غنی‌سازی کتابخانه نمایش فاژی علیه سلول‌های سرطانی سینه به منظور جداسازی آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری شناساگر فاکتور رشد اپیدرمالی2
فاطمه رحیمی جمنانی1، فاطمه رهبری‌زاده2، محمد علی شکرگزار3، داوود احمدوند4، فریدون مهبودی5
چکیده سابقه و هدف ریزش مارکرهای سرطانی مانند HER2 از سطح سلول‌های سرطانی سینه، باعث مخفی ماندن آنها از دید سلول‌های ایمنی می‌گردد. افزایش غلظت HER2 محلول(sHER2)، در نتیجه درمان سرطان سینه HER2+ و پاسخ به تراستوزومب، تاثیرگذار است. در همین راستا، آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری(VHH) به علت خصوصیات منحصر به فرد و توانایی بالا در شناسایی آنتی‌ژن، مواد هدفمند بسیار مؤثری در شناسایی sHER2 محسوب می‌گردند. مواد و روش‌ها در یک مطالعه تجربی، کتابخانه فاژی به دست آمده از دو شتر ایمن با انجام panning بر روی سلول‌های سرطانی فاقد HER2و بیان‌کننده HER2 ، علیه آنتی‌ژن HER2 غنی گردید. میزان افینیتی چهار VHH به دست آمده به HER2 ، شناسایی sHER2 و اتصال به HER2 بر روی سلول‌های سرطانی سینه توسط VHHها با الایزا مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها بعد از انجام panning بر روی سلول والایزا، چهار VHH با اتصال قابل ملاحظه به HER2 در مقایسه با کنترل منفی شناسایی شدند. VHHهای با افینیتی 1-M 1013-1012، توانایی بالایی نیز در شناسایی sHER2 (2 میکروگرم در میلی لیتر) نشان دادند. در اتصال به HER2 در سطح سلول، آنتی‌بادی‌های(VHH) 4RR و 6RR بالاترین میزان اتصال(به ترتیب 33/0 ± 2 و 15/0 ± 5/2) به سلول SKBR3 (بیان‌کننده HER2)را در مقایسه با سلول فاقد HER2 (به ترتیب 17/0 ± 38/0 و 12/0 ± 4/0) نشان دادند. نتیجه گیری استفاده از VHHهای اختصاصی HER2 برای سنجش sHER2 به عنوان بیومارکر، ارزیابی مناسبی از وضعیت HER2 در تومور اولیه و متعاقباً پاسخ به درمان می‌دهد. کلمات کلیدی:ژن‌ها، HER2 ، سرطان سینه
تاریخ دریافت : 30/2/92 تاریخ پذیرش : 18/9/92
1ـ PhD بیوتکنولوژی دارویی ـ استادیار مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران ـ تهران ـ ایران 2ـ مؤلف مسؤول: PhD بیوشیمی بالینی ـ دانشیار گروه بیوتکنولوژی پزشکی ـ دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 331-14115 3- PhD فرآورده‌های بیولوژیک ـ دانشیار بانک سلولی انستیتو پاستور ایران ـ تهران ـ ایران 4ـ PhD بیوشیمی پزشکی ـ استادیار دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران 5- PhD ایمونولوژی ـ دانشیار مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران ـ تهران ـ ایران
مقدمه خانواده گیرنده فاکتور رشد اپیدرمالی(HER = Human Epidermal growth factor Receptor یا HER family) از پروتئیـن‌های سطـح سلـول است که در انسان شامل HER1 ،HER2 ،HER3 و HER4 می‌باشد. اعضای خانواده HER از مدیاتورهای ضروری برای تکثیر و تمایز در جنین در حال رشد و بافت‌های بالغین محسوب می‌شوند که بیان بیش از حد و فعالیت نامناسب آنها با توسعه و شدت تعداد زیادی از سرطان‌ها مرتبط است(2، 1). HER2 از آنتی‌ژن‌های مهم در سرطان به شمار می‌آید زیرا بیان بیش از حد آن، باعث افزایش تکثیر سلول توموری، تشکیل رگ و خاصیت تهاجمی می‌گردد. بیان بیش از حد HER2 در 30%-25% از سرطانهایسینه و در سایر سرطان‌ها مانند تخمدان، رحم، معده، کولون، مغز و پانکراس نشان از اهمیت این آنتی‌ژن می‌باشد(3). آنتی‌ژن HER2 ، پروتئینی 1255 اسید آمینه است و دارای ناحیه خارج سلولی، دومین ترانس ممبرانی دوگانه‌دوست(آمفی پاتیک) و دومین درون سلولی تیروزین کینازی بسیار حفاظت شده(Conserved) می‌باشد(4). تاکنون لیگاندی برای آنتی‌ژن HER2 شناخته نشده ولی ترجیحاً به صورت رسپتور همراه(پارتنری) در هترودایمریزاسیون(به عنوان کورسپتور) برای سایر اعضای خانواده (EGFR یا HER3)، عمل می‌کند. همو یا هترودایمریزاسیون اعضای خانواده باعث ترانس فسفریلاسیون دومین تیروزین کیناز و سیگنال ترانس داکشن می‌گردد(5). بعد از گذشت ربع قرن از ساخت آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، امروزه آنتی‌بادی به عنوان یکی از پرکاربردترین عوامل درمانی علیه انواع بیماری‌های انسانی از جمله سرطان، محسوب می‌شود. آنتی‌بادی‌های نوترکیب بیش از 30% داروهای بیولوژیک را در آزمون‌های بالینی تشکیل می‌دهند و پیش‌بینی شده است که فروش آنتی‌بادی‌ها به حدود 30 بیلیون دلار در سال‌های اخیر برسد(7، 6). در سال 1993 نوع منحصر به فردی از آنتی‌بادی‌های فاقد زنجیره سبک در سرم انواع شترهای یک کوهانه و لاما شناسایی شد(شکل 1)(8). آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری (VHH = Variable domain of camel heavy-chain antibody) به علت اختصاصیت، افینیتی بالا و اندازه کوچک برای مورد هدف قرار دادن آنتی‌ژن‌ها در مکان‌های مسدود نظیر تومورها که نفوذ دارو به آنها به علت وضعیت نامناسب عروقی مشکل می‌باشد، بسیار مناسب هستند(9، 8). VHHها از لحاظ ایمنی‌زایی بسیار ضعیف می‌باشند به طوری که در مطالعه‌های بالینی، تجویز مکرر آنها منجر به هیچ پاسخ ایمنی سلولی یا همورالی قابل توجهی نشده است(10، 8). آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری بسیاری علیه انواع آنتی‌ژن‌های سرطانی از جمله MUC1(MUCin1) ، EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)، VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor) و اندوگلین تولید شده‌اند که با نتایج امید بخشی در مهار سلول‌های سرطانی همراه بوده‌اند (12-10).
شکل 1: نمای شماتیکی از آنتی‌بادی IgG (1)، آنتی‌بادی زنجیره سنگین(2) و تک دومینی شتری(3)
از جمله مسیرهای فرار سلول‌های توموری سینه از دید اجزای سیستم ایمنی، ریزش آنتی‌ژن‌های سرطانی مانند HER2 می‌باشد(15-13). فرم ریزش‌یافته آنتی‌ژن HER2 در سرم افراد بیمار، دید مناسبی از روند سرطان و درمان در بیماران می‌دهد. در همین راستا در این مطالعه، برای اولین بار پنلی از آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری به منظور هدف قرار دادن ناحیه خارج سلولی آنتی‌ژن HER2 (sHER2)، شناسایی و تعیین خصوصیت گردید.
مواد و روش‌ها تکثیر کتابخانه و تخلیص ذرات فاژی: در یک مطالعه تجربی کتابخانــه فاژی pComb3X قطعه cDNA آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری به دست آمده از شترهای ایمن شده با عصاره بافت‌های سرطانی سینه انسانی، علیه آنتی‌ژن HER2 بر روی سلول‌های سرطانی سینه غنی گردید(17، 16). بدین ترتیب که ابتدا 20 میکرولیتر از کتابخانـه ژنـی شتـری به 5 میلی‌لیتر محیط حاوی باکتریE. coli TG1 (استراتاژن) در وضعیت رشد لگاریتمی (1=OD600) افزوده شد. ناقل فاژمیدی pComb3X دارای ژن مقاومت به آمپی‌سیلین می‌باشد به همین منظور 8 میکرولیتر آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین(50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) در دو نوبت و به فاصله 30 دقیقه اضافه شد. سپس 100 میکرولیتر فاژ کمکی M13KO7 (GE Healthcare) دارای ژن مقاومت به کانامایسین اضافه و انکوباسیون به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. محتویات لوله‌های حاوی باکتری‌های دارای فاژ به ارلن 100 میلی‌لیتری منتقل شد و حجم به 25 میلی‌لیتر افزایش یافت. آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین و کانامایسین برای حجم مورد نظر اضافه گردید و انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 16 ساعت صورت گرفت. محتویات ارلن به لوله‌های سانتریفوژ انتقال یافت و سانتریفوژ(3800 دور به مدت 20 دقیقه) انجام شد. فاژهای موجود در مایع‌رویی با استفاده ازپلیاتیلن گلایکول 6000 ، نمک کلرید سدیم 5/2 مولار در آب (روی یخ) و سانتریفوژ(18000 دور به مدت 15 دقیقه)، رسوب داده شدند. فاژهای تغلیظ شده بر روی دیواره با 1 میلی‌لیتر شیر خشک بدون چربی در فسفات بافر سالین(4%)(MPBS = Skim Milk in phosphate – buffered saline) شسته و جمع‌آوری شدند.
غنی‌سازی کتابخانه فاژی با انجام panning بر روی سلول: روند panning سلولی با (mL/cfu) 1014 از فاژ بر روی سلول‌های فاقد آنتی‌ژن HER2 (HepG2) و سپس بیان‌کننده آنتی‌ژن HER2 (SKBR3 = Human breast cancer cell line) آغاز شد. سلول‌های HepG2 و SKBR3 (بانک سلولی انستیتو پاستور ایران) در فلاسک‌های 75 سانتی‌متر مربع دارای محیط DMEM (جیبکو)، آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین(100 واحد در میلی‌لیتر)، استرپتومایسین (100 میکروگرم در میلی لیتر) و گلوتامین (2 میلی‌مولار) کشت داده و بعد از رسیدن به تراکم 90%، تریپسینه (025/0% تریپسین در EDTA وزنی/حجمی) شدند. بعد از شمارش سلول‌ها با لام نئوبار و رنگ‌آمیزی تریپان‌بلو، 106 ×6/2 سلول HepG2 و 106×4/1 سلول SKBR3 (در 1 میلی لیتر MPBS (5%))، به فالکون 15 انتقال داده و بلاکینگ به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. بعد از سانتریفوژ (1000 دور به مدت 4 دقیقه)، مایع رویی را دور ریخته و رسوب سلولی HepG2 با کتابخانه فاژی تکثیر یافت و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید. انکوباسیون سلول‌های HepG2 با کتابخانه فاژی، جهت حذف فاژهای غیراختصاصی می باشد. سلول‌های HepG2 (منفی) و SKBR3 (مثبت) سانتریفوژ شدند، مایع رویی سلول منفی به رسوب سلول مثبت انتقال یافت و انکوباسیون به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. لوله حاوی سلول‌های مثبت سانتریفوژ(1000 دور به مدت 4 دقیقه) شد. رسوب سلولی در 2 میلی لیتر MPBS معلق و مجدداً سانتریفوژ(1000 دور به مدت 4 دقیقه) گردید. این چرخه شستشو 3 بار با MPBS و 3 بار با PBS سرد تکرار شد. جداسازی فاژهای اختصاصی متصل به سلول‌های SKBR3 با 1 میلی‌لیتر تری اتیل آمین (100 میلی‌مولار) به مدت 4 دقیقه در دمای اتاق صورت گرفت. محلول حاصل با 1 میلی‌لیتر تریس ـ هیدروکلراید خنثی، سانتریفوژ(1000 دور به مدت 5 دقیقه) گردید. مایع رویی به 5 میلی‌لیتر باکتری E. coli TG1 در فاز لگاریتمی اضافه شد. مراحل تکثیر با افزودن فاژ کمکی و تخلیص با پلی‌اتیلن گلایکول صورت گرفت. panning برای دو دور دیگر ادامه یافت بدین ترتیب که در دور دوم تعداد شستشو به میزان 6 بار با MPBS ، 6 بار با PBS سرد و و 8 بار در دور سوم افزایش یافت.
شناسایی فاژهای اختصاصی آنتی‌ژن HER2 : بعد از انجام سه دور panning و تکثیر فاژهای اختصاصی آنتی‌ژن HER2 ، نهایتاً سه Input و سه Output به دست آمد که وارد سنجش پلی‌کلونال فاژ الایزا شدند. ابتدا چاهک‌های پلیت 96 خانه با آنتی‌بادی بزی علیه Fc آنتی‌بادی IgG انسانی(سیگما) پوشش داده شدند و سپس آنتی‌ژنrecombinant HER2-Fc chimera (R&D systems) (100 نانوگرم به ازای 100 میکرولیتر در هر چاهک) به آنها افزوده شد. بعد از انکوباسیون با ماده بلاکینگ (MPBS (5%)) به مدت 1 ساعت، Input های 1 تا 3 به چاهک‌های تعیین شده اضافه و به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. بعد از شستشو با تویین 20 در PBS (05/0%)، آنتی‌بادی علیه M13 متصل به آنزیم HRP (رُوش) افزوده شد. بعد از انکوباسیون به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد، پلیت را شسته و ماده TMB اضافه گردید. توقف واکنش با هیدروکلریک اسید صورت گرفت و میزان جذب نوری(1 = OD) در طول موج 450 نانومتر توسط دستگاه سنجش الایزا (ELISA-Reader) (آمریکا، 2100 STAT FAX) خوانده شد. سنجش پلی‌کلونال فاژ الایزا برای یافتن Input با بالاترین میزان تفاوت سیگنال با کنترل منفی(آلبومین سرم گاوی (BSA)، صورت گرفت. Input مورد نظر در باکتری TG1 تکثیر و سپس به پلیت دارای آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین منتقل گردید. مونوکلونال فاژ الایزا برای تک تک کلون‌ها انجام شد. بدین ترتیب که تک کلون برداشته شده با کمک فاژ کمکی تکثیر یافت و مانند پلی‌کلونال فاژ الایزا، اختصاصیت فاژهای تخلیص شده از تک کلون‌ها به آنتی‌ژن HER2 مورد بررسی قرار گرفت.
ارزیابی عملکرد آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری اختصاصی آنتی ژن HER2 : فاژهای تخلیص شده از تک کلون‌ها با بیشترین میزان اختلاف با کنترل منفی(چاهک دارای آلبومین سرم گاوی) به درون باکتری غیر سرکوبگر Rosetta gami IIE. coli (نواژن) انتقال یافت. بعد از تکثیر یافتن باکتری‌ها و رسیدن جذب نوری به 9/0 در طول موج 600 نانومتر، القا با IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalacto pyranoside) یک میلی‌مولار صورت گرفت. برای جداسازی پروتئین‌های سیتوپلاسمی، رسوب باکتریایی سونیکه (3 بار برای 1 دقیقه و فاصله 30 ثانیه در یخ) انجام و سوسپانسیون حاصله سانتریفوژ (15000 دوربرای 20 دقیقه در 4 درجه سانتی‌گراد) شد. اختصاصیت آنتی‌بادی‌های تک دومین شتری (VHH) موجود در مایع رویی به آنتی‌ژن HER2 در مقایسه با کنترل های منفی(چاهک‌های دارای آلبومین سرم گاوی و آنتی‌بادی بزی علیه ناحیه Fc آنتی بادی IgG انسانی) بـا استـفـاده از روش الایــزا و آنـتـی‌بـادی عـلیه هماگلوتینین(HA) متصل به HRP (رُوش)مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از آغازگرهای طراحی شده برای نواحی FR (Frame work) یک و چهار، کلونی - PCR بر روی کلون‌های حاوی فاژمیدهای دارای VHH با اختصاصیت بالا به آنتی‌ژن HER2 صورت گرفت: آغازگر: VHH-for: 5'-GAC TAG TGC GGC CGC GTG AGG AGA CGG TGA CCTG-3' آغازگر: VHH-Back: 5'-CGC GGA TCC AAT GGC CGA KGT SGA GCT-3' برای تایید، فاژمیدهای دارای VHH از کلون‌های منتخب تخلیص و برای تعیین توالی فرستاده شدند. روش‌های SDS-PAGE با استفاده از ژل آکریلامید 12% و وسترن بلات با استفاده از آنتی‌بادی علیه HA متصل به HRP بر اساس دستورالعمل استاندارد انجام گرفت. افینیتی VHHهای اختصاصی آنتی‌ژن HER2 ، با روش Beatty محاسبه شد(18). در این روش دو رقت (10 و 100 نانوگرم به ازای هر چاهک) از آنتی‌ژن HER2 و آلبومین سرم گاوی در چاهک‌های پلیت 96 خانه استفاده شد و غلظت‌های فزاینده(10، 25، 50 و 100 نانومولار) از VHH به چاهک‌ها اضافه گردید. آنتی‌بادی علیه HA متصل به HRP را افزوده و فعالیت آنزیم پراکسیداز با سوبسترا TMB سنجیده شد. ثابت افینیتی(Kaff) آنتی‌بادی به آنتی‌ژن HER2 بر اساس فرمول زیر محاسبه گردید. n= Ag/Aǵ Kaff= n–1/2 (n [Nb́]−[Nb]) در این فرمول، Ag ؛ میزان آنتی‌ژن مورد استفاده در چاهک (100 نانوگرم) Ag' ؛ میزان آنتی‌ژن مورد استفاده در چاهک(10 نانوگرم) VHH ؛ غلظت VHH در حداکثر اتصال به آنتی‌ژن VHH' ؛ غلظت VHH در نصف حداکثر اتصال به آنتی‌ژن بـرای سنجــش قدرت شناسایی آنتی‌ژن HER2 محلول توسط آنتی‌بادی‌های شتری، دو سری از چاهک‌های پلیت 96 خانه از آنتی‌ژن HER2 (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) پوشیده شد. آنتی‌بادی شتری(400 نانوگرم در میلی‌لیتر) به همراه غلظت‌های افزایشی از آنتی‌ژن HER2 محلول و آنتی‌ژن MUC1 محلول (02/0 ، 2/0 و 2 میکروگرم در میلی لیتر) به ترتیب به چاهک‌های سری اول و دوم افزوده شد. حداکثر اتصال(0% مهار) برای آنتی‌بادی‌هایی که به آنتی‌ژن کف چاهک متصل و حداقل اتصال(100% مهار) برای آنتی‌بادی‌هایی که متصل به آنتی‌ژن محلول مانده‌اند، در نظر گرفته شد. اتصال آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری به آنتی‌ژن HER2 بر روی سلول SKBR3 (HER2+) و HepG2 (HER2-) نیز مورد بررسی قرار گرفت. بدین ترتیب که پس از رسیدن تراکم سلولی به 90%، سلول‌ها با متانول خالص به مدت 10 دقیقه بر روی یخ تثبیت شدند و سپس با MPBS ، بلاکینگ انجام گرفت. آنتی‌بادی‌های شتری (5/0 میکروگرم در میلی‌لیتر از هر آنتی‌بادی) را افزوده و انکوباسیون به مدت 1 ساعت انجام شد. ادامه سنجش با افزودن آنتی‌بادی علیه HA متصل به HRP صورت گرفت.
تحلیل آماری: تحلیل‌های آماریبا استفاده از نرم‌افزار آماری 16 SPSS صورت گرفت. گروه‌های مختلف آزمایش در مطالعه با استفاده از آزمون کروسکال ـ والیس مقایسه شدند. مقایسه بین گروهی بر اساس آزمون آماری من‌ویتنی انجام گرفت و 05/0p< به عنوان معنادار در نظر گرفته شد. تمامی مراحل آزمایش‌ها و روش‌های مورد استفاده به صورت سه تایی(تریپلیکیت) انجام گرفتند.
یافته‌ها کتابخانه نمایش فاژی pComb3X در باکتری‌های TG1 با فاژ کمکی M13KO7 تکثیر شد. تعداد 1014×1 از فاژهای تکثیر شده برای شروع panning بر روی سلول‌های سرطانی سینه بیان‌کننده آنتی‌ژن HER2 به کار رفت. طی اولین دور از panning ، تقریباً 109 از فاژهای غیر اختصاصی در اثر شستشو خارج شده و به 105×6 رسید. فاژهای حاصل از اولین دور panning را مجدداً در باکتری TG1 و با فاژ کمکی تکثیر داده و این بار با 1013×5 فاژ (2Input)، مرحله دوم panning آغاز گردید. در دورهای دوم و سوم با افزایش تعداد دور شستشو و متعاقباً سانتریفوژ، میزان Output به ترتیب به 106×4 و 106×8 رسید(جدول 1). سه Output و Input در پلی‌کلونال فاژ الایزا مورد بررسی قرار گرفتند (جدول 2). دور سوم دارای Output (05/0±49/0) و Input (1/0±553/0) با اختلاف OD مشخص، در مقایسه با کنترل منفی آلبومین سرم گاوی بود. از Output و Input سوم، برای انجام منوکلونال فـاژ الایـزا استفــاده شد. بعـد از سنجـش 20 کلون از سه
جدول 1: نتایج Input و Output حاصل از panning بر روی سلول‌های HepG2 (منفی) و سپس SKBR3 (مثبت)
Panning بر روی سلول
دور اول
دور دوم
دور سوم
Input
1014 * 1
1013 * 5
1013 * 6
Output
105 * 6
106 * 4
106 * 8
جدول 2: نتایج پلی‌کلونال فاژ الایزا دورهای اول تا سوم panning بر روی آنتی‌ژن نوترکیب HER2 و کنترل منفی BSA . نتایج به صورت اختلاف OD بین آنتی‌ژن و کنترل نشان داده شد(SD±Mean ، 05/0 p<).
دورها
Input
Output
1
15/0 ± 324/0
1/0 ± 278/0
2
05/0 ± 4/0
08/0 ± 37/0
3
1/0 ± 553/0
05/0 ± 49/0
Output و 30 کلون از سه Input، نهایتاً چهار کلون که بیشترین اختلاف را با کنترل نشان می‌دادند(آلبومین سرم گاوی) به Rosetta gami II برای تولید آنتی‌بادی تک دومینی شتری محلول انتقال یافتند(نمودار 1). بعد از تایید مجدد فرم‌های محلول با الایزا و تعیین توالی، چهار کلون 4RR ، 6RR ، 10 RRو 16RR که توالی‌های منحصر به فـردی نشـان دادنـد، مـورد ارزیابی بیشتر قرار گرفتند(ثبت شده در Genebank به ترتیب JX 576799 ، JX 576800 ، JX 576801 و JX 576803). با انجام کلونی-PCR بر روی چهار کلون حاصله(با آغازگرهای طراحی شده برای FR یک و چهار)، قطعات تقریباً 400 - 380 جفت بازی بر روی ژل آگارز مشاهده گردید(شکل 2). با انجام روش‌های SDS-PAGE و وسترن بلات، آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری با وزن 17 کیلو دالتون مورد تایید قرار گرفتند. بر اساس روش Beatty ، افینیتی آنتی‌بادی‌های 4RR و 6RR به آنتی ژن HER2 ، 1-M 1012 × 4/5 و 1-M 1012 × 5/7 و افینیتی آنتی‌بادی‌های 10RR و 16RR به آنتی‌ژن HER2 ،1M- 1010 × 2/0 و 1M- 1010 × 6/0 به دست آمد. آنتی‌بادی‌های شتری با افینتی بالا 4RR و 6RR ، توانایی بیشتری در شناسایی آنتی‌ژن محلول از خود نشان دادند به طوری که در غلظت 2 میکروگرم در میلی‌لیتر از آنتی‌ژن محلول تقریباً 100% مهار صورت گرفته و هیچ اتصالی بین آنتی‌بادی مورد نظر و آنتی‌ژن HER2 در کف چاهک مشاهده نشد. آنتی‌بادی‌های 10RR و 16RR با افینیتی متوسط هم
توانایی شناسایی آنتی‌ژن HER2 محلول را نشان دادند. ضمن این که در حضور آنتی‌ژن MUC1 محلول، آنتی‌بادی‌هـای مـورد آزمایـش حداکثر اتصال را به آنتی‌ژن HER2 در کف چاهک داشتند(نمودار 2).
شکل 2: نتایج الکتروفورز حاصل از کلونی- PCR آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری. به ترتیب از راست به چپ: مارکر(M)، 4RR (1)، 6RR (2)، 10RR (3) و 16RR (4) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای نواحی FR یک و چهار و ایجاد قطعات 400-380 جفت بازی.
نمودار 1: نتایج الایزا چهار آنتی‌بادی تک دومینی شتری بر روی آنتی‌ژن نوترکیب HER2 و کنترل منفی(BSA و آنتی‌بادی بزی علیه ناحیه Fc انسانی). بر اساس آزمون آماری Mann–Whitney ، تفاوت معناداری در اتصال آنتی‌بادی‌ها به آنتی‌ژن HER2 در مقایسه با کنترل منفی وجود دارد(± SDMEAN ، 05/0p<).
نمودار 2: میزان اتصال آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری به آنتی‌ژن HER2 در کف چاهک و آنتی‌ژن HER2 محلول و MUCI محلول(MEAN ± SD ، 05/0 p<)
نمودار 3: نتایج حاصل از اتصال آنتی بادی‌های تک دومینی شتری به آنتی‌ژن HER2 بر روی سلول HER2+ (SKBR3) و سلول HER2- (HepG2). بر اساس آزمون آماری من‌ویتنی، تفاوت معناداری در اتصال آنتی‌بادی‌ها به سلولمثبت(SKBR3) در مقایسه با سلول کنترل (HepG2) وجود دارد(± SDMEAN ، 05/0p <).
در اتصال به سلول‌های سرطانی، آنتی‌بادی‌های 4RR و 6RR بالاترین میزان اتصال به سلول SKBR3 را نشان دادند اما به سلول‌های منفی هم متصل شدند. اگر چه آنتی‌بادی‌های 10RR و 16RR در اتصال به SKBR3 ، میـزان OD کمتـری نسبـت بـه آنتی‌بادی‌های 4RR و 6RR نشان دادنـد امـا هیـچ اتصالـی بــا سلول هـای منفـی نداشتنــد (نمودار 3).
بحث آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری، کوچکترین قطعه آنتی‌بـادی متصـل شــونـده بـه آنتـی‌ژن هستـنـد کـــه از آنتـی‌بـادی‌هـای زنجیـره سنگیـن فاقد زنجیره سبک شتری مشتق می‌گردند(شکل 2). قطعه کامل آنها به طور تقریبی 5/2 نانومتر قطر و 4 نانومتر طول و وزنی در حدود 15-12 کیلو دالتون دارد(10). خصوصیات منحصر به فرد آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری منجر به برتری آنها نسبت به آنتی‌بادی‌های درمانی متداول از جمله: توانایی شناسایی اپی‌توپ‌های مخفی و نامعمول، توانایی اتصال به حفرات یا جایگاه فعال پروتئین‌ها، انعطاف‌پذیری مناسب برای تبدیل به اشکال دارویی، ایمنی‌زایی بسیار ضعیف و نهایتاً آسانی تولید شده است. خصوصیات بیوفیزیکی و دارویی مناسب آنتی‌بادی‌های تک دومینیشتری به همراه قابلیت تبدیل آنها به پروتئین‌های درمانی چند کاره، باعث گردیده است تا از آنها به عنوان نسل جدیدی در درمان بر پایه آنتی‌بادی یاد شود(20، 19، 9). در همین راستا، در این مطالعه آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری اختصاصی آنتی‌ژن HER2 از کتابخانه فاژی جداسازی و تعیین خصوصیت گردید(23-21). طی دو مطالعه در کشورهای ایران و بلژیک، آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری متفاوتی علیه آنتی‌ژن HER2 به دست آمد(25، 24). آنتی‌ژن HER2 دارای ناحیه خارج سلولی بزرگ(630 اسید آمینه) و متعاقباً اپی‌توپ‌های متنوعی می‌باشد. به طوری که می‌توان تعداد زیادی آنتی‌بادی با خصوصیات متنوع علیه قسمت‌های مختلف آنتی‌ژن HER2 به دست آورد. به همین منظور، پنلی از آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری دارای افینیتی و اختصاصیت بالا به آنتی‌ژن HER2 با توالی‌های متفاوت و
منحصر به فرد از سایر آنتی‌بادی‌های تک دومین شتری گزارش شده علیه HER2 توسط گروه تحقیقاتی ما به دست آمد. از جمله آزمایش‌های مهم قبل از شروع درمان سرطان سینه با تراستوزومب، بررسی میزان پاسخدهی بیمار به درمان با این آنتی‌بادی می‌باشد(14). تراستوزومب از طریق اتصال به دومین نزدیک غشایی HER2 ، باعث از بین بردن سلول‌های سرطانی می‌شود(26). در این راستا سلول‌های سرطانی برای رهایی از این آنتی‌بادی، شروع به ریزش قسمت خارج سلولی مولکول HER2 (HER2 محلول) می‌کنند و نوع مهاجم‌تری از سلول‌های سرطانی مقاوم به تراستوزومب، ایجاد می‌کنند(13). به همین دلیل قبل از درمان پرهزینه با تراستوزومب باید میزان HER2 محلول مورد بررسی قرار گیرد(شکل 3). آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری به دست آمده در این مطالعه به علت افینیتی بالا، توانایی شناسایی آنتی ژن HER2 محلول در سرم بیماران با سرطان سینه را نیز دارا می‌باشند(وجود آنتی‌ژن محلول در اثر ریزش ناحیه خارج سلولی HER2 از سطح سلول‌های سرطانی سینه، نشانه عدم پاسخگویی به آنتی‌بادی تراستوزومب خواهد بود). از این رو پیشنهاد می‌شود مطالعه‌های بیشتری جهت استفاده از آنتی‌بادی‌های شتری به دست آمده در کیت‌های تشخیصی نظیر الایزا برای اندازه‌گیری HER2 محلول(به عنوان مارکر تشخیصی و پیش‌آگهی در طول دوره درمانی)، صورت گیرد(19).
تراستوزومب
آنتی‌بادی تک دومینی شتری
آنتی‌ژن HER2
شکل 3: نمای شماتیکی از آنتی‌ژن HER2 ، آنتی بادی تراستوزومب و آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری
نتیجه‌گیری در انتها، اتصال آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری به آنتی‌ژن HER2 ، مانع از تشکیل دایمرهای HER2 با سایر مولکول‌های HER2 یا سایر اجزای خانواده HER (HER1 ، HER3 و HER4) و هم چنین مانع از ریزش قسمت خارج سلولی HER2 می‌شود. تولید آسان آنتی‌بادی‌های تک دومینی و قدرت هدف‌گیری بالای آنها، موجب می‌گردد تا مقادیر کمتری از آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری برای تزریق مورد استفاده قرار گیرد و متعاقباً عوارض جانبی کمتر و هزینه پایین‌تری را به دنبال داشته باشد. آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری به دست آمده در این مطالعه در دو زمینه کاربرد دارند: 1- استفاده در ناحیه خارج سلولی گیرنده سلول T جهت تولید سلول‌های
مهندسی شده با قدرت شناسایی و کشندگی بالا علیه سلول‌های سرطانی سینه. 2- استفاده از آنتی‌بادی‌های تک دومینی شتری علیه آنتی‌ژن HER2 در شناسایی آنتی‌ژن محلول موجود در سرم بیماران با سرطان سینه برای آگاهی از شروع درمان با تراستوزومب و ارزیابی روند درمان.
تشکر و قدردانی این مقاله برگرفته از طرح مصوب تحت عنوان «سلول درمانی سرطان سینه توسط سلول‌های T لنفوسیت واجد گیرنده‌هـای کایمریک اختصاصی علیه آنتی‌ژن‌های HER2 ، TAG72 و MUC1» به شماره ثبت 67-8-88-TMU می‌باشد که با حمایت مالی انستیتو پاستور ایران و دانشگاه تربیت مدرس انجام شده است.
Rahimi Jamnani F, Rahbarizadeh F, Shokrgozar M, Ahmadvand D, Mahboudi F. Enrichment of phage display library against breast cancer cells for isolation of anti-HER2 camelid single domain antibodies . Sci J Iran Blood Transfus Organ 2014; 11 (2) :126-136 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-755-fa.html
رحیمی جمنانی فاطمه، رهبری‌زاده فاطمه، شکرگزار محمد علی، احمدوند داوود، مهبودی فریدون. غنی سازی کتابخانه نمایش فاژی علیه سلول های سرطانی سینه به منظور تولید آنتی بادی های تک دومینی شتری شناساگر فاکتور رشد اپیدرمالی 2. فصلنامه پژوهشی خون. 1393; 11 (2) :126-136
