اثر اپینفرین بر بیان ژن CXCR4 در سلولهای بنیادی خونساز CD34+ خون بند ناف فخرالدین صبا1، الهام روشندل2، مسعود سلیمانی3، امیر آتشی4، احمد قرهباغیان5، سعید آبرون6، سعید کاویانی6
چکیده سابقه و هدف امروزه از سلولهای خونساز خون محیطی جهت درمان بسیاری از سرطانهای خونی استفاده میشود. با این وجود، هنوز مکانیسم G-CSF به طور کامل مشخص نشده و اعتقاد بر این است که G-CSF بیشتر دارای عملکرد غیر مستقیم است. سرکوب سیستم عصبی، خروج سلولهای خونساز به خون محیطی را حتی در حضور تزریق G-CSF متاثر میکند. ژن اصلی تنظیمکننده حرکت سلولهای خونساز، CXCR4 است که به لیگاند SDF-1 متصل میشود. این مطالعه با هدفاثر کاتکول آمین اصلی سیستم عصبی- اپینفرین- بر بیان ژن CXCR4 طراحی گردید. مواد و روشها در یک مطالعه تجربی، بعد از جداسازی سلولهای CD34+ خون بند ناف 20 نوزاد سالم درانتهای هفته 36 بارداری با روش (Magnetic Cell Sorting of human cells) MACs ، سلولهای با دوز 10 میکرومولار اپینفرین و 1 میکرومولار پروپرانولول تیمار شدند و در بازهای زمانی 1، 3 و 5 ساعت،ارزیابی ژن CXCR4 با استفاده از qRT-PCR انجام شد.بیان کیفی گیرندههای β آدرنرژیک سلولهای CD34+ با روش RT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. یافتهها گیرندههای β آدرنرژیک بر روی سلولهای CD34+ بیان شدند. اپینفرین منجر به افزایش معنادار CXCR4 در ساعت اول(5/0 ± 2/3)، سوم(4/0 ± 4/2) و پنجم(4/0 ± 4/2) شد. همچنین مواجهه با پروپرانولول منجر به خنثی شدن اثر اپینفرین در القای بیان CXCR4 گردید. نتیجه گیری G-CSF با افزایش ترشح اپینفرین در مغز استخوان، به طور غیر مستقیم بر بیان ژن CXCR4 اثر دارد که چنین افزایشی به واسطه گیرندههای β آدرنرژیک صورت میگیرد و در نهایت به سمت SDF-1های ترشحی در خون محیطی حرکت میکنند. کلمات کلیدی:سلولهای بنیادی خونساز، اپینفرین، فاکتور محرک کلنی گرانولوسیت، گیرنده CXCR4
تاریخ دریافت : 31/2/92 تاریخ پذیرش : 20/3/93
1- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران 2- کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون ـ دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران 3- مؤلف مسؤول: PhD هماتولوژی و بانک خون ـ دانشیار دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 111-14115 4- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ استادیار دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران 5- PhD ایمونوهماتولوژی بالینی ـ استاد دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیماریهای مادرزادی خونی کودکان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران 6- PhD هماتولوژی و بانک خون ـ دانشیار دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس ـ تهران ـ ایران
مقدمه جایگاه سلولهای بنیادی خونساز (HSC = Hematopoietic Stem Cell ) در بالغین، مغز استخوان میباشد؛ این سلولها تولید انواعی از ردههای خونی را بر عهده دارند(1). یکی از ویژگیهای بارز این سلولها قدرت حرکت از مغز استخوان به خون محیطی و توانایی برگشت به داخل مغز استخوان است(2). مطالعهها نشان داده است حرکت HSC به صورت پیوسته و وابسته به متغیرهای شبانهروزی است؛ به طوری که روشنایی و یا تاریکی بر روی ورود HSC به خون محیطی یا ماندگاریشان در مغز استخوان تاثیر دارد(3). تغییرات شبانهروزی توسط سیستم عصبی تنظیم میگردد(3). مطالعهها نشان داده است که کاتکول آمینها نقش مهمی در خروج HSCs از مغز استخوان بازی میکنند؛ به طوری که حذف پایانههای عصبی در بستر مغز استخوان، منجر به کاهش شدید خروج HSC شده که در چنین شرایطی تزریق فاکتور تحریکی G-CSF (Growth-Colony Stimulating Factor) تاثیری در افزایش خروج HSCs از مغز استخوان نخواهد داشت(6-4). پایانههای عصبی به همراه شریانهای عروقی به داخل مغز استخوان نفوذ کرده و ارتباط نزدیکی را با نیچهای استخوانی و اندوتلیالی ایجاد میکنند(7). مهمترین کاتکول آمینهایی که از پایانههای عصبی ترشح میشوند، شامل اپینفرین، نوراپینفرین و دوپامین هستند که بر روی انواعی از گیرندههای α و β اثر میگذارند(8). گیرندههای α و β جزء گیرندههای جفت شونده به پروتئین G بوده و دارای مسیر سیگنالی cAMP/PKA (Protein Kinase A) میباشند(8). مهمترین گیرنده عصبی بر روی HSCs و استرومایی مغز استخوان، نوع β است و گفته میشود 2β بیشترین اثر عصبی را بر روی این سلولها دارد(9). با این وجود انواع 1β، 3βو α نیز حایز اهمیت هستند، اگر چه دادههای اندکی در این زمینه وجود دارد. از اوایل سال 2000 مطالعهها و تحقیقات گستردهای در زمینه عملکرد کاتکول آمینها بر روی HSCs صورت گرفته است اما ارتباط بین سیستم عصبی با سایتوکاینها، آنزیمها و مولکولهای چسبنده دخیل در حرکت HSC ، هنوز به طور کامـل مشخـص نشـده و سـؤالهای بسیاری در این زمینه بدون پاسخ باقی مانده است. یکی از مهمترین مولکولهای دخیل در خروج HSCs از مغز استخوان، CXCR4 است که به لیگاند خود SDF1 (Stromal Cell Derived-Factor1) متصل میشود(10). مولکول CXCR4 بر روی انواعی از سلولهای بنیادی خونساز CD34+ یا CD133+ مغز استخوان، خون محیطی و بند ناف بیان میشود(11). ارتباط بین CXCR4 و SDF-1 در فرآیند حرکت HSC بسیار مهم بوده و قطع این ارتباط میتواند منجر به رها شدن HSCs از مغز استخوان به خون محیطی شود(12). مطالعهها بیانگر آن است که حرکت HSCs وابسته به غلظت CXCR4 و SDF1 میباشد به طوری که گرادیانت غلظتی بین این 2 مولکول منجر به حرکت HSCs میگردد(12). در ضمن حرکت HSCs ، SDF-1 توسط سلولهای اندوتلیال مغز استخوان به خون محیطی ترشح شده و سبب جذب سلولهای CXCR4+ به طرف لیگاند مترشحه میشود(13). استفاده از آنتیبادیهای مهاری SDF-1 یا CXCR4 منجر به کاهش حرکت HSCs متعاقب تزریق محرکهایی مثلAMD3100) ) Plerixafor و G-CSF به خون محیطی میشود(13). با وجود افزایش بیان ژن CXCR4 به دنبال تزریق5 روزه G-CSF ، چنین تغییر بیانیدر مواجهه مستقیم سلولهای CD34+ با G-CSF در شرایط آزمایشگاهی دیده نشده است(14، 10). بنابراین، این احتمال وجود دارد که G-CSF به واسطه مکانیسمهای غیر مستقیم همچون سیستم عصبی منجر به تغییر بیان ژن CXCR4 شود به علاوه، تاکنون عملکرد سیستم عصبی بر روی بیان ژن بسیار مهم CXCR4 بررسی نشده و تاثیری که این سیستم میتواند در شرایط in vitro بر روی این ژن داشته باشد مشخص نیست. بنابراین این تحقیق به بررسی این مساله پرداخته است.
مواد و روشها جداسازی سلولهای CD34+ از خون بند ناف نوزادان سالم: در یک مطالعه تجربی، بعد از گرفتن رضایتنامه کتبی از والدین سالم، خون بند ناف از نوزادانشان گرفته شد و در کیسههای خونی حاوی ضد انعقاد اسید سیترات دکستروز جمعآوری شد. جهت جداسازی سلولهای CD34+ در ابتدا لازم است که گلبولهای قرمز رسوب داده شوند که برای این منظور از هیدروکسی اتیل استارچ(HES = Hydroxyethyl starch) استفاده شد. بدین صورت که HES به نسبت 1 به 5 با خون بند ناف مخلوط شد. بعد از 1 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق، مایع رویی جدا شده و در دور G 300 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس رسوب سلولی با PBSphosphate buffered saline)) پیپتاژ شد و به آرامی به نسبت 1 به 2 بر روی محلول قندی فایکول(Ficol) ریخته شد و در دور G 450 به مدت 20دقیقه سانتریفوژ شد. سلولهای تک هستهای کهسلولهای CD34+ را نیز شامل میشوند، دارای چگالی کمتری نسبت به فایکول بوده لذا بر روی آن قرار میگیرند. گلبولهای قرمز باقیمانده دارای وزن مولکولی بیشتری نسبت به فایکول هستند و در ته لوله رسوب میکنند. سپس مایع رویی که حاوی سلولهای تک هستهای بود برداشته و با دور G 300 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. در نهایت بر روی رسوب سلولی ایجاد شده آنتیبادی CD34+ افزوده شد و بعد از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای 4 درجه سانتیگراد، مخلوط سلولی از ستونهای LS MACS عبور داده شد. در انتها سلولهای چسبیده شده به ستون با PBS شسته شده و در محیط کشت StemSpam که حاوی فاکتورهای رشد(ng/mL50) TPO، (ng/mL50) SCF و (ng/mL10) Flt3-Lمیباشد، نگهداری شدند.
فلوسیتومتری: جهت تعیین خلوص سلولهای CD34+ جدا شده، از فلوسیتومتری استفاده شد. برای این منظور حدود 103 * 5-4 سلول CD34+ به لوله اپندورف 5/1 میلیلیتری انتقال داده شد و سپس به مدت 5 دقیقه در دور rpm2000 سانتریفوژ شدند. محیط کشت رویی دور ریخته شد و به رسوب، 100 میکرولیتر PBS اضافه شد. بعد از اضافه کردن حدود 10-5 میکرولیتر آنتیبادی منوکلونال CD34-PE به سوسپانسیون سلولی، 60 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه و بلافاصله با دستگاه فلوسیتومتری خوانده شد. جهت نمونه کنترل(Isotype Control) به جای آنتیبادی CD34-PE ، از محلول کنترل منفی(Mouse IgG1) استفاده گردید. لازم به ذکر است که در کنار کنترل ایزوتیپ، از کنترل تیمار نشده هم استفاده شد.
نحوه مواجهه سلولها با اپینفرین و پروپرانولول: برای این منظور از پلیتهای 24 خانه استفاده شد. حدود 103 * 250 سلول CD34+ در هر پلیت کشت داده شد. دوز و زمان تیمار اپینفرین و پروپرانولول بر اساس مطالعههای قبلی انتخاب شدند به طوری که از دوز 10 میکرومولار برای اپینفرین و 1 میکرومولار برای پروپرانولول و از 3 بازه زمانی 1، 3 و 5 ساعت استفاده شد(6، 3). سلولها در 3 چاهک با اپینفرین 10 میکرومولار و در 3 چاهک دیگر با اپی نفرین 10 میکرومولار به همراه پروپرانولول 1 میکرومولار تیمار شدند. همچنین از 3 چاهک به عنوان کنترل استفاده شد. نتایج آزمایش حاصل حداقل 3 بار تکرار میباشد.
استخراج RNA : مراحل استخراج Total RNA شامل : 1) یک میلیلیتر از محلول کیازول بر روی سلولها ریخته شده، به خوبی مخلوط گردید و در دمای محیط به مدت 5 دقیقه انکوبه شد. 200 میکرولیتر کلروفرم به مخلوط فوق بعد از انتقال به میکروتیوبها، اضافه شده و با تکان دست به مدت 15 ثانیه به خوبی مخلوط گردید. مخلوط حاضر به مدت 4 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شده و پس از آن به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و با دور rpm 13200 سانتریفوژ گردید. فاز رویی محصول 3 فازی به دست آمده را برداشته، به میکروتیوب جدید منتقل کرده و به میزان یک برابر حجم آن اتانول سرد اضافه شد ، مخلوط به دست آمده به مدت 1 شب در دمای 20- درجه سانتیگراد انکوبه گردید. سپس به مدت 45 دقیقه، در دمای 4 درجه سانتیگراد و با دور 12000 rpm سانتریفوژ شد. مایع رویی دور ریخته شده و به رسوب سفید رنگ، 1 میلیلیتر از اتانول 75% سرد اضافه گردید و جهت جداسازی رسوب از ته میکروتیوب به خوبی ورتکس شد. مخلوط حاصله به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و با دورrpm 12000 سانتریفوژ گردید. اتانول روی رسوب دور ریخته شده و در دمای اتاق قرار داده شد تا رسوب تا حد امکان خشک شود. رسوب در 20 میکرولیتر آب استریل حل شد. در نهایت غلظت RNA استخراج شده تعیین شد.
آنالیز RT-PCR : برای بررسی بیان کیفی ژنها از RT-PCR استفاده شد. برای این منظور، RNA سلولهای مورد نظر با استفاده از محلول کیازول جداسازی شد. در ادامه، ساخت cDNA در واکنش رونویسی معکوس(RT) با استفاده از کیت(فرمنتاز، 1622 K) و µL 1 آغازگر 18 اولیگو(dT) انجام شد. در ادامه واکنش PCR با μM2 dNTP ، µg1 cDNA ، بافر PCR ( فرمنتاز) X1، μM 75/0 MgCl2 ،Tag DNA µL 25/U 1 پلیمراز فرمنتاز و 5/0 میکرومول از آغازگرهای ژنهای اختصاصی گیرندههای β آدرنرژیک در دمای 95 درجه سانتیگرادبه مدت 4 دقیقه، 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، دمای آنیلینگ(58 درجه) به مدت 30 ثانیه، دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و در 35 سیکل انجام شد(جدول 1). در پایان محصول PCR درون چاهکهای ژل 5/1% آگاروز ریخته شد و پس از الکتروفورز با رنگ اتیدیوم بروماید رنگآمیزی و سپس ارزیابی شد.
جدول 1: توالی آغازگر ژنهای β آدرنرژیک
bp 146
ADRβ1-F
AGTGGCTTGCTGATGTTCCT
ADRβ1-R
ATGCTTCTCCCTTCCCCTAA
bp 132
ADRβ2-F
CTGTGACTTCTTCACGAACCAAG
ADRβ2-R
GATTTGTCAATCTTCTGGAGCTGC
bp 135
ADRβ3-F
CTTTGCCAACGGCTCGAC
ADRβ3-R
TGGAGGGTAGAGTGTCACAGC
اجرای qRT-PCR : qRT-Real Time PCR یک روش بسیار قوی است که برای بررسی بیان کمی ژن مورد نظر استفاده میشود. در مطالعه حاضر از روش دو مرحلهای SYBR Green استفاده شد به این صورت که ابتدا از RNA ژنومی cDNA تهیه و سپس در تیوب جداگانه cDNA را به DNA دو رشتهای مبدل کردیم. سیستم آشکارکننده سایبرگرین به عنوان سادهترین و شایعترین و با صرفهترین روش بر اساس توانایی در اتصال به شکاف کوچک DNA دو رشتهای و متعاقب آن افزایش فلورسانس تا 2000 برابر مقدار آزاد اولیه است. در این مطالعه ژن GAPDH به عنوان ژن Housekeeping انتخاب گردید. توالی آغازگرهای مورد استفاده عبارت بود از آغازگر رفت ژن GAPDH (5'-3') : CCTGGCGTCGTCATTAGTAGTG ، آغازگر برگشت (5’to3’): TCAGTCCTGTCCATAATTAGTCC، آغازگر رفت CXCR4 : GGTCCATGGTTACCAGAAGA (5’to3’) و آغازگر برگشت CXCR4 (5’to3’):GTC ATC TGC CTC ACT GAC GTTG. کیت Power SYBER Green PCR Master Mix (شرکت ABI) خریداری شد. µL 75/0 از هر یک از آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت μmol10، µL 5/6ddH2 ، µL 10 SYBR Green و µL 2 cDNAبا رقت 1/0 به تیوبهای ویژه اضافه شد. واکنش تکثیری بر طبق الگوی دمایی خاص، 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد، 30 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد، 30 ثانیه در دمای 58 درجه سانتیگراد، 15 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد، خوانش پلیتها و 40 مرتبه تکرار مراحل از مرحله 2 در داخل دستگاه Step-one ABI اجرا گردید.
تجزیه و تحلیل دادهها: پروفایل بیان ژنی به طور نسبی و با روش ΔΔCt-2 محاسبه گردید. سپس دادهها به وسیله نرمافزار 19 SPSS مورد تحلیل آماری قرار گرفتند. میانگین و خطای استاندارد میانگین محاسبه و سپس از طریق آزمونPaired Samples t-test ، میزان معناداری نتایج مشخص شد. دادهها به صورت خطای استاندارد میانگین ± انحراف معیار و در سطوح معناداری 05/0 p< گزارش شدند.
شکل1: نتایج فلوسیتومتری برای مارکرهای CD34+ در سلولهای خونساز جدا شده از بند ناف
شکل 2: بیان کیفی انواعی از رسپتورهای β آدرنرژیک در HSCs . هر سه نوع رسپتورADRB1 ، ADRB2 و ADRB3 توسط HSCs بیان میشود. GAPDH و control منفی جهت صحت آزمایش گذاشته شد.
یافتهها نتایج حاصل از فلوسیتومتری: بعـد از جداسـازی سلولهای CD34+ به منظور ارزیابی سلولهای جدا شده و داشتن جمعیتی یکسان از سلولهای CD34+ ، روش فلوسیتومتری به کار گرفته شد. نتایج فلوسیتومتری که در شکل 1 نشان داده شده است خلوص 98% از سلولهای CD34+ را نشان میدهد.
بیان گیرندههای β آدرنرژیک در سلولهای خونساز CD34+ : جهـت اثبـات بیـان رسپتورهـای بتا آدرنرژیک از روش RT-PCR استفاده شد. بررسیهای RT-PCR نشان داد که هر 3 گیرنده ژن β آدرنرژیک(1β، 2βو 3β) در سلولهای CD34+ جدا شده از بند ناف دارای بیان میباشد(شکل2).
بررسی بیان کمی CXCR4 در سلولهای تیمار شده با اپینفرین و پروپرانولول: اپینفرین منجر به افزایش معناداری در بیان ژنCXCR4 شد به طوری که افزایش در ساعتهای 1 ، 3 و 5 به نسبت کنترل معنادار میباشد(نمودار 1). بیشترین بیان CXCR4 ، را مـیتوان در ساعت 1 مشاهده کرد ولی افزایش بیـان ساعـت 1 نسبـت بـه ساعـت 3 و 5 معنـادار نمیباشد.
نمودار 1: میانگین چند برابر شدن بیان ژن CXCR4 در سلولهای تیمار شده با اپینفرین. در هر 3 بازه زمانی افزایش بیان ژن CXCR4 دیده شد و نسبت به کنترل معنادار میباشند. مقدار p value برای هر 3 بازه زمانی 05/0 است نتایج حاصل از تکرار 3 نمونه متفاوت(mean SD) میباشند. ساعت اول(5/0 ± 2/3)، سوم (4/0 ± 4/2) و پنجم(4/0 ± 2/2) شد.
نمودار2: تاثیر هم زمان پروپرانولول 1 میکرومولار و اپینفرین 10 میکرومولار در بیان ژن CXCR4 در ساعتهای 1، 3 و 5 ؛ مقدار بیان ژن CXCR4 در هر 3 بازه زمانی با نوع کنترلی برابری میکند. نتایج حاصل از تکرار 3 نمونه متفاوت (mean ± SD) میباشند. ساعت اول(1/0 ± 1)، ساعت سوم(1/0 ± 1)، ساعت پنجم(05/0 ± 0.4)
اپینفرین میتواند بر روی گیرندههای α و β آدرنرژیک اثر بگذارد از این رو جهت تعیین نوع گیرنده دخیل در عملکرد اپینفرین جهت افزایش CXCR4 از مهارکنندههای β آدرنرژیک(پروپرانولول) استفاده شد. پروپروانول به صورت یک آنتاگونیست اختصاصی β آدرنرژیک عمل میکند و هر 3 نوع گیرنده β آدرنرژیک را مهار میکند. بنابراین تنها گیرندههای آلفا آدرنرژیک در دسترس اپینفرین باقی میمانند. افزودن 1 میکرو مولار پروپرانولول به سلولهای خونساز CD34+ نیم ساعت قبل از تیمار با اپینفرین، منجر به خنثی شدن اثر اپینفرین بر بیان CXCR4 شد و در هر 3 بازه زمانی، مقدار CXCR4 با نوع کنترل برابری میکرد( نمودار 2).
بحث از HSCs خون محیطی جهت پیوند مغز استخوان به منظور درمان بسیاری از بیماریهای خونی از جمله لوسمیها استفاده میشود(15). بنابراین امروزه تلاش زیادی جهت تسهیل ورود این سلولها از مغز استخوان به خون محیطی و افزایش تعداد آنها در گردش خون صورت گرفته است. یکی از بزرگترین چالشها، مقاومت برخی اهداکنندگان سلولهای بنیادی مغز استخوان به فاکتورهای تحریککننده مثل G-CSF است به طوری که بعد از 5 روز تزریق G-CSF ، همچنان سطح پایینی از CD34+ در خون محیطی وجود دارد(16). بر این اساس شناخت مولکولهای دخیل در خروج سلولهای بنیادی از مغز استخوان، یکی از مسائل اساسی در جهت بهبود پیوند است(16). در این راستا سیستم عصبی، به عنوان اصلیترین سیستم تنظیمکننده بدن، دارای نقش اساسی در حرکت سلولهای CD34+ میباشد و دادههای زیادی در این زمینه وجود دارد(17، 5، 4). در مطالعه حاضر بیان گیرندههای β آدرنرژیک در سطح سلولهای خونساز +CD34 بند ناف مورد تایید قرار گرفت. اپینفرین به عنوان یکی از کاتکولآمینهای مهم سیستم عصبی بر روی انواعی از گیرندههای α و β اثر میگذارد(17). در این بررسی نشان داده شد که سلولهای CD34+ تیمار شده با اپینفرین، دارای بیان معناداری از ژن CXCR4 در هر 3 بازه زمانی 1، 3 و 5 نسبت به سلولهای تیمار نشده هستند. با وجود افزایش نسبی در بیان ژن CXCR4 در ساعت اول، تفاوت معناداری بین بیان ساعت 1 با ساعتهای 3 و 5 به لحاظ آماری دیده نشد. گیرندههای آدرنرژیک اصلی درگیر در بیان ژن CXCR4 ، β آدرنرژیک میباشد به طوری که در این مطالعه دیده شد، با مهار کردن گیرندههای β آدرنرژیک توسط پروپرانولول، تغییری در بیان ژن CXCR4 در دو گروه سلولهای CD34+ تیمار شده و تیمار نشده با اپینفرین ایجاد نمیشود. در سال 2002 پتیت نشان داد که با وجود کاهش بیان SDF-1 در مغز استخوان و افزایش ترشح این کموکاین بـه خـون محیطـی و هم چنین افزایـش بیـــان CXCR4 در سلولهـای خـونساز CD34+ بـه دنبال تـزریق 5 روزه G-CSF ،تغییری در بیان CXCR4 سلولهای خونساز CD34+ بند ناف و مغز استخوان به دنبال تیمار مستقیم با G-CSF در شرایط آزمایشگاهی دیده نمیشود و فرض شد که G-CSF به واسطه مکانیسمهای ثانویه مثل آنزیمها و یا سایتوکاینهای دیگر منجر به تغییر بیان CXCR4 در شرایط داخل بدن میگردد(18). در این مطالعه نشان دادیم که چنین مکانیسم غیر مستقیمی میتواند در نتیجه کاتکولآمینها باشد. در سال 2004 لوسکیو برای اولین بار مدعی شد که در صورت نبود آنزیمهای نوتروفیلی همانند الاستاز و متالوپروتئاز در مغز استخوان، هم چنان حرکت HSCs وجود دارد و لذا پیشنهاد دخالت مکانیسم ثانویه سیستم عصبی را مطرح کرد(19). در سال 2006 کاتایاما در شرایط in vivo به بررسی اثر G-CSF در ترشح کاتکول آمینها پرداخت و یافته او نشان داد که G-CSF به صورت اختصاصی منجر به ترشح کاتکولآمینها در مغز استخوان میشود و میتوان گفت که G-CSF با افزایش فعالیت و ترشح کاتکولآمینها، بر روی بیان ژنهای مربوط به حرکت پروژنیتورهای خونی مثل CXCR4 اثر میگذارد(6). در سال 2005، سمراد و همکارانش نشان دادند که G-CSF فعالیت سلولهای استئوبلاستی و بیان ژن CXCL12 را در این سلولها مهار میکند. این گروه با تزریق G-CSF به موشها نشان دادند که کاهش بیان SDF-1 در مغز استخوان، با مقدار خروج سلولهای HSC ارتباط مستقیم دارد. آنها هم چنین مشاهده کردند که سلولهای استئوبلاستی دچار سرکوب شده و ارتباط آنها با سلولهـای HSC محدود میشود. پیشنهاد این تیم تحقیقاتی آن بود که به علت نبود گیرندههای G-CSF بر روی سلولهای استئوبلاستی، مکانیسم ثانویهای هم چون سیستم عصبی میتواند دخالت داشته باشد(20). در صورتی که یافتههای مطالعه حاضر را در کنار یافتههای گروه اخیر قرار دهیم، میتوان فرض کرد که G-CSF با واسطه سیستم عصبی، منجر به افزایش بیان CXCR4 و کاهش بیان SDF-1 شده که در نهایت به خروج HSCs از مغز استخوان میانجامد. در سال 2006 کاتایاما به صورت In vivo وIn vitro اثبات کرد که مکانیسم اصلی حرکت سلولهای HSC ، به واسطه سیستم عصبی است. آنها نشان دادند که در صورت مهار سیستم عصبی در موشها، G-CSF قدرت القای خروج HSCs را از مغز استخوان ندارد و سلولهای استئوبلاست هم چنان به صورت محکم با HSC دارای ارتباط میباشد. علاوه بر این، بیان CXCL12 نیز در سطح بالا باقی خواهد ماند. این گروه بیان ژن CXCR4 را مورد بررسی قرار نداده بودند(6). با این حال میتوان گفت که G-CSF عملکرد اصلی خود را از طریق کاتکول آمینها انجام میدهد واین فرضیه با دادههای حاصل از این تحقیق هم راستا میباشد. در سال 2007، اسپیگل، نشان داد که کاتکولآمینها با واسطه سیگنالینگ Wnt ، منجر به مهاجرت و لانه گزینی سلولهای CD34+ میشوند. تیم اسپیگل گزارش کردند که سلولهای +CD34 در هر 3 منبع مغز استخوان، خون محیطی و بند ناف دارای گیرندههای آدرنرژِیک و دوپامینی هستند و مواجهه آزمایشگاهی سلولهای بند ناف با G-CSF ، منجر به افزایش بیان گیرندههای عصبی میشود(17). یافته آنها همراستای یافتههای این مطالعه بوده و میتوان گفت که G-CSF با افزایش بیان گیرنده عصبی آدرنرژیک بر روی سلولهای +CD34 ، باعث القای عملکرد بیشتر کاتکولآمین اپینفرین میشود. در سال 2008، مندز نشان داد که مقدار HSCs خون محیطی در طول شبانه روز تغییر میکند و این مقادیر در انسان و موش بر عکس هم میباشد. آنها گزارش کردند که نقش اصلی را گیرندههای 3β بر عهده دارند که بر روی SDF-1 اثر میگذارد(3). با این حال هنوز بر روی تغییرات شبانه روزی CXCR4 مطالعهای انجام نشده است. این یافتهها نشان میدهد سیستم عصبی نه تنها در شرایط استرسی مثل تزریق G-CSF دخالت دارد، بلکه در شرایط فیزیولوژی نیز در خروج HSCs نقش دارد. در سال 2010 ، این بار مندز بر عملکرد گیرندههای 2β و 3β متعاقب تزریق G-CSF به موشها مطالعه کرد. آنها نشان دادند که نقش اصلی را 2β بر عهده دارد به طوری که مهار گیرنده 2β منجر به مهار حرکت HSCs میشود(4). این یافتهها، با نتایج تحقیق حاضر در مورد عملکرد تحریککننده گیرندههای عصبی آدرنرژیک همراستا است؛ ما نیز نشان دادیم که در شرایط آزمایشگاهی مهار گیرندههای β از افزایش بیان CXCR4 در مواجهه با اپی نفرین جلوگیری میکند و این امر تاییدی بر نقش گیرندههای β آدرنرژیک میباشد. در سال 2011، دار و همکارانش به بررسی اثر نوراپینفرین بر روی SDF-1 در موشها پرداختند. این گروه نشان دادند که به دنبال تزریق نوراپینفرین، ترشح SDF-1 از مغز استخوان به خون محیطی افزایش یافته و همزمان از مقدار آن در مغز استخوان کاسته می شود. در واقع این گروه بر اصل فرآیند حرکت شیب غلظتیHSC تاکید کردند و بیان کردند که به دنبال افزایش غلظت SDF-1 در خون محیطی و کاهش آن در مغز استخوان، HSCs به سمت خون محیطی حرکت میکنند(13). این تحقیق نیز نشان داد که کاتکولآمین اپینفرین، منجر به افزایش بیان CXCR4 در سطح HSCs میشود که در صورت قرار دادن این یافتهها در کنار هم، میتوان گفت که کاتکولآمینها با افزایش غلظت SDF-1 در خون محیطی و افزایش بیان CXCR4 در پروژنیتورهای خونساز، شرایط را برای خروج این سلولها از مغز استخوان هموار میکند. در سال 2011، گِرِگ و همکارانش بر روی اثر شوک و آسیبهای بافتی در حرکت پروژنیتورهای خونساز مطالعه کردند. یافتههای این تیم نشان داد که آسیبهای بافتی به خصوص شوک، منجر به خروج HSC خواهد شد که در این راستا مقدار G-CSF در سرم و MMP-9 در مغز استخوان افزایش مییابد. با این حال، تزریق β بلوکرهای عصبی به موشهای آسیبدیده، از حرکت HSCs جلوگیری کرده و مانع از افزایش G-CSF و آنزیمهای متالوپروتئاز با مکانیسمهای نامشخص شده و این احتمال وجود دارد که سیستم عصبی و G-CSF دارای فعالیت فیدبک مثبت باشند(21).
نتیجهگیری با توجه به دادههای به دست آمده همراه با مطالعههای قبلی میتوان نتیجه گرفت که تزریق G-CSF ، بیان کاتکولآمینهایی هم چون اپینفرین را در مغز استخوان افزایش میدهد؛ کاتکولآمینهای افزایش یافته با تحریک گیرندههای β آدرنرژیک، بیان SDF1 را در مغز استخوان کاهش داده و ترشح آن را به خون محیطی افزایش میدهد از طرف دیگر بیان ژن CXCR4 بر روی HSCs را افزایش میدهـد لذا سلولها به طرف شیب غلظتی ایجاد شده SDF-1 در خون محیطی حرکت میکنند.
تشکر و قدردانی این تحقیق، حاصل پایاننامه کارشناسی ارشد رشته هماتولوژی(شماره ثبت 52127824) در دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس میباشد. هم چنین لازم است از آقایان احمد عادلی و محمد حسین مقدسی تشکر نماییم.
Saba F, Roshandel E, Soleimani M, Atashi A, Gharehbaghian A, Abroun S et al . Effect of epinephrine on the CXCR4 expression of human cord blood derived CD34+ hematopoietic stem cells . Sci J Iran Blood Transfus Organ 2015; 11 (4) :271-280 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-753-fa.html
صبا فخرالدین، روشندل الهام، سلیمانی مسعود، اتشی امیر، قره باغیان احمد، آبرون سعید و همکاران.. اثر اپینفرین بر بیان ژن CXCR4 در سلولهای بنیادی خونساز CD34+ خون بند ناف. فصلنامه پژوهشی خون. 1393; 11 (4) :271-280