جلد 10، شماره 1 - ( بهار 1392 )
جلد 10 شماره 1 صفحات 64-53 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Sahraneshin F, Ebrahimi M, Zandiyh T, Mohammad M, Aghdami N, Baharvand H. Differentiation of human cord blood CD133+ cells into insulin secreting cells in vitro. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2013; 10 (1) :53-64
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-739-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-739-fa.html
صحرانشین فاضل، ابراهیمی مرضیه، زندیه طاهره، محمد منیره، اقدمی ناصر، بهاروند حسین. توانایی تمایز سلول CD133+ خون بند ناف به سلول‌های ترشح‌کننده انسولین. فصلنامه پژوهشی خون. 1392; 10 (1) :53-64
پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان
متن کامل [PDF 580 kb]
(2267 دریافت)
| چکیده (HTML) (11055 مشاهده)
مقدمه
دیابت نوع I ، نتیجه حمله اتوایمیون علیه سلول‌های بتا جزایر لانگرهانس بوده که منجر به از دست رفتن 70% توده سلول‌های بتا می‌شود. این در حالی است که دیابت نوع II در نتیجه عدم پاسخ‌گویی سلول‌های هدف به انسولین ترشحی ایجاد گردیده و در مراحل بعد بیماری به کاهش 50% توده سلول‌های بتا می‌انجامد(2، 1). این بیماران نیازمند مصرف مستمر داروهای کاهش‌دهنده قند خون، از جمله انسولین می‌باشند اما مقداری از انسولین تزریق شده در این بیماران توسط آنزیم‌های پروتئولیتیک از بین می‌رود. پیوند کامل پانکراس و یا پیوند جزایر جدا شده از افراد با مرگ مغزی به همراه استفاده از سرکوبگرهای ایمنی غیر استروئیدی از روش‌های دیگر درمان در افراد دیابتی می‌باشد، اگر چه کمبود افراد دهنده و نتایج طولانی مدت ناشی از سرکوبگرهای ایمنی در این بیماران از جمله محدودیت‌های این روش درمانی به شمار می‌رود(3). اخیراً با توجه به پیشرفت در زمینه سلول‌های بنیادی، امید است که با استفاده از این سلول‌ها بتوان به درمان قطعی دیابت کمک نمود.
سلول‌های بنیادی، سلول‌هایی پر توان(Pluripotent stem cells) هستند که قابلیت تمایز به سه لایه جنینی(اکتودرم، مزودرم و آندودرم) را دارا می‌باشند(4). تمایز سلول‌های بنیادی موشی و انسانی از سال 2000 تا کنون با مطالعه تکوین سلول‌های انسولین‌ساز در بدن و بر اساس روش‌هایی از قبیل انتخاب سلول‌های نستین مثبت (بیان‌کننده نستین)، استفاده از بیان ژن‌های هدف و تمایز سلول‌های نستین منفی(عدم بیان نستین) به سلول‌های تولیدکننده انسولین انجام شده است(9-5). اما انسولین ترشحی در سلول‌های تمایز یافته در این نوع مطالعه‌ها، ناشی از جذب انسولین در سلول‌های آپوپتوز شده از محیط کشت بوده است(10). هم چنین خطر تومورزایی، مشکلات اخلاقی و استفاده از داروهای سرکوب‌کننده بعد از پیوند نیز از جمله مشکلات استفاده از سلول‌های بنیادی جنینی است که استفاده درمانی آن را با چالش مواجه می‌سازد(11).
سلول‌هـای بنیـادی بزرگسـال بـه علــت عدم وجـود
مشکلات اخلاقی و خطر پایین تومورزایی، کاندیداهای مناسبی در درمان بیماران دیابتی می‌باشند. سلول‌های مشتق از مغز استخوان، سلول‌های مشتق از بافت‌های چربی، سلول‌های مشتق از بافت پانکراس و سلول‌های مشتق از خون بند ناف از جمله منابع مورد مطالعه برای تولید سلول‌های انسولین‌ساز بوده و هستند. سلول‌های بنیادی موجود در خون بند ناف انسان، جوانترین منابع سلول‌های بالغ با ویژگی‌های تلومراز بلند، خطر آلودگی ویروسی پایین، کاهش القای بیماری پیوند علیه میزبان(GVHD) در مقایسه با سلول‌های مغز استخوان از جمله منابع ارزشمند برای سلول درمانی محسوب می‌شوند(12). از سال 2004 تاکنون مطالعه روی توانایی تمایز سلول‌های جدا شده از خون بند ناف انسان و تمایز آن‌ها به سلول‌های انسولین‌ساز مورد توجه قرار گرفته است. سلول CD133+ موجود در خون بند ناف، با بیان شاخص‌های بنیادی مثل 4-SSEA و A 4OCT از سلول‌های چند توان محسوب شده و کاندید مناسبی برای القای تمایز می‌باشد و به علت در دسترس بودن، از ابزار مناسب درمانی شناخته می‌شود(14-12). لذا در این مطالعه بر آن شدیم که تمایز سلول‌های CD133+ مشتق از خون بند ناف به سلول‌های انسولین‌ساز را در محیط آزمایشگاه مورد بررسی قرار دهیم.
مواد و روش‌ها
جداسازی سلول‌های CD133+ از خون بند ناف با استفاده از روش MACS (Magnetic Activated Sorting) :
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. خون بند ناف انسان از بانک عمومی خون بند ناف رویان تهیه گردید. به منظور جداسازی سلول‌های تک هسته‌ای و افزایش سرعت رسوب سلول‌های قرمز خون بند ناف، از محلول اتیل استارچ (HEAS)(Free flex) به نسبت یک به پنج استفاده شد. سپس پلاسمای غنی از سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف به آرامی توسط پلاسما اکسترکتر جدا و به نسبت 1 به 3 به روی فایکول(Inno-Train) با چگالی cm2/g077/1 منتقل گردید. سپس به مدت 30 دقیقه با دور g 400 و بدون ترمز در دمای اتاق سانتریفوژ شد. سلول‌های تک هسته‌ای((MNC از فاز میانی فایکول و پلاسما جدا و با 3 برابر محلول PBS همراه با mM2 EDTA شستشو داده شد. سپس رسوب سلولی با استفاده از سانتریفوژ به مدت 10 دقیقه و دور g 400 تهیه گردید. برای جداسازی سلول‌های CD133+ ، از روش جداسازی به روش بید مغناطیسی (MACS) و بر اساس دستور شرکت سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، 100 میکرولیتر از محلول FcR blocking ، 100 میکرولیتر از محلول میکروبید(میلتنی - بیوتک) و 300 میکرولیتر از محلول PBS حاوی EDTA mM 2، به رسوب سلولی اضافه و به مدت 30 دقیقه در یخچال انکوبه شد(16، 15). پس از 3-2 بار شستشوی ستون با حجم 500 میکرولیتر از PBS ، سوسپانسیون سلولی به حجم 500 میکرولیتر به ستون اضافه گردید. در مرحله بعد، ستون به میزان 5 بار با حجم 500 میکرولیتر از PBS شستشو داده شد تا سلول‌های نچسبیده به ستون جدا شوند. در پایان یک میلی‌لیتر از PBS به ستون اضافه و پس از جداسازی ستون از آهن‌ربا، سلول‌های چسبیده به ستون با فشار پیستون خارج شدند. سلول‌های حاصل حاوی سلول‌های CD133+ بودند.
به منظور به دست آوردن خلوص بالاتر، سلول‌های فوق شسته شدند و به رسوب حاصل 20 میکرولیترFcR Blocking ، 20 میکرولیتر میکروبید CD133+ و 200 میکرولیتر PBS اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای ºC 4 انکوبه شد و مراحل عبور از ستون مجدداً تکرار شد(16، 15). درصد سلول‌های زنده توسط تریپان‌بلو تعیین گردید. به منظور تعیین خلوص سلولی، سلول‌های CD133+ خارج شده از ستون، شمارش شده و تعداد 106 × 1 سلول به لوله‌های مخصوص فلوسیتومتری منتقل شد و با 3 میکرولیتر از آنتی‌بادی AC133/2 (میلتنی - بیوتک) به مدت 45-30 دقیقه درون یخچال انکوبه گردید. از آنتی‌بادی Mouse IgG1-PE به عنوان کنترل ایزوتیپ استفاده گردید.
در انتها و پس از شستشوی سلول‌ها توسط بافر فسفات نمکی(PBS)، نتایج توسط دستگاه فلوسایتومتری FACSCalibur مجهز به لیزر nm 488 قرائت شد. آنالیز داده‌ها با برنامه Cell Quest انجام شد.
تمایز سلول CD133+ به سلول‌های انسولین ساز:
به منظور تمایز سلول‌ها از روش شیما و با کمـی تغییرات استفاده شد(17). به طور خلاصه تعداد 106 * 2 سلول CD133+ به محیط DMEM با غلظت گلوکز بالا (mg/L 4500) حاوی 10% سرم گاوی(جیبکو)، به همراه ng/mL 100 اکتیوین A (R&D) به پلیت‌های 24 خانه که با ژلاتین 1/0% پوشیده شده بودند، منتقل و به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. پس از گذشت زمان مورد نظر، به منظور تولید سلول‌های اندودرم قطعی، میزان M 6-10 رتینوئیک اسید(سیگما) به سلول‌ها اضافه و 24 ساعت دیگر کشت ادامه یافت. سپس به منظور تولید سلول‌های لوله گوارش خلفی، تعویض محیط صورت گرفت و محیطDMEM با غلظت گلوکز بالا همراه با 10% سرم گاوی و ng/mL 30 از bFGF اضافه و کشت به مدت 5-3 روز دیگر ادامه یافت.
در مرحله آخر، برای تولید پیش‌سازهای پانکراس، تعویض محیط انجام شد و محیط DMEM/F12 (جیبکو) به همراه (ng/mL 10) bFGF ، (mM 10) Nicotinamid ، (2%) 27supplement B و (1%) N2 (سیگما) به سلول‌ها اضافه و کشت به مدت 5 روز دیگر ادامه یافت.
ایمونوسیتوشیمی:
سلول‌های حاصل از مرحله آخر تمایز باPBS به مدت 5 دقیقه شستشو و سپس توسط پارا فرم آلدهید 4% به مدت 30 دقیقه و در یخچال تثبیت شدند. به منظور نفوذپذیری غشا، از 2/0% Tritonx-100 (مرک) به مدت 7 دقیقه و در دمای محیط استفاده شد. برای جلوگیری از اتصالات غیر اختصاصی، سلول‌ها با سرم 10% بز به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. آنتی‌بادی اولیه C-PEPTIDE (کمیکون) با رقت 250/1 و آنتی‌بادی اولیه انسولین(سیگما) 500/1 مورد استفاده قرار گرفت. آنتی‌بادی‌های اولیه به مدت یک شبانه روز در دمای ºC 4 و در تاریکی انکوبه شدند. به گروه ایزوتیپ نیز آنتی‌بادی اولیه زده نشد. سپس سلول‌ها یک بار با PBS حاوی Tween (05/0%) شستشو و سانتریفوژ شد. محیط رویی خارج و آنتی‌بادی ثانویه متصل به FITC (سیگما) با
جدول 1: آغازگرهای ژن‌های مورد استفاده در این مطالعه
جدول 2: مشخصات خون بند ناف‌های مورد آزمایش
شکل 1: نتایج بررسی سلول‌های CD133+ قبل و بعد از جداسازی به روش فلوسایتومتری: A) بررسی اندازه و گرانولوسیتی سلول‌های تک هسته‌ای(MNC) جدا شده با استفاده از شیب غلظت فایکول، B)کنترل ایزوتایپ(Mouse IgG1-PE)، C) سلول‌های CD133+ پس از یک بار عبور از ستون، D) سلول‌های CD133+ پس از دو بار عبور از ستون، E) بیان ژن‌های بنیادینگی در سلول‌های CD133 مثبت(GAPDH به عنوان کنترل داخلی می‌باشد).
شکل 2 : تصاویر میکروسکوپی نوری مربوط به گروه مورد مطالعه: (A مرحله اول، (B مرحله دوم، (C مرحله سوم بزرگ‌نمایی X 10
شکل 3: (A) بررسی پپتید -C و انسولین در گروه مورد آزمایش با روش ایمونوسیتوشیمی(بزرگ‌نمایی X 10). هسته‌ها با رنگ DAPI و شاخص‌های انسولین و پپتید-C با رنگ FITC رنگ‌آمیزی شده‌اند. (B) RT-PCR برای ژن‌های سلول‌های انسولین‌ساز
نمودار 1: میزان ترشح انسولین در دو غلظت 5 و 27 میلی‌مولار
بحث
سلول‌های بنیادی خونساز مستقر در خون بند ناف، با توجه به ویژگی‌های منحصر به فرد خود و نیز بیان برخی شاخص‌های بنیادینگی، از جمله منابع مورد توجه برای تولید سلول‌های انسولین‌ساز می‌باشند(16). هم‌چنین جمعیتی از سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف، شاخص‌هـای سلول‌های اندوکرینی پانکراس از قبیل 3NGN ، 1-IS1 ، 4BRN ، 6PAX و 1PDX را بیان می‌کنند کـه پـس از تـزریـق بـه مدل‌هـای حیوانـی، بـه سلول‌های
ترشح‌کننده انسولین انسانی تمایز می‌یابند(19). لذا در این مطالعه، سلول‌های +CD133 خون بند ناف به منظور تمایز به سلول‌های انسولین‌ساز مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج این مطالعه که با استفاده از سلول‌های خالص شده CD133+ خون بندناف صورت گرفت نیز نشان داد که این سلول‌ها، ژن‌های 4OCT و NANOG را که از جمله ژن‌های بنیادی هستند بیان می‌کنند. در دو مطالعه جداگانه که توسط بال و مک گوکین بر سلول‌های خون بند ناف صورت گرفت، نیز نشان داده شده که این سلول‌ها ژن‌های 1REX ، 4FGF ، 2SOX ، 1SOX ، 4OCT و NANOG را بیان می‌کنند(20، 16). از آن جا که هدف این مطالعه، بررسی توان تمایزی این سلول‌ها به سمت سلول‌های ترشح‌کننده انسولینی بود، لذا در مرحله بعد سلول‌های +CD133 با استفاده از روش شای به منظور تولید سلول‌های اندودرم اصلی در تیمار با اکتیوین A و سپس رتینوئیک اسید قرار گرفتند(21). به منظور تولید اندودرم پانکراس و پیش‌سازهای پانکراس نیز به محیط کشت این سلول‌ها bFGF اضافه شد و در نهایت تکثیر و رشد پیش‌سازهای پانکراس به واسطه فاکتورهایی نظیر 27B ، 2N و نیکوتین آمید القا گردید.
نتایج میکروسکوپی نشان داد که در گروه مورد مطالعه، پس از مرحله اول شبه اجتماعاتی از سلول‌ها تشکیل گردید که پس از افزودن bFGF ، دسته‌های سلولی با یکدیگر تشکیل کلونی داده و با افزودن فاکتورهایی نظیر 27B و نیکوتین‌آمید، کلونی‌ها بزرگ‌تر شدند. در مطالعه‌های پیشین نیز که روی تمایز سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف و سلول‌های CD133+ و CD34+ به سلول‌های انسولینی انجام شده، کلونی و اجتماعات سلولی مشاهده شده بود(22، 15). به این ترتیب تشکیل کلونی می‌تواند یکی از مراحل تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های انسولین‌ساز در نظر گرفته شود. این امر با بررسی بیان انسولین و پپتید-C که از شاخص‌های سلول‌های تمایزیافته انسولین‌ساز می‌باشند، توسط ایمنوسیتوشیمی مورد تایید قرار گرفت. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که سلول‌های بیان‌کننده این دو شاخص در کلونی‌ها واقع شده‌اند. در این مطالعه، درصد سلول‌های بیان‌کننده انسولین بیشتر از درصد سلول‌های بیان‌کننده پپتید-C بود که می‌تواند به سه دلیل باشد: 1- نیمه عمر پپتید-C از نیمه عمر انسولین کمتر است، 2- ممکن است مقداری از انسولین از محیط کشت جذب شده باشد، 3- درصد سلول‌های بیان‌کننده پپتید-C از درصد سلول‌های بیان‌کننده انسولین کمتر باشد(23، 10).
بررسی بیان ژن‌های GLOCAGON ، 1PDX ، 1/6NKX و INSULIN توسط RT-PCR در این مطالعه حاکی از عدم بیان ژن‌های مربوط به مرحله آخر تمایز سلول‌های انسولینی بود که می‌تواند به دلیل کافی نبودن سلول‌ها از نظر تعداد برای انجام این آزمون باشد. هم‌چنین میزان بیوسنتز انسولین توسط مکانیسم‌های مختلف از جمله افزایش رونویسی ژن انسولین، افزایش ترجمه از PreproInsulin mRNA و افزایش ظرفیت شبکه آندوپلاسمی برای ساخت انسولین کنترل می‌شوند(26-24). این در حالی است که تخریب mRNA انسولین به طور مستمر صورت می‌گیرد. هم چنین میزان تجدیدپذیری Preproinsulin mRNA در سلول‌های بتای بالغ پایین است. گلوکز اصلی‌ترین تنظیم‌کننده انسولین بوده که از تخریب mRNA انسولین در سلول‌ها جلوگیری می‌کند. به طوری که نیمه عمر mRNA انسولین در غلظت کم گلوکز 29 ساعت و در غلظت زیاد گلوکز 77 ساعت گزارش شده است(25). از راه‌کارهای مورد استفاده برای جلوگیری از تخریب mRNA انسولین در سال‌های اخیر، استفاده از پروتئین‌های متصل شونده به منطقه 3´UTR RNA به نام Polypyrimidine tract-binding protein (PTB) برای ثبوت RNA می‌باشد(27).
نتایج حاصل از سنجش فعالیت سلول‌های تمایزیافته در برابر غلظت‌های مختلف گلوکز نیز نشان داد که این سلول‌ها قادر به شناسایی غلظت‌های متفاوت گلوکز و ایجاد پاسخ مناسب در برابر آن نمی‌باشند، به این معنا که مقدار انسولین ترشحی در سلول‌های تمایز یافته در غلظت 5 میلی‌مولار گلوکز بیش از 27 میلی‌مولار گلوکز بود، که این مساله می‌تواند به دلایل زیر باشد:
- سلول‌های تمایزیافته دارای عملکرد طبیعی نیستند و نمی‌توانـند متناسب با غلظت‌های مختلف گلوکز انسولین
ترشح کنند.
- بخشی از انسولین آزاد شده در غلظت 5 و 27 میلی‌مولار، انسولین جذب شده از محیط کشت می‌باشند و توسط سلول و در پاسخ به گلوکز ساخته نشده‌اند.
لذا پیشنهاد می‌گردد که برای رفع این محدودیت از کیت‌هایی استفاده شود که اختصاصاً پپتید-C را شناسایی می‌کنند و یا این که انسولین مورد استفاده را نشان‌دار کرده تا از انسولینی که توسط خود سلول ساخته می‌شود، قابل تشخیص باشد. هم چنین برای بهبود نتایج حاصل از تمایز به سلول‌های انسولین‌ساز در محیط آزمایشگاه، انجام Quantitive Real Time PCR برای ژن‌های دخیل در تکوین پانکراس در مقاطع زمانی متعدد، تزریق سلول‌های حاصل از گروه مورد مطالعه به مدل‌های حیوانی جهت بررسی سطح قند خون، بررسی محتوای پروتئین انسولین و پپتید- C در سلول‌های تمایزیافته و انجام تمایز با طولانی‌تر کردن تیمار هر فاکتور القایی ضروری به نظر می‌رسد.
نتیجه‌گیری
نتایج این مطالعه که با هدف تمایز سلول‌های CD133+ مثبت مشتق از خون بند ناف انسان انجام گرفت نشان داد که سلول‌های CD133+ مثبت مشتق از خون بند ناف انسان در روشی کوتاه، توانایی تمایز به سلول‌های تولیدکننده انسولین را دارا هستند.
این در حالی است که وجود پپتید - C در محیط کشت حاکی از سنتز انسولین در داخل سلول است. ژن‌های مراحل آخر تمایزی در سلول‌های انسولینی حاصل مشاهده نگردید. هم‌چنین سلول‌های انسولینی تمایزیافته به تیمار با غلظت‌های مختلف گلوکز پاسخ نداده و انسولین را ترشح نمی‌کردند. همه این نتایج نشان‌دهنده آن است که سلول‌های CD133+ در محیط آزمایشگاه قادر به شروع تمایز به سلول‌های ترشح‌کننده انسولین می‌باشند، اما برای رسیدن به سلول‌های فعال ترشح‌کننده انسولین، نیازمند به سیگنال‌هایی از محیط زنده می‌باشند.
متن کامل: (2332 مشاهده)
توانایی تمایز سلول CD133+ خون بند ناف به سلول‌های ترشح‌کننده انسولین
فاضل صحرانشین سامانی1، مرضیه ابراهیمی2، طاهره زندیه3، منیره محمد4، ناصر اقدمی5، حسین بهاروند6
چکیده
سابقه و هدف
تولید سلول‌های اندوکرینی و جزایر انسولین‌ساز، از جمله اهداف درمان دیابت می‌باشد. مشخص شده است که سلول‌های CD133+ خون بند ناف قادر به بیان فاکتورهای رونویسی جنینی هم چون 4-SSEA و 4OCT هستند و لذا می‌توانند کاندید مناسبی برای درمان دیابت محسوب شوند. در این مطالعه سلول‌های CD133+ خون بند ناف به منظور تمایز به سلول‌های ترشح‌کننده انسولین مورد بررسی قرار گرفتند.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. سلول‌های CD133+ خون بند ناف با استفاده از روش MACS جدا شدند و در محیط کشت تمایزی(حاوی DMEM/F12 ، Nicotinamid ، bFGF ، N2 supplement B27) به مدت 9 روز قرار گرفتند. از روش ایمونوسیتوشیمی، برای بررسی بیان پروتئین‌های انسولین و پپتید-C ، از RT-PCR برای بررسی بیان ژن‌های انسولین، گلوکاگون، 1PDX و 1/6NKX و از الایزا برای تعیین عملکرد سلول‌های تمایز یافته استفاده شد.
یافته‌ها
سلول‌های CD133+ مشتق از خون بند ناف در انتهای مرحله تمایزی، پروتئین انسولین و پپتید-C را بیان کردند. سلول‌های تمایز یافته، قادر به بیان ژن‌های 1/6NKX ، 1PDX ، انسولین و گلوکاگون نبودند و هم چنین توانایی پاسخ به تیمارهای مختلف گلوکز(5 و 27 میلی مولار) را نداشتند.
نتیجه گیری
سلول‌های CD 133+ قادر به تمایز به سلول‌های انسولین‌ساز در محیط آزمایشگاه می‌باشند اما توانایی لازم برای ترشح انسولین را نداشته و نیازمند سیگنال‌های مناسب از محیط زنده هستند.
کلمات کلیدی: خون بند ناف، سلول‌های ترشح‌کننده انسولین، دیابت قندی تیپ I
تاریخ دریافت : 21/10/90
تاریخ پذیرش : 11/5 /91
1- کارشناس ارشد علوم سلولی تکوینی ـ گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسؤول: PhD ایمونولوژی ـ استادیار گروه زیست پزشکی ترمیمی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 4644-19395
3- PhD بیوتکنولوژی ـ دانشیار گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس علوم آزمایشگاهی ـ گروه زیست پزشکی ترمیمی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
5- PhD ایمونولوژی ـ استادیار گروه زیست پزشکی ترمیمی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
6- PhD علوم سلولی تکوینی ـ استاد گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
فاضل صحرانشین سامانی1، مرضیه ابراهیمی2، طاهره زندیه3، منیره محمد4، ناصر اقدمی5، حسین بهاروند6
چکیده
سابقه و هدف
تولید سلول‌های اندوکرینی و جزایر انسولین‌ساز، از جمله اهداف درمان دیابت می‌باشد. مشخص شده است که سلول‌های CD133+ خون بند ناف قادر به بیان فاکتورهای رونویسی جنینی هم چون 4-SSEA و 4OCT هستند و لذا می‌توانند کاندید مناسبی برای درمان دیابت محسوب شوند. در این مطالعه سلول‌های CD133+ خون بند ناف به منظور تمایز به سلول‌های ترشح‌کننده انسولین مورد بررسی قرار گرفتند.
مواد و روش‌ها
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. سلول‌های CD133+ خون بند ناف با استفاده از روش MACS جدا شدند و در محیط کشت تمایزی(حاوی DMEM/F12 ، Nicotinamid ، bFGF ، N2 supplement B27) به مدت 9 روز قرار گرفتند. از روش ایمونوسیتوشیمی، برای بررسی بیان پروتئین‌های انسولین و پپتید-C ، از RT-PCR برای بررسی بیان ژن‌های انسولین، گلوکاگون، 1PDX و 1/6NKX و از الایزا برای تعیین عملکرد سلول‌های تمایز یافته استفاده شد.
یافته‌ها
سلول‌های CD133+ مشتق از خون بند ناف در انتهای مرحله تمایزی، پروتئین انسولین و پپتید-C را بیان کردند. سلول‌های تمایز یافته، قادر به بیان ژن‌های 1/6NKX ، 1PDX ، انسولین و گلوکاگون نبودند و هم چنین توانایی پاسخ به تیمارهای مختلف گلوکز(5 و 27 میلی مولار) را نداشتند.
نتیجه گیری
سلول‌های CD 133+ قادر به تمایز به سلول‌های انسولین‌ساز در محیط آزمایشگاه می‌باشند اما توانایی لازم برای ترشح انسولین را نداشته و نیازمند سیگنال‌های مناسب از محیط زنده هستند.
کلمات کلیدی: خون بند ناف، سلول‌های ترشح‌کننده انسولین، دیابت قندی تیپ I
تاریخ دریافت : 21/10/90
تاریخ پذیرش : 11/5 /91
 |
1- کارشناس ارشد علوم سلولی تکوینی ـ گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
2- مؤلف مسؤول: PhD ایمونولوژی ـ استادیار گروه زیست پزشکی ترمیمی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 4644-19395
3- PhD بیوتکنولوژی ـ دانشیار گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
4- کارشناس علوم آزمایشگاهی ـ گروه زیست پزشکی ترمیمی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
5- PhD ایمونولوژی ـ استادیار گروه زیست پزشکی ترمیمی ـ پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
6- PhD علوم سلولی تکوینی ـ استاد گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی ـ پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی جهاد دانشگاهی ـ مرکز تحقیقات علوم سلولی ـ پژوهشگاه رویان ـ تهران ـ ایران
مقدمه
دیابت نوع I ، نتیجه حمله اتوایمیون علیه سلول‌های بتا جزایر لانگرهانس بوده که منجر به از دست رفتن 70% توده سلول‌های بتا می‌شود. این در حالی است که دیابت نوع II در نتیجه عدم پاسخ‌گویی سلول‌های هدف به انسولین ترشحی ایجاد گردیده و در مراحل بعد بیماری به کاهش 50% توده سلول‌های بتا می‌انجامد(2، 1). این بیماران نیازمند مصرف مستمر داروهای کاهش‌دهنده قند خون، از جمله انسولین می‌باشند اما مقداری از انسولین تزریق شده در این بیماران توسط آنزیم‌های پروتئولیتیک از بین می‌رود. پیوند کامل پانکراس و یا پیوند جزایر جدا شده از افراد با مرگ مغزی به همراه استفاده از سرکوبگرهای ایمنی غیر استروئیدی از روش‌های دیگر درمان در افراد دیابتی می‌باشد، اگر چه کمبود افراد دهنده و نتایج طولانی مدت ناشی از سرکوبگرهای ایمنی در این بیماران از جمله محدودیت‌های این روش درمانی به شمار می‌رود(3). اخیراً با توجه به پیشرفت در زمینه سلول‌های بنیادی، امید است که با استفاده از این سلول‌ها بتوان به درمان قطعی دیابت کمک نمود.
سلول‌های بنیادی، سلول‌هایی پر توان(Pluripotent stem cells) هستند که قابلیت تمایز به سه لایه جنینی(اکتودرم، مزودرم و آندودرم) را دارا می‌باشند(4). تمایز سلول‌های بنیادی موشی و انسانی از سال 2000 تا کنون با مطالعه تکوین سلول‌های انسولین‌ساز در بدن و بر اساس روش‌هایی از قبیل انتخاب سلول‌های نستین مثبت (بیان‌کننده نستین)، استفاده از بیان ژن‌های هدف و تمایز سلول‌های نستین منفی(عدم بیان نستین) به سلول‌های تولیدکننده انسولین انجام شده است(9-5). اما انسولین ترشحی در سلول‌های تمایز یافته در این نوع مطالعه‌ها، ناشی از جذب انسولین در سلول‌های آپوپتوز شده از محیط کشت بوده است(10). هم چنین خطر تومورزایی، مشکلات اخلاقی و استفاده از داروهای سرکوب‌کننده بعد از پیوند نیز از جمله مشکلات استفاده از سلول‌های بنیادی جنینی است که استفاده درمانی آن را با چالش مواجه می‌سازد(11).
سلول‌هـای بنیـادی بزرگسـال بـه علــت عدم وجـود
مشکلات اخلاقی و خطر پایین تومورزایی، کاندیداهای مناسبی در درمان بیماران دیابتی می‌باشند. سلول‌های مشتق از مغز استخوان، سلول‌های مشتق از بافت‌های چربی، سلول‌های مشتق از بافت پانکراس و سلول‌های مشتق از خون بند ناف از جمله منابع مورد مطالعه برای تولید سلول‌های انسولین‌ساز بوده و هستند. سلول‌های بنیادی موجود در خون بند ناف انسان، جوانترین منابع سلول‌های بالغ با ویژگی‌های تلومراز بلند، خطر آلودگی ویروسی پایین، کاهش القای بیماری پیوند علیه میزبان(GVHD) در مقایسه با سلول‌های مغز استخوان از جمله منابع ارزشمند برای سلول درمانی محسوب می‌شوند(12). از سال 2004 تاکنون مطالعه روی توانایی تمایز سلول‌های جدا شده از خون بند ناف انسان و تمایز آن‌ها به سلول‌های انسولین‌ساز مورد توجه قرار گرفته است. سلول CD133+ موجود در خون بند ناف، با بیان شاخص‌های بنیادی مثل 4-SSEA و A 4OCT از سلول‌های چند توان محسوب شده و کاندید مناسبی برای القای تمایز می‌باشد و به علت در دسترس بودن، از ابزار مناسب درمانی شناخته می‌شود(14-12). لذا در این مطالعه بر آن شدیم که تمایز سلول‌های CD133+ مشتق از خون بند ناف به سلول‌های انسولین‌ساز را در محیط آزمایشگاه مورد بررسی قرار دهیم.
مواد و روش‌ها
جداسازی سلول‌های CD133+ از خون بند ناف با استفاده از روش MACS (Magnetic Activated Sorting) :
مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. خون بند ناف انسان از بانک عمومی خون بند ناف رویان تهیه گردید. به منظور جداسازی سلول‌های تک هسته‌ای و افزایش سرعت رسوب سلول‌های قرمز خون بند ناف، از محلول اتیل استارچ (HEAS)(Free flex) به نسبت یک به پنج استفاده شد. سپس پلاسمای غنی از سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف به آرامی توسط پلاسما اکسترکتر جدا و به نسبت 1 به 3 به روی فایکول(Inno-Train) با چگالی cm2/g077/1 منتقل گردید. سپس به مدت 30 دقیقه با دور g 400 و بدون ترمز در دمای اتاق سانتریفوژ شد. سلول‌های تک هسته‌ای((MNC از فاز میانی فایکول و پلاسما جدا و با 3 برابر محلول PBS همراه با mM2 EDTA شستشو داده شد. سپس رسوب سلولی با استفاده از سانتریفوژ به مدت 10 دقیقه و دور g 400 تهیه گردید. برای جداسازی سلول‌های CD133+ ، از روش جداسازی به روش بید مغناطیسی (MACS) و بر اساس دستور شرکت سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، 100 میکرولیتر از محلول FcR blocking ، 100 میکرولیتر از محلول میکروبید(میلتنی - بیوتک) و 300 میکرولیتر از محلول PBS حاوی EDTA mM 2، به رسوب سلولی اضافه و به مدت 30 دقیقه در یخچال انکوبه شد(16، 15). پس از 3-2 بار شستشوی ستون با حجم 500 میکرولیتر از PBS ، سوسپانسیون سلولی به حجم 500 میکرولیتر به ستون اضافه گردید. در مرحله بعد، ستون به میزان 5 بار با حجم 500 میکرولیتر از PBS شستشو داده شد تا سلول‌های نچسبیده به ستون جدا شوند. در پایان یک میلی‌لیتر از PBS به ستون اضافه و پس از جداسازی ستون از آهن‌ربا، سلول‌های چسبیده به ستون با فشار پیستون خارج شدند. سلول‌های حاصل حاوی سلول‌های CD133+ بودند.
به منظور به دست آوردن خلوص بالاتر، سلول‌های فوق شسته شدند و به رسوب حاصل 20 میکرولیترFcR Blocking ، 20 میکرولیتر میکروبید CD133+ و 200 میکرولیتر PBS اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای ºC 4 انکوبه شد و مراحل عبور از ستون مجدداً تکرار شد(16، 15). درصد سلول‌های زنده توسط تریپان‌بلو تعیین گردید. به منظور تعیین خلوص سلولی، سلول‌های CD133+ خارج شده از ستون، شمارش شده و تعداد 106 × 1 سلول به لوله‌های مخصوص فلوسیتومتری منتقل شد و با 3 میکرولیتر از آنتی‌بادی AC133/2 (میلتنی - بیوتک) به مدت 45-30 دقیقه درون یخچال انکوبه گردید. از آنتی‌بادی Mouse IgG1-PE به عنوان کنترل ایزوتیپ استفاده گردید.
در انتها و پس از شستشوی سلول‌ها توسط بافر فسفات نمکی(PBS)، نتایج توسط دستگاه فلوسایتومتری FACSCalibur مجهز به لیزر nm 488 قرائت شد. آنالیز داده‌ها با برنامه Cell Quest انجام شد.
تمایز سلول CD133+ به سلول‌های انسولین ساز:
به منظور تمایز سلول‌ها از روش شیما و با کمـی تغییرات استفاده شد(17). به طور خلاصه تعداد 106 * 2 سلول CD133+ به محیط DMEM با غلظت گلوکز بالا (mg/L 4500) حاوی 10% سرم گاوی(جیبکو)، به همراه ng/mL 100 اکتیوین A (R&D) به پلیت‌های 24 خانه که با ژلاتین 1/0% پوشیده شده بودند، منتقل و به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. پس از گذشت زمان مورد نظر، به منظور تولید سلول‌های اندودرم قطعی، میزان M 6-10 رتینوئیک اسید(سیگما) به سلول‌ها اضافه و 24 ساعت دیگر کشت ادامه یافت. سپس به منظور تولید سلول‌های لوله گوارش خلفی، تعویض محیط صورت گرفت و محیطDMEM با غلظت گلوکز بالا همراه با 10% سرم گاوی و ng/mL 30 از bFGF اضافه و کشت به مدت 5-3 روز دیگر ادامه یافت.
در مرحله آخر، برای تولید پیش‌سازهای پانکراس، تعویض محیط انجام شد و محیط DMEM/F12 (جیبکو) به همراه (ng/mL 10) bFGF ، (mM 10) Nicotinamid ، (2%) 27supplement B و (1%) N2 (سیگما) به سلول‌ها اضافه و کشت به مدت 5 روز دیگر ادامه یافت.
ایمونوسیتوشیمی:
سلول‌های حاصل از مرحله آخر تمایز باPBS به مدت 5 دقیقه شستشو و سپس توسط پارا فرم آلدهید 4% به مدت 30 دقیقه و در یخچال تثبیت شدند. به منظور نفوذپذیری غشا، از 2/0% Tritonx-100 (مرک) به مدت 7 دقیقه و در دمای محیط استفاده شد. برای جلوگیری از اتصالات غیر اختصاصی، سلول‌ها با سرم 10% بز به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. آنتی‌بادی اولیه C-PEPTIDE (کمیکون) با رقت 250/1 و آنتی‌بادی اولیه انسولین(سیگما) 500/1 مورد استفاده قرار گرفت. آنتی‌بادی‌های اولیه به مدت یک شبانه روز در دمای ºC 4 و در تاریکی انکوبه شدند. به گروه ایزوتیپ نیز آنتی‌بادی اولیه زده نشد. سپس سلول‌ها یک بار با PBS حاوی Tween (05/0%) شستشو و سانتریفوژ شد. محیط رویی خارج و آنتی‌بادی ثانویه متصل به FITC (سیگما) با
جدول 1: آغازگرهای ژن‌های مورد استفاده در این مطالعه
| ژن | توالی آغازگر '5 به '3 | دمای آنیلینگ | طول bp |
| GAPDH | CTC ATT TCC TGG TAT GAC AAC GA CTT CCT CTT GTG TTGCT |
58 | 224 |
| Glucagon | CCA GAT CAT TCT CAG CTT CC GGC AAT GTT ATT CCT GTT CC |
56 | 180 |
| Insulin | AGC CTT TGT GAA CCA ACA CC GCT GGT AGA GGG AGC AGA TG |
60 | 245 |
| 1PDX | GGA TGA AGT CTA CCA AAG CTC AC CCA GAT CTT GAT GTG TCT CTC G |
62 | 180 |
| 1/6NKX | GTT CCT CCT CCT CCT CTT CCT C AAG ATC TGC TGT CCG GAA AAA G | 58 | 381 |
| Nanog | AGC TAC AAA CAG GTG AAG AC GGT GGT AGG AAG AGT AAA GG | 58 | 145 |
| 4OCT | GTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGC GTT ACA GAA CCA CAC TCG GA |
60 | 323 |
| CD133+ | TAAGTACTATCGTCGAATGG TCAAGCAGTTTCAACATCAGC |
60 | 310 |
رقت 200/1 به مدت 45 دقیقه در ºC 37 انکوبه شد. سلول‌ها دو بار و هر بار به مدت 15 دقیقه شستشو داده شدند. برای مشخص شدن هسته‌ها، از DAPI استفـاده شد(18).
بررسی بیان ژن‌های تولیدکننده انسولین در سلول‌های تمایز یافته انسولین ساز توسط RT-PCR :
استخراج RNA با کیت Rneasy Micro از شرکت کیاژن و طبق روش پیشنهادی کیت انجام شد. غلظت RNA محاسبه و برای ساخت cDNA مطابق با دستور کیت (6110A) تاکارا اقدام شد. به این منظور 1 میکرولیتر رندوم هگزامر با 1 میکرولیتر dNTPو 10 میکرولیتر RNA (µg/µL 13/0) مخلوط و در دمای ºC 65 به مدت 5 دقیقه انکوبه گردید. سپس 12میکرولیتر از cDNA با غلظت ng/µL 50 ، 5/0 میکرولیتر RNase Inhibitor ، 1 میکرولیتر RTase و 4 میکرولیتر بافر X 5 اضافه و حجم نهایی با آب دپس به 20 میکرولیتر رسانده شد. به مدت 10 دقیقه در دمای ºC 30 انکوبه و سپس در دمای ºC 42 به مدت یک ساعت انکوباسیون انجام شد. برای غیر فعال شدن آنزیم در دمای ºC 95 به مدت 5 دقیقه، انکوباسیون ادامه پیدا کرد. از GAPDH به عنوان کنترل داخلی و از سلول‌های بنیادی انسانی که به سلول‌های انسولین‌ساز تمایز داده شده بودند به عنوان گروه کنترل مثبت استفاده شد. سپس به منظور شروع دناتوراسیون به مدت 4 دقیقه در دمای ºC 94 ، برای ادامه دناتوراسیون به مدت 30 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، برای آنیلینگ در دمای 60 درجه سانتی‌گراد(به طور میانگین) به مدت 30 ثانیه و برای مرحله اکستنشن به مدت 20 ثانیه و در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و برای 35 بار تکرار، در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد(جدول 1).
بررسی میزان ترشح انسولین با روش الایزا:
سلول‌های تمایز یافته در مرحله آخر با بافر کربس- رینگر که شامل 120 میلی‌مولار NaCl ، 5 میلی‌مولار KCl ، 5/2 میلی‌مولار CaCl2 ، 25 میلی‌مولار NaHCO3 Buffer و 10 درصد BSA است، دو بار شسته شدند و سپس با بافر حاوی گلوکز با غلظت 3 میلی‌مولار در دمای ºC 37 به مدت 45 دقیقه تیمار شدند. سپس محلول رویی سلول‌ها برداشته شد و تا زمان آزمایش در دمای 20- درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از آن، سلول‌ها به مدت 45 دقیقه دیگر در مجاورت محلول کربس با غلظت mM 5 و 45 دقیقه دیگر نیز با غلظت mM 27 قرار گرفتند و مجدد محلول رویی سلولی جمع‌آوری و در فریزر تا زمان آزمایش نگهداری شد.
میزان ترشح انسولین در محلول رویی سلول‌های تمایز یافته با استفاده از کیت الایزا (شرکت مرکودیا) و طبق دستورالعمل شرکت سازنده محاسبه شد. نمونه استاندارد موجود در کیت با غلظت‌هایng/mL 20-0 و نیز نمونه‌های آزمایش به طور جداگانه(هر کدام 25 میکرولیتر) به خانه‌های پلیت 96 تایی که با آنتی‌بادی مونوکلونال ضد انسولین انسانی پوشیده شده اضافه گردید. سپس آنزیم کونژوگه رقیق شده را به هر خانه اضافه کرده، به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوباسیون شد.
پس از 6 بار شستشو توسط بافر شستشو، 200 میکرولیتر سوبسترای TMB به هر خانه اضافه و به مدت 15 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق انکوباسیون گردید. با افزودن50 میکرولیتر از محلول متوقف کننده، واکنش آنزیمی متوقف شد و میزان جذب نمونه‌ها با دستگاهELISA reader در طول موج nm 450 به دست آمد. در پایان غلظت انسولین موجود در نمونه‌های آزمایش به کمک نمودار استاندارد رسم گردید.
آنالیز داده‌ها:
داده‌ها با نرم‌افزار 18SPSS به روش آنالیز واریانس یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و 05/0 p< به عنوان معناداری در نظر گرفته شد. هر کدام از آزمایش‌ها و روش‌های مورد استفاده در این مطالعه حداقل سه بار مورد آزمایش قرار گرفتند.
یافته‌ها
در این مطالعه سلول‌های CD133+ از خون بند ناف با روش جداسازی توسط ذرات مغناطیسی(MACS) جدا شد. به منظور افزایش خلوص سلولی، سلول‌ها دو بار از روی ستون گذرانده شدند. نتایج نشان داد که از متوسط حجمی 82/93 میلی‌لیتر خون بند ناف مورد آزمایش، میزان 106 * 97/45 ± 93/98 سلول تک هسته‌ای جدا شد. درصد خلوص سلول‌های CD133+ مشتق از سلول‌های تک هسته‌ای پس از یک بار عبور از ستون 19/13 ± 07/47% و پس از دو بار عبور از ستون 21/5 ± 28/91% بود. اگر چه تعداد سلول CD133+ جدا شده پس از دومین عبور از ستون، به طور معناداری کاهش یافت اما میزان خلوص سلولی از 47 % به93% افزایش یافت(جدول 2). درصـد بازیافـت سلول‌هـا (Recovery) از محاسبـه نسبـت تعـداد
سلول‌های CD133+ خالص شده به تعـداد سلول‌هـای تـک هسته‌ای که وارد ستون شده‌اند به دست آمد.
بررسی بیان ژن‌های بنیادی توسط RT-PCR نشان داد که ژن‌های 4OCT و NANOG در این سلول‌ها بیان می‌شوند (شکل 1). در بررسی ریخت‌شناسی سلول‌های تمایز یافته مشخص گردید که 48 ساعت پس از کشت، اجتماعات کوچکی از سلول‌ها، در ظروف کشت ظاهر می‌شونـد که در مرحله دوم تشکیل دهنده اجتماعات شبه کلونی می‌باشند. به نظر می‌رسد که این اجسام شبه کلونی، حاصل تکثیر اجتماعات سلولی مرحله اول باشند(شکلB و A -2). با افزایش فاکتورهای نیکوتین آمید، B27 و N2 در مرحله سوم، اندازه این کلونی‌ها افزایش یافت (شکل C-2). در پاسخ به این پرسش که آیا سلول‌های تشکیل‌دهنده این کلونی‌ها، توان تولید انسولین را دارند، پروتئین‌های انسولین و پپتید - C به وسیله روش ایمونوسیتوشیمی و با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی ضد انسولین و ضد پپتید -C مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج نشان داد که اکثر سلول‌های بیان‌کننده دو پروتئین انسولین و پپتید-C در سیتوپلاسم سلول‌های موجود در کلونی‌های شبه‌جزیره‌ای وجود داشتند. به منظور کمی کردن نتایج ایمونوسیتوشیمی، ده تصویر به طور تصادفی در هر گروه شمارش و درصد سلول‌های مثبت تعیین گردید(18). نتایج نشان داد که درصد سلول‌های بیان‌کننده انسولین در گروه آزمایش، 31/0 ± 25/2% و پپتید، C 37/0 ± 02/1% بود(شکل B و A-3).
بررسی بیان ژن‌های مورد مطالعه سلول‌های انسولینی با روش RT-PCR نشان داد که ژن‌های 1PDX ، 1/6NKX ، GLOCAGON و INSULIN در گروه مورد مطالعه بیان نشدند(شکل B -3). نتایج به دست آمده از بررسی ترشح فعالانه انسولین نیز نشان داد که سلول‌های تمایز یافته در پاسخ به غلظت‌های بالاتر گلوکز(27 میلی‌مولار)، مقادیر کمتری از انسولین را نسبت به غلظت‌های پایین‌تر گلوکز(5 میلی‌مولار) ترشح می‌کنند(نمودار 1). ترشح انسولین در سلول‌های CD133+ مشتق از خون بندناف تمایز داده نشده(روز اول)، به عنوان گروه کنترل منفی نیز مشاهده نشد.
بررسی بیان ژن‌های تولیدکننده انسولین در سلول‌های تمایز یافته انسولین ساز توسط RT-PCR :
استخراج RNA با کیت Rneasy Micro از شرکت کیاژن و طبق روش پیشنهادی کیت انجام شد. غلظت RNA محاسبه و برای ساخت cDNA مطابق با دستور کیت (6110A) تاکارا اقدام شد. به این منظور 1 میکرولیتر رندوم هگزامر با 1 میکرولیتر dNTPو 10 میکرولیتر RNA (µg/µL 13/0) مخلوط و در دمای ºC 65 به مدت 5 دقیقه انکوبه گردید. سپس 12میکرولیتر از cDNA با غلظت ng/µL 50 ، 5/0 میکرولیتر RNase Inhibitor ، 1 میکرولیتر RTase و 4 میکرولیتر بافر X 5 اضافه و حجم نهایی با آب دپس به 20 میکرولیتر رسانده شد. به مدت 10 دقیقه در دمای ºC 30 انکوبه و سپس در دمای ºC 42 به مدت یک ساعت انکوباسیون انجام شد. برای غیر فعال شدن آنزیم در دمای ºC 95 به مدت 5 دقیقه، انکوباسیون ادامه پیدا کرد. از GAPDH به عنوان کنترل داخلی و از سلول‌های بنیادی انسانی که به سلول‌های انسولین‌ساز تمایز داده شده بودند به عنوان گروه کنترل مثبت استفاده شد. سپس به منظور شروع دناتوراسیون به مدت 4 دقیقه در دمای ºC 94 ، برای ادامه دناتوراسیون به مدت 30 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، برای آنیلینگ در دمای 60 درجه سانتی‌گراد(به طور میانگین) به مدت 30 ثانیه و برای مرحله اکستنشن به مدت 20 ثانیه و در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و برای 35 بار تکرار، در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد(جدول 1).
بررسی میزان ترشح انسولین با روش الایزا:
سلول‌های تمایز یافته در مرحله آخر با بافر کربس- رینگر که شامل 120 میلی‌مولار NaCl ، 5 میلی‌مولار KCl ، 5/2 میلی‌مولار CaCl2 ، 25 میلی‌مولار NaHCO3 Buffer و 10 درصد BSA است، دو بار شسته شدند و سپس با بافر حاوی گلوکز با غلظت 3 میلی‌مولار در دمای ºC 37 به مدت 45 دقیقه تیمار شدند. سپس محلول رویی سلول‌ها برداشته شد و تا زمان آزمایش در دمای 20- درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از آن، سلول‌ها به مدت 45 دقیقه دیگر در مجاورت محلول کربس با غلظت mM 5 و 45 دقیقه دیگر نیز با غلظت mM 27 قرار گرفتند و مجدد محلول رویی سلولی جمع‌آوری و در فریزر تا زمان آزمایش نگهداری شد.
میزان ترشح انسولین در محلول رویی سلول‌های تمایز یافته با استفاده از کیت الایزا (شرکت مرکودیا) و طبق دستورالعمل شرکت سازنده محاسبه شد. نمونه استاندارد موجود در کیت با غلظت‌هایng/mL 20-0 و نیز نمونه‌های آزمایش به طور جداگانه(هر کدام 25 میکرولیتر) به خانه‌های پلیت 96 تایی که با آنتی‌بادی مونوکلونال ضد انسولین انسانی پوشیده شده اضافه گردید. سپس آنزیم کونژوگه رقیق شده را به هر خانه اضافه کرده، به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوباسیون شد.
پس از 6 بار شستشو توسط بافر شستشو، 200 میکرولیتر سوبسترای TMB به هر خانه اضافه و به مدت 15 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق انکوباسیون گردید. با افزودن50 میکرولیتر از محلول متوقف کننده، واکنش آنزیمی متوقف شد و میزان جذب نمونه‌ها با دستگاهELISA reader در طول موج nm 450 به دست آمد. در پایان غلظت انسولین موجود در نمونه‌های آزمایش به کمک نمودار استاندارد رسم گردید.
آنالیز داده‌ها:
داده‌ها با نرم‌افزار 18SPSS به روش آنالیز واریانس یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و 05/0 p< به عنوان معناداری در نظر گرفته شد. هر کدام از آزمایش‌ها و روش‌های مورد استفاده در این مطالعه حداقل سه بار مورد آزمایش قرار گرفتند.
یافته‌ها
در این مطالعه سلول‌های CD133+ از خون بند ناف با روش جداسازی توسط ذرات مغناطیسی(MACS) جدا شد. به منظور افزایش خلوص سلولی، سلول‌ها دو بار از روی ستون گذرانده شدند. نتایج نشان داد که از متوسط حجمی 82/93 میلی‌لیتر خون بند ناف مورد آزمایش، میزان 106 * 97/45 ± 93/98 سلول تک هسته‌ای جدا شد. درصد خلوص سلول‌های CD133+ مشتق از سلول‌های تک هسته‌ای پس از یک بار عبور از ستون 19/13 ± 07/47% و پس از دو بار عبور از ستون 21/5 ± 28/91% بود. اگر چه تعداد سلول CD133+ جدا شده پس از دومین عبور از ستون، به طور معناداری کاهش یافت اما میزان خلوص سلولی از 47 % به93% افزایش یافت(جدول 2). درصـد بازیافـت سلول‌هـا (Recovery) از محاسبـه نسبـت تعـداد
سلول‌های CD133+ خالص شده به تعـداد سلول‌هـای تـک هسته‌ای که وارد ستون شده‌اند به دست آمد.
بررسی بیان ژن‌های بنیادی توسط RT-PCR نشان داد که ژن‌های 4OCT و NANOG در این سلول‌ها بیان می‌شوند (شکل 1). در بررسی ریخت‌شناسی سلول‌های تمایز یافته مشخص گردید که 48 ساعت پس از کشت، اجتماعات کوچکی از سلول‌ها، در ظروف کشت ظاهر می‌شونـد که در مرحله دوم تشکیل دهنده اجتماعات شبه کلونی می‌باشند. به نظر می‌رسد که این اجسام شبه کلونی، حاصل تکثیر اجتماعات سلولی مرحله اول باشند(شکلB و A -2). با افزایش فاکتورهای نیکوتین آمید، B27 و N2 در مرحله سوم، اندازه این کلونی‌ها افزایش یافت (شکل C-2). در پاسخ به این پرسش که آیا سلول‌های تشکیل‌دهنده این کلونی‌ها، توان تولید انسولین را دارند، پروتئین‌های انسولین و پپتید - C به وسیله روش ایمونوسیتوشیمی و با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی ضد انسولین و ضد پپتید -C مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج نشان داد که اکثر سلول‌های بیان‌کننده دو پروتئین انسولین و پپتید-C در سیتوپلاسم سلول‌های موجود در کلونی‌های شبه‌جزیره‌ای وجود داشتند. به منظور کمی کردن نتایج ایمونوسیتوشیمی، ده تصویر به طور تصادفی در هر گروه شمارش و درصد سلول‌های مثبت تعیین گردید(18). نتایج نشان داد که درصد سلول‌های بیان‌کننده انسولین در گروه آزمایش، 31/0 ± 25/2% و پپتید، C 37/0 ± 02/1% بود(شکل B و A-3).
بررسی بیان ژن‌های مورد مطالعه سلول‌های انسولینی با روش RT-PCR نشان داد که ژن‌های 1PDX ، 1/6NKX ، GLOCAGON و INSULIN در گروه مورد مطالعه بیان نشدند(شکل B -3). نتایج به دست آمده از بررسی ترشح فعالانه انسولین نیز نشان داد که سلول‌های تمایز یافته در پاسخ به غلظت‌های بالاتر گلوکز(27 میلی‌مولار)، مقادیر کمتری از انسولین را نسبت به غلظت‌های پایین‌تر گلوکز(5 میلی‌مولار) ترشح می‌کنند(نمودار 1). ترشح انسولین در سلول‌های CD133+ مشتق از خون بندناف تمایز داده نشده(روز اول)، به عنوان گروه کنترل منفی نیز مشاهده نشد.
جدول 2: مشخصات خون بند ناف‌های مورد آزمایش
| شماره | حجم (mL) |
سلول‌های تک هسته‌ای (درصد) |
زنده ماندن (درصد) |
خلوص CD133+ (مرحله اول) (درصد) |
شمارش (مرحله اول) (درصد) |
خلوص CD133+ (مرحله دوم) (درصد) |
شمارش (مرحله دوم) (104 *) |
بازدهی (درصد) |
| 1 | 100 | 118 | 100 | 17/40 | 130 | 54/84 | 100 | 84/0 |
| 2 | 94 | 88 | 98 | 32/20 | 160 | 55/80 | 100 | 1/1 |
| 3 | 90 | 250 | 97 | 94/34 | 145 | 61/95 | 120 | 48/0 |
| 4 | 87 | 7/140 | 97 | 62 | 200 | 57/89 | 150 | 07/1 |
| 5 | 100 | 70 | 98 | 25 | 50 | 28/91 | 4/32 | 46/0 |
| 6 | 86 | 70 | 100 | 6/56 | 51 | 27/92 | 40 | 57/0 |
| 7 | 66 | 70 | 99 | 37/44 | 75 | 99 | 55 | 78/0 |
| 8 | 5/132 | 150 | 985 | 37/57 | 85 | 84/93 | 70 | 46/0 |
| 9 | 111 | 90 | 95 | 97/59 | 175 | 54/80 | 125 | 3/1 |
| 10 | 109 | 70 | 94 | 35/54 | 130 | 96 | 6/105 | 5/1 |
| 11 | 106 | 50 | 97 | 34/37 | 35 | 89 | 20 | 4/0 |
| 12 | 106 | 70 | 98 | 45/51 | 50 | 97 | 30 | 42/0 |
| 13 | 89 | 45 | 99 | 98/56 | 50 | 6/88 | 35 | 7/0 |
| 14 | 101 | 90 | 99 | 45/51 | 120 | 6/95 | 95 | 05/1 |
| 15 | 90 | 110 | 100 | 99/56 | 140 | 6/89 | 105 | 95/0 |
| 16 | 65 | 96 | 95 | 25/65 | 56 | 06/92 | 4/36 | 37/0 |
| 17 | 70 | 87 | 98 | 2/35 | 54 | 07/95 | 41 | 47/0 |
| 18 | 85 | 95 | 98 | 6/42 | 64 | 3/95 | 35 | 36/0 |
| 19 | 95 | 120 | 99 | 1/35 | 70 | 98/88 | 40 | 3/0 |
| میانگین | 82/93 | 93/98 | 84/97 | 07/47 | 84/96 | 28/91 | 28/70 | 71/0 |
| انحراف معیار | 42/16 | 97/45 | 7/1 | 19/13 | 59/50 | 21/5 | 99/39 | 35/0 |
شکل 1: نتایج بررسی سلول‌های CD133+ قبل و بعد از جداسازی به روش فلوسایتومتری: A) بررسی اندازه و گرانولوسیتی سلول‌های تک هسته‌ای(MNC) جدا شده با استفاده از شیب غلظت فایکول، B)کنترل ایزوتایپ(Mouse IgG1-PE)، C) سلول‌های CD133+ پس از یک بار عبور از ستون، D) سلول‌های CD133+ پس از دو بار عبور از ستون، E) بیان ژن‌های بنیادینگی در سلول‌های CD133 مثبت(GAPDH به عنوان کنترل داخلی می‌باشد).
شکل 2 : تصاویر میکروسکوپی نوری مربوط به گروه مورد مطالعه: (A مرحله اول، (B مرحله دوم، (C مرحله سوم بزرگ‌نمایی X 10
شکل 3: (A) بررسی پپتید -C و انسولین در گروه مورد آزمایش با روش ایمونوسیتوشیمی(بزرگ‌نمایی X 10). هسته‌ها با رنگ DAPI و شاخص‌های انسولین و پپتید-C با رنگ FITC رنگ‌آمیزی شده‌اند. (B) RT-PCR برای ژن‌های سلول‌های انسولین‌ساز
نمودار 1: میزان ترشح انسولین در دو غلظت 5 و 27 میلی‌مولار
بحث
سلول‌های بنیادی خونساز مستقر در خون بند ناف، با توجه به ویژگی‌های منحصر به فرد خود و نیز بیان برخی شاخص‌های بنیادینگی، از جمله منابع مورد توجه برای تولید سلول‌های انسولین‌ساز می‌باشند(16). هم‌چنین جمعیتی از سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف، شاخص‌هـای سلول‌های اندوکرینی پانکراس از قبیل 3NGN ، 1-IS1 ، 4BRN ، 6PAX و 1PDX را بیان می‌کنند کـه پـس از تـزریـق بـه مدل‌هـای حیوانـی، بـه سلول‌های
ترشح‌کننده انسولین انسانی تمایز می‌یابند(19). لذا در این مطالعه، سلول‌های +CD133 خون بند ناف به منظور تمایز به سلول‌های انسولین‌ساز مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج این مطالعه که با استفاده از سلول‌های خالص شده CD133+ خون بندناف صورت گرفت نیز نشان داد که این سلول‌ها، ژن‌های 4OCT و NANOG را که از جمله ژن‌های بنیادی هستند بیان می‌کنند. در دو مطالعه جداگانه که توسط بال و مک گوکین بر سلول‌های خون بند ناف صورت گرفت، نیز نشان داده شده که این سلول‌ها ژن‌های 1REX ، 4FGF ، 2SOX ، 1SOX ، 4OCT و NANOG را بیان می‌کنند(20، 16). از آن جا که هدف این مطالعه، بررسی توان تمایزی این سلول‌ها به سمت سلول‌های ترشح‌کننده انسولینی بود، لذا در مرحله بعد سلول‌های +CD133 با استفاده از روش شای به منظور تولید سلول‌های اندودرم اصلی در تیمار با اکتیوین A و سپس رتینوئیک اسید قرار گرفتند(21). به منظور تولید اندودرم پانکراس و پیش‌سازهای پانکراس نیز به محیط کشت این سلول‌ها bFGF اضافه شد و در نهایت تکثیر و رشد پیش‌سازهای پانکراس به واسطه فاکتورهایی نظیر 27B ، 2N و نیکوتین آمید القا گردید.
نتایج میکروسکوپی نشان داد که در گروه مورد مطالعه، پس از مرحله اول شبه اجتماعاتی از سلول‌ها تشکیل گردید که پس از افزودن bFGF ، دسته‌های سلولی با یکدیگر تشکیل کلونی داده و با افزودن فاکتورهایی نظیر 27B و نیکوتین‌آمید، کلونی‌ها بزرگ‌تر شدند. در مطالعه‌های پیشین نیز که روی تمایز سلول‌های تک هسته‌ای خون بند ناف و سلول‌های CD133+ و CD34+ به سلول‌های انسولینی انجام شده، کلونی و اجتماعات سلولی مشاهده شده بود(22، 15). به این ترتیب تشکیل کلونی می‌تواند یکی از مراحل تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های انسولین‌ساز در نظر گرفته شود. این امر با بررسی بیان انسولین و پپتید-C که از شاخص‌های سلول‌های تمایزیافته انسولین‌ساز می‌باشند، توسط ایمنوسیتوشیمی مورد تایید قرار گرفت. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که سلول‌های بیان‌کننده این دو شاخص در کلونی‌ها واقع شده‌اند. در این مطالعه، درصد سلول‌های بیان‌کننده انسولین بیشتر از درصد سلول‌های بیان‌کننده پپتید-C بود که می‌تواند به سه دلیل باشد: 1- نیمه عمر پپتید-C از نیمه عمر انسولین کمتر است، 2- ممکن است مقداری از انسولین از محیط کشت جذب شده باشد، 3- درصد سلول‌های بیان‌کننده پپتید-C از درصد سلول‌های بیان‌کننده انسولین کمتر باشد(23، 10).
بررسی بیان ژن‌های GLOCAGON ، 1PDX ، 1/6NKX و INSULIN توسط RT-PCR در این مطالعه حاکی از عدم بیان ژن‌های مربوط به مرحله آخر تمایز سلول‌های انسولینی بود که می‌تواند به دلیل کافی نبودن سلول‌ها از نظر تعداد برای انجام این آزمون باشد. هم‌چنین میزان بیوسنتز انسولین توسط مکانیسم‌های مختلف از جمله افزایش رونویسی ژن انسولین، افزایش ترجمه از PreproInsulin mRNA و افزایش ظرفیت شبکه آندوپلاسمی برای ساخت انسولین کنترل می‌شوند(26-24). این در حالی است که تخریب mRNA انسولین به طور مستمر صورت می‌گیرد. هم چنین میزان تجدیدپذیری Preproinsulin mRNA در سلول‌های بتای بالغ پایین است. گلوکز اصلی‌ترین تنظیم‌کننده انسولین بوده که از تخریب mRNA انسولین در سلول‌ها جلوگیری می‌کند. به طوری که نیمه عمر mRNA انسولین در غلظت کم گلوکز 29 ساعت و در غلظت زیاد گلوکز 77 ساعت گزارش شده است(25). از راه‌کارهای مورد استفاده برای جلوگیری از تخریب mRNA انسولین در سال‌های اخیر، استفاده از پروتئین‌های متصل شونده به منطقه 3´UTR RNA به نام Polypyrimidine tract-binding protein (PTB) برای ثبوت RNA می‌باشد(27).
نتایج حاصل از سنجش فعالیت سلول‌های تمایزیافته در برابر غلظت‌های مختلف گلوکز نیز نشان داد که این سلول‌ها قادر به شناسایی غلظت‌های متفاوت گلوکز و ایجاد پاسخ مناسب در برابر آن نمی‌باشند، به این معنا که مقدار انسولین ترشحی در سلول‌های تمایز یافته در غلظت 5 میلی‌مولار گلوکز بیش از 27 میلی‌مولار گلوکز بود، که این مساله می‌تواند به دلایل زیر باشد:
- سلول‌های تمایزیافته دارای عملکرد طبیعی نیستند و نمی‌توانـند متناسب با غلظت‌های مختلف گلوکز انسولین
ترشح کنند.
- بخشی از انسولین آزاد شده در غلظت 5 و 27 میلی‌مولار، انسولین جذب شده از محیط کشت می‌باشند و توسط سلول و در پاسخ به گلوکز ساخته نشده‌اند.
لذا پیشنهاد می‌گردد که برای رفع این محدودیت از کیت‌هایی استفاده شود که اختصاصاً پپتید-C را شناسایی می‌کنند و یا این که انسولین مورد استفاده را نشان‌دار کرده تا از انسولینی که توسط خود سلول ساخته می‌شود، قابل تشخیص باشد. هم چنین برای بهبود نتایج حاصل از تمایز به سلول‌های انسولین‌ساز در محیط آزمایشگاه، انجام Quantitive Real Time PCR برای ژن‌های دخیل در تکوین پانکراس در مقاطع زمانی متعدد، تزریق سلول‌های حاصل از گروه مورد مطالعه به مدل‌های حیوانی جهت بررسی سطح قند خون، بررسی محتوای پروتئین انسولین و پپتید- C در سلول‌های تمایزیافته و انجام تمایز با طولانی‌تر کردن تیمار هر فاکتور القایی ضروری به نظر می‌رسد.
نتیجه‌گیری
نتایج این مطالعه که با هدف تمایز سلول‌های CD133+ مثبت مشتق از خون بند ناف انسان انجام گرفت نشان داد که سلول‌های CD133+ مثبت مشتق از خون بند ناف انسان در روشی کوتاه، توانایی تمایز به سلول‌های تولیدکننده انسولین را دارا هستند.
این در حالی است که وجود پپتید - C در محیط کشت حاکی از سنتز انسولین در داخل سلول است. ژن‌های مراحل آخر تمایزی در سلول‌های انسولینی حاصل مشاهده نگردید. هم‌چنین سلول‌های انسولینی تمایزیافته به تیمار با غلظت‌های مختلف گلوکز پاسخ نداده و انسولین را ترشح نمی‌کردند. همه این نتایج نشان‌دهنده آن است که سلول‌های CD133+ در محیط آزمایشگاه قادر به شروع تمایز به سلول‌های ترشح‌کننده انسولین می‌باشند، اما برای رسیدن به سلول‌های فعال ترشح‌کننده انسولین، نیازمند به سیگنال‌هایی از محیط زنده می‌باشند.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
