جلد 11، شماره 4 - ( زمستان 1393 )
جلد 11 شماره 4 صفحات 317-306 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Heydari D, Ghaffari S, Chahardouli B, Gh. A, Alimoghaddam K, Ghavamzadeh A. The development of Multiplex PCR-STR system for the analysis of genetic data of the Iranian population. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2015; 11 (4) :306-317
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-705-fa.html
URL: http://bloodjournal.ir/article-1-705-fa.html
حیدری داریوش، غفاری سید حمید، چهاردولی بهرام، قره‌باغیان احمد، علی‌مقدم کامران، قوام‌زاده اردشیر. توسعه سیستم‌های Multiplex PCR-STR جهت آنالیز داده‌های ژنتیکی جمعیت ایرانی. فصلنامه پژوهشی خون. 1393; 11 (4) :306-317
داریوش حیدری* 
، سید حمید غفاری ، بهرام چهاردولی ، احمد قره‌باغیان ، کامران علی‌مقدم ، اردشیر قوام‌زاده
، سید حمید غفاری ، بهرام چهاردولی ، احمد قره‌باغیان ، کامران علی‌مقدم ، اردشیر قوام‌زاده
تهران ـ‌ایران ـ 37515-16177
متن کامل [PDF 548 kb]
(3965 دریافت)
| چکیده (HTML) (8004 مشاهده)
مقدمه
روش واکنش زنجیره پلی‌مراز در توالی‌های بسیار تکرار شونده کوتاه(PCR-STR)؛ به عنوان یک روش انتخابی در پزشکی قانونی و تعیین ابوت و هم چنین در تعیین نقشه ژنتیکی، مطالعه‌های جمعیتی، آنالیز رده‌ای، مطالعه‌های تکاملی، تهیه بانک ملی DNA و تعیین هویت سوش‌ها در کشت بافتی استفاده می‌شود(4-1). این روش هم چنین در زمینه‌های مختلف تشخیص پزشکی شامل ارزیابی وضعیت کایمریسم و بررسی بیماران پس از پیوند آلوژنیک مغز استخوان(BMT) معرفی می‌شود(5). لکوس‌های STR ، دارای توالی‌های بسیار تکرار شونده bp7-3 هستند. ژنوم انسان ممکن است حاوی تعداد بسیار زیادی از یک STR تری‌مریک یا تترامریک در هر kb 20 باشد و تقریباً نصف لکوس‌های STR مطالعه شده، در تعداد تکرارها پلی‌مورفیک هستند، آن‌ها دارای یک منبع غنی از مارکرهای ژنتیکی می‌باشند(9-6). آزمایش PCR به وسیله آغازگرهای حاوی توالی‌های بی‌نظیر کنار هم(unique flanking sequence primers)، جهت آمپلی‌فای(تکثیر) قطعات DNA دارای لکوس‌های STR به کار گرفته شده است. در سال‌های اخیر، کشف و توسعه STR های پلی‌مورفیک به عنوان مارکرهای(نشانگرهای) ژنتیکی پیشرفت در جزئیات نقشه ژنتیکی رده‌ای، تشخیص هویت و تشخیص ژن‌های بیماری و در آسان‌سازی و دقت در تعیین نوع DNA استفاده شده است(19-10). خصوصیات تعداد زیادی از لکوس‌های STR با پلی‌مورفیک بالا، استفاده زیاد از این سیستم‌ها را در بررسی پزشکی قانونی، تعیین ابوت، تشخیص نوع سوش در کشت بافتی و آنالیز BMT میسر می‌سازد. مارکرهای (نشانگرهای) STR ، آنالیز مقادیر بسیار کم نمونه‌های بیولوژیکی را حتی با یک روش خالص‌سازی DNA خام اجازه می‌دهد. نتیجه آمپلی فیکاسیون(تکثیر)، قطعات لکوس‌های STR افراد از 100 تا 400 جفت باز می‌باشد که می‌تواند به سرعت و به طور صحیحی با استفاده از یک allelic ladder که به خوبی تعریف شده است، آنالیز شود. در جمعیت ایرانی از نقطه نظر ژنتیکی اطلاعاتی وجود ندارد و با توجه به دانش و آگاهی ما در این زمینه، این اولین مطالعه‌ای است که از ایران در زمینه انتشار و پراکندگی STRها گزارش شده است. در این مطالعه، طراحی سیستم‌های آمپلی فیکاسیون(تکثیر) Multiplex STR-PCR و کاربرد این سیستم‌ها از جهت بررسی انتشار فراوانی آللی 10 لکوس STR در جمعیت ایرانی توصیف شد. این مطالعه به عنوان یک رویکرد اولیه نسبت به ارزیابی و معرفی تعیین DNA در ایران انجام شد. به طور رایج این روش تعیین Multiplex DNA در مرکز تحقیــقـات خـون ، انکولوژی و پیونـد مغـز استخوان برای ارزیابی وضعیت کایمریسم و بررسی بیماران پس از BMT تاسیس شده است(21، 20).
مواد و روش‌ها
تهیه نمونه:
مطالعه انجام شده از نوع توصیفی بود. نمونه‌های خون محیطی از 100 نفر غیر خویشاوند سالم (hematopoietic stem cell donors) زنده در مناطق مختلف ایران صرف نظر از زمینه نژادیشان جمع‌آوری شدند. تمام این افراد اهداکنندگان سلول‌های بنیادی خونساز(به روش برداشت از مغز استخوان) بودند که به مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران از سراسر کشور فرستاده شده بودند. DNA با وزن مولکولی بالا از سلول‌های تک هسته‌ای گلبول‌های سفید با روش استاندارد نمک اشباع((salting out استخراج شدند(24-22). غلظت هر نمونه DNA توسط یک اسپکتروفتومترUV تعیین گردید (نسبت A260/A280 که برآوردی از خلوص DNA است، بین 2-7/1 بود).
آمپلی فیکاسیون(تکثیر) STR-PCR :
بعد از تحقیقات وسیع در نشریات، 15 لکوس STR تترانوکلئوتیدی که خوب تعریف شده بودند و از پلی‌مورفیسم بالایی برخوردار بودند، جهت این که به صورت مولتی‌پلکس ارزیابی شوند، انتخاب شدند. معیارهای انتخاب شامل، عدم هم‌پوشانی محصولات آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر)، مقدار بسیار کم یا نبود آرتی‌فکت‌های(محصولات ناخواسته) PCR که به علت آمپلی‌فیکاسیون غیر اختصاصی ایجاد می‌شود، سهل‌انگاری در تعیین آلل‌ها و وجود درجه بالای پلی‌مورفیسم در جمعیت ایرانی بودنـد. از ایـن مطالعه‌های اولیـه، 9 لکوس تترانوکلئوتیدی پلی‌مورفیک جهت این کار انتخاب شدند. 9 لکوس آمپلی‌فای شده در این مطالعه D4S2366 ، D16S539 ، TH01 ، D13S317 ، TPOX ، CSF1PO ، VWA ، FES/FPS و F13A01 بودند(جدول 1). به خاطر توالی‌های کنار هم بی‌نظیر هر لکوس، یک جفت آغازگر انتخاب و ساخته شد. منبع توالی الیگوساکاریدها برای هر لکوس از NCBI به دست آمد. تمام اولیگوساکاریدها توسط MWG ساخته شدند. نمونه‌های DNA ابتدا در واکنش‌های Monoplex PCRکه هر یک حاوی یک سری از آغازگرها برای هر لکوس بودند، آمپلی‌فای شدند. سپس واکنش‌های مولتی‌پلکس PCR با استفاده از مخلوطی از 4-3 جفت از آغازگرهای جدا از هم برای آمپلی‌فیکاسیون هم زمان لکوس‌های مولتی‌پلکس در یک لوله واکنش تنها گسترش داده شد. جهت ایجاد این سری مولتی‌پلکس‌ها، ترکیب بسیار لکوس‌ها با هم و شرایط آمپلی‌فیکاسیون (تکثیر) مورد ارزیابی قرار گرفت. در هر مرحله از آزمایش PCR ، شرایط آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) ابتدا برای هر منوپلکس و سپس برای هر واکنش مولتی‌پلکس به کمک گرادیان دمایی لکوس‌های STR با یک اختلاف زیاد در
حرکت الکتروفورتیک به شکل خوبی انجام شد، این در حالی بود که جدا شدن روی PAGE مشکل بود و لکوس‌هایی که حرکت نزدیک به هم داشتند به علت هم پوشانی آلل‌ها حذف می‌شدند. مجموعه‌های مولتی‌‌پلکسی که اجازه داده شد آمپلی‌فیکاسیون تمام لکوس‌ها در یک شرایط یکسان انجام شود و آرتی‌فکت (محصول ناخواسته) PCR ایجاد نشود، به طور هم زمان در یک لوله واکنش آمپلی‌فای (تکثیر) شدند، توسط PAGE دناتوره (تغییر ماهیت داده) کننده و یا غیر دناتوره‌کننده جدا شده و توسط رنگ‌آمیزی نقره کشف شدند.آزمایش PCR دارای یک حجم نهاییµL 30 شامل ng DNA 50-10 ، µmoL 10 از هر آغازگر آمپلی‌فیکاسیون، یک واحد تک پلی‌مراز (فرمنتاز ـ لیتوانی)، µL 3 بافر X PCR 10 حاوی mM KCl 500 ، (8/8 pH) M Tris HCL 1/0 و mM MgCl2 25 و mM2 از هر dNTPمی‌باشد.
PCRبه صورت 30 سیکل(هر سیکل حاوی 45 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد، 45 ثانیه در60-50 درجه سانتی‌گراد، بسته به سری آغازگرها و 45 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد) با یک دناچوراسیون اولیه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد.
شکل 2: پروفایل‌های DNA رنگ‌آمیزی شده با نقره لکوس‌های STR آمپلی‌فای شده با استفاده از سه سیستم مولتی‌پلکس. هتروزیگوسیتی و فراوانی آللی تک تک لکوس‌های موجود در مولتی‌پلکس‌های DDT ، DTC و VFF در اشکال a، b و c (به ترتیب) نمایش داده شده است.
.jpg)
شکل 3: ارزیابی نسبی ازDNA مرد و زن. حساسیت مارکر آمیلوژن(کمترین غلظت از DNA که تولید می‌کند یک باند قابل مشاهده بر روی ژل پلی‌اکریلامید رنگ شده با نقره‌ای) با مخلوط سلولی از اهداکننده(زن) و گیرنده(مرد)، متغیر از 5/0% از جمعیت مینور تا 80% از جمعیت‌های بزرگ، تعیین شد. برای این مارکر حساسیت 2-1% بود.
ژل به Quantity One programs منتقل گردید و توسط یک Multi-analyzer software (بیوراد) بررسـی و آنالیـز شـد.
آنالیز آماری و مطالعه جمعیتی:
جدول 2 انتشار فراوانی آللی و ارزیابی‌های آماری را برای هر یک از 9 لکوس آنالیز شده در نمونه‌های جمعیت ایرانی نشان می‌دهد. فراوانی‌های تعدادی از آلل‌ها در میان جمعیت کاملاً متغیر هستند.
7 آلل برای لکوس D4S2366 ، 7 آلل برای D16S539،
6 آلل برای TH01 ، 8 آلل برای VWA، 9 آلل برای FES/FPS ، 8 آلل برای F13A01 ، 8 آلل برای D13S317 ، 6 آلل بـرای TPOXو 7 آلل برای CSF1PO شناسایی شدند. به علت یک زمینه پایین، نتیجه خوب محصولات آمپلـی‌فیکاسیون و سادگی تعیین آللی در ژل غیر دناتوره و
درجه بالای هتروزیگوسیتی، قدرت تمایز(PD) و آگاهی بخشی مفید، تریپلکس DDT به عنوان یک سیستم مولتی پلکس سودمند در پزشکی قانونی، آزمایش تعیین ابوت و در آنالیز BMT در جمعیت ایرانی برگزیده شد. این مولتی‌پلکس هم اکنون برای ارزیابی روتین کایمریسم در بیماران BMTآلوژنیک این مرکز استفاده می‌شود. اطلاعات آماری رایج استفاده شده در آزمایشگاه‌های پزشکی قانونی و تعیین ابوت برای جمعیت ایرانی با استفاده از تمام 3 سیستم مولتی‌پلکس و لکوس نماینده‌شان تعیین شده است(جدول 3).
هتروزیگوسیتی(H):
مقادیر هتروزیگوسیتی مشاهده شده(Ho) و قابل انتظار(He) در جدول 2 و نمودار 1 نشـان داده شـده اسـت. تمام 9 لکوس پلی‌مورفیسم بالایی را در نمونه جمعیتی ایران نشان می‌دهند و هتروزیگوسیتی‌هایشان بیشتر از 50% بوده که با بالاترین هتروزیگوسیتی مشاهده شده(81%) برای لکوس TH01و پایین‌ترین هتروزیگوسیتی نمایش داده شده(17% و 22%) به ترتیب برای لکوس‌های F13A01 و CSF1PO می‌باشد. برای تمام 9 لکوس هیچ‌گونه انحرافی از هاردی ـ وین‌برگ کشف نگردید.
Matching probability (MP) :
شاخصی است که اغلب در پزشکی قانونی برای تعیین قدرت تمایز یک سیستم ژنتیکی اندازه‌گیری می‌شود(28، 27). جدول 3 MP را برای 10 لکوس در جمعیت ایرانی نشان می‌دهد. دامنه‌های MP در هر سیستم مولتی‌پلکس از 4-10 * 967 تا 6-10 * 177 می‌باشد. مقدار MPمرکب برای هر سه سیستم تریپلکس 17-10 * 115 برای جمعیت ایرانی است. شانس این که 2 فرد در تمام 9 لکوس موجـود در 3 تریپلکس مشابـه باشنـد، 1 در 109 * 7/8 می‌باشـد.
Power of discrimination (PD) :
متمایز کننـده‌ترین لکوس‌ها TH01 (9656/0 = PD) و VWA (955/0 = PD) بوده و پایین‌ترین لکوس F13A01 می‌باشد. دامنه PD 985/0 برای DDT ، 972/0 برای DTC و 966/0 برای VFF است. PD مرکب برای 9 لکوس در 3 سیستم تریپلکس 99999999988/0 است.
Paternity index (PI) :
معیاری از تمایز است که در بررسی تعیین ابوت استفاده می‌شود و در واقع ابزاری جهت نمایش ژنتیک احتمالی به نفع ژنوتیپ‌های مفروض پدری برای مادر، بچه و پدر فرضی است(29). typical PI ها برای هر لکوس و تمام مولتـی‌پلکس‌هــا در جدول 3 آورده شده است. typical PI
مرکب برای تمام تریپلکس‌ها 366/2115 می‌باشد.
Power of exclusion (PE) :
معیار دومی از تمایز است که اغلب در بررسی ابوت بـه
کار می‌رود که در واقع توانایی یک آزمایش ژنتیکی را جهت حذف فردی که به اشتباه مورد اتهام قرار گرفته است می‌سنجد(28). PE به دست آمده به صورت 058/0 برای تریپلکس DDT ، 002/0 برای VFF و 002/0 برای DTC است. PE مرکب برای تمام لکوس در 3 تریپلکس 0002/0 می‌باشد، که بیان‌کننده سودمندی این 3 سیستم برای بررسی‌های ابوت و تصمیم‌های پزشکـی قانونی است.
نمودار 1: هتروزیگوسیتی مشاهده شده(Ho) 9 لکوس تترانوکلئوتیدی STR در جمعیت ایرانی
جدول 2: انتشار فراوانی 9 لکوس STR در نمونه جمعیت ایرانی و مقایسه آن با مطالعه‌های مشابه
AF* : Allelic Frequency
N**: Number of Alleles Observed
جدول 3: آمار جمعیتی احتمال تشابه دو فرد در یک نمونه جمعیتی(MP)،قدرت تمایز بین افراد یک جمعیت(PD)، قدرت حذف(PE) و اندیکس ابوت(PI)) با استفاده از لکوس‌های منفرد و سیستم‌های مولتی‌پلکس برای جمعیت ایرانی
بحث
به طور خلاصه، ما گسترش 3 سیستم آمپلی فیکاسیون تریپلکس STR-PCR و کاربرد این سیستم‌ها برای بررسی انتشار فراوانی آللی 9 لکوس STR در جمعیت ایرانی را توضیح داده‌ایم. این اطلاعات بیان می‌کند که اهمیت بالای تمایز(999999988/0 PD=) هنگامی که هر 3 تریپلکس برای مشخص کردن گواهی بیولوژیک قانونی استفاده می‌شوند، می‌تواند حاصل شود. احتمال تشابه(PM) برای تمامی 9 لکوس، 1 در 6/3 میلیارد تخمین زده شد که این امر بر مفید بودن این سیستم‌ها در پزشکی قانونی و برای کاربردهـای شناسایـی انسـان در جمعیت ایرانی تاکید دارد.
این سیستم‌های مولتی‌پلکس حاوی اطلاعات بسیار سودمندی هستند و می‌توانند هم‌چنین برای پیگیری کایمریسم بعد از BMT آلوژنیک استفاده شوند(هم اکنون در مرکز تحقیقات پیوند مغز استخوان بیمارستان شریعتی تهران بر همین اساس آنالیز کایمریسم بعد از BMT آلوژنیک صورت می‌گیرد).
مقایسه با جمعیت‌های دیگر(غیر ایرانی):
در سال 1998، هالوس و همکارانش، به مطالعه نمونه جمعیتی از فیلیپین با استفاده از سه لکوس STR پرداختند. هتروزیگوسیتی این لکوس‌ها؛ VWA(4/80%) و FES/FPS (1/67%) و F13A01 (1/66%) بوده است. پلی‌مورفیسم در این لکوس‌ها به جز در لکوس VWA نسبت به لکوس‌های مشابه در مطالعه ما، بیشتر بود(30). در سال 1998 انترالا و همکارانش، به مطالعه روی نمونه جمعیتی در جنوب اسپانیا با استفاده از سه لکوس STR پرداختند. نتایج به دست آمده راجع به هتروزیگوسیتی این‌ها بدین صورت بود: لکوس D16S539 (6/81%)، لکوس D13S317 (2/79%) و لکوسD7S820 (1/74%). این نتایج نسبت به هتروزیگوسیتی در لکوس‌های مشابه در تحقیق ما نشان داد که در این‌ها هتروزیگوسیتی بیشتر بوده است. در مورد پلی‌مورفیسم این لکوس‌ها باید گفت در لکوس‌های D16S539 و D13S317 پلی‌مورفیسم مشابه ولی در مورد لکوس D7S820 پلی‌مورفیسم کمتر از لکوس مشابه در مطالعه بوده است(31).
در سال 2000، بالداسارا و نونیزو و همکارانشان به مطالعه روی یک نمونه جمعیتی در جنوب ایتالیا، با استفاده از 8 لکوس STR پرداختند. در این تحقیق درصد هتروزیگوسیتی در این لکوس‌ها به قرار زیر بود: لکوس D16S539 (75%)، D7S820 (6/81%)، D13S317 (6/86%) ، VWA (3/75%) ، FES/FPS (75%) ، TH01 (4/80%) ، TPOX (8/67%) و لکوس CSF1PO (6/48%). پلی‌مورفیسم در این لکوس‌ها به نسبت لکوس‌های مشابه در مطالعه ما؛ در لکوس‌های D16S539 و VWA مشابه بوده، در لکوس D13S317 پلی‌مورفیسم بیشتر و در بقیه لکوس‌ها پلی‌مورفیسم کمتر بود(32).
در سال 2001، C-H ژنگ و همکارانش، روی جمعیت چینی‌های مقیم تایوان، با استفاده از 5 لکوس STR مطالعه کردند که هتروزیگوسیتی آن‌ها به قرار زیر بود: لکوس CSF1PO (9/74%)، TH01 (7/62%)، VWF (5/82%)، FES/FPS (9/65%) و F13A01 (7/87%). پلی‌مورفیسم در این لکوس‌ها در مقایسه با پلی‌مورفیسم‌شان در مطالعه حاضر: لکوس‌های CSF1PO، VWF و F13A01 پلی‌مورفیسم بیشتر، و در لکوس‌های TH01 و FES/FPS پلی‌مورفیسم کمتر بود(33).
در سال 2003، کاکیر و همکارانش، به مطالعه نمونه جمعیتی از ترکیه با استفاده از 8 لکوس STR پرداختند. هتروزیگوسیتی در این لکوس‌ها به‌قرار زیر می‌باشد: (7/84%) ،TH01 ، VWA (6/80%) ، CSF1PO (5/69%)، F13A01 (75%) ، FES/FPS(70%)، D16S539 (1/78%) ، D7S820(6/75%) ، D13S317(4/85%). پلی‌مورفیسم این لکوس‌ها در مقایسه با لکوس‌های مشابه در مطالعه ما، در لکوس TH01 و D7S820 پلی‌مورفیسم کمتر، در لکوس‌هـای VWA و D16S539 پلی‌مورفیسم برابر و بقیه لکوس‌ها، پلی‌مورفیسم بیشتر بوده است(34).
نتیجه‌گیری
با نتایج به دست آمده از این مطالعه مشخص شد از چه لکوس‌هایی برای مطالعه کایمریسم بعد از پیوند مغز استخوان در جمعیت ایرانی، بهتر است استفاده کنیم. هم چنین با انجام آزمایش‌های آماری می‌توانیم قضاوت خوبی از جمعیت ایرانی در موارد پزشکی قانونی، رد ابوت، بررسی ن‍‍ژاد ایرانی و ... داشته باشیم. در این تحقیق از روش Multiplex PCR استفاده شد، به طوری که سه تریپلکس با استفاده از 9 لکوس، تنظیم گردید که روشی ارزان، راحت و سریع می‌باشد. به خاطر این که STR-PCR بر روی نمونه سلول های خون محیطی در حال حاضر دقیق‌ترین و حساس‌ترین روش تحلیل کایمریسم است، با این روش می‌توان ارزیابی صحیح و کمی با سرعت بالا از وضعیت کایمریسم بعد از پیوند را در بیماران فراهم نماید. چنین اطلاعاتی می‌تواند در تصمیم‌گیری برای استفاده از درمان‌های اضافی جهت جلوگیری از رد پیوند یا سرکوب عود بیماری مفید واقع شود. از کارهای مهمی که می‌شود انجام داد(البته برخی از آن‌ها در مرکز پیوند مغز استخوان بیمارستان شریعتی در حال اجراست) استفاده از حجم بیشتر نمونه، مطالعه روی نژادهای مختلف ایرانی و اجرای روش سکانس کردن(Sequencing) برای به دست آوردن هتروزیگوسیتی دقیق‌تر این لکوس‌ها می‌باشد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله نویسندگان مقاله از همکاری خانم‌ها دکتر شایگان، دکتر نادعلی، آسیه عشوری و آقای شهرام آذری تشکر می‌کنند. هم چنین از تمام افرادی که با سعه صدر، نمونه خون خود را برای این طرح اهدا نمودند سپاسگزارند.
متن کامل: (3648 مشاهده)
توسعه سیستم‌های Multiplex PCR-STR جهت آنالیز داده‌های ژنتیکی
جمعیت ایرانی
داریوش حیدری1، سید حمید غفاری2، بهرام چهاردولی3، احمد قره‌باغیان4، کامران علی مقدم5، اردشیر قوام‌زاده5
چکیده
سابقه و هدف
تکثیر لکوس‌های STR (توالی‌های تکرار شونده کوتاه، (Short Tandem Repeats به عنوان یک روش مفید در تعیین هویت انسان به کار می‌رود. در حال حاضر آنالیز پلی‌مورفیسم‌های STR نه تنها در پزشکی قانونی و تعیین ابوت بلکه در زمینه‌های مختلف تشخیص پزشکی شامل ارزیابی وضعیت کایمریسم و بررسی بیماران پس از پیوند آلوژنیک مغز استخوان(BMT) نیز معرفی می‌گردد.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی، نمونه‌های خون از 100 نفر از جمعیت ایرانی به صورت تصادفی به دست آمد. به منظور گسترش سیستم‌های مولتی پلکس STR ، ارزیابی فراوانی از نظر نحوه ترکیب و تکثیر لکوس‌ها انجام گرفت و 3 سیستم تریپلکس STR بدون هم‌پوشانی به دست آمد. تریپلکس DDT شامل لکوس‌های TH01 ، D4S2366 ، D16S539 ؛تریپلکس VFF حاوی لکوس‌های F13A01 ، FES/FPS و VWA و تریپلکس DTC حاوی لکوس‌های CSF1PO ، Tpox و D13S317 می‌باشند.
یافته‌ها
از اطلاعات آماری رایج، در تعیین ابوت و پزشکی قانونی از قبیل هتروزیگوسیتی(H)، احتمال تشابه دو فرد در یک نمونه جمعیتی(PM)، قدرت تمایز بین افراد یک جمعیت(PD)، قدرت حذف(PE) و اندیکس ابوت(PI) و نیز فراوانی آللی برای جمعیت ایرانی با استفاده از هر 3 سیستم مولتی‌پلکس و لکوس‌های نماینده‌شان تعیین شد. برای تمام لکوس‌ها هیچ انحرافی از معادله هاردی ـ وین‌برگ دیده نشد.
نتیجه گیری
گسترش این سیستم‌های مولتی پلکس STR ، باعث ایجاد درجه بالایی از قدرت تمایز (9999999997/0 (PD= و احتمال تشابه دو فرد در یک نمونه جمعیتی(= PM 1 در 109 * 6/3) می‌گردد که بر کاربردی بودن این سیستم‌ها در پزشکی قانونی و تعیین هویت انسان تاکید می‌نماید.
کلمات کلیدی: جمعیت، توالی‌های تکرار شونده کوتاه، پزشکی قانونی
تاریخ دریافت : 8/11/91
تاریخ پذیرش : 21/3/93
1- مؤلف مسؤول: کارشناس ارشد هماتولوژی ـ آزمایشگاه رفرانس سازمان تامین اجتماعی ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 37515-16177
2- PhD ژنتیـک مولکولی ـ دانشیار مرکز تحقیقات خـون، انکولوژی و پیونـد سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ کارگر شمالی ـ تهران ـ ایران
3- دانشجوی PhD هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
4- PhD ایمونوهماتولوژی بالینی ـ استاد دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیماری‌های مادرزادی خونی کودکان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
5- فوق تخصص خون و انکولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
جمعیت ایرانی
داریوش حیدری1، سید حمید غفاری2، بهرام چهاردولی3، احمد قره‌باغیان4، کامران علی مقدم5، اردشیر قوام‌زاده5
چکیده
سابقه و هدف
تکثیر لکوس‌های STR (توالی‌های تکرار شونده کوتاه، (Short Tandem Repeats به عنوان یک روش مفید در تعیین هویت انسان به کار می‌رود. در حال حاضر آنالیز پلی‌مورفیسم‌های STR نه تنها در پزشکی قانونی و تعیین ابوت بلکه در زمینه‌های مختلف تشخیص پزشکی شامل ارزیابی وضعیت کایمریسم و بررسی بیماران پس از پیوند آلوژنیک مغز استخوان(BMT) نیز معرفی می‌گردد.
مواد و روش‌ها
در این مطالعه توصیفی، نمونه‌های خون از 100 نفر از جمعیت ایرانی به صورت تصادفی به دست آمد. به منظور گسترش سیستم‌های مولتی پلکس STR ، ارزیابی فراوانی از نظر نحوه ترکیب و تکثیر لکوس‌ها انجام گرفت و 3 سیستم تریپلکس STR بدون هم‌پوشانی به دست آمد. تریپلکس DDT شامل لکوس‌های TH01 ، D4S2366 ، D16S539 ؛تریپلکس VFF حاوی لکوس‌های F13A01 ، FES/FPS و VWA و تریپلکس DTC حاوی لکوس‌های CSF1PO ، Tpox و D13S317 می‌باشند.
یافته‌ها
از اطلاعات آماری رایج، در تعیین ابوت و پزشکی قانونی از قبیل هتروزیگوسیتی(H)، احتمال تشابه دو فرد در یک نمونه جمعیتی(PM)، قدرت تمایز بین افراد یک جمعیت(PD)، قدرت حذف(PE) و اندیکس ابوت(PI) و نیز فراوانی آللی برای جمعیت ایرانی با استفاده از هر 3 سیستم مولتی‌پلکس و لکوس‌های نماینده‌شان تعیین شد. برای تمام لکوس‌ها هیچ انحرافی از معادله هاردی ـ وین‌برگ دیده نشد.
نتیجه گیری
گسترش این سیستم‌های مولتی پلکس STR ، باعث ایجاد درجه بالایی از قدرت تمایز (9999999997/0 (PD= و احتمال تشابه دو فرد در یک نمونه جمعیتی(= PM 1 در 109 * 6/3) می‌گردد که بر کاربردی بودن این سیستم‌ها در پزشکی قانونی و تعیین هویت انسان تاکید می‌نماید.
کلمات کلیدی: جمعیت، توالی‌های تکرار شونده کوتاه، پزشکی قانونی
تاریخ دریافت : 8/11/91
تاریخ پذیرش : 21/3/93
1- مؤلف مسؤول: کارشناس ارشد هماتولوژی ـ آزمایشگاه رفرانس سازمان تامین اجتماعی ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 37515-16177
2- PhD ژنتیـک مولکولی ـ دانشیار مرکز تحقیقات خـون، انکولوژی و پیونـد سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ کارگر شمالی ـ تهران ـ ایران
3- دانشجوی PhD هماتولوژی ـ مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
4- PhD ایمونوهماتولوژی بالینی ـ استاد دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ مرکز تحقیقات بیماری‌های مادرزادی خونی کودکان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی ـ تهران ـ ایران
5- فوق تخصص خون و انکولوژی ـ استاد مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران ـ تهران ـ ایران
مقدمه
روش واکنش زنجیره پلی‌مراز در توالی‌های بسیار تکرار شونده کوتاه(PCR-STR)؛ به عنوان یک روش انتخابی در پزشکی قانونی و تعیین ابوت و هم چنین در تعیین نقشه ژنتیکی، مطالعه‌های جمعیتی، آنالیز رده‌ای، مطالعه‌های تکاملی، تهیه بانک ملی DNA و تعیین هویت سوش‌ها در کشت بافتی استفاده می‌شود(4-1). این روش هم چنین در زمینه‌های مختلف تشخیص پزشکی شامل ارزیابی وضعیت کایمریسم و بررسی بیماران پس از پیوند آلوژنیک مغز استخوان(BMT) معرفی می‌شود(5). لکوس‌های STR ، دارای توالی‌های بسیار تکرار شونده bp7-3 هستند. ژنوم انسان ممکن است حاوی تعداد بسیار زیادی از یک STR تری‌مریک یا تترامریک در هر kb 20 باشد و تقریباً نصف لکوس‌های STR مطالعه شده، در تعداد تکرارها پلی‌مورفیک هستند، آن‌ها دارای یک منبع غنی از مارکرهای ژنتیکی می‌باشند(9-6). آزمایش PCR به وسیله آغازگرهای حاوی توالی‌های بی‌نظیر کنار هم(unique flanking sequence primers)، جهت آمپلی‌فای(تکثیر) قطعات DNA دارای لکوس‌های STR به کار گرفته شده است. در سال‌های اخیر، کشف و توسعه STR های پلی‌مورفیک به عنوان مارکرهای(نشانگرهای) ژنتیکی پیشرفت در جزئیات نقشه ژنتیکی رده‌ای، تشخیص هویت و تشخیص ژن‌های بیماری و در آسان‌سازی و دقت در تعیین نوع DNA استفاده شده است(19-10). خصوصیات تعداد زیادی از لکوس‌های STR با پلی‌مورفیک بالا، استفاده زیاد از این سیستم‌ها را در بررسی پزشکی قانونی، تعیین ابوت، تشخیص نوع سوش در کشت بافتی و آنالیز BMT میسر می‌سازد. مارکرهای (نشانگرهای) STR ، آنالیز مقادیر بسیار کم نمونه‌های بیولوژیکی را حتی با یک روش خالص‌سازی DNA خام اجازه می‌دهد. نتیجه آمپلی فیکاسیون(تکثیر)، قطعات لکوس‌های STR افراد از 100 تا 400 جفت باز می‌باشد که می‌تواند به سرعت و به طور صحیحی با استفاده از یک allelic ladder که به خوبی تعریف شده است، آنالیز شود. در جمعیت ایرانی از نقطه نظر ژنتیکی اطلاعاتی وجود ندارد و با توجه به دانش و آگاهی ما در این زمینه، این اولین مطالعه‌ای است که از ایران در زمینه انتشار و پراکندگی STRها گزارش شده است. در این مطالعه، طراحی سیستم‌های آمپلی فیکاسیون(تکثیر) Multiplex STR-PCR و کاربرد این سیستم‌ها از جهت بررسی انتشار فراوانی آللی 10 لکوس STR در جمعیت ایرانی توصیف شد. این مطالعه به عنوان یک رویکرد اولیه نسبت به ارزیابی و معرفی تعیین DNA در ایران انجام شد. به طور رایج این روش تعیین Multiplex DNA در مرکز تحقیــقـات خـون ، انکولوژی و پیونـد مغـز استخوان برای ارزیابی وضعیت کایمریسم و بررسی بیماران پس از BMT تاسیس شده است(21، 20).
مواد و روش‌ها
تهیه نمونه:
مطالعه انجام شده از نوع توصیفی بود. نمونه‌های خون محیطی از 100 نفر غیر خویشاوند سالم (hematopoietic stem cell donors) زنده در مناطق مختلف ایران صرف نظر از زمینه نژادیشان جمع‌آوری شدند. تمام این افراد اهداکنندگان سلول‌های بنیادی خونساز(به روش برداشت از مغز استخوان) بودند که به مرکز تحقیقات خون، انکولوژی و پیوند سلول‌های بنیادی دانشگاه علوم پزشکی تهران از سراسر کشور فرستاده شده بودند. DNA با وزن مولکولی بالا از سلول‌های تک هسته‌ای گلبول‌های سفید با روش استاندارد نمک اشباع((salting out استخراج شدند(24-22). غلظت هر نمونه DNA توسط یک اسپکتروفتومترUV تعیین گردید (نسبت A260/A280 که برآوردی از خلوص DNA است، بین 2-7/1 بود).
آمپلی فیکاسیون(تکثیر) STR-PCR :
بعد از تحقیقات وسیع در نشریات، 15 لکوس STR تترانوکلئوتیدی که خوب تعریف شده بودند و از پلی‌مورفیسم بالایی برخوردار بودند، جهت این که به صورت مولتی‌پلکس ارزیابی شوند، انتخاب شدند. معیارهای انتخاب شامل، عدم هم‌پوشانی محصولات آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر)، مقدار بسیار کم یا نبود آرتی‌فکت‌های(محصولات ناخواسته) PCR که به علت آمپلی‌فیکاسیون غیر اختصاصی ایجاد می‌شود، سهل‌انگاری در تعیین آلل‌ها و وجود درجه بالای پلی‌مورفیسم در جمعیت ایرانی بودنـد. از ایـن مطالعه‌های اولیـه، 9 لکوس تترانوکلئوتیدی پلی‌مورفیک جهت این کار انتخاب شدند. 9 لکوس آمپلی‌فای شده در این مطالعه D4S2366 ، D16S539 ، TH01 ، D13S317 ، TPOX ، CSF1PO ، VWA ، FES/FPS و F13A01 بودند(جدول 1). به خاطر توالی‌های کنار هم بی‌نظیر هر لکوس، یک جفت آغازگر انتخاب و ساخته شد. منبع توالی الیگوساکاریدها برای هر لکوس از NCBI به دست آمد. تمام اولیگوساکاریدها توسط MWG ساخته شدند. نمونه‌های DNA ابتدا در واکنش‌های Monoplex PCRکه هر یک حاوی یک سری از آغازگرها برای هر لکوس بودند، آمپلی‌فای شدند. سپس واکنش‌های مولتی‌پلکس PCR با استفاده از مخلوطی از 4-3 جفت از آغازگرهای جدا از هم برای آمپلی‌فیکاسیون هم زمان لکوس‌های مولتی‌پلکس در یک لوله واکنش تنها گسترش داده شد. جهت ایجاد این سری مولتی‌پلکس‌ها، ترکیب بسیار لکوس‌ها با هم و شرایط آمپلی‌فیکاسیون (تکثیر) مورد ارزیابی قرار گرفت. در هر مرحله از آزمایش PCR ، شرایط آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) ابتدا برای هر منوپلکس و سپس برای هر واکنش مولتی‌پلکس به کمک گرادیان دمایی لکوس‌های STR با یک اختلاف زیاد در
حرکت الکتروفورتیک به شکل خوبی انجام شد، این در حالی بود که جدا شدن روی PAGE مشکل بود و لکوس‌هایی که حرکت نزدیک به هم داشتند به علت هم پوشانی آلل‌ها حذف می‌شدند. مجموعه‌های مولتی‌‌پلکسی که اجازه داده شد آمپلی‌فیکاسیون تمام لکوس‌ها در یک شرایط یکسان انجام شود و آرتی‌فکت (محصول ناخواسته) PCR ایجاد نشود، به طور هم زمان در یک لوله واکنش آمپلی‌فای (تکثیر) شدند، توسط PAGE دناتوره (تغییر ماهیت داده) کننده و یا غیر دناتوره‌کننده جدا شده و توسط رنگ‌آمیزی نقره کشف شدند.آزمایش PCR دارای یک حجم نهاییµL 30 شامل ng DNA 50-10 ، µmoL 10 از هر آغازگر آمپلی‌فیکاسیون، یک واحد تک پلی‌مراز (فرمنتاز ـ لیتوانی)، µL 3 بافر X PCR 10 حاوی mM KCl 500 ، (8/8 pH) M Tris HCL 1/0 و mM MgCl2 25 و mM2 از هر dNTPمی‌باشد.
PCRبه صورت 30 سیکل(هر سیکل حاوی 45 ثانیه در 95 درجه سانتی‌گراد، 45 ثانیه در60-50 درجه سانتی‌گراد، بسته به سری آغازگرها و 45 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد) با یک دناچوراسیون اولیه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد.
جدول 1: خصوصیات 9 لکوس STR استفاده شده همراه با نمایش آن‌ها در قالب 3 سیستم تریپلکس
شکل 1: شرح شماتیکی دامنه‌های آللی استفاده شده در 3 سیستم تریپلکس STR-PCR .
اندازه دامنه‌های 9 لکوس STR و مارکر آمیلوژنین هنگامی که به صورت 3 تریپلکس در واکنش‌های PCR آمپلی‌فای شده و توسط PAGE آنالیز گردند. اندازه دامنه هر لکوس به صورت جفت باز نمایش داده می‌شود. (A) لکوس‌های آمیلوژنین را نمایش می‌دهد. این مارکر می‌توانست به طور هم زمان در همان لاین run شود و به عنوان یک باند تنها برای زنان و دو باند برای مردان مشاهده شود. اندازه‌های مورد انتظار قطعه(جفت باز) برای آمیلوژنین X106 و Y112 می‌باشند(25).
| سیستم مولتی‌پلکس STR | نام لکوس | محل کروموزومی | Repeat motif | شماره آلل | Allele Range | محدوده سایز |
| DDT | D4S2366 | p4 | GATA | 8 | 12-5 | 144-120 |
| D16S539 | 24-22q16 | GATA | 7 | 13-7 | 173-141 | |
| TH01 | 5/15-15p11 | AATG | 14 | 10-3 | 215-171 | |
| DCT | D13S317 | 24-22q13 | TATC | 10 | 13-7 | 201-157 |
| TPOX | pter2-23p2 | AATG | 8 | 12-5 | 256-220 | |
| CSF1PO | 34-3/33q5 | AGAT | 10 | 16-10 | 331-291 | |
| VFF | VWA | pter-12p12 | [TCTG][TCTA] | 12 | 20-13 | 182-122 |
| FES/FPS | qter-25q15 | ATTT | 7 | 13-7 | 252-222 | |
| F13A1 | 24-24p6 | AAAG | 8 | 15-8 | 335-279 |
شکل 1: شرح شماتیکی دامنه‌های آللی استفاده شده در 3 سیستم تریپلکس STR-PCR .
اندازه دامنه‌های 9 لکوس STR و مارکر آمیلوژنین هنگامی که به صورت 3 تریپلکس در واکنش‌های PCR آمپلی‌فای شده و توسط PAGE آنالیز گردند. اندازه دامنه هر لکوس به صورت جفت باز نمایش داده می‌شود. (A) لکوس‌های آمیلوژنین را نمایش می‌دهد. این مارکر می‌توانست به طور هم زمان در همان لاین run شود و به عنوان یک باند تنها برای زنان و دو باند برای مردان مشاهده شود. اندازه‌های مورد انتظار قطعه(جفت باز) برای آمیلوژنین X106 و Y112 می‌باشند(25).
الکتروفورزیس:
محصولات آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) PCR تحت ژل پلی‌اکریلامید 6% دناتوره(تغییر ماهیت داده) کننده و یا غیر دناتوره کننده الکتروفورز شدند و باندهای DNA به کمک رنگ‌آمیزی نیترات نقره قابل مشاهده گردید. پس از عکس‌برداری از ژل‌ها و انتقال آن‌ها به یک Bio-Ras Multi-Analyst image analyzer ، اندازه باندهای لکوس‌های مولتی‌پلکس DNA توسط یک allelic ladder و مارکرهای با وزن مولکولی مشخص تعیین گردید.
آنالیز آماری:
انتشار فراوانی آللی، درصد هتروزیگوسیتی قابل مشاهده (Ho) و مورد انتظار (He) likelihood ration test, و Hardy-Weinberg expectations (HWE) توسط تست c2 به کمک برنامه 4/3 GENEPOP software v. انجام شد (24). واگرایی ممکن از HWE با محاسبه یک تخمین مناسب از فراوانی‌های هموزیگوت به هتروزیگوت مورد انتظار تعیین شد(24). تعداد دیگری از پارامترهای جمعیتی سودمند در تعیین ابوت و پزشکی قانونی از قبیل power of discrimination (PD) ، matching probability (PM) ، paternity index (PI) وpower of exclusion (PE) به وسیله روش‌های آماری مختلفی محاسبه شدند(26). HWE بـا استفاده از آزمون کای‌دو بررسی و چک گردید.
یافته‌ها
تفسیر سیستم‌های مولتی‌پلکس:
پس از ارزیابی فراوان ترکیبات لکوسی و شرایط آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) ، 9 لکوس STR جهت ایجاد 3 سیستم تریپلکس غیر هم‌پوشاننده برای آنالیز سریع و درست، ترکیب شدند(جدول 1). اولین تریپلکسDDT)) شامل آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) هم زمان لکوس‌های TH01 ، D4S2366 ، D16S539 ؛ دومین تریپلکس((VFF حاوی لکوس‌های F13A01 ، FES/FPS ، VWA ؛ و سومین تریپلکس(DTC) حاوی لکوس‌های CsF1po ، Tpox و D13S317 می‌باشند. دامنه اندازه آلل‌ها برای سنجش‌های مولتی‌پلکس در شکل 1 توضیح داده شده است. نمونه‌های DNA (ng100-50) از افراد ایرانی توسط سیستم‌های مولتی‌پلکس آمپلی‌فای شدند; محصولات PCR روی PAGE 6% غیر دناتوره‌کننده جدا و توسط رنگ‌آمیزی نقره مشاهده شدند.
شکل‌های 2 و 3 پروفایل‌های DNA را برای هر 3 مولتی‌پلکس و نیز مارکر آمیلوژنین نشان می‌دهند. جهت تجزیه قطعات DNA بیشتر از 250 نوکلئوتید، یک PAGE دناتوره‌کننده به کار می‌رود. نمونه‌های DNA آمپلی‌فای شده معمولاً جهت الکتروفورزیس در مجاورت با مخلوطی از allelic ladderها برای لکوس‌های مربوطه یا سایز مارکر قرار گرفتند. این رویکرد تعیین سریع، ساده و دقیق اندازه‌های آللی را به وسیله مقایسه بصری اجزاء allelic ladder بـدون نیـاز به هر دستگاه مخصوصی میسر می‌سازد. گر چه برای تعییـن دقیق اندازه‌های آللی، تصویر
محصولات آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) PCR تحت ژل پلی‌اکریلامید 6% دناتوره(تغییر ماهیت داده) کننده و یا غیر دناتوره کننده الکتروفورز شدند و باندهای DNA به کمک رنگ‌آمیزی نیترات نقره قابل مشاهده گردید. پس از عکس‌برداری از ژل‌ها و انتقال آن‌ها به یک Bio-Ras Multi-Analyst image analyzer ، اندازه باندهای لکوس‌های مولتی‌پلکس DNA توسط یک allelic ladder و مارکرهای با وزن مولکولی مشخص تعیین گردید.
آنالیز آماری:
انتشار فراوانی آللی، درصد هتروزیگوسیتی قابل مشاهده (Ho) و مورد انتظار (He) likelihood ration test, و Hardy-Weinberg expectations (HWE) توسط تست c2 به کمک برنامه 4/3 GENEPOP software v. انجام شد (24). واگرایی ممکن از HWE با محاسبه یک تخمین مناسب از فراوانی‌های هموزیگوت به هتروزیگوت مورد انتظار تعیین شد(24). تعداد دیگری از پارامترهای جمعیتی سودمند در تعیین ابوت و پزشکی قانونی از قبیل power of discrimination (PD) ، matching probability (PM) ، paternity index (PI) وpower of exclusion (PE) به وسیله روش‌های آماری مختلفی محاسبه شدند(26). HWE بـا استفاده از آزمون کای‌دو بررسی و چک گردید.
یافته‌ها
تفسیر سیستم‌های مولتی‌پلکس:
پس از ارزیابی فراوان ترکیبات لکوسی و شرایط آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) ، 9 لکوس STR جهت ایجاد 3 سیستم تریپلکس غیر هم‌پوشاننده برای آنالیز سریع و درست، ترکیب شدند(جدول 1). اولین تریپلکسDDT)) شامل آمپلی‌فیکاسیون(تکثیر) هم زمان لکوس‌های TH01 ، D4S2366 ، D16S539 ؛ دومین تریپلکس((VFF حاوی لکوس‌های F13A01 ، FES/FPS ، VWA ؛ و سومین تریپلکس(DTC) حاوی لکوس‌های CsF1po ، Tpox و D13S317 می‌باشند. دامنه اندازه آلل‌ها برای سنجش‌های مولتی‌پلکس در شکل 1 توضیح داده شده است. نمونه‌های DNA (ng100-50) از افراد ایرانی توسط سیستم‌های مولتی‌پلکس آمپلی‌فای شدند; محصولات PCR روی PAGE 6% غیر دناتوره‌کننده جدا و توسط رنگ‌آمیزی نقره مشاهده شدند.
شکل‌های 2 و 3 پروفایل‌های DNA را برای هر 3 مولتی‌پلکس و نیز مارکر آمیلوژنین نشان می‌دهند. جهت تجزیه قطعات DNA بیشتر از 250 نوکلئوتید، یک PAGE دناتوره‌کننده به کار می‌رود. نمونه‌های DNA آمپلی‌فای شده معمولاً جهت الکتروفورزیس در مجاورت با مخلوطی از allelic ladderها برای لکوس‌های مربوطه یا سایز مارکر قرار گرفتند. این رویکرد تعیین سریع، ساده و دقیق اندازه‌های آللی را به وسیله مقایسه بصری اجزاء allelic ladder بـدون نیـاز به هر دستگاه مخصوصی میسر می‌سازد. گر چه برای تعییـن دقیق اندازه‌های آللی، تصویر
شکل 2: پروفایل‌های DNA رنگ‌آمیزی شده با نقره لکوس‌های STR آمپلی‌فای شده با استفاده از سه سیستم مولتی‌پلکس. هتروزیگوسیتی و فراوانی آللی تک تک لکوس‌های موجود در مولتی‌پلکس‌های DDT ، DTC و VFF در اشکال a، b و c (به ترتیب) نمایش داده شده است.
شکل 3: ارزیابی نسبی ازDNA مرد و زن. حساسیت مارکر آمیلوژن(کمترین غلظت از DNA که تولید می‌کند یک باند قابل مشاهده بر روی ژل پلی‌اکریلامید رنگ شده با نقره‌ای) با مخلوط سلولی از اهداکننده(زن) و گیرنده(مرد)، متغیر از 5/0% از جمعیت مینور تا 80% از جمعیت‌های بزرگ، تعیین شد. برای این مارکر حساسیت 2-1% بود.
ژل به Quantity One programs منتقل گردید و توسط یک Multi-analyzer software (بیوراد) بررسـی و آنالیـز شـد.
آنالیز آماری و مطالعه جمعیتی:
جدول 2 انتشار فراوانی آللی و ارزیابی‌های آماری را برای هر یک از 9 لکوس آنالیز شده در نمونه‌های جمعیت ایرانی نشان می‌دهد. فراوانی‌های تعدادی از آلل‌ها در میان جمعیت کاملاً متغیر هستند.
7 آلل برای لکوس D4S2366 ، 7 آلل برای D16S539،
6 آلل برای TH01 ، 8 آلل برای VWA، 9 آلل برای FES/FPS ، 8 آلل برای F13A01 ، 8 آلل برای D13S317 ، 6 آلل بـرای TPOXو 7 آلل برای CSF1PO شناسایی شدند. به علت یک زمینه پایین، نتیجه خوب محصولات آمپلـی‌فیکاسیون و سادگی تعیین آللی در ژل غیر دناتوره و
درجه بالای هتروزیگوسیتی، قدرت تمایز(PD) و آگاهی بخشی مفید، تریپلکس DDT به عنوان یک سیستم مولتی پلکس سودمند در پزشکی قانونی، آزمایش تعیین ابوت و در آنالیز BMT در جمعیت ایرانی برگزیده شد. این مولتی‌پلکس هم اکنون برای ارزیابی روتین کایمریسم در بیماران BMTآلوژنیک این مرکز استفاده می‌شود. اطلاعات آماری رایج استفاده شده در آزمایشگاه‌های پزشکی قانونی و تعیین ابوت برای جمعیت ایرانی با استفاده از تمام 3 سیستم مولتی‌پلکس و لکوس نماینده‌شان تعیین شده است(جدول 3).
هتروزیگوسیتی(H):
مقادیر هتروزیگوسیتی مشاهده شده(Ho) و قابل انتظار(He) در جدول 2 و نمودار 1 نشـان داده شـده اسـت. تمام 9 لکوس پلی‌مورفیسم بالایی را در نمونه جمعیتی ایران نشان می‌دهند و هتروزیگوسیتی‌هایشان بیشتر از 50% بوده که با بالاترین هتروزیگوسیتی مشاهده شده(81%) برای لکوس TH01و پایین‌ترین هتروزیگوسیتی نمایش داده شده(17% و 22%) به ترتیب برای لکوس‌های F13A01 و CSF1PO می‌باشد. برای تمام 9 لکوس هیچ‌گونه انحرافی از هاردی ـ وین‌برگ کشف نگردید.
Matching probability (MP) :
شاخصی است که اغلب در پزشکی قانونی برای تعیین قدرت تمایز یک سیستم ژنتیکی اندازه‌گیری می‌شود(28، 27). جدول 3 MP را برای 10 لکوس در جمعیت ایرانی نشان می‌دهد. دامنه‌های MP در هر سیستم مولتی‌پلکس از 4-10 * 967 تا 6-10 * 177 می‌باشد. مقدار MPمرکب برای هر سه سیستم تریپلکس 17-10 * 115 برای جمعیت ایرانی است. شانس این که 2 فرد در تمام 9 لکوس موجـود در 3 تریپلکس مشابـه باشنـد، 1 در 109 * 7/8 می‌باشـد.
Power of discrimination (PD) :
متمایز کننـده‌ترین لکوس‌ها TH01 (9656/0 = PD) و VWA (955/0 = PD) بوده و پایین‌ترین لکوس F13A01 می‌باشد. دامنه PD 985/0 برای DDT ، 972/0 برای DTC و 966/0 برای VFF است. PD مرکب برای 9 لکوس در 3 سیستم تریپلکس 99999999988/0 است.
Paternity index (PI) :
معیاری از تمایز است که در بررسی تعیین ابوت استفاده می‌شود و در واقع ابزاری جهت نمایش ژنتیک احتمالی به نفع ژنوتیپ‌های مفروض پدری برای مادر، بچه و پدر فرضی است(29). typical PI ها برای هر لکوس و تمام مولتـی‌پلکس‌هــا در جدول 3 آورده شده است. typical PI
مرکب برای تمام تریپلکس‌ها 366/2115 می‌باشد.
Power of exclusion (PE) :
معیار دومی از تمایز است که اغلب در بررسی ابوت بـه
کار می‌رود که در واقع توانایی یک آزمایش ژنتیکی را جهت حذف فردی که به اشتباه مورد اتهام قرار گرفته است می‌سنجد(28). PE به دست آمده به صورت 058/0 برای تریپلکس DDT ، 002/0 برای VFF و 002/0 برای DTC است. PE مرکب برای تمام لکوس در 3 تریپلکس 0002/0 می‌باشد، که بیان‌کننده سودمندی این 3 سیستم برای بررسی‌های ابوت و تصمیم‌های پزشکـی قانونی است.
نمودار 1: هتروزیگوسیتی مشاهده شده(Ho) 9 لکوس تترانوکلئوتیدی STR در جمعیت ایرانی
جدول 2: انتشار فراوانی 9 لکوس STR در نمونه جمعیت ایرانی و مقایسه آن با مطالعه‌های مشابه
| TH01 | D16S539 | D4S2366 | |||||||||
| 38 | هموزیگوت | 24 | هموزیگوت | 36 | هموزیگوت | ||||||
| 62 | هتروزیگوت | 76 | هتروزیگوت | 64 | هتروزیگوت | ||||||
| 100 | جمع نمونه‌ها | 100 | جمع نمونه‌ها | 100 | جمع نمونه‌ها | ||||||
| N | AF | آلل | N | AF | آلل | N** | AF* | آلل | |||
| 3 | 0150/0 | 3 | 3 | 0150/0 | 7 | 17 | 0850/0 | 5 | |||
| 29 | 1450/0 | 4 | 20 | 1000/0 | 8 | 33 | 1650/0 | 6 | |||
| 34 | 1700/0 | 5 | 30 | 1500/0 | 9 | 42 | 2100/0 | 7 | |||
| 18 | 0900/0 | 3/5 | 54 | 2700/0 | 10 | 28 | 1400/0 | 8 | |||
| 17 | 0850/0 | 6 | 57 | 2850/0 | 11 | 30 | 1500/0 | 9 | |||
| 13 | 0650/0 | 1/6 | 30 | 1500/0 | 12 | 29 | 1450/0 | 10 | |||
| 29 | 1450/0 | 7 | 6 | 0300/0 | 13 | 18 | 0900/0 | 11 | |||
| 12 | 0600/0 | 1/7 | 3 | 0150/0 | 12 | ||||||
| 13 | 0650/0 | 3/7 | |||||||||
| 18 | 0900/0 | 8 | |||||||||
| 8 | 0400/0 | 3/8 | |||||||||
| 4 | 0200/0 | 9 | |||||||||
| 1 | 0050/0 | 3/9 | |||||||||
| 1 | 0050/0 | 10 | |||||||||
| 200 | 000/1 | جمع | 200 | 000/1 | جمع | 200 | 000/1 | جمع | |||
| CSF1PO | TPOX | D13S317 | |||||||||
| 83 | هموزیگوت | 56 | هموزیگوت | 48 | هموزیگوت | ||||||
| 17 | هتروزیگوت | 44 | هتروزیگوت | 52 | هتروزیگوت | ||||||
| 100 | جمع نمونه‌ها | 100 | جمع نمونه‌ها | 100 | جمع نمونه‌ها | ||||||
| N | AF | آلل | N | AF | آلل | N** | AF* | آلل | |||
| 2 | 0100/0 | 10 | 9 | 0450/0 | 5 | 1 | 0050/0 | 7 | |||
| 1 | 0050/0 | 1/10 | 36 | 1800/0 | 6 | 2 | 0100/0 | 1/7 | |||
| 2 | 0100/0 | 3/10 | 42 | 2100/0 | 7 | 9 | 0450/0 | 8 | |||
| 2 | 0100/0 | 11 | 50 | 2500/0 | 8 | 17 | 0850/0 | 1/8 | |||
| 6 | 0300/0 | 12 | 26 | 1300/0 | 9 | 21 | 1050/0 | 9 | |||
| 9 | 0450/0 | 1/12 | 28 | 1400/0 | 10 | 28 | 1400/0 | 10 | |||
| 62 | 3100/0 | 13 | 5 | 0250/0 | 11 | 56 | 2800/0 | 11 | |||
| 49 | 2450/0 | 14 | 4 | 0200/0 | 12 | 41 | 2050/0 | 12 | |||
| 41 | 2050/0 | 15 | 24 | 1200/0 | 13 | ||||||
| 26 | 1300/0 | 16 | 1 | 0050/0 | 14 | ||||||
| 200 | 000/1 | جمع | 200 | 000/1 | جمع | 200 | 000/1 | جمع | |||
| F13A01 | FES/FPS | VWA | |||||||||
| 88 | هموزیگوت | 49 | هموزیگوت | 40 | هموزیگوت | ||||||
| 12 | هتروزیگوت | 51 | هتروزیگوت | 60 | هتروزیگوت | ||||||
| 100 | جمع نمونه‌ها | 100 | جمع نمونه‌ها | 100 | جمع نمونه‌ها | ||||||
| N | AF | آلل | N | AF | آلل | N** | AF* | آلل | |||
| 3 | 0150/0 | 8 | 7 | 0350/0 | 7 | 5 | 0250/0 | 13 | |||
| 5 | 0250/0 | 9 | 17 | 0850/0 | 8 | 12 | 0600/0 | 14 | |||
| 12 | 0600/0 | 10 | 33 | 1650/0 | 9 | 14 | 0700/0 | 15 | |||
| 12 | 0600/0 | 11 | 41 | 2050/0 | 10 | 15 | 0750/0 | 2/15 | |||
| 58 | 2900/0 | 12 | 52 | 2600/0 | 11 | 16 | 0800/0 | 16 | |||
| 67 | 3350/0 | 13 | 36 | 1800/0 | 12 | 30 | 1500/0 | 1/16 | |||
| 32 | 1600/0 | 14 | 14 | 0700/0 | 13 | 55 | 2750/0 | 17 | |||
| 11 | 0550/0 | 15 | 28 | 1400/0 | 18 | ||||||
| 7 | 0350/0 | 2/18 | |||||||||
| 8 | 0400/0 | 3/18 | |||||||||
| 2 | 0100/0 | 19 | |||||||||
| 8 | 0400/0 | 20 | |||||||||
| 200 | 000/1 | جمع | 200 | 000/1 | جمع | 200 | 000/1 | جمع | |||
N**: Number of Alleles Observed
جدول 3: آمار جمعیتی احتمال تشابه دو فرد در یک نمونه جمعیتی(MP)،قدرت تمایز بین افراد یک جمعیت(PD)، قدرت حذف(PE) و اندیکس ابوت(PI)) با استفاده از لکوس‌های منفرد و سیستم‌های مولتی‌پلکس برای جمعیت ایرانی
| Power of Exclusion (PE) |
Paternity Index (PI) |
Power of Discrimination (PD) |
Matching Probability (MP) |
Loci |
| 4928/0 | 9231/1 | 9376/0 | (1 در 16) 0624/0 | D4S2366 |
| 7750/0 | 5455/4 | 9118/0 | (1 در 11) 0882/0 | D16S539 |
| 6367/0 | 7778/2 | 9142/0 | (1 در 11) 0852/0 | TH01 |
| 6399/0 | 8043/2 | 9647/0 | (1 در 28) 0353/0 | VWA |
| 5194/0 | 0458/2 | 8991/0 | (1 در 10) 1009/0 | FESFPS |
| 5018/0 | 9631/1 | 9238/0 | (1 در 13) 0762/0 | F13A01 |
| 6247/0 | 6838/2 | 9204/0 | (1 در 12) 0796/0 | D13S317 |
| 4297/0 | 6717/1 | 7992/0 | (1 در 5) 2008/0 | TPOX |
| 4439/0 | 7241/1 | 8640/0 | (1 در 7) 1360/0 | CSF1PO |
| 9585/0 | 282/24 | 99953/0 | (1 در 2118) 000472/0 | DDT |
| 9101/0 | 26238/11 | 99973/0 | (1 در 3690) 000271/0 | VFF |
| 8810/0 | 735189/7 | 99783/0 | (1 در 460) 002174/0 | DTC |
| 9996/0 | 366/2115 | 9999999997/0 | (1 در 109 * 6/3) 12-10 * 279 |
DDT+VFF+DTC |
بحث
به طور خلاصه، ما گسترش 3 سیستم آمپلی فیکاسیون تریپلکس STR-PCR و کاربرد این سیستم‌ها برای بررسی انتشار فراوانی آللی 9 لکوس STR در جمعیت ایرانی را توضیح داده‌ایم. این اطلاعات بیان می‌کند که اهمیت بالای تمایز(999999988/0 PD=) هنگامی که هر 3 تریپلکس برای مشخص کردن گواهی بیولوژیک قانونی استفاده می‌شوند، می‌تواند حاصل شود. احتمال تشابه(PM) برای تمامی 9 لکوس، 1 در 6/3 میلیارد تخمین زده شد که این امر بر مفید بودن این سیستم‌ها در پزشکی قانونی و برای کاربردهـای شناسایـی انسـان در جمعیت ایرانی تاکید دارد.
این سیستم‌های مولتی‌پلکس حاوی اطلاعات بسیار سودمندی هستند و می‌توانند هم‌چنین برای پیگیری کایمریسم بعد از BMT آلوژنیک استفاده شوند(هم اکنون در مرکز تحقیقات پیوند مغز استخوان بیمارستان شریعتی تهران بر همین اساس آنالیز کایمریسم بعد از BMT آلوژنیک صورت می‌گیرد).
مقایسه با جمعیت‌های دیگر(غیر ایرانی):
در سال 1998، هالوس و همکارانش، به مطالعه نمونه جمعیتی از فیلیپین با استفاده از سه لکوس STR پرداختند. هتروزیگوسیتی این لکوس‌ها؛ VWA(4/80%) و FES/FPS (1/67%) و F13A01 (1/66%) بوده است. پلی‌مورفیسم در این لکوس‌ها به جز در لکوس VWA نسبت به لکوس‌های مشابه در مطالعه ما، بیشتر بود(30). در سال 1998 انترالا و همکارانش، به مطالعه روی نمونه جمعیتی در جنوب اسپانیا با استفاده از سه لکوس STR پرداختند. نتایج به دست آمده راجع به هتروزیگوسیتی این‌ها بدین صورت بود: لکوس D16S539 (6/81%)، لکوس D13S317 (2/79%) و لکوسD7S820 (1/74%). این نتایج نسبت به هتروزیگوسیتی در لکوس‌های مشابه در تحقیق ما نشان داد که در این‌ها هتروزیگوسیتی بیشتر بوده است. در مورد پلی‌مورفیسم این لکوس‌ها باید گفت در لکوس‌های D16S539 و D13S317 پلی‌مورفیسم مشابه ولی در مورد لکوس D7S820 پلی‌مورفیسم کمتر از لکوس مشابه در مطالعه بوده است(31).
در سال 2000، بالداسارا و نونیزو و همکارانشان به مطالعه روی یک نمونه جمعیتی در جنوب ایتالیا، با استفاده از 8 لکوس STR پرداختند. در این تحقیق درصد هتروزیگوسیتی در این لکوس‌ها به قرار زیر بود: لکوس D16S539 (75%)، D7S820 (6/81%)، D13S317 (6/86%) ، VWA (3/75%) ، FES/FPS (75%) ، TH01 (4/80%) ، TPOX (8/67%) و لکوس CSF1PO (6/48%). پلی‌مورفیسم در این لکوس‌ها به نسبت لکوس‌های مشابه در مطالعه ما؛ در لکوس‌های D16S539 و VWA مشابه بوده، در لکوس D13S317 پلی‌مورفیسم بیشتر و در بقیه لکوس‌ها پلی‌مورفیسم کمتر بود(32).
در سال 2001، C-H ژنگ و همکارانش، روی جمعیت چینی‌های مقیم تایوان، با استفاده از 5 لکوس STR مطالعه کردند که هتروزیگوسیتی آن‌ها به قرار زیر بود: لکوس CSF1PO (9/74%)، TH01 (7/62%)، VWF (5/82%)، FES/FPS (9/65%) و F13A01 (7/87%). پلی‌مورفیسم در این لکوس‌ها در مقایسه با پلی‌مورفیسم‌شان در مطالعه حاضر: لکوس‌های CSF1PO، VWF و F13A01 پلی‌مورفیسم بیشتر، و در لکوس‌های TH01 و FES/FPS پلی‌مورفیسم کمتر بود(33).
در سال 2003، کاکیر و همکارانش، به مطالعه نمونه جمعیتی از ترکیه با استفاده از 8 لکوس STR پرداختند. هتروزیگوسیتی در این لکوس‌ها به‌قرار زیر می‌باشد: (7/84%) ،TH01 ، VWA (6/80%) ، CSF1PO (5/69%)، F13A01 (75%) ، FES/FPS(70%)، D16S539 (1/78%) ، D7S820(6/75%) ، D13S317(4/85%). پلی‌مورفیسم این لکوس‌ها در مقایسه با لکوس‌های مشابه در مطالعه ما، در لکوس TH01 و D7S820 پلی‌مورفیسم کمتر، در لکوس‌هـای VWA و D16S539 پلی‌مورفیسم برابر و بقیه لکوس‌ها، پلی‌مورفیسم بیشتر بوده است(34).
نتیجه‌گیری
با نتایج به دست آمده از این مطالعه مشخص شد از چه لکوس‌هایی برای مطالعه کایمریسم بعد از پیوند مغز استخوان در جمعیت ایرانی، بهتر است استفاده کنیم. هم چنین با انجام آزمایش‌های آماری می‌توانیم قضاوت خوبی از جمعیت ایرانی در موارد پزشکی قانونی، رد ابوت، بررسی ن‍‍ژاد ایرانی و ... داشته باشیم. در این تحقیق از روش Multiplex PCR استفاده شد، به طوری که سه تریپلکس با استفاده از 9 لکوس، تنظیم گردید که روشی ارزان، راحت و سریع می‌باشد. به خاطر این که STR-PCR بر روی نمونه سلول های خون محیطی در حال حاضر دقیق‌ترین و حساس‌ترین روش تحلیل کایمریسم است، با این روش می‌توان ارزیابی صحیح و کمی با سرعت بالا از وضعیت کایمریسم بعد از پیوند را در بیماران فراهم نماید. چنین اطلاعاتی می‌تواند در تصمیم‌گیری برای استفاده از درمان‌های اضافی جهت جلوگیری از رد پیوند یا سرکوب عود بیماری مفید واقع شود. از کارهای مهمی که می‌شود انجام داد(البته برخی از آن‌ها در مرکز پیوند مغز استخوان بیمارستان شریعتی در حال اجراست) استفاده از حجم بیشتر نمونه، مطالعه روی نژادهای مختلف ایرانی و اجرای روش سکانس کردن(Sequencing) برای به دست آوردن هتروزیگوسیتی دقیق‌تر این لکوس‌ها می‌باشد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله نویسندگان مقاله از همکاری خانم‌ها دکتر شایگان، دکتر نادعلی، آسیه عشوری و آقای شهرام آذری تشکر می‌کنند. هم چنین از تمام افرادی که با سعه صدر، نمونه خون خود را برای این طرح اهدا نمودند سپاسگزارند.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
