جلد ۱۱، شماره ۳ - ( پاييز ۱۳۹۳ )
جلد ۱۱ شماره ۳ صفحات ۲۲۹-۲۲۱ |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Hamidpour M, Kadem maboodi A, Sigarchin taghizadeh F, Janmaleki M, Seyed Alikhani S. The influence of Low Density Lipoprotein on vein thrombus formation. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2014; 11 (3) :221-229
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-760-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-760-fa.html
حمید پور محسن، خادم معبودی علی اکبر، سیگارچیان تقی زاده فاطمه، جانملکی محسن، سید علیخانی سید بهزاد. اثر لیپوپروتئینهای با وزن مولکولی کم بر تشکیل ترومبوز عروقی. فصلنامه پژوهشی خون. ۱۳۹۳; ۱۱ (۳) :۲۲۱-۲۲۹
محسن حمید پور* 
، علی اکبر خادم معبودی ، فاطمه سیگارچیان تقی زاده ، محسن جانملکی ، سید بهزاد سید علیخانی
، علی اکبر خادم معبودی ، فاطمه سیگارچیان تقی زاده ، محسن جانملکی ، سید بهزاد سید علیخانی
تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: ۱۹۷۱۶۵۳۳۸۶۳
متن کامل [PDF 441 kb]
(۲۰۹۱ دریافت)
| چکیده (HTML) (6532 مشاهده)
مقدمه
لخته‌هایی که در ضایعات آترواسکلروزیس عروق به خصوص عروق کرونری ایجاد می‌شود، می‌تواند مسؤول ترومبوس و نهایتاً ایسکمی قلبی گردد. در بررسی‌های اپیدمیولوژی گزارش شده که عامل بیش از 50% بیماران قلبی عروقی در ایالات متحده، ژاپن و اروپا ناشی از آترواسکلروزیس می‌باشد(3-1). گر چه مکانیسم پاتوفیزیولوژیکی ایجاد ترومبوس شریانی به طور گسترده‌ای مشخص شده، ولی هنوز نکاتی قابل بحث وجود دارد که باید مورد بررسی قرار گیرد. به دنبال رسوب لیپیدها به خصوص LDL و اکسید شدن آن‌ها در ماکروفاژهای جدار عروق و سلول‌های مزانشیال عضلات صاف و انتقال آن‌ها به سلول‌های فوما لیپیدی- لیدن (Lipid- Laden foam cells)، بیشترین تغییر را در لایه اینتمای شریان‌ها ایجاد می‌کنند. پیشرفت آترواسکلروزیس توام با نفوذ و گسترش این سلول‌ها به زیر اندوتلیوم، تحت تاثیر مواد ماتریکسی قرار گرفته که نهایتاً منجر به تشکیل آتروما می‌گردد(5، 4).
تغییرات در شدت جریان خون شریانی موجب گسیختگی پلاک و به دنبال آن تماس پلاکت‌ها با پروتئین‌های زیر اندوتلیال مانند کلاژن، فون‌ویلبراند و ترمبواسپوندین گشته و موجب تشکیل ترومبوس اولیه می‌گردد.
از طرف دیگر پلاک آترواسکلروتیک باعث فعال شدن فاکتورهای انعقادی شده و لخته فیبرینی تشکیل می‌گردد و با افزایش اندازه لخته، تنگی عروق شروع می‌شود(6، 4). همین طور Minimal OX-LDL (m-OX-LDL) می‌تواند پلاکت‌ها را فعال کرده و باعث تغییر شکل آن‌ها شده و تجمع پلاکتی را افزایش دهد. با توجه به شرایط فیزیولوژیکی هر فرد ممکن است تاثیر لیپیدها بر روی فعالیت پلاکتی متغیر باشد(7).
از طرفی نفوذ LDL به درون این سلول‌ها و اکسید شدن آن‌ها باعث القای آپوپتوزیس در سلول‌های فوما شده، پس از آپوپتوزیس سلولی، لیپیدها بر سطح غشای سلول تراوش کرده و موجب فعال شدن بیشتر فاکتورهای انعقادی و افزایش تجمع پلاکتی می‌گردد(10-8).
در افرادی که دچار هیپر لیپیدمی تیپ II هستند، میزان ترومبوکسان TXA2 افزایش یافته که خود موجب پراکسیداسیون لیپیدها و افزایش فعالیت‌های پلاکت می‌گردد(11، 2). در این پروژه چگونگی اثرات LDL اکسید شده در فعال کردن پلاکت‌ها به عنوان اولین عامل تشکیل لخته خونی مورد بررسی قرار خواهد گرفت و در عین حال با توجه به امکانات موجود در سطح بیمارستان‌ها، بناست تا از دو روش اگریگومتری و فلوسیتومتری در جهت انجام این پروژه استفاده شود.
مواد و روش‌ها
مطالعه پروژه به صورت مقطعی(cross sectional) انجام شد. پس از کسب رضایت از افرادی که به آزمایشگاه برای انجام آزمایش‌های لیپیدی مراجعه نموده بودند، 42 نفر که سابقه افزایش چربی خون با کلسترول بالای mg/dL200 را داشتند و 14 نفر داوطلب سالم که میزان چربی و قند آن‌ها طبیعی بود، به عنوان نمونه‌های بیمار و کنترل منفی مورد بررسی قرار گرفتند. در شرایط 14 ساعت ناشتا، خونگیری انجام شد که پس از جداسازی سرم و تعیین میزان کلسترول خون به روش فتومتری با کیت آنزیماتیک(شرکت پارس آزمون) و دسته‌بندی (بر اساس میزان کلسترول)، سرم آن‌ها در فریزر تا زمان انجام آزمایش‌های بعدی نگهداری شد.
جدا کردن LDL سرم:
برای جدا کردن LDL سرم از دستگاه اولترا سانتریفیوژ با بهره‌گیری از روش اصلاح شده هاول و فرمول
{A*Y + B* Z = (A+B) X}
استفاده شد(12). در این فرمول: (A : حجم سرم، B : حجـم نمک جداکننده، Y : وزن مخصوص LDL سرم (1006)، Z : وزن مخصوص نمک جداکننده(1005)، X : وزن مخصوص مخلوط بافر جداکننده و سرم).
تهیه محلول نمکی جداکننده:
153 گرم کلرور سدیم با 354 گرم بر مول پتاسیم را در یک لیتر آب مقطر حل کرده، این محلول به عنوان محلول نمک با دانسیته بالا(با دانسیته 346/1) ذخیره می‌شود. برای تهیه محلول نمکی کار جداکننده، محلول نمکی ذخیره را با استفاه از محلول کلرور پتاسیم 15/0 مولار رقیق کرده و دانسیته آن را به (005/1) می‌رسانیم تا محلول نمکی آماده کار شود. 4 میلی‌لیتر سرم بیمار را در یک لوله در پیچ‌دار ریخته و مقدار مورد نیاز محلول نمکی کار را طبق فرمول فوق(هاول) اضافه کرده و خوب مخلوط می‌کنیم. سپس 6 میلی‌لیتر از مخلوط سرم و بافر جداکننده را با سرنگ درون لوله‌های مخصوص اولترا سانتریفیوژ(ساخته شرکت بیکمن) ریخته و با دور 100000 برای 5/2 ساعت در دمای 16 درجه سانتی‌گراد با اولترا سانتریفیوژ بیکمن در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ سه لایه جداگانه در لوله تشکیل شد که با سرنگ از هر سه لایه محلول‌ها جدا شدند. میزان LDL جدا شده در لایه رویی با استفاده از کیت(Elitech Ref: LDLD-03600 France) به روش فتومتری اندازه‌گیری شد.
تغلیظ LDL :
لایه رویی را با لوله‌های فیلتردار سانتریفیوژ کرده که نهایتـاً میـزانLDL برابر 150 میلی‌گرم در دسی‌لیتر بود. µL/L 50 از LDL جدا شده از سرم بیماران و شاهد به مدت 8 ساعت در معرض µL950 سولفات مس قرار داده شد، تا LDL سرم اکسید شود. برای اطمینان از اکسید شدن LDL ، میزان جذب محلول در طول موج 234 نانومتر با فتومتر (Clinic II) سنجیده شد.
از خون سیتراته افراد داوطلب گروه خونی O منفی که تا 15 روز قبل از نمونه‌گیری آسپرین و سایر داروهای غیر استروئیدی مصرف نکرده بودند، پلاسمای غنی شده از پلاکت{ {Platelet Rich Plasma (PRP)با سانتریفیوژ کردن خون در دور g200 تهیه شد.
بررسی میزان تجمع پلاکتی:
50 میکرولیتر ازPRP حاوی/mL 105 * 2 پلاکت را به ترتیب در 2 لوله حاوی 50 میکرولیترn-LDL و OX-LDL با غلظت‌های مختلف برای مدت 30 دقیقه انکوبه کرده و سپس آن‌ها را با غلظت‌های مختلف ADP (µmol/mL 10، 1، 1/0)؛ مجاور نموده و میزان فعالیت آن‌ها توسط دستگاه اگریگومتری در مرکز هموفیلی ایران بررسی شد.
تعیین درصد باند شدن فیبرینوژن به پلاکت‌ها:
50 میکرولیتر ازPRP حاوی/mL 105 * 2 پلاکت به ترتیب در 2 لوله حاوی 50 میکرولیتر n-LDL و OX-LDL با غلظت‌های مختلف برای مدت 30 دقیقه انکوبه شد و سپس آن‌ها را با غلظت‌های مختلف ADP (µmol/mL 10، 1، 1/0)؛ مجاور کردیم تا میزان باند شدن فیبرینوژن به پلاکت‌ها را توسط فلوسیتومتری آزمایشگاه گروه ایمنولوژی دانشگاه علوم پزشکی ایران تعیین کنیم. لازم به ذکر است که قبل از آماده کردن دستگاه فلوسیتومتری برای جلوگیری از فعالیت بیشتر پلاکت‌ها، بلافاصله پس از افزودنADP ، با افزودن 100 میکرولیتر پارافرمالدئید10% به پلاکت‌ها, فعالیت آن‌ها را تثبیت کردیم.
با استفاده از برنامه آماری 16 SPSS و آزمونt- student و t زوجی، داده‌ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
یافته‌ها
از میان افرادی که مورد پژوهش قرار گرفتند و میزان کلسترول آن‌ها بالا بود، 55% مرد و بقیه از میان زنان انتخاب شدند. بر اساس میزان کلسترول، افراد در سه گروه تقسیم شدند:
گروه اول 14 نفر(کلسترول mg/dL 235-200)، گروه دوم 16 نفر(کلسترول mg/dL 270-236) و گروه سوم 12 نفر(کلسترول بالای mg/dL 270). نتیجه بررسی LDL اکسید شده نشان داد که میانگین جذب در طول موج 234 نانومتر، دو برابر شده است به نحوی که میزان جذب از 05/0 ± 45/0 OD= به 03/0 ± 98/0 OD= افزایش یافته است(14 n= ، 0008/0 p<).
اثر n-LDL غیر اکسیده یا طبیعی بر فعالیت پلاکت‌ها:
نتایج نشان داد که n-LDL نمونه‌ها همانند کنترل (پلاکت + بافر) در مجاورت ADPاثرات قابل توجهی بر روی فعالیت پلاکت‌ها نگذاشت. شکل 1، نشان‌دهنده نتایج
آزمایـش اگریگـاسیون پـلاکتی بـا n-LDL سـرم بیماران و
شکل 1 : عدم مشاهده اختلاف معناداری اگریگاسیون پلاکتی در مجاورت n-LDL سرم بیماران با 8% (منحنی 2) در مقایسه با کنترل(پلاکت + بافر) 6% (منحنی 1) که با 1 میکرومول ADP تحریک شده بودند(05/0 p<).
شکل 2: مشاهده 11% اگریگاسیون پلاکتی که در معرض n-LDL سرم بیماران با 10 میکرومول ADP قرار گرفتند.
شکل 3: افزایش تجمع پلاکتی در اثر تحریک OX-LDL و در غلظت 10 میکرومولADP در چهار نمونه که به ترتیب 40% ، 39%، 44% و 45% می‌باشد.
شاهد؛ منحنی 1 (کنترل) در مقایسه با منحنی 2 (n-LDL) که با 1 میکرومول ADP تحریک شده بودند نشان داده می‌شود. اثر n-LDL بر فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت ADP با غلظت بالاتر تاثیر چندانی نداشت که نشان‌دهنده فعالیت 11% پلاکتـی در مجـاورت n-LDL و 10 میکرومـول ADP
می‌باشد(شکل 2). اثر OX-LDL بر فعالیت پلاکت‌ها؛ با اضافه کردن ADP با غلظت‌های 10 و 1 و 1/0 میکرومول بر روی مخلوط OX-LDL و PRP و انکوبه کردن آن‌ها به مدت یک دقیقه، نشان داد که در غلظت‌های 1 و 1/0 میکرومول از ADP ، تجمع پلاکتی زیادی مشاهده نشد ولی با غلظت 10 میکرومول، تجمع یا اگریگاسیون تا 45% مشاهده گردید. شکل 3 نشان‌دهنده افزایش تجمع پلاکتی در اثر تحریک OX-LDL و در غلظت 10 میکرومول ADP می‌باشد. شکل 4 نشان‌دهنده میزان باند شدن پلاکت‌ها در مجاورت n-LDL ، OX-LDL و کنترل با غلظت‌های مختلف از ADP می‌باشد.
بررسی فلوسیتومتریک باندشدن فیبرینوژن به پلاکت‌ها در مجاورت OX-LDL :
کمپلکس گلیکوپروتئینی IIb/IIIa به عنوان رسپتور فیبرینوژن هنگام اضافه کردن آگونیست‌ها مثل ADP بیشتر بر سطح پلاکت بروز می‌کنند. در ابتدا برای مشخص کردن محل تجمع پلاکت‌ها، از Side Scatter بر Forward Scatter فلوسیتومتری استفاده شد. شکل 5 نشان‌دهنده جمعیت پلاکتی است که پس از فعال شدن با 10 میکرومولADP ،
به فیبرینـوژن بانـد شدنـد. بـرای مقایسـه اثر n-LDL با OX-LDL ، 50 میکرولیتر لیپوپروتئین را به مدت 30 دقیقه در مجاورت 50 میکرولیتر PRP انکوبه کرده با اضافه کردن غلظت‌های 1/0 ، 1 ، 10 میکرومول از ADP و 2 میکرولیتر از فیبرینوژن کونژوگه شده با FITC (Fluorescent Isothio Cyanide ) میزان باند شدن پلاکت‌ها بررسی شد. نتایج نشان داد که حداکثر میزان باند شدن پلاکت‌ها به فیبرینوژن در مجاورت 10 میکرومول ADP و mg/dL 20 لیپوپروتئینهای طبیعی و اکسید شده به ترتیب 82% بودند.
در شکل‌های 6 و 7 ، به ترتیب میزان باند شدن پلاکت‌ها به فیبرینوژن در مجاورت لیپوپروتئینهای طبیعی و اکسید شده را به ترتیب از روی میزان متوسط فلورسان فلوسیتومتریک{ Mean Fluorescence Intensive (MFI) { نشان می‌دهد.
شکل 4: تجمع پلاکتی در اثر تحریک OX-LDL ، n-LDLو کنترل در غلظت‌های مختلف ADP که بیشترین فعالیت پلاکتی در غلظت 10 میکرومول ADP متعلق به OX-LDL با میانگین فعالیت 45% در اکثر نمونه‌ها مشاهده می‌شود.
شکل 5: برای مشخص شدن پراکنش(Gating) پلاکت‌ها و فوروارد اسکتر آن‌ها با اضافه کردن 2 میکرولیتر آنتی‌فیبرینوژن آنتی‌بادی کونژوگه شده بهFITC استفاده شد. در این شکل پراکنش پلاکت‌ها در داخل پنجره(Gate) نشان داده شدند.
شکل 6: میزان MFI 8% نشان‌دهنده کاهش باند شدن پلاکت‌ها با فیبرینوژن در مجاورت n-LDL می‌باشد.
شکل 7: میزان MFI بیشتر از 82% نشان‌دهنده افزایش باند شدن پلاکت‌ها با فیبرینوژن در مجاورت OX-LDL می‌باشد.
بحث
امروزه مشخص شده افزایش میزان لیپوپروتئین‌ها با وزن مولکولی پایین LDL در بدن انسان به عنوان یک فاکتور خطر بیماری‌های قلبی عروقی مطرح می‌باشد. مکانیسم عمل آن در عروق متعدد است. مهم‌ترین آن‌ها ایجاد پلاک آترواسکلروزیس در جدار عروق و به دنبال آن ترومبوس‌های عروقی می‌باشد(13). در این پروسه فعالیت پلاکت‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار هستند. یکی از مواردی که در تحقیقات به آن اشاره شده، اکسید شدن LDL در بدن به مقدار کم می‌باشد. تغییرات جذب LDL اکسید شده در طول موج 234 نانومتر، نشان داد که LDL با مواد اکسیدان حتی با غلظت اندک تغییر ماهیت داده که این وضعیت می‌تواند موجب تغییرات در اعمال بیولوژیکی آن شود و یا با اثرگذاری بر بافت‌ها و یا سلول‌های دیگر، باعث تغییر در بافت‌های همجوار گردد(14). مواد اکسیدان فراوانی وجود دارند، انتخاب ما در این پروژه سولفات مس به خاطر سهولت انجام کار و تایید نهایی اکسید شدن LDL با فتومتر بود. لازم به ذکر است که مس در کنار لیپوپراکسیداز موجود در سرم، قادر به اکسید کردن LDL است.
نتایج به دست آمده در این پروژه نشان می‌دهد که LDL اکسید نشده یا طبیعیn-LDL)) به تنهایی و حتی با اضافه کردن آگونیست پلاکتی مثل ADP با غلظت‌های مختلف از 1/0 تا 10 میکرومول، موجب تجمع محسوس پلاکتی نشد. از آن جایی که آراشیدونیک اسید یکی از عوامل اصلی تجمع پلاکت‌ها می‌باشد، پس احتمال دارد که LDL طبیعی با اثرگذاری روی لیپیدهای پلاکتی باعث کاهش سرعت فعال شدن پلاکتی شود(16، 15). لازم به توضیح است که با افزایش مقدار n-LDL ، تجمع پلاکتی نیز حتی با غلظت بالای آگونیست کاهش می‌یابد. پس وجود اندک LDL موجود در پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) در مقایسه با LDL تهیه شده از سرم بیماران، تاثیر چندانی در آزمایش نداشت. چرا که نتایج کنترل‌ها بدون LDL نشان از تجمع طبیعی پلاکت‌ها داشت. بـا توجه به این کـه نتایج آزمایـش
فلوسیتومتریک فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت n-LDL ، نشان از عدم باند شدن فیبرینوژن با سطح پلاکتی که حاصل آن تجمع می‌باشد داشت، در این آزمایش هم از غلظت‌های مختلف ADP استفاده شد که در قسمت روش‌ها توضیح داده شد. به نظر می‌رسد که n-LDL در این آزمایش، عمل پوششی را بر سطح پلاکت‌ها انجام داده و مانع از باند شدن فیبرینوژن و پلاکت‌ها شود. کولر و همکارانش نشان دادند کهLDL و HDL ، گیرنده‌های گلیکوپروتئینی IIb و IIIa را بلوک کرده و مانع از فعالیت پلاکت‌ها شدند(17). اگر چه امروزه مشخص شده است که عامل اصلی باند شدن فیبرینوژن بر سطح پلاکت‌ها، گلیکوپروتئین IIb/IIIa می‌باشد، ولی گفته می‌شود که اخیراً اسید آمینه‌ای در قسمتMotif RGD گلیکوپروتئین IIIa پیدا شده که شباهت‌هایی با ساختمان گیرنده Apo B/E که محل باند شدن LDL است دارد(19، 18).
انجام آزمایش تجمع پلاکتی با دستگاه اگریگومتری، با اضافه کردن آگونیست‌های پلاکتی می‌تواند نشان‌دهنده تشکیل ترومبوز در عروق باشد، به خاطر این که چرخاندن پلاسمای غنی از پلاکت در لوله‌های حاوی مگنت در دستگاه اگریگومتری، شباهت‌هایی با شدت جریان خون دارد، لذا با اضافه کردن ADP ، فعالیت پلاکت‌ها به واسطه (TXA2) بستگی به اگریگاسیون دارد و نه باند شدن فیبرینوژن(20). برخلاف n-LDL ، لیپوپروتئینهای اکسید شده(OX-LDL) موجب افزایش تجمع پلاکتی شدند. بیشترین فعالیت در غلظت mg/mL 20 از LDL و 10 میکرومول ADP نشان داده شده است. با توجه به وجود پراکسیداز در خون، احتمال اکسید شدن لیپیدها وجود دارد که یکی از علل تجمع پلاکتی و ایجاد پلاک لیپیدی می‌باشد .به نظر می‌رسد که OX-LDL توسط سلول‌های فومای پلاک آترواسکلروزیس آزاد و در گردش خون جریان پیدا می‌کند(21). از طرف دیگرOX-LDL باعث تحریک افزایش تولید و تجمع میکرووزیکول‌های پلاکتی شده و به دنبال آن موجب افزایش تجمع پلاکتی می‌شود، زیرا افزایش میکرووزیکول‌های CD36 مثبت موجب افزایش فعالیت پلاکت‌ها می‌شود. مجموعه میکرووزیکول CD36 موجب فعال شدن سیگنال MKK4/JNK2 می‌شود(22). به عبارتی OX-LDL باعث القای فسفوریلاسیون JNK2 و MKK4 وابسته به CD36 پلاکت‌ها توسط خانواده کینازهای src می‌شود(23). امروزه ثابت شده که میکرووزیکول‌های پلاکتی همانند دیگر میکرووزیکول‌ها تشکیل‌دهنده هسته اصلی پلاکت‌های پلاکتی و ترومبوس می‌باشند(24). کنستانتینوس استلوس و همکارانش در پروژه‌ای که روی بیماران مبتلا به سندرم حاد کرونر انجام دادند، مشاهده کردند که افزایش پلاکت‌های باند شده به OX-LDL در این بیماران نقش بارزی را در تشکیل آتروترومبوزیس ایفا می‌کند(24).
نتیجه‌گیری
افزایش چربی بد یا LDL در بدن با وجود مواد لیپواکسید فراوان در غذاها، احتمال تشکیل OX-LDL را زیاد می‌کند. از این رو می‌توان به عنوان یک مورد بالقوه جهت درمان و بیماران قلبی عروقی مورد نظر قرارداد.
از آن جا که بر سطح پلاکت‌ها گیرنده‌هایی برای اتصال LDL و HDL کلسترول وجود دارد، میزان بیان این گیرنده‌ها در بیماران آترواسکلروتیک حائز اهمیت است، لذا بررسی میزان بیان این گیرنده‌ها و عملکرد آن‌ها در این بیماران پیشنهاد می‌شود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله از معاونت فناوری و تحقیقات دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی به خاطر تصویب طرح و کمک مالی تشکر می‌نمایند. همین طور از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و مهندسی بافت دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی و مرکز هموفیلی ایران به خاطر همکاری بی‌دریغشان تشکر می‌شود.
متن کامل: (۱۹۹۸ مشاهده)
اثر لیپوپروتئینهای با وزن مولکولی کم بر تشکیل ترومبوز عروقی
محسن حمیدپور1، علی‌اکبر خادم معبودی2، فاطمه سیگارچیان تقی‌زاده3، محسن جانملکی4، سید بهزاد سید علیخانی5
چکیده
سابقه و هدف
شواهد بسیاری وجود دارند که لیپیدها به ویژه لیپوپروتئین‌ها با وزن مولکولی پایین و همین طور پلاکت‌ها نقش مهمی در پاتوژنز پلاک آترواسکلروزیس و تشکیل لخته عروقی دارند. مساله مهم این است که چگونه لیپیدها می‌توانند باعث القای تشکیل ترومبوز اولیه گشته و چه آزمایش‌هایی در تشخیص زودرس این ترومبوس‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است؟
مواد و روش‌ها
این تحقیق به روش مقطعی(cross sectional) انجام شد. 42 نفراز میان افرادی که سابقه افزایش چربی با کلسترول تام سرم بالاتر از mg/dL 200 داشتند و 14 نفر از میان افراد داوطلب سالم (کلسترول طبیعی) به عنوان شاهد سالم انتخاب شدند. پس از جمع‌آوری LDL سرم نمونه‌ها و اکسید کردن آن‌ها، فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت این نمونه‌ها آزمایش شد. نتایج با استفاده از 16 SPSS و آزمون t-test تجزیه و تحلیل شدند.
یافته‌ها
میزان جذب LDL اکسیده نمونه ها از 45/0 در LDL طبیعی به 98/0 در فرم اکسیده تبدیل شده(0008/0 p<). برخلاف LDL طبیعی، لیپوپروتئینهای اکسید شده موجب افزایش تجمع پلاکتی با اگریگومتری شدند، فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت n-LDL فقط 11% بود، در صورتی که در مجاورت mg/dL 20 از OX-LDL ، این فعالیت تا 45% رسید. فلوسیتومتری نشان داد که حداکثر میزان باند شدن پلاکت‌ها به فیبرینوژن در مجاورت 10 میکرومول ADP و mg/dL 20 لیپوپروتئینهای طبیعی و اکسید شده، به ترتیب 8% و 82% بود.
نتیجه گیری
آزمایش‌ها نشان دادند که چنانچه لیپیدها در مجاورت مواد و داروهای اکسیدان قرار گیرند، اکسید شده و موجب فعالیت بیشتر پلاکت‌ها می‌گردند. بنابراین احتمال ایجاد ترومبوز وریدی و بیماری‌های قلبی عروقی زیاد می‌شود.
کلمات کلیدی: آترواسکلروزیس، ترومبوز، LDL کلسترول
تاریخ دریافت : 28/3/92
تاریخ پذیرش : 1/11/92
1- مؤلف مسؤول: PhD هماتولوژی ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1971653383
2- PhD آمار حیاتی ـ دانشیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه آمار حیاتی ـ تهران ـ ایران
3- کارشناس ارشد محیط زیست ـ شورای تخصصی دندانپزشکی معاونت آموزشی ـ وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس مهندسی پزشکی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و مهندسی بافت ـ تهران ـ ایران
5- کارشناس مهندسی پزشکی ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
محسن حمیدپور1، علی‌اکبر خادم معبودی2، فاطمه سیگارچیان تقی‌زاده3، محسن جانملکی4، سید بهزاد سید علیخانی5
چکیده
سابقه و هدف
شواهد بسیاری وجود دارند که لیپیدها به ویژه لیپوپروتئین‌ها با وزن مولکولی پایین و همین طور پلاکت‌ها نقش مهمی در پاتوژنز پلاک آترواسکلروزیس و تشکیل لخته عروقی دارند. مساله مهم این است که چگونه لیپیدها می‌توانند باعث القای تشکیل ترومبوز اولیه گشته و چه آزمایش‌هایی در تشخیص زودرس این ترومبوس‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است؟
مواد و روش‌ها
این تحقیق به روش مقطعی(cross sectional) انجام شد. 42 نفراز میان افرادی که سابقه افزایش چربی با کلسترول تام سرم بالاتر از mg/dL 200 داشتند و 14 نفر از میان افراد داوطلب سالم (کلسترول طبیعی) به عنوان شاهد سالم انتخاب شدند. پس از جمع‌آوری LDL سرم نمونه‌ها و اکسید کردن آن‌ها، فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت این نمونه‌ها آزمایش شد. نتایج با استفاده از 16 SPSS و آزمون t-test تجزیه و تحلیل شدند.
یافته‌ها
میزان جذب LDL اکسیده نمونه ها از 45/0 در LDL طبیعی به 98/0 در فرم اکسیده تبدیل شده(0008/0 p<). برخلاف LDL طبیعی، لیپوپروتئینهای اکسید شده موجب افزایش تجمع پلاکتی با اگریگومتری شدند، فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت n-LDL فقط 11% بود، در صورتی که در مجاورت mg/dL 20 از OX-LDL ، این فعالیت تا 45% رسید. فلوسیتومتری نشان داد که حداکثر میزان باند شدن پلاکت‌ها به فیبرینوژن در مجاورت 10 میکرومول ADP و mg/dL 20 لیپوپروتئینهای طبیعی و اکسید شده، به ترتیب 8% و 82% بود.
نتیجه گیری
آزمایش‌ها نشان دادند که چنانچه لیپیدها در مجاورت مواد و داروهای اکسیدان قرار گیرند، اکسید شده و موجب فعالیت بیشتر پلاکت‌ها می‌گردند. بنابراین احتمال ایجاد ترومبوز وریدی و بیماری‌های قلبی عروقی زیاد می‌شود.
کلمات کلیدی: آترواسکلروزیس، ترومبوز، LDL کلسترول
تاریخ دریافت : 28/3/92
تاریخ پذیرش : 1/11/92
1- مؤلف مسؤول: PhD هماتولوژی ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1971653383
2- PhD آمار حیاتی ـ دانشیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ گروه آمار حیاتی ـ تهران ـ ایران
3- کارشناس ارشد محیط زیست ـ شورای تخصصی دندانپزشکی معاونت آموزشی ـ وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس مهندسی پزشکی ـ دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و مهندسی بافت ـ تهران ـ ایران
5- کارشناس مهندسی پزشکی ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
مقدمه
لخته‌هایی که در ضایعات آترواسکلروزیس عروق به خصوص عروق کرونری ایجاد می‌شود، می‌تواند مسؤول ترومبوس و نهایتاً ایسکمی قلبی گردد. در بررسی‌های اپیدمیولوژی گزارش شده که عامل بیش از 50% بیماران قلبی عروقی در ایالات متحده، ژاپن و اروپا ناشی از آترواسکلروزیس می‌باشد(3-1). گر چه مکانیسم پاتوفیزیولوژیکی ایجاد ترومبوس شریانی به طور گسترده‌ای مشخص شده، ولی هنوز نکاتی قابل بحث وجود دارد که باید مورد بررسی قرار گیرد. به دنبال رسوب لیپیدها به خصوص LDL و اکسید شدن آن‌ها در ماکروفاژهای جدار عروق و سلول‌های مزانشیال عضلات صاف و انتقال آن‌ها به سلول‌های فوما لیپیدی- لیدن (Lipid- Laden foam cells)، بیشترین تغییر را در لایه اینتمای شریان‌ها ایجاد می‌کنند. پیشرفت آترواسکلروزیس توام با نفوذ و گسترش این سلول‌ها به زیر اندوتلیوم، تحت تاثیر مواد ماتریکسی قرار گرفته که نهایتاً منجر به تشکیل آتروما می‌گردد(5، 4).
تغییرات در شدت جریان خون شریانی موجب گسیختگی پلاک و به دنبال آن تماس پلاکت‌ها با پروتئین‌های زیر اندوتلیال مانند کلاژن، فون‌ویلبراند و ترمبواسپوندین گشته و موجب تشکیل ترومبوس اولیه می‌گردد.
از طرف دیگر پلاک آترواسکلروتیک باعث فعال شدن فاکتورهای انعقادی شده و لخته فیبرینی تشکیل می‌گردد و با افزایش اندازه لخته، تنگی عروق شروع می‌شود(6، 4). همین طور Minimal OX-LDL (m-OX-LDL) می‌تواند پلاکت‌ها را فعال کرده و باعث تغییر شکل آن‌ها شده و تجمع پلاکتی را افزایش دهد. با توجه به شرایط فیزیولوژیکی هر فرد ممکن است تاثیر لیپیدها بر روی فعالیت پلاکتی متغیر باشد(7).
از طرفی نفوذ LDL به درون این سلول‌ها و اکسید شدن آن‌ها باعث القای آپوپتوزیس در سلول‌های فوما شده، پس از آپوپتوزیس سلولی، لیپیدها بر سطح غشای سلول تراوش کرده و موجب فعال شدن بیشتر فاکتورهای انعقادی و افزایش تجمع پلاکتی می‌گردد(10-8).
در افرادی که دچار هیپر لیپیدمی تیپ II هستند، میزان ترومبوکسان TXA2 افزایش یافته که خود موجب پراکسیداسیون لیپیدها و افزایش فعالیت‌های پلاکت می‌گردد(11، 2). در این پروژه چگونگی اثرات LDL اکسید شده در فعال کردن پلاکت‌ها به عنوان اولین عامل تشکیل لخته خونی مورد بررسی قرار خواهد گرفت و در عین حال با توجه به امکانات موجود در سطح بیمارستان‌ها، بناست تا از دو روش اگریگومتری و فلوسیتومتری در جهت انجام این پروژه استفاده شود.
مواد و روش‌ها
مطالعه پروژه به صورت مقطعی(cross sectional) انجام شد. پس از کسب رضایت از افرادی که به آزمایشگاه برای انجام آزمایش‌های لیپیدی مراجعه نموده بودند، 42 نفر که سابقه افزایش چربی خون با کلسترول بالای mg/dL200 را داشتند و 14 نفر داوطلب سالم که میزان چربی و قند آن‌ها طبیعی بود، به عنوان نمونه‌های بیمار و کنترل منفی مورد بررسی قرار گرفتند. در شرایط 14 ساعت ناشتا، خونگیری انجام شد که پس از جداسازی سرم و تعیین میزان کلسترول خون به روش فتومتری با کیت آنزیماتیک(شرکت پارس آزمون) و دسته‌بندی (بر اساس میزان کلسترول)، سرم آن‌ها در فریزر تا زمان انجام آزمایش‌های بعدی نگهداری شد.
جدا کردن LDL سرم:
برای جدا کردن LDL سرم از دستگاه اولترا سانتریفیوژ با بهره‌گیری از روش اصلاح شده هاول و فرمول
{A*Y + B* Z = (A+B) X}
استفاده شد(12). در این فرمول: (A : حجم سرم، B : حجـم نمک جداکننده، Y : وزن مخصوص LDL سرم (1006)، Z : وزن مخصوص نمک جداکننده(1005)، X : وزن مخصوص مخلوط بافر جداکننده و سرم).
تهیه محلول نمکی جداکننده:
153 گرم کلرور سدیم با 354 گرم بر مول پتاسیم را در یک لیتر آب مقطر حل کرده، این محلول به عنوان محلول نمک با دانسیته بالا(با دانسیته 346/1) ذخیره می‌شود. برای تهیه محلول نمکی کار جداکننده، محلول نمکی ذخیره را با استفاه از محلول کلرور پتاسیم 15/0 مولار رقیق کرده و دانسیته آن را به (005/1) می‌رسانیم تا محلول نمکی آماده کار شود. 4 میلی‌لیتر سرم بیمار را در یک لوله در پیچ‌دار ریخته و مقدار مورد نیاز محلول نمکی کار را طبق فرمول فوق(هاول) اضافه کرده و خوب مخلوط می‌کنیم. سپس 6 میلی‌لیتر از مخلوط سرم و بافر جداکننده را با سرنگ درون لوله‌های مخصوص اولترا سانتریفیوژ(ساخته شرکت بیکمن) ریخته و با دور 100000 برای 5/2 ساعت در دمای 16 درجه سانتی‌گراد با اولترا سانتریفیوژ بیکمن در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ سه لایه جداگانه در لوله تشکیل شد که با سرنگ از هر سه لایه محلول‌ها جدا شدند. میزان LDL جدا شده در لایه رویی با استفاده از کیت(Elitech Ref: LDLD-03600 France) به روش فتومتری اندازه‌گیری شد.
تغلیظ LDL :
لایه رویی را با لوله‌های فیلتردار سانتریفیوژ کرده که نهایتـاً میـزانLDL برابر 150 میلی‌گرم در دسی‌لیتر بود. µL/L 50 از LDL جدا شده از سرم بیماران و شاهد به مدت 8 ساعت در معرض µL950 سولفات مس قرار داده شد، تا LDL سرم اکسید شود. برای اطمینان از اکسید شدن LDL ، میزان جذب محلول در طول موج 234 نانومتر با فتومتر (Clinic II) سنجیده شد.
از خون سیتراته افراد داوطلب گروه خونی O منفی که تا 15 روز قبل از نمونه‌گیری آسپرین و سایر داروهای غیر استروئیدی مصرف نکرده بودند، پلاسمای غنی شده از پلاکت{ {Platelet Rich Plasma (PRP)با سانتریفیوژ کردن خون در دور g200 تهیه شد.
بررسی میزان تجمع پلاکتی:
50 میکرولیتر ازPRP حاوی/mL 105 * 2 پلاکت را به ترتیب در 2 لوله حاوی 50 میکرولیترn-LDL و OX-LDL با غلظت‌های مختلف برای مدت 30 دقیقه انکوبه کرده و سپس آن‌ها را با غلظت‌های مختلف ADP (µmol/mL 10، 1، 1/0)؛ مجاور نموده و میزان فعالیت آن‌ها توسط دستگاه اگریگومتری در مرکز هموفیلی ایران بررسی شد.
تعیین درصد باند شدن فیبرینوژن به پلاکت‌ها:
50 میکرولیتر ازPRP حاوی/mL 105 * 2 پلاکت به ترتیب در 2 لوله حاوی 50 میکرولیتر n-LDL و OX-LDL با غلظت‌های مختلف برای مدت 30 دقیقه انکوبه شد و سپس آن‌ها را با غلظت‌های مختلف ADP (µmol/mL 10، 1، 1/0)؛ مجاور کردیم تا میزان باند شدن فیبرینوژن به پلاکت‌ها را توسط فلوسیتومتری آزمایشگاه گروه ایمنولوژی دانشگاه علوم پزشکی ایران تعیین کنیم. لازم به ذکر است که قبل از آماده کردن دستگاه فلوسیتومتری برای جلوگیری از فعالیت بیشتر پلاکت‌ها، بلافاصله پس از افزودنADP ، با افزودن 100 میکرولیتر پارافرمالدئید10% به پلاکت‌ها, فعالیت آن‌ها را تثبیت کردیم.
با استفاده از برنامه آماری 16 SPSS و آزمونt- student و t زوجی، داده‌ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
یافته‌ها
از میان افرادی که مورد پژوهش قرار گرفتند و میزان کلسترول آن‌ها بالا بود، 55% مرد و بقیه از میان زنان انتخاب شدند. بر اساس میزان کلسترول، افراد در سه گروه تقسیم شدند:
گروه اول 14 نفر(کلسترول mg/dL 235-200)، گروه دوم 16 نفر(کلسترول mg/dL 270-236) و گروه سوم 12 نفر(کلسترول بالای mg/dL 270). نتیجه بررسی LDL اکسید شده نشان داد که میانگین جذب در طول موج 234 نانومتر، دو برابر شده است به نحوی که میزان جذب از 05/0 ± 45/0 OD= به 03/0 ± 98/0 OD= افزایش یافته است(14 n= ، 0008/0 p<).
اثر n-LDL غیر اکسیده یا طبیعی بر فعالیت پلاکت‌ها:
نتایج نشان داد که n-LDL نمونه‌ها همانند کنترل (پلاکت + بافر) در مجاورت ADPاثرات قابل توجهی بر روی فعالیت پلاکت‌ها نگذاشت. شکل 1، نشان‌دهنده نتایج
آزمایـش اگریگـاسیون پـلاکتی بـا n-LDL سـرم بیماران و
شکل 1 : عدم مشاهده اختلاف معناداری اگریگاسیون پلاکتی در مجاورت n-LDL سرم بیماران با 8% (منحنی 2) در مقایسه با کنترل(پلاکت + بافر) 6% (منحنی 1) که با 1 میکرومول ADP تحریک شده بودند(05/0 p<).
شکل 2: مشاهده 11% اگریگاسیون پلاکتی که در معرض n-LDL سرم بیماران با 10 میکرومول ADP قرار گرفتند.
شکل 3: افزایش تجمع پلاکتی در اثر تحریک OX-LDL و در غلظت 10 میکرومولADP در چهار نمونه که به ترتیب 40% ، 39%، 44% و 45% می‌باشد.
شاهد؛ منحنی 1 (کنترل) در مقایسه با منحنی 2 (n-LDL) که با 1 میکرومول ADP تحریک شده بودند نشان داده می‌شود. اثر n-LDL بر فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت ADP با غلظت بالاتر تاثیر چندانی نداشت که نشان‌دهنده فعالیت 11% پلاکتـی در مجـاورت n-LDL و 10 میکرومـول ADP
می‌باشد(شکل 2). اثر OX-LDL بر فعالیت پلاکت‌ها؛ با اضافه کردن ADP با غلظت‌های 10 و 1 و 1/0 میکرومول بر روی مخلوط OX-LDL و PRP و انکوبه کردن آن‌ها به مدت یک دقیقه، نشان داد که در غلظت‌های 1 و 1/0 میکرومول از ADP ، تجمع پلاکتی زیادی مشاهده نشد ولی با غلظت 10 میکرومول، تجمع یا اگریگاسیون تا 45% مشاهده گردید. شکل 3 نشان‌دهنده افزایش تجمع پلاکتی در اثر تحریک OX-LDL و در غلظت 10 میکرومول ADP می‌باشد. شکل 4 نشان‌دهنده میزان باند شدن پلاکت‌ها در مجاورت n-LDL ، OX-LDL و کنترل با غلظت‌های مختلف از ADP می‌باشد.
بررسی فلوسیتومتریک باندشدن فیبرینوژن به پلاکت‌ها در مجاورت OX-LDL :
کمپلکس گلیکوپروتئینی IIb/IIIa به عنوان رسپتور فیبرینوژن هنگام اضافه کردن آگونیست‌ها مثل ADP بیشتر بر سطح پلاکت بروز می‌کنند. در ابتدا برای مشخص کردن محل تجمع پلاکت‌ها، از Side Scatter بر Forward Scatter فلوسیتومتری استفاده شد. شکل 5 نشان‌دهنده جمعیت پلاکتی است که پس از فعال شدن با 10 میکرومولADP ،
به فیبرینـوژن بانـد شدنـد. بـرای مقایسـه اثر n-LDL با OX-LDL ، 50 میکرولیتر لیپوپروتئین را به مدت 30 دقیقه در مجاورت 50 میکرولیتر PRP انکوبه کرده با اضافه کردن غلظت‌های 1/0 ، 1 ، 10 میکرومول از ADP و 2 میکرولیتر از فیبرینوژن کونژوگه شده با FITC (Fluorescent Isothio Cyanide ) میزان باند شدن پلاکت‌ها بررسی شد. نتایج نشان داد که حداکثر میزان باند شدن پلاکت‌ها به فیبرینوژن در مجاورت 10 میکرومول ADP و mg/dL 20 لیپوپروتئینهای طبیعی و اکسید شده به ترتیب 82% بودند.
در شکل‌های 6 و 7 ، به ترتیب میزان باند شدن پلاکت‌ها به فیبرینوژن در مجاورت لیپوپروتئینهای طبیعی و اکسید شده را به ترتیب از روی میزان متوسط فلورسان فلوسیتومتریک{ Mean Fluorescence Intensive (MFI) { نشان می‌دهد.
شکل 4: تجمع پلاکتی در اثر تحریک OX-LDL ، n-LDLو کنترل در غلظت‌های مختلف ADP که بیشترین فعالیت پلاکتی در غلظت 10 میکرومول ADP متعلق به OX-LDL با میانگین فعالیت 45% در اکثر نمونه‌ها مشاهده می‌شود.
شکل 5: برای مشخص شدن پراکنش(Gating) پلاکت‌ها و فوروارد اسکتر آن‌ها با اضافه کردن 2 میکرولیتر آنتی‌فیبرینوژن آنتی‌بادی کونژوگه شده بهFITC استفاده شد. در این شکل پراکنش پلاکت‌ها در داخل پنجره(Gate) نشان داده شدند.
شکل 6: میزان MFI 8% نشان‌دهنده کاهش باند شدن پلاکت‌ها با فیبرینوژن در مجاورت n-LDL می‌باشد.
شکل 7: میزان MFI بیشتر از 82% نشان‌دهنده افزایش باند شدن پلاکت‌ها با فیبرینوژن در مجاورت OX-LDL می‌باشد.
بحث
امروزه مشخص شده افزایش میزان لیپوپروتئین‌ها با وزن مولکولی پایین LDL در بدن انسان به عنوان یک فاکتور خطر بیماری‌های قلبی عروقی مطرح می‌باشد. مکانیسم عمل آن در عروق متعدد است. مهم‌ترین آن‌ها ایجاد پلاک آترواسکلروزیس در جدار عروق و به دنبال آن ترومبوس‌های عروقی می‌باشد(13). در این پروسه فعالیت پلاکت‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار هستند. یکی از مواردی که در تحقیقات به آن اشاره شده، اکسید شدن LDL در بدن به مقدار کم می‌باشد. تغییرات جذب LDL اکسید شده در طول موج 234 نانومتر، نشان داد که LDL با مواد اکسیدان حتی با غلظت اندک تغییر ماهیت داده که این وضعیت می‌تواند موجب تغییرات در اعمال بیولوژیکی آن شود و یا با اثرگذاری بر بافت‌ها و یا سلول‌های دیگر، باعث تغییر در بافت‌های همجوار گردد(14). مواد اکسیدان فراوانی وجود دارند، انتخاب ما در این پروژه سولفات مس به خاطر سهولت انجام کار و تایید نهایی اکسید شدن LDL با فتومتر بود. لازم به ذکر است که مس در کنار لیپوپراکسیداز موجود در سرم، قادر به اکسید کردن LDL است.
نتایج به دست آمده در این پروژه نشان می‌دهد که LDL اکسید نشده یا طبیعیn-LDL)) به تنهایی و حتی با اضافه کردن آگونیست پلاکتی مثل ADP با غلظت‌های مختلف از 1/0 تا 10 میکرومول، موجب تجمع محسوس پلاکتی نشد. از آن جایی که آراشیدونیک اسید یکی از عوامل اصلی تجمع پلاکت‌ها می‌باشد، پس احتمال دارد که LDL طبیعی با اثرگذاری روی لیپیدهای پلاکتی باعث کاهش سرعت فعال شدن پلاکتی شود(16، 15). لازم به توضیح است که با افزایش مقدار n-LDL ، تجمع پلاکتی نیز حتی با غلظت بالای آگونیست کاهش می‌یابد. پس وجود اندک LDL موجود در پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) در مقایسه با LDL تهیه شده از سرم بیماران، تاثیر چندانی در آزمایش نداشت. چرا که نتایج کنترل‌ها بدون LDL نشان از تجمع طبیعی پلاکت‌ها داشت. بـا توجه به این کـه نتایج آزمایـش
فلوسیتومتریک فعالیت پلاکت‌ها در مجاورت n-LDL ، نشان از عدم باند شدن فیبرینوژن با سطح پلاکتی که حاصل آن تجمع می‌باشد داشت، در این آزمایش هم از غلظت‌های مختلف ADP استفاده شد که در قسمت روش‌ها توضیح داده شد. به نظر می‌رسد که n-LDL در این آزمایش، عمل پوششی را بر سطح پلاکت‌ها انجام داده و مانع از باند شدن فیبرینوژن و پلاکت‌ها شود. کولر و همکارانش نشان دادند کهLDL و HDL ، گیرنده‌های گلیکوپروتئینی IIb و IIIa را بلوک کرده و مانع از فعالیت پلاکت‌ها شدند(17). اگر چه امروزه مشخص شده است که عامل اصلی باند شدن فیبرینوژن بر سطح پلاکت‌ها، گلیکوپروتئین IIb/IIIa می‌باشد، ولی گفته می‌شود که اخیراً اسید آمینه‌ای در قسمتMotif RGD گلیکوپروتئین IIIa پیدا شده که شباهت‌هایی با ساختمان گیرنده Apo B/E که محل باند شدن LDL است دارد(19، 18).
انجام آزمایش تجمع پلاکتی با دستگاه اگریگومتری، با اضافه کردن آگونیست‌های پلاکتی می‌تواند نشان‌دهنده تشکیل ترومبوز در عروق باشد، به خاطر این که چرخاندن پلاسمای غنی از پلاکت در لوله‌های حاوی مگنت در دستگاه اگریگومتری، شباهت‌هایی با شدت جریان خون دارد، لذا با اضافه کردن ADP ، فعالیت پلاکت‌ها به واسطه (TXA2) بستگی به اگریگاسیون دارد و نه باند شدن فیبرینوژن(20). برخلاف n-LDL ، لیپوپروتئینهای اکسید شده(OX-LDL) موجب افزایش تجمع پلاکتی شدند. بیشترین فعالیت در غلظت mg/mL 20 از LDL و 10 میکرومول ADP نشان داده شده است. با توجه به وجود پراکسیداز در خون، احتمال اکسید شدن لیپیدها وجود دارد که یکی از علل تجمع پلاکتی و ایجاد پلاک لیپیدی می‌باشد .به نظر می‌رسد که OX-LDL توسط سلول‌های فومای پلاک آترواسکلروزیس آزاد و در گردش خون جریان پیدا می‌کند(21). از طرف دیگرOX-LDL باعث تحریک افزایش تولید و تجمع میکرووزیکول‌های پلاکتی شده و به دنبال آن موجب افزایش تجمع پلاکتی می‌شود، زیرا افزایش میکرووزیکول‌های CD36 مثبت موجب افزایش فعالیت پلاکت‌ها می‌شود. مجموعه میکرووزیکول CD36 موجب فعال شدن سیگنال MKK4/JNK2 می‌شود(22). به عبارتی OX-LDL باعث القای فسفوریلاسیون JNK2 و MKK4 وابسته به CD36 پلاکت‌ها توسط خانواده کینازهای src می‌شود(23). امروزه ثابت شده که میکرووزیکول‌های پلاکتی همانند دیگر میکرووزیکول‌ها تشکیل‌دهنده هسته اصلی پلاکت‌های پلاکتی و ترومبوس می‌باشند(24). کنستانتینوس استلوس و همکارانش در پروژه‌ای که روی بیماران مبتلا به سندرم حاد کرونر انجام دادند، مشاهده کردند که افزایش پلاکت‌های باند شده به OX-LDL در این بیماران نقش بارزی را در تشکیل آتروترومبوزیس ایفا می‌کند(24).
نتیجه‌گیری
افزایش چربی بد یا LDL در بدن با وجود مواد لیپواکسید فراوان در غذاها، احتمال تشکیل OX-LDL را زیاد می‌کند. از این رو می‌توان به عنوان یک مورد بالقوه جهت درمان و بیماران قلبی عروقی مورد نظر قرارداد.
از آن جا که بر سطح پلاکت‌ها گیرنده‌هایی برای اتصال LDL و HDL کلسترول وجود دارد، میزان بیان این گیرنده‌ها در بیماران آترواسکلروتیک حائز اهمیت است، لذا بررسی میزان بیان این گیرنده‌ها و عملکرد آن‌ها در این بیماران پیشنهاد می‌شود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله از معاونت فناوری و تحقیقات دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی به خاطر تصویب طرح و کمک مالی تشکر می‌نمایند. همین طور از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و مهندسی بافت دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی و مرکز هموفیلی ایران به خاطر همکاری بی‌دریغشان تشکر می‌شود.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
