت‌های مهم این روش، ایمن بودن آن است که در آن سلول بنیادی از نظر ژنتیکی دست‌ورزی نمی‌شود و این که می‌توان این روش را بدون خطر در طب بالینی نیز استفاده کرد. با توجه به بررسی‌های صورت گرفته، در این مطالعه از پیش شرطی کردن سلولهای بنیادی مزانشیمال با غلظت‌های بهینه H2O2، به عنوان یک استراتژی درمانی جدید و ایمن با هدف افزایش بقای MSCs پس از مواجهه با استرس‌های اکسیداتیو کشنده استفاده گردید.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود.
آنتی‌بادی‌های مورد استفاده جهت بررسی‌های فلوسایتومتریک شامل؛
CD 44-FITC ، CD 73 (ALCAM)-PE ، CD 105-PE ، CD 90-FITC ، CD 34-FITC و CD 271-FITC (داکو ـ دانمارک) بودند.
تهیه غلظت‌های مختلف H2O2 :
مولاریته استوکی که برای تهیه غلظت‌های مختلف H2O2 مورد استفاده قرار گرفت، برابر M 8/8 بود. غلظت‌هایی که برای پیش شرطی کردن مورد نیاز بودند به صورت میکرومولار بودند. بنابراین این استوک باید با استفاده از PBS (بافر نمکی) رقیق می‌شد تا به غلظت‌های مورد نظر می‌رسید.
تهیه محلول تریپان بلو 4/0% :
4 میلی‌گرم پودر تریپان بلـو را در 1 میلی‌لیتـر آب مقطر
حـل نمودیـم. محلـول تهیه شده از صافی عبور داده شد و برای ممانعت از رشد قارچ‌ها، چند قطره سدیم آزاید بـه محلول اضافه گردید.
تهیه محلول MTT :
5 میلی‌گرم از پودر Thiazolyl blue tetrazolium bromide را در 1 میلی‌لیتر PBS حل نمودیم.
کشت سلولی:
مقدار 10 میلی‌لیتر نمونه آسپیراسیون مغز استخوان یک اهداکننده سالم(با کسب رضایت)، به وسیله متخصص مربوطه در مرکز خون و پیوند مغز استخوان بیمارستان شریعتی گرفته شد و بعد از انتقال نمونه به لوله‌های حاوی ضد انعقاد هپارین، تحت شرایط استریل در درجه حرارت 8-2 درجه سانتی‌گراد به آزمایشگاه مرکز تحقیقات انتقال خون ایران منتقل شد. به طور خلاصه، سلولهای تک هسته‌ای که سلولهای مزانشیمی نیز جزو این دسته از سلول‌ها هستند، با استفاده از فایکول(سوئد، آمرشام بیوساینس) و روش گرادیانت غلظت جداسازی و در محیط کشت اختصاصی DMEM-Low Glucose (آمریکا، سیگما) با 10% FBS (آمریکا، اینویتروژن)، 1% پنی‌سیلین و 1% استرپتومایسین(ایران، سیناژن) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 انکوبه شدند.
دو روز پس از کشت اولیه، سلولهای غیر چسبنده به وسیله تعویض محیط کشت حذف شدند اما سلولهای مزانشیمی به کف فلاسک چسبیدند. در نهایت MSCs حاصل از پاساژ چهارم جهت مطالعه مورد نظر فراهم شدند. به منظور تایید سلولهای بنیادی مزانشیمال جدا شده در مراحل قبل، پس از رشد سلول‌ها در محیط کشت اختصاصی، خصوصیات مورفولوژیکی(شکل ظاهری) سلول‌ها با استفاده از میکروسکوپ معکوس و هم چنین حضور مارکرهای سطحی اختصاصی سلولهای بنیادی مزانشیمال به وسیله فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفت.
تعیین شاخص‌های سطحی MSCs به وسیله فلوسایتومتری:
ابتدا MSCs را با PBS (آمریکا، اینویتروژن) شستشو داده
و پس از تریپسینه کردن به فالکن منتقل شدند و به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ انجام شد. پس از سانتریفوژ کردن، مایع رویی را دور ریخته و به ازای هر 104-103 سلول در هر میکرولیتر محیط، 5 میکرولیتر از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال مربوطه افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در تاریکی انکوبه شدند. در انتها 100 میکرولیتر محلول پارافرمالدئید به محلول حاوی سلول و آنتی‌بادی اضافه شد و نتایج توسط دستگاه فلوسایتومتری آنالیز گردید.
مراحل پیش شرطی‌کردن سلولهای بنیادی مزانشیمال با H2O2 :
ابتدا در 2 پلیت 96 خانه‌ای، تعداد 12000 سلول در هر خانه پلیت ریخته و به محیط کشت DMEM Low Glucose حاوی 10% FBS و آنتی‌بیوتیک اضافه شد. سپس پلیت به انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد CO2 دار منتقل و به مدت 24 ساعت انکوبه گردید. پس از این مدت تعدادی از سلول‌ها با غلظت‌های 5 , 10 , 15 , 20 , 25 , 30 , 40 , 50 , 60 , 80 , µM 100 از ماده H2O2 مجاور شده و مابقی سلول‌ها به عنوان کنترل باقی ماندند. پلیت‌ها به انکوباتور منتقل شدند تا زمان انکوباسیون را طی کنند. یکی از پلیت‌ها به مدت 12 ساعت و پلیت دیگر به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. بعد از اتمام زمان انکوباسیون، سلول‌ها ریکاور شده و در نهایت تحت شرایط کشندگی(غلظت‌های µM 500 و µM 300 از ماده H2O2) قرار گرفتند.
سنجش درصد بقای سلولی با استفاده از آزمون MTT :
پس از اتمام مراحل پیش شرطی کردن و القای آپوپتوز، محیط چاهک‌ها خارج شد و 15 میکرولیتر MTT (آمریکا، سیگما) به همراه 90 میکرولیتر ار محیط DMEM Low Glucose بر روی سلولهای موجود در هر چاهک اضافه و پلیت حاوی سلول‌ها و MTT به مدت 2 ساعت در انکوباسیون 37 درجه سانتی‌گراد و 5% CO2 و دور از نور نگهداری شد. سپس 90 میکرولیتر از محیط چاهک‌ها خارج و 100 میکرولیتر DMSO (آلمان، مرک) به همراه 25 میکرولیتر از بافر سورنسن به هر چاهک اضافه شد. در نهایت میزان جذب نوری در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد.
تحلیل آماری و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS با در نظر گرفتن خطای معیار(SEM) و 001/0 p< ، 01/0 p< و 05/0 p< انجام گردید. تمام مراحل آزمایش‌های فوق به صورت دوتایی(داپلیکیت) انجام شد. تمایز سلولهای MSC که تحت مراحل پیش شرطی با H2O2 قرار گرفته بودند، به رده‌های سلولی استخوان (اوستئوبلاست)، بررسی میزان تاثیر پیش شرطی کردن بر روی قدرت تمایز سلولهای MSC با استفاده از کیت‌های تمایز سلولی و رنگ‌آمیزی‌های اختصاصی بر روی سلولهای MSC که تحت مراحل پیش شرطی کردن قرار گرفته بودند و سلولهای کنترل(MSC معمولی) انجام شد.
تمایز سلولهای MSC که تحت مراحل پیش شرطی با H2O2 قرار گرفته بودند، به رده سلولی چربی(آدیپوسیت):
پس از طی مراحل پیش شرطی کردن در MSCs این سلول‌ها به همراه سلولهای MSC معمولی، با استفاده از روش‌های ذکر شده، به رده سلولی چربی تمایز داده شدند، پس از 7 روز رنگ‌آمیزی با 1% HCS LipidTOXTM Green Neutral Lipid صورت گرفت.
یافته‌ها
تایید حضور مارکرهای سطحی اختصاصی سلولهای بنیادی مزانشیمال با استفاده از آنتی‌بادی اختصاصی و دستگاه فلوسایتومتری:
پس از جداسازی سلول‌ها و کشت در محیط کشت اختصاصی، سلولهای رشد کرده از لحاظ مورفولوژی مورد بررسی قرار گرفتند. مشاهده میکروسکوپی نشان داد که سلولهای جدا شده از لحاظ مورفولوژی مشابه سلولهای بنیادی مزانشیمال بودند(شکل1). پس از مشاهدات میکروسکوپی، حضور آنتی‌بادی‌های موجود در سطح سلول‌ها مورد بررسی قرار گرفت. وجود مارکرهای سطحی CD105 ، CD29 و CD73 و عدم حضور مارکرهای
CD45 ، CD31 و CD34 تاییدکننده سلول‌هـای مزانشیمـال
می‌باشد(شکل2).
شکل1: سلولهای بنیادی مزانشیمال جدا شده از مغز استخوان سلول‌ها پس از گذشت 7 روز از پاساژ اول
ارزیابی کاهش مرگ سلولی در سلولهای پیش شرطی شده با H2O2 با استفاده از تریپان بلو وMTT :
به منظور تعیین میزان سلولهای زنده بعد از قرار گرفتن تحت شرایط کشندگی، سلول‌ها با تریپان‌بلو رنگ‌آمیزی شدند(جدول 1).
همان طور که در جدول 1 مشاهده می‌شود، بقای سلول‌هایی که با محدوده غلظت بین µM 15-5 از H2O2 پیش‌شرطی شده بودند، در مقایسه با سلولهای کنترل (بدون پیش شرطی) در مواجهه با دوز کشندگی µM 300 و µM500 از H2O2 ، تقریباً به طور متوسط به میزان چهار برابر افزایش یافت. لازم به ذکر است که هیچ گونه تفاوتی در نتایج به دست آمده از انکوباسیون سلول‌ها به مدت 12 ساعت با انکوباسیون سلول‌ها به مدت 24 ساعت و هم چنین نتایج حاصل از کشندگی سلول‌ها با غلظت µM 300 و µM 500 از H2O2 ، مشاهده نشد. اما از غلظت‌های µM500H2O2 به بالا، میزان مرگ در سلولهای پیش شرطی شده و سلولهای کنترل یکسان بوده و بیش از 80% سلول‌ها دچار مرگ شدند. هم چنین میزان بقای سلولی پس از پیش شرطی کردن با H2O2 با آزمایش MTT بررسی شد(نمودار 1). درصد بقای سلولهای پیش شرطی شـده بـا غلظت‌هـای 5 ، 10 و 15 میکـرومـولار H2O2 در قایسه با سلول‌هـای کنترل، به میزان قابل ملاحظه‌ای افزایش یافته است. میانگین و انحراف معیار سلولهای کنترل و MSC تیمار شده حدود 04/1 ± 98 بود.
 شکل 2: بررسی مارکرهای اختصاصی سلولهای بنیادی مزانشیمال. وجود مارکرهای سطحی CD105 ، CD29 و CD73 و عدم حضور مارکرهای CD45، CD31 و CD34 تاییدکننده سلولهای مزانشیمال می‌باشد.
جدول 1: بررسی میزان مرگ سلول پس از تیمار با H2O2 با استفاده از تریپان‌بلو
غلظت‌های پیش‌شرطی H2O2
(بر حسب µM) |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25، 30، 40، 50، 60، 80 |
| درصد سلولهای مرده در سلولهای پیش‌شرطی شده* |
5/0 ± 2 |
89/0 ± 15% |
5/0 ± 12% |
5/1 ± 18% |
5/2 ± 68 |
3/2 ± 85% |
| درصد سلولهای مرده در سلولهای کنترل* |
5/0 ± 2 |
34/0 ± 79% |
37/0 ± 78% |
25/0 ± 79% |
30/0 ± 78% |
45/0 ± 80% |
همان طور که در جدول 1 مشاهده می‌شود، بقای سلول‌هایی که با محدوده غلظت بین µM15-5 از H2O2 پیش شرطی شده بودند در مقایسه با سلولهای کنترل(بدون پیش شرطی) در مواجهه با دوز کشندگی µM 300 و µM500 از H2O2 تقریباً به طور متوسط به میزان چهار برابر افزایش یافت.
نمودار1: میزان بقای سلول با استفاده از MTT: محور افقی نشان‌دهنده غلظت‌های پیش‌شرطی H2O2 و محور عمودی درصد بقای سلول است. میزان دوز کشندگی 300 و 500 میکرومولار به مدت 24 ساعت. SD ± Mean ، (001/0 p< : ***) همان طور که در نمودار مشخص است درصد بقای سلولهای پیش‌شرطی‌شده با غلظت‌های 5، 10 و 15 میکرومولار H2O2 در مقایسه با سلولهای کنترل(در همان غلظت‌ها) به میزان قابل ملاحظه‌ای افزایش یافته است. میانگین و انحراف معیار سلولهای کنترل و MSC تیمارشده حدود 04/1 ± 98 بود.
شکل 3: تمایز سلولی. پس از طی مراحل پیش شرطی با H2O2 ، سلولهای پیش شرطی شده از نظر قابلیت تمایز به رده استخوانی مورد ارزیابی قرار گرفتند که همان گونه که در تصویر مشخص است، پیش شرطی کردن MSCs تغییری در روند تمایز سلولی نداشته و این سلول‌ها به سلولهای رده مورد نظر تمایز پیدا کردند.
نتایج تمایز سلولهای MSC و سلولهای MSC پیش‌شرطی شده با H2O2 ، به رده سلولی استخوان (اوستئوبلاست):
پس از طی مراحل پیش شرطی کردن در سلولهای MSC ، این سلول‌ها به همراه سلولهای MSC معمولی، با استفاده از روش‌های ذکر شده، به رده سلولی استخوانی تمایـز داده شدنـد و پس از 21 روز، رنگ‌آمیزی آلیزارین رد S 2% صورت گرفت. نتایج بیانگر آن است که سلول های MSC که تحت مراحل پیش شرطی قرار گرفتند، همانند سلولهای کنترل می‌توانند به رده سلولی استخوانی تمایز یابند و پیش شرطی کردن تغییری در خاصیت تمایزی سلولهای MSC به رده استخوانی ایجاد نمی‌کند(شکل 3). نتایج تمایز سلولهای MSC و سلولهای MSC پیش شرطی شده با H2O2 ، به رده‌های سلولی چربی (آدیپوسیت) و غضروف پس از طی مراحل پیش شرطی کردن در MSCs این سلول‌ها به همراه سلولهای MSC معمولی، با استفاده از روش‌های ذکر شده، به رده سلولی چربی تمایز داده شدند، پس از 7 روز رنگ‌آمیزی HCS 1%LipidTOXTM Green Neutral Lipid صورت گرفت. نتایج بیانگر آن است که سلولهای MSC که تحت مراحل پیش شرطی قرار گرفتند، همانند سلولهای کنترل می‌توانند به رده چربی تمایز یابند. به عبارت دیگر پیش شرطی کردن تاثیری در خاصیت چند ظرفیتی بودن MSC ندارد و احتمالاً بیانگر کاربردی بودن این سلول‌ها برای مطالعه‌های in vivo می‌باشد.
بحث
امروزه سلولهای بنیادی مزانشیمال به عنوان یک هدف امید بخش در زمینه سلول درمانی و ژن درمانی برای بیماری‌های مختلف و نیز مهندسی بافت مطرح شده‌اند و اخیراً در تعدادی از موارد از جمله پیوند، کاربردهای بالینی از آن گزارش شده است. به طوری که در سال 1999 وقتی برای اولین بار ماکینو و همکارانش در آزمایش‌های in vitro ظرفیت تمایزی MSCs به سلولهای عضله قلبی (کاردیومیوسیت‌ها) را گزارش کردند، به یک باره تحقیقات در زمینه سلول درمانی و مهندسی بافت به طرز شگفت‌انگیزی توسعه پیدا کرد(4). در همین راستا مطالعه‌های دیگری ظرفیت تمایزی MSCs مغز استخوان را در in vitro و in vivo به سلولهای عصبی، سلولهای عضله اسکلتی و کاردیومیوسیت‌ها نشان دادند(8-5). با این وجود سلولهای بنیادی پیوندی نمی‌توانند در محیط ایسکمیک پیوند که سرشار از رادیکال‌های آزاد اکسیژن و سایتوکاین‌های التهابی می‌باشد، به مدت زیادی دوام بیاورند و در همان روزهای ابتدایی قسمت اعظم سلولهای بنیادی دچار مرگ سلولی می‌شوند که کارایی‌شان را در درمان سلولی بسیار محدود می‌کند(9). در این رابطه، توما و همکارانش گزارش کردند، کمتر از 44/0% از MSCs در طی 4 روز بعد از پیوند به قلب موش‌های SCID ، بقای مطلوب را داشتند(10). هم چنین کو و همکارانش اشاره داشتند که بیش از 93% از میوبلاست‌های عضله اسکلتی، 2 روز بعد از پیوند دچار مرگ سلولی می‌شوند(11). هم چنین در مطالعه‌ای بر روی انسان، پاگانی و همکارانش گزارش کردند در پیوند اتولوگ میوبلاست‌های عضله اسکلتی به قلب ایسکمیک بیماران، کمتر از 1% سلولهای پیوندی زنده بودند(12).
عوامل متعددی در مرگ زودرس MSCs در ریز محیط پیوندی نقش دارند. در همین رابطه ژو و همکارانش در طی آزمایشاتی به این نتیجه رسیدند که استرس‌های اکسیداتیو و آسیب ایسکمی(فقر غذایی به همراه هایپوکسی) از دلایل اصلی آپوپتوز MSCs در روزهای ابتدایی پس از پیوند می‌باشند(13). با این وجود هاگتز علاوه بر استرس‌های اکسیداتیو و آسیب ایسکمی، پاسخ‌های التهابی و ایمنی موضعی را نیز از دلایل اصلی مرگ زودرس سلولهای پیوندی می‌دانست(14). با توجه به اهمیت موضوع، M ژانگ و روبی در پایان مطالعه‌های‌شان به این نتیجه رسیدند که عامل موفقیت در افزایش کارایی پیوند MSCs ، در ارتباط با ظرفیت بقای MSCs و نیز مقاومت‌شان به عوامل آسیب‌رسان موجود در ریز محیط پیوندی می‌باشد(15). در این رابطه هایدر مهم‌ترین عامل عدم موفقیت پیوند MSCs را بقای پایین سلولهای پیوندی می‌داند و برای افزایش کارایی و موفقیت پیوند، افزایش بقای MSCs به وسیله عوامل محافظت‌کننده سلولی را ضروری می‌داند(8). بنابراین برای افزایش کارایی، درمان مؤثر نیاز است تا سلولهای بنیادی را در برابر این شرایط سخت مقاوم کرده و مدت بقای این سلول‌ها را در محیط پیوند افزایش دهیم. برای نیل به این هدف، مطالعه‌های زیادی در خصوص دست‌ورزی ژنتیکی MSCs به وسیله ژن‌های بقا و ضد آپوپتوزی و دیگر عوامل انجام شده و می‌شود ولی به علت خطر جهش‌زایی، از دیدگاه ایمن بودن این روش هنوز مورد تردید است و کاربرد بالینی پیدا نکرده است. یکی از روش‌هایی که در طی چند سال اخیر توجه بسیار ویژه‌ای به آن شده است، استفاده از روش پیش شرطی کردن با عوامل مختلف از قبیل هیپوکسی، فاکتورهای رشد و دیگر عوامل می‌باشد که اثرات بسیار سودمندی در محافظت سلولی دارد و به این ترتیب می‌توان تا حد زیادی به افزایش اثر بخشی پیوند کمک کرد. استفاده از پیش شرطی کردن به منظور پیوند سلولهای بنیادی، یک روش بسیار مؤثر است و اثرات بسیار قوی در محافظت سلولی دارد(16). موری و همکارانش در سال 1986 اولین پیشگامان این روش بودند که نشان دادند مواجهه کوتاه مدت به طور دوره‌ای با استفاده از پیش شرطی کردن با ایسکمی، منجر به این می‌شود که قلب مقاومت زیادی در برابر ایسکمی کشنده داشته باشد و بعد از آن پیش شرطی کردن به عنوان یک روش مؤثر و بسیار قوی به منظور محافظت سلولی مطرح شد. افضل و همکارانش در سال 2007 ، کوی و همکارانش در سال 2007 ، و سوزوکی و همکارانش در سال 2000 نشان دادند که اثرات محافظت سلولی پیش شرطی کردن با ایسکمی را می‌توان به وسیله روش‌های مختلف دیگر از قبیل استفاده از عوامل دارویی، شوک حرارتی، تعدیل و اصلاح ژنتیکی سلول‌ها به منظور افزایش بیان فاکتورهای رشد و مولکول‌های مسیر بقای سلولی و در معرض قرار دادن سلول‌ها با فرا صوت(Ultrasound) نیز انجام داد(19-17). گورک و همکارانش در سال 1996 ، مولیک و همکارانش در سال 1998 و نیز یلون و همکارانش در سال 2003 به این نتیجه رسیدند که پیش شرطی کردن با ایسکمی دوره‌ای خفیف، تحمل بافت‌های بدن مانند عضلات اسکلتی و قلبی را در برابر ایسکمی کشنده بسیار افزایش می‌دهد(22-20). در روش‌های آزمایشگاهی به منظور محافظت قلب، داس و همکارانش در سال 2006 و نیز سوزوکی و همکارانش در سال 2004، طی مطالعه‌هایی که انجام دادند مشاهده کردند پیش شرطی کردن با استفاده از ایسکمی مختصر و دوره‌ای، اندازه ناحیه سکته دیده شده عضله قلبی را به وسیله کاهش مرگ آپوپتوتیک و نکروتیک میوسیت‌ها به مقدار زیادی کاهش می‌دهد(25-23). روسوا و همکارانش در سال 2008 طی مطالعه‌هایی که انجام دادند، مشاهده کردند که پیش شرطی کردن سلولهای بنیادی مزانشیمال انسان(MSCs) با هایپوکسی منجر به افزایش تحرک و نیز بهبود پتانسیل درمانی MSCs می‌شود(26). زیشان پاشا و همکارانش در سال 2008 در آزمایش‌هایی که انجام دادند به این نتیجه رسیدند که پیش شرطی کردن MSCs با SDF-1α (Stromal-derived factor-1α)، باعث افزایش بقای سلولی و تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمال به میوسیت‌ها در طی پیوند به قلبی که دچار انفارکتوس شده می‌شوند(17). در سال 2012، ون ولتون و همکارانش با پیوند سلولهای بنیادی مزانشیمال به مغز مدل‌های نوزاد حیوانی که دچار آسیب ایسکمی شده بودند، موفق شدند تا اندازه ناحیه آسیب دیده را کاهش داده و موجب بهبود عملکرد مغز شوند. آن‌ها این طور نتیجه گرفته‌اند که سلولهای مزانشیمال در پاسخ به نیازهای محیط ایسکمیک مغز با ترشح فاکتورهای رشد متعدد، سایتوکاین‌ها و سایر مولکول‌های بیواکتیو، فرآیندهای ترمیمی را تنظیم می‌کنند(27).
با توجه به این که نتایج بسیاری از مطالعه‌ها حاکی از این است که پیش شرطی کردن سلولهای بنیادی با استفاده از عوامل مختلف نظیر H2O2 ، هیپوکسی، عوامل شیمیایی و فاکتورهای رشد موجب افزایش مقاومت و بقای سلولهای پیوندی در محیط ایسکمیک بافت می‌شود و علاوه بر ایجاد مقاومت در سلول‌ها، خطرات ناشی از دست‌ورزی ژنتیکی را نیز ندارد، در این مطالعه ما نیز به بررسی تاثیرات پیش شرطی کردن سلول‌ها با H2O2 پرداختیم(30-28).
در ایـن مطالعـه، سلول‌هـای بنیـادی مزانشیمال را در in vitro با غلظت‌های پایین H2O2 در فواصل زمانی کوتاه مواجه کردیم، سپس سلولهای پیش شرطی شده را در معرض عوامل کشنده(غلظت‌های کشنده H2O2) قرار دادیم و در ادامه میزان بقای سلولی را به طور کیفی با تریپان‌بلو و به طور کمی با آزمایش MTT assay اندازه‌گیری نمودیم.
در طی آزمایش‌های متعددی که انجام دادیم، نتایج حاکی از این بود که پیش شرطی کردن سلول‌ها با H2O2، می‌تواند موجب افزایش مقاومت MSCs در پاسخ به استرس‌های کشنده شده و بقای سلولی را به میزان قابل توجهی در مقایسه با کنترل(MSCs معمولی که تحت هیچ گونه فرآیند پیش شرطی کردن قرار نگرفته) بهبود دهد.
نتایج آزمایش‌های مطالعه حاضر نشان می‌دهد که پیش شرطی کردن MSCs با عوامل اکسیدان، می‌تواند یک سیستم دفاعی قوی برای MSCs در جهت مقابله با آسیب‌های وارده در شرایط in vitro و in vivo فراهم کند.
در تایید مطالب ذکر شده، تانگ و همکارانش در سال 2005 در طی تحقیقاتی که انجام دادند ثابت کردند که پیش شرطی کردن به وسیله H2O2 در رده سلولی PC12 ، اثرات محافظتی در برابر استرس‌های اکسیداتیو دارد و باعث کاهش آپوپتوز از طریق مکانیسم‌های ROS ، MMP و Bcl-2 می‌شود. هم چنین شی یانگ و همکارانش در سال 2009 نشان دادند که پیش شرطی کردن MSCs با H2O2 باعث افزایش بیان مولکول چسبندگی CXCR4 و جلوگیری از آپوپتوز MSCs می‌شود(31).
اشمل کو و همکارانش در سال 2005 نشان دادند کشت سلولهای CD133+ در حضور VEGF و فاکتور رشد سلولهای عصبی مشتق شده از مغز(b NGF) به صورت تکـی یـا هـر دو با هم، تمایز میواندوتلیال سلولهای CD133+ را تقویت می‌کنند.
آپوپتوز یکـی از عوامـل بسیار مهم کاهش بقای MSCs
در پیوند می‌باشد. مطالعه‌ها نشان می‌دهند که پیش شرطی کردن سلول‌ها، سبب فعال شدن مسیرهای آنتی‌آپوپتوتیک شده و در نتیجه بقای MSCs را افزایش می‌دهد. در تایید این موضوع می‌توان به مطالعه پاریزاس و همکارانش اشاره کرد که در سال 1997 نشان دادند که واکنش IGF-1/IGF-1R باعث فعال شدن متوالی مسیرهای انتقال سیگنالی می‌شود که از آپوپتوز سلول جلوگیری می‌کنند.
در این مطالعه، سلول‌ها را به صورت موقتی در معرض
غلظت‌های بهینه شده عوامل اکسیدان قرار دادیم تا از این طریق استرسی به سلول‌ها وارد کرده باشیم که نه تنها برای آن‌ها آسیب‌رسان و کشنده نمی‌باشد، بلکه از طریق القای مکانیسم‌های گوناگون نظیر فعال کردن ژن‌های آنتی‌آپوپتوتیک، القای بیان فاکتورهای رشد و مهار ژن‌های آپوپتوتیک در سلول‌ها سبب ایجاد مقاومت در آن‌ها و افزایش بقای آن‌ها می‌شود. تاکنون مسیرهای انتقال سیگنالی که به وسیله پیش شرطی کردن ایسکمیک شروع می‌شود و در فعال‌سازی مسیرهای مختلف پروتئین‌های بقای سلولی نقش دارد گزارش شده است. گورک و همکارانش در سال 1996 ، ژو و همکارانش در سال 2001 و هازنلوی و همکارانش در سال 2006 آن‌ها را شناسایی کردند که عبارتند از پروتئین کینازهای C ، A و G که جزو خانواده MAPK و BMK1 (JNK ، P38 و Erk1/2) ، فسفاتیدیل اینوزیتول 3- کیناز(P13K) آبشار P13k-Akt و مسیر JAK-STAT می‌باشند(32، 31، 22).
در مقایسه با مقاوم کردن سلول‌ها از طریق دست‌ورزی ژنتیکی، پیش شرطی کردن سلول‌ها این مزیت را دارد که خطر تومورزایی را نداشته و تغییرات پایدار در سلول‌ها ایجاد نمی‌کند. از طرفی نیز در این فرآیند، سلول‌ها با عواملی مواجه می‌شوند که به طور طبیعی با آن‌ها رو به رو می‌شوند، بنابراین سلول‌ها در معرض شرایط ناشناخته جدید که می‌تواند برای آن‌ها مضر باشد قرار نمی‌گیرند. از دیگر مزایای پیش شرطی کردن این است که مقاومت بالایی را در سلول‌ها ایجاد می‌کنند. به طوری که در مطالعه‌ای که انجام شد، مشاهده گردید که غلظت µM 5 از H2O2 موجب می‌شود تا حدود 85% از سلول‌ها در برابر شرایط کشنده القا شده، زنده بمانند.
نتیجه‌گیری
پیش شرطی کردن فرآیندی است که طی آن سلول‌ها به طور موقتی تحریک شده و به طور موقتی هم فعال می‌شوند بنابراین می‌توان از آن به عنوان راه‌کاری مؤثر در جهت افزایش بقای سلول‌ها پس از پیوند و افزایش اثر بخشی پیوند، بدون داشتن خطرات سرطان‌زایی، بهره گرفت.
تشکر و قدردانی
این تحقیق حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد هماتولوژی مصوب مرکز تحقیقات مؤسسه عالی آموزشی
و پژوهشی طب انتقال خون می‌باشد.
|
|
| ارسال پیام به نویسنده مسئول |
|
|
|
| ارسال نظر درباره این مقاله |
|
|
|
